RU2418860C1 - Method of detecting presence of anthrax infection in biological fluids and environment - Google Patents

Abstract

FIELD: medicine.

SUBSTANCE: method of detecting anthrax pathogen in environment and biological fluids is based on functional detection of activity of one of anthrax toxin components, weak protease of anthrax lethal factor (LF). Applied principle of highly sensitive detection of LF proteolytic activity is based on the system of amplification of sugnal, originating from the act of substrate cutting, by means of present in substrate composition auxiliary enzyme of alkaline phosphatase of Escherichia coli (AP). In composition of recombinant LF substrate in addition to alkaline phosphotase and specific for LF substrate sequence RRKKVYPYPME, there is a peptide which is biotinilated in vivo and in vitro by means of biotin-ligase of E.coli and ensuring substrate immobilisation on solid phase (plaque surface) due to interaction with avidin and its derivatives, and sequence of six histidines for purification of recombinant substrate from periplasm of E.coli by means of metal-chelate resin.

EFFECT: method in accordance with the invention possesses high sensitivity, with application of fluorescein diphosphate makes it possible to detect up to 1 pM of lethal factor, rapidity of execution, high specificity, low risk of false-positive signals.

1 dwg, 3 ex

Description

Изобретение относится к биотехнологии, конкретно к областям биомедицины, биоскрининга и разработки способов диагностики на основе искусственных репортерных биомолекул, касается нового способа высокочувствительной детекции каталитически активного белка летального фактора сибирской язвы LF; способа амплификации сигнала, образуемого при расщеплении субстрата низкоэффективным протеолитическим ферментом.The invention relates to biotechnology, specifically to the fields of biomedicine, bioscreening and the development of diagnostic methods based on artificial reporter biomolecules, relates to a new method for the highly sensitive detection of catalytically active protein of anthrax factor LF; a method for amplifying a signal generated by cleavage of a substrate by a low-efficient proteolytic enzyme.

Основной областью применения технологии высокочувствительного способа определения активного белка LF являются биологические исследования, биомедицина и разработка лекарств. Определение активности LF в окружающей среде и биологических жидкостях может иметь важное значение как для борьбы с локальными вспышками заболевания, так и для быстрой нейтрализации последствий возможных биотеррористических актов с использованием бактерий или спор бактерий сибирской язвы. Возможность специфической детекции микроколичеств LF критически важна для ранней диагностики сибиреязвенной инфекции и для ранней детекции присутствия вирулентных бактерий в окружающей среде. Метод детекции сибирской язвы, основанный на определении активности LF, позволит избежать ложноположительных сигналов от различных высокотехнологичных муляжей патогена, таких как убитые бактерии или препараты ДНК сибиреязвенных бацилл.The main area of application of the technology of the highly sensitive method for determining the active LF protein is biological research, biomedicine and drug development. Determination of LF activity in the environment and biological fluids can be important both for combating local outbreaks of the disease and for quickly neutralizing the effects of possible bioterrorist acts using bacteria or anthrax bacteria spores. The ability to specifically detect LF trace amounts is critical for early diagnosis of anthrax infection and for early detection of the presence of virulent bacteria in the environment. A method for detecting anthrax based on the determination of LF activity will allow avoiding false-positive signals from various high-tech imitations of the pathogen, such as killed bacteria or DNA preparations of anthrax bacilli.

Сибирская язва - инфекционное заболевание, вызываемое токсигенными штаммами граммположительной бактерии Bacillus anthracis. Вирулентность бактерии определяется капсулой, состоящей из поли-D-глютаминовой кислоты, и экзотоксином, включающим в себя три компонента - летальный фактор (LF), протективный антиген (РА) и фактор отечности (EF). По отдельности эти белки не обладают токсическим эффектом, но комбинации LF+PA (летальный токсин) и EF+PA (токсин отечности) приводят к различным патологическим последствиям как у млекопитающих и человека, так и в культуре клеток. Функционально LF сибирской язвы представляет собой Zn²⁺-зависимую металлопротеазу, специфически расщепляющую белки семейства митоген-активируемых протеинкиназ МАРКК (в частности, МЕК1), приводя к лизису клеток, подвергшихся действию токсина под воздействием макрофагов. Проводились исследования ферментативной активности LF, его субстратной специфичности, его трехмерной структуры. Было продемонстрировано, что летальный фактор сибирской язвы (LF), наряду с протективным антигеном (РА), представляет собой важнейший компонент летального токсина сибирской язвы и является основным фактором, определяющим летальный исход при сибиреязвенной инфекции (Young JA, Collier RJ (2007) Annu Rev Biochem, 76, 243-265).Anthrax - an infectious disease caused by toxigenic strains of gram-positive bacteria Bacillus anthracis. Bacterial virulence is determined by a capsule consisting of poly-D-glutamic acid and exotoxin, which includes three components - lethal factor (LF), protective antigen (RA) and swelling factor (EF). Separately, these proteins do not have a toxic effect, but combinations of LF + PA (lethal toxin) and EF + PA (puffiness toxin) lead to various pathological consequences both in mammals and humans, and in cell culture. Functionally, anthrax LF is a Zn ²⁺ -dependent metalloprotease that specifically cleaves the proteins of the family of mitogen-activated protein kinases MAPKK (in particular, MEK1), leading to the lysis of cells exposed to the toxin under the influence of macrophages. Studies were carried out on the enzymatic activity of LF, its substrate specificity, and its three-dimensional structure. It has been demonstrated that anthrax lethal factor (LF), along with a protective antigen (RA), is an essential component of anthrax lethal toxin and is a major determinant of fatal outcome in anthrax infection (Young JA, Collier RJ (2007) Annu Rev Biochem 76, 243-265).

