RU2569196C1 - METHOD TO DETECT AVAILABILITY OF BACTERIA Escherichia coli O157:H7 IN BIOLOGICAL AND FOOD SAMPLES BASED ON IMMUNODETECTION COUPLED WITH POLYMERASE CHAIN REACTION - Google Patents
METHOD TO DETECT AVAILABILITY OF BACTERIA Escherichia coli O157:H7 IN BIOLOGICAL AND FOOD SAMPLES BASED ON IMMUNODETECTION COUPLED WITH POLYMERASE CHAIN REACTION Download PDFInfo
- Publication number
- RU2569196C1 RU2569196C1 RU2014128165/10A RU2014128165A RU2569196C1 RU 2569196 C1 RU2569196 C1 RU 2569196C1 RU 2014128165/10 A RU2014128165/10 A RU 2014128165/10A RU 2014128165 A RU2014128165 A RU 2014128165A RU 2569196 C1 RU2569196 C1 RU 2569196C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- coli
- bacteria
- samples
- dna
- detection
- Prior art date
Links
Images
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
Данное изобретение относится к биотехнологии, конкретно - к областям диагностической медицинской микробиологии, медицинской биохимии, прикладной иммунохимии, касается разработки нового способа высокочувствительного определения клеток Escherichia coli O157:Н7 в инфицированных образцах биологического происхождения и может быть использовано для разработки средств ранней и высокоэффективной специфической диагностики геморрагического колита, санитарно-гигиенического контроля над наличием возбудителя геморрагического колита в продуктах питания и окружающей среде.This invention relates to biotechnology, specifically to the fields of diagnostic medical microbiology, medical biochemistry, applied immunochemistry, it relates to the development of a new method for the highly sensitive determination of Escherichia coli O157: H7 cells in infected samples of biological origin and can be used to develop means for the early and highly effective specific diagnosis of hemorrhagic colitis, sanitary-hygienic control over the presence of the causative agent of hemorrhagic colitis in foods ia and the environment.
Штаммы Escherichia coli O157:Н7 - продуценты веротоксина - вызывают острые кишечные инфекции, осложненные геморрагическим колитом (ГК) и гемолитикоуремическим синдромом (HUS). Основными факторами патогенности серовара O157:Н7 являются веротоксины (шигаподобные токсины) Stx1 и Stx2 (или только Stx2), белок интимин, ответственный за адгезию возбудителя к эпителиальным клеткам кишечника, энтерогемолизин и жгутиковый антиген Н7. Перечисленные факторы патогенности детерминируются соответственно генами stx1, stx2, еае, hly и flic. Указанные гены, а также rfb гены, ответственные за синтез соматического О антигена, являются основными генами-мишенями для диагностических ПЦР-тест-систем, используемых при идентификации серовара E.coli O151:H7 [Fagan, P.K., Hornitzky, M.A., Bettelheim K.A. с соавт. // Appl. Environ. Microbiol. - 1999. - V. 65. - №2. - P. 868-872].Strains of Escherichia coli O157: H7 - producers of verotoxin - cause acute intestinal infections complicated by hemorrhagic colitis (HA) and hemolyticouremic syndrome (HUS). The main pathogenicity factors of serovar O157: H7 are verotoxins (shigapodobny toxins) Stx1 and Stx2 (or only Stx2), the intimin protein responsible for adhesion of the pathogen to intestinal epithelial cells, enterohemolysin and flagellate antigen H7. The listed pathogenicity factors are determined respectively by the stx1, stx2, еае, hly, and flic genes. These genes, as well as the rfb genes responsible for the synthesis of somatic O antigen, are the main target genes for diagnostic PCR test systems used to identify the serovar E. coli O151: H7 [Fagan, PK, Hornitzky, MA, Bettelheim KA c et al. // Appl. Environ. Microbiol. - 1999. - V. 65. - No. 2. - P. 868-872].
В случае иммунологической детекции E.coli O157:Н7 специфичность, как правило, детерминируется уникальной структурой липополисахарида (ЛПС) клеточной стенки бактерий, который является мишенью для моноклональных антител, узнающих бактерию [Westerman, R.B., He, Y., Keen, J.E. с соавт. // J. Clin. Microbiol. - 1997. - V. 35. - №3. - P. 679-684].In the case of immunological detection of E. coli O157: H7, specificity is usually determined by the unique structure of the bacterial cell wall lipopolysaccharide (LPS), which is the target for monoclonal antibodies recognizing the bacterium [Westerman, RB, He, Y., Keen, JE et al. . // J. Clin. Microbiol. - 1997. - V. 35. - No. 3. - P. 679-684].
E.coli O157:H7 обладает высокой устойчивостью к различным условиям окружающей среды. Клетки E.coli O157:Н7 способны приспосабливаться и выживать в почве и воде даже при низких температурах, сохраняться в фекалиях сельскохозяйственных животных в течение 21 месяца, не теряя при этом ни вирулентности, ни способности продуцировать шига-токсины. Кроме того, возбудитель хорошо переносит высушивание и способен размножаться в молочных пищевых продуктах [Kudva, I.T., Blanch, K., Hovde, C.J. // Appl. Environ. Microbiol. - 1998. - Vol. 64; N. 9. - P. 3166-3174; LeJeune, J.T., Besser. Т.Е., Hancock, D.D. // Appl. Environ. Microbiol. - 2001. - Vol. 67; N. 7. - P. 3053-3057]. E.coli O157: H7 is highly resistant to various environmental conditions. E.coli O157: H7 cells are able to adapt and survive in soil and water even at low temperatures, stored in the feces of farm animals for 21 months, without losing either virulence or the ability to produce Shiga toxins. In addition, the pathogen tolerates drying well and is able to multiply in dairy foods [Kudva, IT, Blanch, K., Hovde, CJ // Appl. Environ. Microbiol. - 1998. - Vol. 64; N. 9. - P. 3166-3174; LeJeune, JT, Besser. T.E., Hancock, DD // Appl. Environ. Microbiol. - 2001. - Vol. 67; N. 7. - P. 3053-3057].
Инфекция, вызванная Escherichia coli O157:H7, может представлять серьезную угрозу жизни, особенно для пожилых людей и детей до 5 лет. Первичные симптомы инфекции, вызванной E.coli O157:Н7, от случая к случаю варьируют и являются неспецифичными. Чаще всего наблюдаются спазмы в животе, диарея, рвота, небольшое повышение температуры. Однако с течением инфекции у 5-10% больных развиваются микроангиопатическая гемолитическая анемия, тромбоцитопения и почечная недостаточность, которые могут привести к летальному исходу.Infection caused by Escherichia coli O157: H7 can be a serious life threat, especially for older people and children under 5 years old. The primary symptoms of E. coli O157: H7 infection vary from case to case and are non-specific. Most often, abdominal cramps, diarrhea, vomiting, a slight increase in temperature are observed. However, with the course of infection, 5-10% of patients develop microangiopathic hemolytic anemia, thrombocytopenia, and renal failure, which can lead to death.
Инфицирование человека происходит при употреблении в пищу недостаточно термически обработанных изделий из говядины (котлеты, сосиски, гамбургеры), коровьего молока, майонеза, воды, фруктовых и овощных соков и других продуктов, а также при контакте с крупным рогатым скотом или взаимодействии с фекалиями зараженных животных или людей. Люди заражаются при глотании воды во время купания, а также при употреблении не хлорированной воды [Bryant, H.E., Athar, M.A., Pai, C.H. // J. Infect. Dis. - 1989. - V. 160. - P. 858-864; Karmali, M.A. // Clin. Microbiol. Rev. - 1989. - V. 2. - P. 15-38; Keene, W.E., McAnulty, J.M., Hoesly, F.C. с соавт. // N. Engl. J. Med. - 1994. - V. 331. - №.9. - P. 579-584; Maule, A. // International Food Hygiene. - 1999. - V. 9. - P. 21; Olsen, J.S., Breuer, Т. ссоавт. // Emerg. Infect. Dis. - 2002. - V. 8. - №4. - P. 370].Human infection occurs when eating insufficiently thermally processed products from beef (cutlets, sausages, hamburgers), cow's milk, mayonnaise, water, fruit and vegetable juices and other products, as well as in contact with cattle or in the feces of infected animals or people. People become infected by swallowing water while swimming, as well as drinking non-chlorinated water [Bryant, H.E., Athar, M.A., Pai, C.H. // J. Infect. Dis. - 1989. - V. 160. - P. 858-864; Karmali, M.A. // Clin. Microbiol. Rev. - 1989. - V. 2. - P. 15-38; Keene, W.E., McAnulty, J.M., Hoesly, F.C. et al. // N. Engl. J. Med. - 1994. - V. 331. - No. 9. - P. 579-584; Maule, A. // International Food Hygiene. - 1999. - V. 9. - P. 21; Olsen, J.S., Breuer, T. et al. // Emerg. Infect. Dis. - 2002. - V. 8. - No. 4. - P. 370].
Ранняя диагностика инфекции, вызванная E.coli O157:Н7 при энтерогеморрагическом колите, гемолитикоуремическом синдроме и своевременно примененная терапия обеспечивают благоприятный прогноз исхода заболевания. Применение в клинической практике специфичных и высокочувствительных диагностических тест систем, способных определять крайне низкие концентрации микробных клеток E.coli O157:Н7 на ранних этапах энтерогеморрагического колита, предотвращает риск летального исхода, а для эффективного предотвращения последствий массовых эпидемий или биотеррористических атак необходима разработка способов экспресс-определения единичных клеток E.coli O157:Н7 в сложных биологических и пищевых образцах. Очевидно, что для изучения эпидемической значимости E.coli O157:Н7, путей ее распространения, диагностики заболевания, вопрос совершенствования средств идентификации этого возбудителя чрезвычайно актуален.Early diagnosis of infection caused by E. coli O157: H7 with enterohemorrhagic colitis, hemolyticouremic syndrome and timely treatment provide a favorable prognosis of the disease outcome. The use in clinical practice of specific and highly sensitive diagnostic test systems capable of detecting extremely low concentrations of microbial cells of E.coli O157: H7 in the early stages of enterohemorrhagic colitis prevents the risk of death, and the development of rapid methods is necessary to effectively prevent the effects of mass epidemics or bioterrorist attacks determination of single cells of E.coli O157: H7 in complex biological and food samples. Obviously, to study the epidemic significance of E.coli O157: H7, its distribution, diagnosis of the disease, the question of improving the means of identification of this pathogen is extremely relevant.
В настоящее время основными способами, применяемыми для этиологического определения клеток E.coli O157:Н7, являются микробиологическое определение, иммуноферментный анализ и ПЦР-диагностика. В целом данные способы достаточно эффективны, однако каждый из этих способов детекции возбудителя имеет определенные недостатки.Currently, the main methods used for the etiological determination of E.coli O157: H7 cells are microbiological determination, enzyme immunoassay and PCR diagnostics. In General, these methods are quite effective, however, each of these methods of detection of the pathogen has certain disadvantages.
Известен способ детекции клеток E.coli O157:Н7 на основе иммуноферментного анализа (ИФА)с применением тест-системы «Premier Ε.coli O157» (Meridian Diagnostics, США).A known method for the detection of E.coli O157: H7 cells based on enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) using the test system "Premier Ε.coli O157" (Meridian Diagnostics, USA).
Однако данный способ обладает недостаточной чувствительностью, в частности, при тестировании образцов фекалий [Mackenzie, A.M.R., Lebel, P., Orrbine, E. с соавт. // J. Clin. Microbiol. - 1998. - V. 36. - №6. - Р. 1608-1611].However, this method has insufficient sensitivity, in particular, when testing fecal samples [Mackenzie, A.M.R., Lebel, P., Orrbine, E. et al. // J. Clin. Microbiol. - 1998. - V. 36. - No. 6. - R. 1608-1611].
Известен способ детекции клеток на основе иммунохроматографии с использованием системы «Экспресс-тест для определения E.coli O157:Н7 - Singlepath® E.coli O157» (Merck, США). Данный способ характеризуется быстротой проведения анализа и позволяет провести тестирование образца в течение 20 минут.A known method of cell detection based on immunochromatography using the system "Express test for determination of E. coli O157: H7 - Singlepath® E. coli O157" (Merck, USA). This method is characterized by the speed of analysis and allows you to test the sample within 20 minutes.
Однако способ обладает невысокой чувствительностью и специфичностью и требует этапа обогащения образца наращиванием на селективной среде, который длится в течение 18-24 часов.However, the method has a low sensitivity and specificity and requires the stage of enrichment of the sample by growth on a selective medium, which lasts for 18-24 hours.