Известны способы определения сибиреязвенной инфекции, основанные на детекции LF или других компонентов сибиреязвенного токсина с использованием стандартных методов иммуноферментного анализа (ИФА) (www.anaspec.com, Anthrax Detection Set, каталожный номер 54312; Бондарев В.П. с соавт.(2007) Разработка иммуноферментной моноклональной тест-системы для обнаружения протективного антигена Bacillus anthracis. Пробл. особо-опасных инфекций, 93, с.66-69). Известен способ определения наличия LF методом ИФА на основе лантанидной детекции (Tang S, Moayeri M, Chen Z, Harma H, Zhao J, Hu H, Purcell RH, Leppla SH, Hewlett IK. (2009) Clin Vaccine Immunol, 16, 408-413). Иммуноферментные способы детекции сибиреязвенных антигенов могут рассматриваться как важный компонент комплексной диагностики, но принципы ИФА не позволяют определить наличие протеолитической активности LF - главной патогенной детерминанты сибирской язвы или изолированного сибиреязвенного токсина. ИФА не дает возможность дифференцировать возбудитель сибирской язвы от молекулярных муляжей патогена (например, рекомбинантных фрагментов LF или убитых бацилл сибирской язвы), которые могут быть применены в биотеррористических актах. Кроме того, для методов ИФА характерен высокий фоновый сигнал, нивелировать который в случае анализа полевых образцов, содержащих значительное количество разнородных примесей, не представляется возможным.Known methods for determining anthrax infection, based on the detection of LF or other components of anthrax ulcer toxin using standard enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) (www.anaspec.com, Anthrax Detection Set, catalog number 54312; Bondarev V.P. et al. (2007) Development of an enzyme-linked immunosorbent monoclonal test system for the detection of the protective antigen Bacillus anthracis. Probl. Especially dangerous infections, 93, p.66-69). A known method for determining the presence of LF by ELISA based on lanthanide detection (Tang S, Moayeri M, Chen Z, Harma H, Zhao J, Hu H, Purcell RH, Leppla SH, Hewlett IK. (2009) Clin Vaccine Immunol, 16, 408- 413). Enzyme-linked immunosorbent methods for the detection of anthrax antigens can be considered as an important component of a comprehensive diagnosis, but the principles of ELISA cannot determine the presence of the proteolytic activity of LF, the main pathogenic determinant of anthrax or an isolated anthrax toxin. ELISA does not allow differentiating the causative agent of anthrax from molecular models of the pathogen (for example, recombinant LF fragments or killed anthrax bacilli), which can be used in bioterrorist acts. In addition, ELISA methods are characterized by a high background signal, which is not possible to level out in the case of analysis of field samples containing a significant amount of heterogeneous impurities.

Известны способы детекции активности LF, основанные на стандартных методах определения протеолитической активности с применением хромогенных и флюорогенных пептидных субстратов (Merck, каталожные номера 176902, 176904, 176903). Чувствительность флюоресцентных субстратов LF выше, чем колориметрических (детектируют до 5-10 пМ LF), но она не достаточна для обнаружения инфекции на достаточно ранних стадиях заражения сибирской язвой, что ограничивает возможности проведения своевременной терапии.Known methods for detecting LF activity based on standard methods for determining proteolytic activity using chromogenic and fluorogenic peptide substrates (Merck, catalog numbers 176902, 176904, 176903). The sensitivity of fluorescent LF substrates is higher than colorimetric (detect up to 5-10 pM LF), but it is not sufficient to detect infection at an early stage of anthrax infection, which limits the possibility of timely therapy.

Известны способы определения активности LF методом белкового или пептидного FRET (резонансного переноса энергии Форстера), но эти методы имеют достаточно низкую чувствительность, что объясняется длиной пептидного субстрата LF, превышающей эффективную область радиуса Форстера для большинства красителей и ограничивающей тем самым эффективность FRET. Невысокая каталитическая эффективность расщепления известных субстратов LF в еще большей степени снижает общую чувствительность прямого определения активности LF методом FRET (Cummings RT, Salowe SP, Cunningham BR, Wiltsie J, Park YW, Sonatore LM, Wisniewski D, Douglas CM, Hermes JD, Scolnick EM. (2002) Proc Natl Acad Sci USA, 99, 6603-6603).Known methods for determining the activity of LF by protein or peptide FRET (Forster resonance energy transfer), but these methods have a fairly low sensitivity, which is explained by the length of the peptide substrate LF, exceeding the effective region of the Forster radius for most dyes and thereby limiting the effectiveness of FRET. The low catalytic efficiency of the cleavage of known LF substrates further reduces the overall sensitivity of the direct determination of LF activity by FRET (Cummings RT, Salowe SP, Cunningham BR, Wiltsie J, Park YW, Sonatore LM, Wisniewski D, Douglas CM, Hermes JD, Scolnick EM . (2002) Proc Natl Acad Sci USA, 99, 6603-6603).