Известен иммунохроматографический тест ImmunoCard STAT! Ε.coli O157 Plus (MeridianDiagnostics Inc., США), который позволяет одновременно детектировать О- и Н-антигены E.coli O157:Н7 напрямую в образцах фекалий или после предварительного обогащения на питательных средах [Mackenzie, A., Orrbine, E., Hyde, L. c соавт. // J. Clin. Microbiol. - 2000. - V. 38. - №5. - P. 1866-1868] Известен иммунохроматографический тест RIDA®QUICK Verotoxin/O157 Combi (Lenco Hellas Ltd., Греция), который одновременно детектирует шига-токсины и O157 антиген в предварительно обогащенных образцах.Known immunochromatographic test ImmunoCard STAT! Col.coli O157 Plus (Meridian Diagnostics Inc., USA), which allows the simultaneous detection of O- and H-antigens of E.coli O157: H7 directly in fecal samples or after preliminary enrichment in nutrient media [Mackenzie, A., Orrbine, E. , Hyde, L. et al. // J. Clin. Microbiol. - 2000. - V. 38. - No. 5. - P. 1866-1868] The RIDA ® QUICK Verotoxin / O157 Combi immunochromatographic test is known (Lenco Hellas Ltd., Greece), which simultaneously detects shiga toxins and O157 antigen in pre-enriched samples.
Оба эти экспресс-теста являются быстрыми и не требуют привлечения оборудования, однако их чувствительность не высока и они не пригодны для прямого анализа клинических и пищевых образцов [Lim, D.V., Simpson, J.M., Kearns, E.A. ссоавт. // http://Clin.Microbiol.Rev. - 2005. - V.18. - №4. - Р. 583-607].Both of these rapid tests are quick and do not require equipment, but their sensitivity is not high and they are not suitable for direct analysis of clinical and food samples [Lim, D.V., Simpson, J.M., Kearns, E.A. et al. // http: //Clin.Microbiol.Rev. - 2005. - V.18. - No. 4. - R. 583-607].
Известен диагностикум для идентификации Escherichia coli O157:Н7 в реакции латекс-агглютинации, ориентированный на идентификацию патогена по двум типам антигенов E.coli - липополисахаридному антигену O157 и жгутиковому антигену Н7 (Патент РФ 2189253). Постановка реакции занимает 5 минут, не требует высокотехнологичного оборудования и квалифицированного персонала.A known diagnosticum for the identification of Escherichia coli O157: H7 in the latex agglutination reaction, focused on the identification of the pathogen by two types of E.coli antigens - lipopolysaccharide antigen O157 and flagellar antigen H7 (RF Patent 2189253). The reaction takes 5 minutes, does not require high-tech equipment and qualified personnel.
Недостатком описанного диагностикума является низкая специфичность и чувствительность (не более 104 м.к./мл), обусловленная использованием высоко аффинных поликлональных иммуноглобулинов кролика, полученных иммунизацией инактивированными бактериями E.coli O157:Н и обогащенных адсорбцией на нативные липополисахариды E.coli O157:Н7 и на жгутиковый антиген Н7, выделенные из бактериальной культуры.The disadvantage of the described diagnosticum is the low specificity and sensitivity (not more than 10 4 mk / ml), due to the use of high affinity polyclonal rabbit immunoglobulins obtained by immunization with inactivated E.coli O157: H bacteria and enriched in adsorption on native E.coli O157 lipopolysaccharides: H7 and the flagellar antigen H7 isolated from a bacterial culture.
Известен способ ПЦР-детекции для идентификации E.coli O157:Н7 и дифференциации энтерогеморрагических E.coli, использованный при разработке тест-системы «КОЛИ-ДИФ» (РУ №Р077-1-4.6-1332, утв. Россельхознадзором 29.12.2006). Способ обладает 100% специфичностью и имеет предел аналитической чувствительности 102 м.к./мл [Брюсова М.Б., Обухов И.Л., Тугаринов О.А. с соавт. // Ветеринария. - 2008. - №12. - С. 42-49].A known method of PCR detection for the identification of E.coli O157: H7 and the differentiation of enterohemorrhagic E.coli used in the development of the test system "KOLI-DIF" (RU No. P077-1-4.6-1332, approved by Rosselkhoznadzor 12/29/2006). The method has 100% specificity and has a limit of analytical sensitivity of 10 2 MK / ml [Bryusova MB, Obukhov I.L., Tugarinov O.A. et al. // Veterinary medicine. - 2008. - No. 12. - S. 42-49].
Однако клинические образцы или образцы, включающие частицы пищи, почвы и прочие примеси, содержат также ингибиторы ПЦР, родственные микроорганизмы, неспецифическую ДНК, способную дать ложноположительный сигнал. Кроме того, прямая ПЦР-детекция не применима для детекции патогенных микроорганизмов в сложных комплексных средах, например, при анализе продуктов питания, поскольку в данном случае требуется обогащение детектируемых мишеней (аналитов) в образце с применением аффинных меток или селективных сред, что значительно увеличивает время детекции.However, clinical samples or samples, including food particles, soil and other impurities, also contain PCR inhibitors, related microorganisms, non-specific DNA that can give a false-positive signal. In addition, direct PCR detection is not applicable for the detection of pathogenic microorganisms in complex complex media, for example, in the analysis of food products, since in this case enrichment of the detected targets (analytes) in the sample using affinity tags or selective media is required, which significantly increases the time detection.
Способы определения на базе иммуно-ПЦР успешно применялись для идентификации различных инфекционных патогенов, в частности, для детекции шига-токсинов, продуцируемых патогенными штаммами E.coli [Не, Х., Qi, W., Quiñones, B. с соавт. // Appl. Environ. Microbiol. - 2011. - V. 77. - №.11 - Р. 3558-3564], вирусов [Barletta, J., Bartolome, A., Constantine, N.T. // J. Virol. Methods. - 2009. - V. 157. - №.2 - P. 122-132], стафилококкового энтеротоксина [Fischer, A., vonEiff, C., Kuczius, T. с соавт. // J. Mol. Med. (Berl). - 2007. - V. 85. - №.5. - P. 461-469] и др., однако способ детекции бактерий E.coli O157:Н7 на основе иммуно-ПЦР не известен.Methods for determination based on immuno-PCR have been successfully used to identify various infectious pathogens, in particular, for the detection of shiga toxins produced by pathogenic strains of E. coli [He, X., Qi, W., Quiñones, B. et al. // Appl. Environ. Microbiol. - 2011. - V. 77. - No. 11 - P. 3558-3564], viruses [Barletta, J., Bartolome, A., Constantine, NT // J. Virol. Methods - 2009. - V. 157. - No. 2 - P. 122-132], staphylococcal enterotoxin [Fischer, A., vonEiff, C., Kuczius, T. et al. // J. Mol. Med. (Berl). - 2007. - V. 85. - No. 5. - P. 461-469] and others, however, a method for detecting E.coli O157: H7 bacteria based on immuno-PCR is not known.
Наиболее технически близким к заявляемому является способ обнаружения патогенов в пищевых продуктах, объединяющий преимущества специфичности иммунологической детекции с высокой чувствительностью полимеразной цепной реакции [WO Patent 1998020148 А1]. Проведение детекции по данному способу включает в себя следующие этапы: 1) обогащение образцов по исследуемому бактериальному патогену культивацией на богатой питательной среде; 2) иммуномагнитную сепарацию патогенных бактерий с использованием парамагнитных частиц, покрытых специфическими антителами, в частности, распознающими, связывающими и захватывающими E.coli O157:Н7 (Dynabeads anti-E.coli O157:Н7, DynalAs, Oslo, Norway или аналогичные); 3) амплификацию последовательностей ДНК, специфичных для данного патогена, с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР); 4) детекцию продуктов амплификации с помощью электрофореза в агарозном геле. С применением данной технологии за период в 8 часов можно провести выявление единичных клеток патогена в пищевых образцах.The most technically closest to the claimed is a method for detecting pathogens in food products, combining the advantages of the specificity of immunological detection with high sensitivity polymerase chain reaction [WO Patent 1998020148 A1]. Detection by this method includes the following steps: 1) enrichment of samples according to the studied bacterial pathogen by cultivation in a rich nutrient medium; 2) immunomagnetic separation of pathogenic bacteria using paramagnetic particles coated with specific antibodies, in particular, recognizing, binding and capturing E.coli O157: H7 (Dynabeads anti-E.coli O157: H7, DynalAs, Oslo, Norway or the like); 3) amplification of DNA sequences specific for a given pathogen using polymerase chain reaction (PCR); 4) detection of amplification products by agarose gel electrophoresis. Using this technology for a period of 8 hours, it is possible to identify single pathogen cells in food samples.
Преимуществом данного способа является двухэтапное обеспечение специфичности детекции (за счет селекции анализируемых бактерий с помощью высокоспецифичных антител к патогену и за счет использования при ПЦР-амплификации праймеров, специфичных к ДНК бактерии-патогена), а также повышение чувствительности определения патогена за счет ПЦР-амплификации, поскольку ПЦР позволяет детектировать даже единичные молекулы ДНК.The advantage of this method is a two-stage provision for the specificity of detection (due to the selection of the analyzed bacteria using highly specific antibodies to the pathogen and due to the use of primers specific for the bacterium of the pathogen during PCR amplification), as well as increasing the sensitivity of determining the pathogen due to PCR amplification, since PCR allows even single DNA molecules to be detected.
Однако на практике прямое применение ПЦР для детекции бактериальной ДНК, полученной из сложных биологических образцов, осложнено наличием примесей, ингибирующих реакцию, а процедура обогащения образцов наращиванием на питательной среде значительно (от 8 часов и более) увеличивает как время проведения детекции, так и вероятность контаминации культуры, полученной от исследуемого образца, что может привести к неточным и малодостоверным результатам. Данная процедура вкупе с примененным способом анализа продуктов амплификации в агарозном геле дает возможность лишь качественно охарактеризовать образцы по наличию патогена и полностью исключает возможность его количественного определения.However, in practice, the direct use of PCR for the detection of bacterial DNA obtained from complex biological samples is complicated by the presence of impurities that inhibit the reaction, and the procedure for enrichment of samples by growth on a nutrient medium significantly (from 8 hours or more) increases both the time of detection and the likelihood of contamination culture obtained from the test sample, which can lead to inaccurate and unreliable results. This procedure, coupled with the applied method for the analysis of amplification products in agarose gel, makes it possible only to qualitatively characterize the samples by the presence of the pathogen and completely excludes the possibility of quantifying it.
Предлагаемое изобретение решает задачу создания высокочувствительного способа идентификации Escherichia coli O157:Н7 на основе иммунодетекции, сопряженной с ПЦР в режиме реального времени, применимого для его выявления в пищевых продуктах, образцах биологических жидкостей и тканей на ранних и поздних этапах развития инфекции, а также в окружающей среде, употребимого для работы как с живыми патогенными бактериями, так и с инактивированными пробами.The present invention solves the problem of creating a highly sensitive method for the identification of Escherichia coli O157: H7 based on immunodetection coupled with real-time PCR, applicable for its detection in food products, samples of biological fluids and tissues at early and late stages of infection, as well as in the environment environment used to work with living pathogenic bacteria, as well as with inactivated samples.
Поставленная задача решается за счет связывания бактерий Escherichia coli O157:Н7 с помощью пары специфических моноклональных антител, одно из которых, иммобилизованное на парамагнитных частицах, служит для селективного отбора клеток E.coli O157:Н7, находящихся в исследуемой пробе, а второе (биотинилированное) антитело детектирует клетки E.coli O157:Н7 и посредством мостика, образованного тетравалентной молекулой нейтравидина, связывается с биотинилированными фрагментами ДНК, используемыми в качестве матрицы для ПЦР-амплификации с флуоресцентной детекцией сигнала в режиме реального времени.The problem is solved by binding bacteria Escherichia coli O157: H7 using a pair of specific monoclonal antibodies, one of which, immobilized on paramagnetic particles, serves to selectively select E. coli O157: H7 cells in the test sample, and the second (biotinylated) the antibody detects E. coli O157: H7 cells and, through a bridge formed by the tetravalent neutravidin molecule, binds to biotinylated DNA fragments used as a template for PCR amplification with fluorescence detection her signal in real time.
Также поставленная задача решается за счет использования высокоаффинных моноклональных антител, специфичных к E.coli O157:Н7. Применение данных антител для адсорбции бактериального материала из лизатов патогена обеспечивает повышенную чувствительность определения бактерий по сравнению с их применением для адсорбции бактерий из образцов, содержащих интактные бактериальные клетки, что объясняется увеличением количества и концентрации детектируемых мишеней в лизате в силу множественности молекул мишеней, находящихся на поверхности бактерии и распределяющихся в растворе при лизисе.Also, the problem is solved by using high-affinity monoclonal antibodies specific for E. coli O157: H7. The use of these antibodies for adsorption of bacterial material from pathogen lysates provides an increased sensitivity for determining bacteria compared to their use for adsorption of bacteria from samples containing intact bacterial cells, which is explained by an increase in the number and concentration of detected targets in the lysate due to the multiplicity of target molecules located on the surface bacteria and distributed in solution during lysis.