Известен наиболее близкий к заявленному способ детекции активного LF, базирующийся на амплификации сигнала, предложенный компанией Quickzyme (http://www.tno.co.jp/Pharma/Protease_111a.pdf). Этот метод использует сопряженно-амплифицирующую систему детекции на основе активации урокиназы и обеспечивает в 1000 раз большую чувствительность, чем детекция летального фактора при помощи FRET с применением флюорогенных пептидных субстратов. Недостатком этого метода является необходимость дорогостоящей продукции белковых компонентов системы в эукариотических клетках, а также относительно невысокая скорость работы этой протеазы, снижающая общую чувствительность метода. При применении этой системы не исключены и ложноположительные сигналы, поскольку урокиназа не полностью ингибирована в нерасщепленном состоянии и может активироваться неспецифически или при хранении. Длина и аминокислотный состав пептида, встраиваемого в N-концевую область урокиназы, весьма ограничены; пептиды с увеличенной длиной или повышенной гидрофобностью, а также со значительным положительным зарядом (что характерно для высокоэффективных субстратов LF), могут нарушить фолдинг и активацию урокиназы и ее зимогена.Known closest to the claimed method for detecting active LF, based on signal amplification, proposed by Quickzyme (http://www.tno.co.jp/Pharma/Protease_111a.pdf). This method uses a coupled amplification detection system based on the activation of urokinase and provides 1000 times greater sensitivity than the detection of lethal factor using FRET using fluorogenic peptide substrates. The disadvantage of this method is the need for expensive production of protein components of the system in eukaryotic cells, as well as the relatively low speed of this protease, which reduces the overall sensitivity of the method. When using this system, false-positive signals are not excluded, since urokinase is not completely inhibited in an unsplit state and can be activated non-specifically or during storage. The length and amino acid composition of the peptide inserted into the N-terminal region of urokinase is very limited; peptides with an increased length or increased hydrophobicity, as well as with a significant positive charge (which is typical for highly efficient LF substrates), can disrupt the folding and activation of urokinase and its zymogen.

Изобретение решает задачу разработки высокочувствительного способа определения присутствия каталитически активного летального фактора сибирской язвы в биологических жидкостях, полученных от инфицированных людей или животных, а также из окружающей среды, содержащей вегетативные формы возбудителя сибирской язвы.The invention solves the problem of developing a highly sensitive method for determining the presence of a catalytically active lethal factor of anthrax in biological fluids obtained from infected people or animals, as well as from the environment containing vegetative forms of the anthrax causative agent.

Поскольку каталитическая активность LF по отношению к пептидным субстратам, выделенным из его природных мишеней, весьма невысока, для достижения высокой чувствительности метода в изобретении используется новый подход амплификации сигнала, свидетельствующего об акте протеолиза.Since the catalytic activity of LF with respect to peptide substrates isolated from its natural targets is very low, in order to achieve high sensitivity of the method, the invention uses a new signal amplification approach indicative of an act of proteolysis.

Поставленная задача решается за счет способа детекции активности летального фактора с помощью слитого белка-субстрата летального фактора сибирской язвы, содержащего в своем составе щелочную фосфатазу в Escherichia coli, обработку очищенного продукта белка-субстрата биотин-лигазой в присутствии свободного биотина и АТФ, иммобилизацию биотинилированнного по лизину-19 слитого белка щелочной фосфатазы, обработку данного иммобилизованного белка препаратом, содержащим LF, отбор перешедшего в раствор слитого белка щелочной фосфатазы и детекцию активности щелочной фосфатазы с использованием флюоресцентного или хемилюминесцентного метода.The problem is solved by a method for detecting the activity of a lethal factor using a fusion protein substrate of a lethal factor of anthrax containing alkaline phosphatase in Escherichia coli, processing the purified product of the protein substrate by biotin ligase in the presence of free biotin and ATP, immobilization of biotinylated by lysine-19 of an alkaline phosphatase fusion protein, treatment of this immobilized protein with a preparation containing LF, selection of an alkaline phosphatase fusion protein transferred to a solution, and act detection evidence of alkaline phosphatase using a fluorescent or chemiluminescent method.

В качестве субстрата для детекции протеолитической активности летального фактора может быть использован биотинилированный рекомбинантный слитый белок на основе модифицированной щелочной фосфатазы Escherichia coli, имеющего в своем составе пептид RRKKVYPYPME, являющийся чувствительным субстратом летального фактора сибирской язвы.A biotinylated recombinant fusion protein based on modified alkaline phosphatase Escherichia coli containing the peptide RRKKVYPYPME, which is a sensitive substrate of anthrax lethal factor, can be used as a substrate for detecting the proteolytic activity of a lethal factor.

Также задача решается применением нового принципа амплификации сигнала, происходящего от акта разрезания субстрата протеазой, за счет каталитической активности репортерного фермента щелочной фосфатазы.The problem is also solved by applying the new principle of amplification of the signal resulting from the act of cutting the substrate with a protease due to the catalytic activity of the reporter enzyme alkaline phosphatase.