Также поставленная задача решается за счет проведения процедуры пробоподготовки, предусматривающей дезинтеграцию бактериальных клеток ферментативной обработкой и их лизис неионным детергентом непосредственно в образцах биологических жидкостей или продуктов питания, что позволяет сократить время проведения эксперимента и амплифицировать количество детектируемых мишеней, избегая стадии культивации, которая может привести к контаминации образца сторонними микроорганизмами и исключает возможность проведения количественного определения содержания патогена в образце.Also, the problem is solved by conducting a sample preparation procedure that involves the disintegration of bacterial cells by enzymatic treatment and their lysis with a non-ionic detergent directly in samples of biological fluids or food products, which reduces the time of the experiment and amplifies the number of detected targets, avoiding the cultivation stage, which can lead to contamination of the sample with external microorganisms and excludes the possibility of quantitative determination Jelenia pathogen content in the sample.
Также поставленная задача решается за счет использования парамагнитных частиц с иммобилизованным на их поверхности моноклональным антителом, специфичным к бактериям E.coli O157:Н7, которые позволяют осуществить связывание бактерий E.coli O157:Н7 из сложных комплексных образцов, избавиться от содержащихся в образцах примесей на ранних этапах эксперимента и изолировать ДНК-матрицу, применяемую при конечной ПЦР-амплификации, от компонентов детекционного комплекса.The problem is also solved by using paramagnetic particles with a monoclonal antibody immobilized on their surface, specific for E.coli O157: H7 bacteria, which allow the binding of E.coli O157: H7 bacteria from complex complex samples, to get rid of the impurities contained in the samples early stages of the experiment and isolate the DNA matrix used in the final PCR amplification from the components of the detection complex.
Также поставленная задача решается за счет использования коньюгата ДНК с нейтравидином, образующего молекулярную ″сетку″ (ДНК-сетка), способную связываться с биотинилированным антителом с высокой аффинностью. При использовании ДНК-сетки можно увеличить количество матричных молекул ДНК, связанных с единичной молекулой биотинилированного антитела, и, таким образом, амплифицировать сигнал.Also, the problem is solved by using a conjugate of DNA with neutravidin, forming a molecular "network" (DNA network), capable of binding to biotinylated antibodies with high affinity. When using a DNA network, it is possible to increase the number of matrix DNA molecules associated with a single biotinylated antibody molecule, and thus amplify the signal.
Также поставленная задача решается за счет разрушения детекционного комплекса ″антитело - антиген - биотинилированное антитело-коньюгат″ обработкой раствором глицина с рН 2.6 и отделения ДНК-матрицы от парамагнитных частиц путем магнитной сепарации, что способствует снижению фонового сигнала в эксперименте. Данная обработка позволяет провести разрушение детекционного комплекса, сформировавшегося на поверхности частиц, не нарушая первичную структуру матричной ДНК.Also, the problem is solved by destroying the detection complex ″ antibody - antigen - biotinylated antibody-conjugate ″ by treatment with a solution of glycine with a pH of 2.6 and separation of the DNA matrix from paramagnetic particles by magnetic separation, which helps to reduce the background signal in the experiment. This treatment allows the destruction of the detection complex formed on the surface of the particles without violating the primary structure of the matrix DNA.
Также поставленная задача решается за счет применения в анализе редко встречающейся в окружающей среде ДНК-матрицы, оптимизированной для проведения ПЦР-амплификации с флуоресцентной детекцией сигнала в режиме реального времени, что снижает вероятность возникновения ложноположительного сигнала при детекции, позволяет существенно повысить чувствительность метода и провести количественное определение содержания клеток E.coli O157:Н7 в исследуемых образцах.Also, the problem is solved by using a DNA matrix that is rarely found in the environment, which is optimized for real-time PCR amplification with fluorescence detection of the signal, which reduces the likelihood of a false-positive signal during detection, significantly increases the sensitivity of the method, and quantitatively determination of the content of E.coli O157: H7 cells in the studied samples.
Техническим результатом данного изобретения является создание нового эффективного высокочувствительного способа определения клеток E.coli O157:Н7, применимого для мониторинга окружающей среды, для контроля за качеством пищевых продуктов и в области клинической диагностики. С использованием разработанного способа можно детектировать клетки E.coli O157:Н7 в концентрации до 10 м.к./мл, не прибегая к процедуре обогащения образцов наращиванием на селективных средах.The technical result of this invention is the creation of a new effective highly sensitive method for the determination of E.coli O157: H7 cells, applicable for environmental monitoring, for food quality control and in the field of clinical diagnostics. Using the developed method, it is possible to detect E. coli O157: H7 cells at a concentration of up to 10 mk / ml without resorting to the procedure of specimen enrichment by growth on selective media.
Предлагаемое техническое решение предусматривает использование не ковалентного коньюгата ДНК с нейтравидином, который представляет собой молекулярную ″сетку″, образованную при взаимодействии биотина, находящегося на 5′-концах двухцепочечного фрагмента ДНК с тетравалетной молекулой нейтравидина. Наиболее эффективным является формирование таких комплексов в эквимолярном соотношении биотинилированной ДНК с белками авидинового ряда, которые обладают высокой специфичностью и эффективностью взаимодействия с биотином [Niemeyer, С.М., Wacker, R., Adler, M. // Nucl. Acid. Res. - 2003. - V. 31. - №16. - P. 90]. Применение ДНК-сетки вместо индивидуальных фрагментов биотинилированной ДНК повышает количество ДНК-матрицы, удерживаемой единичной молекулой антитела, и более чем в 10 раз увеличивает чувствительность метода.The proposed technical solution involves the use of a non-covalent conjugate of DNA with neutravidin, which is a molecular “network” formed by the interaction of biotin located at the 5′-ends of a double-stranded DNA fragment with a tetravalent neutravidin molecule. The most effective is the formation of such complexes in an equimolar ratio of biotinylated DNA with avidin proteins that have high specificity and efficiency of interaction with biotin [Niemeyer, S. M., Wacker, R., Adler, M. // Nucl. Acid Res. - 2003. - V. 31. - No. 16. - P. 90]. The use of a DNA network instead of individual biotinylated DNA fragments increases the amount of DNA matrix held by a single antibody molecule and increases the sensitivity of the method by more than 10 times.
Существенным условием успешного использования заявляемого способа является осуществление процедуры предварительной подготовки проб, предусматривающей дезинтеграцию клеточной стенки и мембраны бактериальных клеток для увеличения в образце концентрации детектируемых мишеней бактериального происхождения.An essential condition for the successful use of the proposed method is the implementation of the preliminary sample preparation procedure, which provides for the disintegration of the cell wall and the membrane of bacterial cells to increase the concentration of detected targets of bacterial origin in the sample.
Важным достоинством предлагаемого способа определения клеток E.coli O157:Н7 является применение в качестве носителя комплекса парамагнитных частиц, которые допускают проведение автоматизации этого способа детекции с использованием роботизированных дозаторов и промывочных устройств и минимизирует контакт оператора с потенциально инфицированным материалом. Альтернативными матрицами для иммобилизации антитела к E.coli O157:Н7 могут являться: 1) немагнитные пористые и непористые полимерные микросферы и микрочастицы; 2) хроматографические носители; 3) микрочастицы, образуемые коллоидным золотом; 4) квантовые точки; 5) пористые и непористые полимерные поверхности; 6) рабочие поверхности биосенсоров.An important advantage of the proposed method for determining E.coli O157: H7 cells is the use of a complex of paramagnetic particles as a carrier, which allow automation of this detection method using robotic dispensers and flushing devices and minimizes operator contact with potentially infected material. Alternative matrices for immobilizing antibodies to E. coli O157: H7 can be: 1) non-magnetic porous and non-porous polymer microspheres and microparticles; 2) chromatographic media; 3) microparticles formed by colloidal gold; 4) quantum dots; 5) porous and non-porous polymer surfaces; 6) working surfaces of biosensors.
Предлагаемый способ определения наличия бактерий Escherichia coli O157:Н7 на основе иммунодетекции, сопряженной с полимеразной цепной реакцией, позволяет провести прямую детекцию бактерий патогена в сложных пищевых и биологических образцах, что повышает достоверность его определения по сравнению с методами, требующими обогащения образцов культивацией. Повышение чувствительности детекции по данному способу осуществляется за счет трехэтапного усиления сигнала от единичной бактериальной клетки, происходящего за счет увеличения концентрации детектируемых мишеней (молекул белка или ЛПС) при дезинтеграции бактериальных клеток, увеличения числа связанных с детектируемым комплексом молекул ДНК-матрицы при использовании молекулярной «сетки» ДНК/нейтравидин, а также за счет накопления флуоресцентного продукта на стадии ПЦР-амплификации.The proposed method for determining the presence of Escherichia coli O157: H7 bacteria based on immunodetection coupled with a polymerase chain reaction allows direct detection of pathogen bacteria in complex food and biological samples, which increases the reliability of its determination in comparison with methods requiring cultivation of samples. The detection sensitivity of this method is increased by a three-stage amplification of the signal from a single bacterial cell, which occurs due to an increase in the concentration of detectable targets (protein or LPS molecules) during the disintegration of bacterial cells, and an increase in the number of molecules associated with the detected complex of DNA matrix molecules using a molecular “grid” »DNA / neutravidin, as well as due to the accumulation of a fluorescent product at the stage of PCR amplification.
К преимуществам заявляемого способа определения клеток E.coli O157:Н7 относятся: 1) высокая чувствительность способа; 2) высокая специфичность детекции и низкая вероятность получения ложноположительных сигналов по сравнению со стандартными методами ПЦР-диагностики; 3) возможность проведения прямого определения бактерий в сложных биологических и пищевых образцах, минуя стадию культивации; 4) гомологичность заявляемого способа в части реагентов, материалов и оборудования стандартному иммуноферментному анализу и технологиям ПЦР-диагностики, применяемым в клинической практике; 5) возможность проведения быстрого автоматизированного анализа большого количества образцов; 6) возможность проведения детекции крайне низких концентраций бактерий в пищевых образцах большого объема/массы за счет проведения процедуры пробоподготовки и использования в качестве носителя парамагнитных частиц; 7) возможность экстраполяции разработанного способа для детекции других патогенных и непатогенных бактериальных клеток при подборе соответствующей пары специфических моноклональных детектирующих антител.The advantages of the proposed method for the determination of E.coli O157: H7 cells include: 1) high sensitivity of the method; 2) high specificity of detection and a low probability of receiving false-positive signals in comparison with standard PCR diagnostic methods; 3) the ability to conduct a direct determination of bacteria in complex biological and food samples, bypassing the stage of cultivation; 4) the homology of the proposed method in terms of reagents, materials and equipment standard enzyme immunoassay and PCR diagnostic technologies used in clinical practice; 5) the ability to conduct rapid automated analysis of a large number of samples; 6) the ability to detect extremely low concentrations of bacteria in food samples of large volume / mass due to the sample preparation procedure and the use of paramagnetic particles as a carrier; 7) the ability to extrapolate the developed method for the detection of other pathogenic and non-pathogenic bacterial cells by selecting the appropriate pair of specific monoclonal detecting antibodies.
Изобретение осуществляют следующим образом:The invention is as follows:
Проводят подготовку проб инфицированного биологического материала или образцов окружающей среды и продуктов питания, потенциально содержащих бактерии штамма E.coli O157:Н7, предусматривающую дезинтеграцию клеточной стенки и мембраны бактерий. Для этого образцы твердых продуктов питания и почвы гомогенизируют с раствором, содержащим 100 мМ трис-HCl рН 7,5, 100 мМ хлорида натрия, 100 мкг/мл лизоцима и смесь ингибиторов протеолиза, и инкубируют при встряхивании на шейкере в течение 10 минут. К образцам жидких продуктов питания и биологических жидкостей добавляют 1/10 раствора, содержащего 1М трис-HCl рН 7,5, 1 M хлорида натрия, 100 мкг/мл лизоцима и ингибиторы протеолиза, и инкубируют при встряхивании на шейкере в течение 10 минут.Samples of infected biological material or environmental samples and food products potentially containing bacteria of E. coli strain O157: H7 are prepared, which involves the disintegration of the cell wall and bacterial membrane. For this, samples of solid food and soil are homogenized with a solution containing 100 mM Tris-HCl pH 7.5, 100 mM sodium chloride, 100 μg / ml lysozyme and a mixture of proteolysis inhibitors, and incubated with shaking on a shaker for 10 minutes. 1/10 solution containing 1 M Tris-HCl pH 7.5, 1 M sodium chloride, 100 μg / ml lysozyme and proteolysis inhibitors was added to samples of liquid food and biological fluids and incubated with shaking on a shaker for 10 minutes.