Кроме того, задача решается за счет моноклональных антител, специфичных к N-концевому домену летального фактора, ответственному за связывание с протективным антигеном и не препятствующему каталитической активности LF.In addition, the problem is solved by monoclonal antibodies specific for the N-terminal domain of the lethal factor, which is responsible for binding to the protective antigen and does not interfere with the catalytic activity of LF.

Также задача решается за счет применения твердофазного формата анализа, который позволяет быстро и эффективно проводить тестирование большого количества образцов.Also, the problem is solved by using a solid-phase analysis format, which allows you to quickly and efficiently test a large number of samples.

А также задача решается за счет эффективного определения ферментативной активности белка щелочной фосфатазы, находящегося в составе субстрата LF, с использованием высокочувствительных флюоресцентных или хемилюминесцентных субстратов.And also the problem is solved by effectively determining the enzymatic activity of the alkaline phosphatase protein, which is part of the LF substrate, using highly sensitive fluorescent or chemiluminescent substrates.

Техническим результатом изобретения является создание эффективного и высокочувствительного способа определения сибиреязвенной инфекции на основе детекции каталитической активности летального фактора сибирской язвы, применимого для нужд клинической диагностики и широкоформатного скрининга химических библиотек. С использованием разработанного метода можно детектировать летальный фактор сибирской язвы в концентрации до 1 пМ.The technical result of the invention is the creation of an effective and highly sensitive method for determining anthrax infection based on the detection of the catalytic activity of the lethal factor of anthrax, applicable for the needs of clinical diagnosis and large-format screening of chemical libraries. Using the developed method, it is possible to detect the lethal factor of anthrax in a concentration of up to 1 pM.

В предлагаемом техническом решении в качестве субстрата LF применяют биотинилированный рекомбинантный слитый белок на основе модифицированной щелочной фосфатазы Escherichia coli, объединяющий в составе одной полипептидной цепи лидерный пептид щелочной фосфатазы Escherichia coli, 6 первых аминокислотных остатков зрелой щелочной фосфатазы, пептид NPGGLNDIFEAQKIEWHED, содержащий сайт для специфического биотинилирования остатка лизина-13 в составе этого пептида ферментом биотин-лигаза из Escherichia coli, спейсерный пептид, высокоэффективный субстратный пептид для LF RRKKVYPYPME и домен, содержащий активный центр фосфатазы, модифицированный внесением мутаций D153G и D330N, повышающих каталитическую эффективность фосфатазы более чем в 30 раз (Muller BH, Lamoure С, Le Du MH, Cattolico L, Lajeunesse E, Lemaître F, Pearson A, Ducancel F, Ménez A, Boulain J-C. (2001) ChemBioChem, 2, 517-523).In the proposed technical solution, a biotinylated recombinant fusion protein based on modified Escherichia coli alkaline phosphatase is used as an LF substrate, combining the leader peptide of alkaline phosphatase Escherichia coli, the first 6 amino acid residues of mature alkaline phosphatase, the NPGGLNEWIFEEQ peptide, of lysine-13 residue in the composition of this peptide by the biotin ligase enzyme from Escherichia coli, spacer peptide, highly effective substrate peptide for LF RRK KVYPYPME and a domain containing an active phosphatase center modified by introducing D153G and D330N mutations that increase the catalytic efficiency of phosphatase by more than 30 times (Muller BH, Lamoure C, Le Du MH, Cattolico L, Lajeunesse E, Lemaître F, Pearson A, Dearance A, Dear , Ménez A, Boulain JC. (2001) ChemBioChem, 2, 517-523).

Щелочная фосфатаза E.coli (АР), примененная в данной системе детекции в качестве репортерного фермента, является белком с молекулярной массой 94 кДа, секретируемым в периплазматическое пространство бактерии и содержащим дисульфидные связи. Показано, что N-концевая область АР в районе 20-30-го аминокислотного остатка не является существенной для каталитической активности и может быть разделена на различные домены путем внесения в эту область пептидного или белкового линкера длиной от 1 до 300-400 аминокислотных остатков (Clin Chem, (1994) 40, 688-704), таким образом, оказывается возможным внесение в эту зону различных функционально-активных элементов. Помимо высокой каталитической эффективности щелочная фосфатаза обладает сравнительной температурной и рН-стабильностью, а также устойчивостью к неспецифическому протеолизу, что обусловливает перспективность его использования в качестве репортерного фермента для повышения чувствительности метода. Принципиальным преимуществом использования щелочной фосфатазы в качестве репортера является также наличие коммерчески доступных высокочувствительных специфических колориметрических или флюоресцентных субстратов для щелочной фосфатазы, таких как пара-нитрофенилфосфат (pNPP), флюоресцеин-дифосфат, 9Н-(1,3дихлоро-9,9-диметилакридин-2-один-7-ил) фосфат (DDAO фосфата), 6,8-дифлюоро-4-метил умбеллиферилфосфат (DiFMUP), 4-метилумбеллиферил фосфата (MUP) и их производных (http://probes.invitrogen.com/media/pis/mp02999.pdf).E. coli alkaline phosphatase (AP), used as a reporter enzyme in this detection system, is a protein with a molecular weight of 94 kDa, secreted into the periplasmic space of the bacterium and containing disulfide bonds. It was shown that the N-terminal region of AR in the region of the 20-30th amino acid residue is not essential for catalytic activity and can be divided into different domains by introducing a peptide or protein linker from 1 to 300-400 amino acid residues in this region (Clin Chem, (1994) 40, 688-704), thus, it is possible to introduce various functionally active elements into this zone. In addition to the high catalytic efficiency, alkaline phosphatase has comparative temperature and pH stability, as well as resistance to non-specific proteolysis, which makes it promising to use it as a reporter enzyme to increase the sensitivity of the method. The principal advantage of using alkaline phosphatase as a reporter is also the presence of commercially available highly sensitive specific colorimetric or fluorescent substrates for alkaline phosphatase, such as para-nitrophenyl phosphate (pNPP), fluorescein diphosphate, 9H- (1,3-dichloro-9,9-dimethylacrid -inodin-7-yl) phosphate (DDAO phosphate), 6,8-difluoro-4-methyl umbelliferyl phosphate (DiFMUP), 4-methylumbelliferyl phosphate (MUP) and their derivatives (http://probes.invitrogen.com/media/ pis / mp02999.pdf).

Важным условием успешного технического решения поставленной задачи определения минимальных количеств летального фактора в биологических образцах является использование антител, специфичных к N-концевому домену летального фактора, ответственному за связывание с протективным антигеном и не препятствующему каталитической активности LF (Белова Е.В., Колесников А.В., Захарова М.Ю., Дубилей С.А., Дятлов И.А., Шемякин И.Г. (2007) Биоорг. химия, (2008) 34, 639-644). Применение этих антител позволяет сконцентрировать LF преципитацией из культуральных или биологических жидкостей без потери каталитической активности.An important condition for the successful technical solution of the problem of determining the minimum amounts of lethal factor in biological samples is the use of antibodies specific to the N-terminal domain of the lethal factor, which is responsible for binding to the protective antigen and does not interfere with the catalytic activity of LF (Belova E.V., Kolesnikov A. V., Zakharova M.Yu., Dubiley S.A., Dyatlov I.A., Shemyakin I.G. (2007) Bioorg.chemistry, (2008) 34, 639-644). The use of these antibodies allows LF to be concentrated by precipitation from culture or body fluids without loss of catalytic activity.

Существенным достоинством предлагаемого метода является твердофазный формат проведения тестов, который допускает проведение автоматизации этого способа детекции активности LF. Связывание субстрата происходит за счет взаимодействия биотина субстрата LF и белков авидинового ряда, иммобилизованных на твердой фазе. В стандартном случае в качестве матрицы используют иммунологические планшеты, покрытые авидином или его производными. Кроме микропланшет и микрострипов, предпочтительными матрицами для иммобилизации LF являются нагруженные нейтравидином, или стрептавидином, или авидином, или иными биотин-связывающими субстанциями 1) парамагнитные микросферы или микрочастицы; 2) немагнитные пористые и непористые полимерные микросферы и микрочастицы; микрочастицы, образуемые коллоидным золотом; 3) квантовые точки; 4) пористые и непористые полимерные поверхности; 5) рабочие поверхности биосенсоров. В силу возможности автоматизации, разработанный метод оказывается применимым для нужд широкоформатного скрининга библиотек потенциальных химических ингибиторов активности летального фактора сибирской язвы, что имеет важное значение для разработки новых терапевтических агентов против сибиреязвенной инфекции.A significant advantage of the proposed method is the solid-phase test format, which allows automation of this method for detecting LF activity. The binding of the substrate occurs due to the interaction of the biotin of the substrate LF and the avidin series proteins immobilized on the solid phase. In the standard case, immunological tablets coated with avidin or its derivatives are used as a matrix. In addition to microplates and microstrips, preferred matrices for LF immobilization are loaded with neutravidin, or streptavidin, or avidin, or other biotin-binding substances 1) paramagnetic microspheres or microparticles; 2) non-magnetic porous and non-porous polymer microspheres and microparticles; microparticles formed by colloidal gold; 3) quantum dots; 4) porous and non-porous polymer surfaces; 5) working surfaces of biosensors. Due to the possibility of automation, the developed method is applicable to the needs of large-format screening of libraries of potential chemical inhibitors of the activity of the lethal factor of anthrax, which is important for the development of new therapeutic agents against anthrax infection.