По окончании инкубации к образцам, обработанным лизоцимом, добавляют 1/10 раствора, содержащего 100 мМ трис-HCl рН 7,5, 5% TritonX-100, 100 мкг/мл ДНКазы и 10 мМ хлорида магния. Образцы перемешивают и выдерживают при комнатной температуре в течение 5 минут. К обработанным образцам добавляют 1/50 (v/v) 0,5 M раствора ЭДТА и удаляют дебрис центрифугированием. Тестирование проводят с отобранным супернатантом.At the end of the incubation, 1/10 of the solution containing 100 mM Tris-HCl pH 7.5, 5% TritonX-100, 100 μg / ml DNase and 10 mM magnesium chloride was added to the lysozyme-treated samples. Samples are mixed and kept at room temperature for 5 minutes. 1/50 (v / v) 0.5 M EDTA solution was added to the treated samples and debris was removed by centrifugation. Testing is performed with a selected supernatant.
Для адсорбции бактериального материала E.coli O157:Н7 из исследуемых образцов используют парамагнитные частицы с иммобилизованными антителами, специфически связывающиеся с данными бактериями (магноиммуносорбенты). Свободные валентности поверхности пробирок и парамагнитных частиц блокируют 2.5% раствором сухого молока, содержащим 0,02% азида натрия. После блокировки частицы троекратно промывают фосфатным буфером с добавлением 0.05% Tween 20 (ФСБ-Tween).For the adsorption of bacterial material E.coli O157: H7 from the studied samples, paramagnetic particles with immobilized antibodies that specifically bind to these bacteria (magneto-immunosorbents) are used. The free valencies of the surface of the tubes and paramagnetic particles are blocked with a 2.5% milk powder solution containing 0.02% sodium azide. After blocking, the particles are washed three times with phosphate buffer with the addition of 0.05% Tween 20 (PBS-Tween).
Подготовленные пробы инкубируют с магноиммуносорбентами в течение 1 часа. После троекратной промывки магноиммуносорбентов с адсорбированными бактериальными мишенями ФСБ-Tween проводят инкубацию частиц с биотинилированным антителом к E.coli O157:Н7 при комнатной температуре со встряхиванием в течение 30 минут, после чего промывку частиц повторяют.The prepared samples are incubated with magnetic immunosorbents for 1 hour. After washing the magnetic immunosorbents with adsorbed bacterial targets three times with FSB-Tween, the particles are incubated with biotinylated anti- E.coli O157: H7 antibody at room temperature with shaking for 30 minutes, after which the particles are washed again.
К парамагнитным частицам, несущим комплекс ″антитело - антиген - биотинилированное антитело″, добавляют раствор нековалентного коньюгата матричной ДНК с нейтравидином (молекулярная ″сетка″) и инкубируют парамагнитные частицы с коньюгатом в течение 30 минут. Промывку поверхности частиц от несвязавшегося коньюгата проводят троекратно раствором, содержащим 20 мМ трис-НС рН 7,5, 300 мМ хлорида натрия.To the paramagnetic particles carrying the “antibody - antigen - biotinylated antibody” complex, a solution of a non-covalent conjugate of matrix DNA with neutravidin (molecular "net") is added and paramagnetic particles with the conjugate are incubated for 30 minutes. The particle surface was washed from an unbound conjugate three times with a solution containing 20 mM Tris-HC pH 7.5, 300 mM sodium chloride.
Диссоциацию комплекса ″антитело - антиген - биотинилированное антитело-коньюгат″ осуществляют добавлением раствора глицин-HCl рН 2.6. Раствор, содержащий продукты диссоциации, высвобождающиеся с поверхности частиц, изолируют от частиц магнитной сепарацией, отбирают в пробирки для ПЦР-амплификациии нейтрализуют добавлением 1М раствора трис-основание.Dissociation of the complex "antibody - antigen - biotinylated antibody-conjugate" is carried out by adding a solution of glycine-HCl pH 2.6. A solution containing dissociation products released from the surface of the particles is isolated from the particles by magnetic separation, sampled into PCR amplification tubes and neutralized by the addition of a 1M Tris-base solution.
К раствору, содержащему матричную ДНК, снятую с поверхности парамагнитных частиц, добавляют 10 объемов смеси для ПЦР-амплификации, включающей буфер для ПЦР-амплификации, праймеры, термостабильную полимеразу и флуоресцентную пробу для мониторинга накопления продуктов амплификации в режиме реального времени по методу TaqMan. Регистрацию флуоресцентного сигнала осуществляют в течение 50 циклов амплификации с использованием праймеров, специфичных к матричной ДНК с использованием прибора для ПЦР в режиме реального времени.10 volumes of a mixture for PCR amplification, including a buffer for PCR amplification, primers, thermostable polymerase, and a fluorescent sample to monitor the accumulation of amplification products in real time according to the TaqMan method, are added to a solution containing matrix DNA taken from the surface of paramagnetic particles. The fluorescence signal is recorded for 50 amplification cycles using primers specific for template DNA using a real-time PCR device.
Отрицательные контрольные значения флуоресценции фиксируют в пробирках, соответствующих образцам, не содержащим бактерий E.coli O157:Н7. Положительные контрольные значения флуоресценции регистрируют в пробирках, соответствующих образцам, содержащим известное количество бактерий E.coli O157:H7 в концентрации 1 м.к./мл образца и выше. Содержание бактерий E.coli O157:Н7 в неизвестных образцах определяют на основании сравнения скорости нарастания флуоресценции в соответствующих реакциях ПЦР-амплификации с калибровочной шкалой, характеризующей скорость нарастания флуоресценции в реакциях ПЦР-амплификации, полученных от серии образцов, содержащих набор известных концентраций бактерий E.coli O157:Н7.Negative fluorescence control values are recorded in tubes corresponding to samples containing no bacteria E.coli O157: H7. Positive control fluorescence values are recorded in tubes corresponding to samples containing a known number of bacteria E.coli O157: H7 at a concentration of 1 MK / ml sample and above. The bacterial content of E. coli O157: H7 in unknown samples is determined by comparing the rate of increase in fluorescence in the corresponding PCR amplification reactions with a calibration scale characterizing the rate of increase in fluorescence in PCR amplification reactions obtained from a series of samples containing a set of known concentrations of E. bacteria . coli O157: H7.