К преимуществам заявленного способа определения сибиреязвенной инфекции относятся: 1) высокая чувствительность метода и его гомологичность в части реагентов, материалов и оборудования стандартному иммуноферментному анализу, применяемому в клинической практике; 2) устойчивость к ложноположительным сигналам и к возможным молекулярным муляжам патогена, что позволяет сэкономить огромные средства в случае необходимости принятия/непринятия решения о возможной атаке бактериологическим оружием или эпидемии и связанным с этим запуском комплекса дорогостоящих мер; 3) возможность широкого использования существующих и разработанных в будущем субстратов LF без существенных ограничений по длине пептидной цепи и аминокислотному составу; 4) дешевизна используемых рекомбинантных белков, которые продуцируются на основе стандартных экспрессионных систем Escherichia coli, а не дорогостоящих эукариотических систем; 5) высокая специфичность детекции LF и низкая вероятность получения ложноположительных сигналов по сравнению с методами высокочувствительной ИФА.The advantages of the claimed method for determining anthrax infection include: 1) high sensitivity of the method and its homology in terms of reagents, materials and equipment, standard enzyme immunoassay used in clinical practice; 2) resistance to false positive signals and to possible molecular imitations of the pathogen, which saves a lot of money if it is necessary to make / not decide on a possible attack with a bacteriological weapon or an epidemic and the launch of a complex of costly measures; 3) the possibility of widespread use of existing and developed in the future LF substrates without significant restrictions on the length of the peptide chain and amino acid composition; 4) the cheapness of the used recombinant proteins that are produced on the basis of standard expression systems of Escherichia coli, and not expensive eukaryotic systems; 5) high specificity of LF detection and low probability of receiving false-positive signals in comparison with methods of highly sensitive ELISA.

Изобретение осуществляют следующим образом.The invention is as follows.

Биотинилированный рекомбинантный слитный белок на основе модифицированной щелочной фосфатазы иммобилизуют на микропланшетах или микрострипах для ИФА, покрытых авидином или его производными.Modified alkaline phosphatase-based biotinylated recombinant protein is immobilized on microplates or ELISA microstrips coated with avidin or its derivatives.

Летальный фактор выделяют из диагностируемых образцов иммунопреципитацией с моноклональным антителом к LF (Ig) с последующей сорбцией комплексов LF-Ig стафилококковым белком G, либо стрептококковым белком А, иммобилизованными на магнитных частицах или на сорбенте либо находящимися в виде комплексов с клеточными стенками стафилококков (Pansorbin^ТМ). Комплекс LF-Ig-иммобилизованный белок (А или G) отмывают от примесей, а затем разрушают добавлением мягкого хаотропного агента, не влияющего на каталитическую активность LF.Lethal factor isolated from diagnosable immunoprecipitation samples with monoclonal antibody to the LF (Ig) with subsequent sorption complexes LF-Ig staphylococcal protein G, or streptococcal protein A-immobilized magnetic particles or on the sorbent, or are in the form of complexes with cell walls of staphylococci (Pansorbin ^TM ) The complex LF-Ig-immobilized protein (A or G) is washed away from impurities and then destroyed by the addition of a mild chaotropic agent that does not affect the catalytic activity of LF.

К иммобилизованному на микропланшетах или микрострипах слитному белку, содержащему субстрат LF и щелочную фосфатазу, добавляют выделенный из образца LF и инкубируют 2 часа при 37°С. По окончании инкубации жидкую и твердую фазы разделяют. К полученной жидкой фазе добавляют колориметрический, флюорогенный или хемилюминесцентный субстрат для щелочной фосфатазы. Присутствие и концентрацию каталитически активного LF определяют по наличию сигнала от щелочной фосфатазы, элюированной в раствор после отрезания биотинилированного компонента LF в сравнении с калибровочной кривой, построенной для различных концентраций LF с использованием этого метода. Принципиальная схема осуществления изобретения приведена на чертеже.The fusion protein containing LF substrate and alkaline phosphatase is immobilized on microplates or microstrips and the LF extracted from the sample is added and incubated for 2 hours at 37 ° C. At the end of the incubation, the liquid and solid phases are separated. A colorimetric, fluorogenic or chemiluminescent alkaline phosphatase substrate is added to the obtained liquid phase. The presence and concentration of catalytically active LF is determined by the presence of a signal from alkaline phosphatase eluted into the solution after cutting off the biotinylated LF component in comparison with a calibration curve constructed for different LF concentrations using this method. A schematic diagram of an embodiment of the invention is shown in the drawing.

Изобретение иллюстрируют следующие графические материалы:The invention is illustrated by the following graphic materials:

Чертеж-схема определения присутствия летального фактора сибирской язвы в растворе на основе амплификационной детекции протеолитической активности летального фактора.A drawing is a diagram for determining the presence of anthrax lethal factor in a solution based on amplification detection of the proteolytic activity of a lethal factor.

Изобретение иллюстрируют примеры.The invention is illustrated by examples.

Пример 1Example 1

Подготовка образцов крови мышей, инфицированных Bacillus anthracis, и иммунопреципитация летального фактора из плазмы крови мышейPreparation of blood samples of mice infected with Bacillus anthracis and immunoprecipitation of lethal factor from the blood plasma of mice

У мышей линии BALB/c, инфицированных микробными клетками Bacillus anthracis вакцинного штамма сибирской язвы СТИ-1, начиная с 4 часов от момента внесения инфекции до момента гибели с интервалом в 3 часа, забирают кровь по 100 мкл из хвостовой вены. Образцы крови при заборе смешивают с 10 мкл 20 мМ гепарин сульфата для предотвращения свертывания крови. Клетки крови отделяют центрифугированием при 2000 об/мин, плазму крови разводят в 4 раза буфером, содержащим 20 мМ трис-HCl рН 8, 100 мМ NaCl и 1 мМ PMSF. Образцы плазмы смешивают с иммобилизованными на сефарозе моноклональными антителами, специфичными к специфичных к N-концевому домену летального фактора, ответственному за связывание с протективным антигеном и не препятствующему каталитической активности LF. Сорбент с антителами добавляют из расчета 100 мкл на 0.2 мл плазмы крови, емкость сорбента составляет 500 мкг LF на 1 мл смолы. Сорбент троекратно промывают буфером, содержащим 20 мМ трис-HCl рН 8, 100 мМ NaCl. Элюцию летального фактора проводят с буфером Gentle Ag/Ab Elution Buffer (Pierce). Элюат с сорбента, содержащий LF, сразу используют для определения активности летального фактора либо замораживают для хранения при -70°С.In BALB / c mice infected with microbial cells of the Bacillus anthracis vaccine strain of anthrax STI-1, starting from 4 hours from the moment of infection until death at an interval of 3 hours, 100 μl of blood is taken from the tail vein. Blood samples at sampling are mixed with 10 μl of 20 mM heparin sulfate to prevent blood coagulation. Blood cells are separated by centrifugation at 2000 rpm, the blood plasma is diluted 4 times with buffer containing 20 mm Tris-HCl pH 8, 100 mm NaCl and 1 mm PMSF. Plasma samples are mixed with Sepharose-immobilized monoclonal antibodies specific for the N-terminal domain of the lethal factor responsible for binding to the protective antigen and not inhibiting the catalytic activity of LF. The sorbent with antibodies is added at the rate of 100 μl per 0.2 ml of blood plasma, the capacity of the sorbent is 500 μg LF per 1 ml of resin. The sorbent is washed three times with buffer containing 20 mm Tris-HCl pH 8, 100 mm NaCl. Elution of the lethal factor is carried out with Gentle Ag / Ab Elution Buffer (Pierce). The eluate from the sorbent containing LF is immediately used to determine the activity of the lethal factor or frozen for storage at -70 ° C.

Пример 2Example 2

Иммобилизация на планшетах слитого репортерного субстрата LF на основе щелочной фосфатазыAlkaline phosphatase-based fusion reporter substrate LF immobilization on plates

Нейтравидин иммобилизуют на 96-луночных планшетах для иммуноферментного анализа (NUNC). Для этого на планшеты наносят раствор 0.1 М карбоната натрия рН 9, содержащий 50 мкг/мл нейтравидина (Pierce) из расчета 5 мкг нейтравидина на лунку планшета. Инкубируют планшет при 37°С 2 часа со встряхиванием. Удаляют из лунок раствор нейтравидина. Блокируют свободные валентности поверхности планшета раствором 1% бычьего сывороточного альбумина в 50 мМ трис-HCl рН 7.5, 50 мМ NaCl при 37°С при встряхивании в течение 1 часа. По окончании инкубации планшет трижды промывают раствором 50 мМ трис-HCl рН 7.5, 50 мМ NaCl и добавляют раствор биотинилированного репортерного субстрата LF на основе щелочной фосфатазы из расчета 5 мкг субстратного белка на лунку планшета и инкубируют при 37°С в течение 30 минут для связывания субстрата с нейтравидином. По окончании инкубации лунки планшета трижды промывают по 5 минут со встряхиванием буфером для LF для удаления несвязавшегося субстрата.Neutravidin is immobilized on 96-well plates for enzyme-linked immunosorbent assay (NUNC). To do this, a solution of 0.1 M sodium carbonate pH 9 containing 50 μg / ml neutravidin (Pierce) is applied to the tablets at the rate of 5 μg neutravidin per well of the tablet. Incubate the plate at 37 ° C for 2 hours with shaking. Remove the neutravidin solution from the wells. Free valencies of the tablet surface are blocked with a solution of 1% bovine serum albumin in 50 mM Tris-HCl pH 7.5, 50 mM NaCl at 37 ° C with shaking for 1 hour. At the end of the incubation, the plate is washed three times with a solution of 50 mM Tris-HCl pH 7.5, 50 mM NaCl and a solution of alkaline phosphatase-based biotinylated reporter substrate LF is added at the rate of 5 μg of substrate protein per well of the plate and incubated at 37 ° C for 30 minutes to bind substrate with neutravidin. At the end of the incubation, the wells of the plate were washed three times for 5 minutes with shaking with LF buffer to remove unbound substrate.

Пример 3Example 3

Определение летального фактора в раствореDetermination of lethal factor in solution

На планшет с иммобилизованным на нейтравидине слитным репортерным субстратом LF на основе щелочной фосфатазы наносят различные разведения (1:2, 1:5, 1:10, 1:50, 1:100, 1:500, 1:1000) преципитированного при помощи моноклональных антител из плазмы крови мышей, инфицированных Bacillus anthracis, белка LF в 100 мкл буфера для LF, содержащего 50 мМ HEPES рН 7, 20 микромоль ZnCl₂ и EDTA-free ингибитор протеаз (Roche), и инкубируют планшет в течение 2 часов при температуре 37°С. В контрольные лунки LF не добавляют. Для построения калибровочной кривой в отдельные лунки наносят активный белок LF (получение активного фермента летального фактора -патент РФ №2355769), раститрованный в известных концентрациях от 1 до 1500 пМ. По окончании инкубации из лунок переносят супернатант в новый планшет и добавляют флюоресцентный субстрат щелочной фосфатазы флюоресцеин дифосфат. Измерения проводят на флюорометре (Тесаn, Genios) при соотношении длин волн экстинкции/эмиссии 470/540. Минимальное значение флюоресценции, заведомо превышающее контрольное, соответствует минимальной детектируемой с применением данного метода концентрации фермента летального фактора и наблюдается при концентрации 1 пМ. Содержание LF в плазме крови инфицированных мышей рассчитывается на основе построенной калибровочной кривой. Концентрация LF в плазме крови инфицированных мышей нарастает по мере развития инфекции от 4 часов (начала забора образцов крови) до 48 часов (момента гибели животного), составляя в момент первого забора крови 1 пМ, а в момент гибели животного 3 нМ.Various dilutions (1: 2, 1: 5, 1:10, 1:50, 1: 100, 1: 500, 1: 1000) precipitated using monoclonal monoclonal are applied on a tablet with an alkaline phosphatase immobilized on neutravidin fused reporter substrate LF antibodies from the blood plasma of mice infected with Bacillus anthracis, LF protein in 100 μl LF buffer containing 50 mM HEPES pH 7, 20 micromoles ZnCl ₂ and an EDTA-free protease inhibitor (Roche), and the plate is incubated for 2 hours at 37 ° C. LF is not added to control wells. To build a calibration curve, LF active protein is applied to individual wells (production of the active enzyme of the lethal factor — RF patent No. 2355769), cultivated in known concentrations from 1 to 1500 pM. At the end of the incubation, the supernatant is transferred from the wells to a new plate and the fluorescent alkaline phosphatase substrate fluorescein diphosphate is added. Measurements are carried out on a fluorometer (Tesan, Genios) with an extinction / emission wavelength ratio of 470/540. The minimum value of fluorescence, obviously exceeding the control, corresponds to the minimum concentration of the lethal factor enzyme detected using this method and is observed at a concentration of 1 pM. The plasma LF content of infected mice is calculated based on the constructed calibration curve. The concentration of LF in the blood plasma of infected mice increases as the infection develops from 4 hours (the start of blood sampling) to 48 hours (the time of the death of the animal), amounting to 1 pM at the time of the first blood sampling and 3 nM at the time of the death of the animal.

Claims (1)

Способ определения присутствия в среде и биологических жидкостях сибиреязвенного патогена, включающий иммобилизацию на микропланшетах или микрострипах для иммуноферментного анализа, покрытых авидином или его производными, биотинилированного рекомбинантного слитого белка на основе модифицированной щелочной фосфатазы Escherichia coli, имеющего в своем составе биотинилирующийся пептид NPGGLNDIFEAQKIEWHED, а также пептид RRKKVYPYPME, являющийся чувствительным субстратом летального фактора сибирской язвы и расположенный между биотинилирующимся пептидом и каталитическим доменом щелочной фосфатазы, выделение летального фактора из диагностируемых образцов иммунопреципитацией с моноклональным антителом к летальному фактору, сорбцию комплексов летальный фактор-антитело стафилококковым белком G либо стрептококковым белком А, иммобилизованным на магнитных частицах или на сорбенте, либо находящимся в виде комплексов с клеточными стенками стафилококков, добавление выделенного летального фактора к иммобилизованному слитому белку, инкубирование в течение 2 ч при 37°С, разделение жидкой и твердой фазы, добавление к жидкой фазе колориметрического, флюорогенного или хемилюминесцентного субстрата для щелочной фосфатазы и определение каталитически активного летального фактора по наличию сигнала от щелочной фосфатазы, элюированной в раствор после отрезания биотинилированного компонента летального фактора, в сравнении с калибровочной кривой, построенной для различных концентраций летального фактора сибирской язвы. A method for determining the presence in an environment and biological fluids of an anthrax pathogen, including immobilization on microplates or microstrips for enzyme-linked immunosorbent assay, coated with avidin or its derivatives, a biotinylated recombinant fusion protein based on a modified alkaline phosphatase Escherichia coli, which contains the biotinylated Q peptide also includes a biotinylated IL peptidylidequid RRKKVYPYPME, which is a sensitive substrate of anthrax lethal factor and located between the biotinylated peptide catalytic domain of alkaline phosphatase, isolation of a lethal factor from diagnosed samples by immunoprecipitation with a monoclonal antibody to a lethal factor, sorption of lethal factor-antibody complexes by staphylococcal protein G or streptococcal protein A immobilized on magnetic particles or on a sorbent, or located in the form of complexes with staph cells with cell walls , adding the selected lethal factor to the immobilized fusion protein, incubation for 2 hours at 37 ° C, separation of liquid and solid phase, adding a colorimetric, fluorogenic or chemiluminescent substrate for alkaline phosphatase to the liquid phase and determining the catalytically active lethal factor by the presence of a signal from alkaline phosphatase eluted into the solution after cutting off the biotinylated component of the lethal factor, in comparison with a calibration curve constructed for different concentrations of lethal anthrax factor.

Images