Изобретение иллюстрируют следующие графические материалы:The invention is illustrated by the following graphic materials:
Фиг.1. Схема проведения пробоподготовки при определении E.coli O157:Н7 способом иммунодетекции, сопряженной с ПЦР-амплификацией.Figure 1. The scheme of sample preparation in the determination of E.coli O157: H7 by immunodetection, coupled with PCR amplification.
Фиг.2. Этапы постановки эксперимента при определении E.coli O157:Н7 способом иммунодетекции, сопряженной с ПЦР-амплификацией.Figure 2. The stages of the experiment in determining E.coli O157: H7 by immunodetection, coupled with PCR amplification.
Фиг.3. Последовательность матричной ДНК и праймеров для проведения ПЦР-амплификации.Figure 3. The sequence of template DNA and primers for PCR amplification.
A) Последовательность ДНК, использованная в качестве матрицы при проведении детекции E.coli O157:Н7 на основе иммунодетекции, сопряженной с ПЦР-амплификацией. Зоны отжига биотинилированных праймеров для наработки ДНК-матрицы отмечены подчеркиванием. Зоны отжига праймеров для проведения ПЦР-амплификации в режиме реального времени отмечены выделением. Зона отжига пробы TaqMan отмечена подчеркиванием и выделением.A) The DNA sequence used as a template for the detection of E. coli O157: H7 based on immunodetection coupled with PCR amplification. Annealing zones of biotinylated primers for DNA matrix production are underlined. The primer annealing zones for real-time PCR amplification are highlighted. The TaqMan sample annealing zone is underlined and highlighted.
B) Последовательности биотинилированных праймеров, использованные для наработки ДНК-матрицы, праймеров для проведения ПЦР в режиме реального времени и последовательность пробы TaqMan, содержащая на 5′-конце карбоксифлуоресцеин (FAM), а на 3′-конце гаситель флуоресценции RTQ1 (разработка компании Syntol, Россия).B) Biotinylated primer sequences used to generate the DNA template, real-time PCR primers and a TaqMan sample sequence containing carboxyfluorescein (FAM) at the 5′-end and RTQ1 fluorescence quencher (developed by Syntol , Russia).
Фиг.4. Получение коньюгата биотинилированной ДНК с нейтравидином для определения E.coli O157:Н7 способом иммунодетекции, сопряженной с ПЦР-амплификацией.Figure 4. Obtaining a conjugate of biotinylated DNA with neutravidin for determination of E. coli O157: H7 by immunodetection coupled with PCR amplification.
Результаты электрофореза в полиакриламидном геле комплексов биотинилированной ДНК с нейтравидином, сформированных при различном молярном соотношении ДНК к нейтравидину. Дорожка 1-1 Kbмаркер молекулярной массы (McLab США), 2 - молярное соотношение ДНК к нейтравидину 1:2, 3 - молярное соотношение ДНК к нейтравидину 1:1, 4 - молярное соотношение ДНК к нейтравидину 2:1.The results of polyacrylamide gel electrophoresis of complexes of biotinylated DNA with neutravidin, formed at different molar ratios of DNA to neutravidin. Lane 1-1 Kb molecular weight marker (McLab USA), 2 - molar ratio of DNA to neutravidin 1: 2, 3 - molar ratio of DNA to neutravidin 1: 1, 4 - molar ratio of DNA to neutravidin 2: 1.
Фиг.5. Типичные результаты определения E.coli O157:Н7 способом иммунодетекции, сопряженной с ПЦР-амплификацией в режиме реального времени.Figure 5. Typical results for the determination of E.coli O157: H7 by immunodetection coupled to real-time PCR amplification.
Для лучшего понимания сущности изобретения ниже следуют примеры его конкретного выполнения.For a better understanding of the invention, the following are examples of its specific implementation.
Пример 1. Приготовление проб биологических образцов и продуктов питания для определения E.coli O157:Н7 способом иммунодетекции, сопряженной с ПЦР-амплификацией.Example 1. The preparation of samples of biological samples and food products for determination of E.coli O157: H7 by immunodetection, coupled with PCR amplification.
Схема подготовки проб инфицированного биологического материала представлена на Фиг.1. Отобранные образцы жидких продуктов питания (сок, молоко, минеральная вода) и биологических жидкостей (кровь, моча, слюна) центрифугируют при 5000 об/мин и температуре +4°С, отбирают супернатант и повторно центрифугируют его при 10000 об/мин в течение 15 минут. К супернатанту добавляют 1/10 (v/v) стерильного раствора, содержащего 1M трис-HCl pH 7,5, 1M хлорида натрия, 100 мкг/мл лизоцима и 10Х раствор Complete Protease Inhibitor Cocktail EDTA-free (Roche, США), и инкубируют пробы при температуре +4°С и встряхивании на шейкере в течение 10 мин.The scheme for the preparation of samples of infected biological material is presented in figure 1. Selected samples of liquid food products (juice, milk, mineral water) and biological fluids (blood, urine, saliva) are centrifuged at 5000 rpm and a temperature of + 4 ° C, the supernatant is taken and centrifuged again at 10000 rpm for 15 minutes. To the supernatant was added a 1/10 (v / v) sterile solution containing 1M Tris-HCl pH 7.5, 1M sodium chloride, 100 μg / ml lysozyme and 10X Complete Protease Inhibitor Cocktail EDTA-free solution (Roche, USA), and samples are incubated at a temperature of + 4 ° С and shaking on a shaker for 10 minutes.
Образцы твердых продуктов питания (мясо, овощи), фекалии и образцы почвы добавляют раствор, содержащий 100 мМ трис-HCl рН 7,5, 100 мМ хлорида натрия, 10 мкг/мл лизоцима из расчета один объем раствора (в мл) на одну единицу массы твердого образца (в г) и 1/10 (v/v) 10Х раствора Complete Protease Inhibitor Cocktail EDTA-free (Roche, США), и растирают в гомогенизаторе Дунса (20 ударов плотно прилегающего пестика) во льду. Полученный однородный гомогенат встряхивают на шейкере при температуре +4°С в течение 10 минут.Samples of solid food products (meat, vegetables), feces and soil samples add a solution containing 100 mM Tris-HCl pH 7.5, 100 mM sodium chloride, 10 μg / ml lysozyme based on one solution volume (in ml) per unit mass of solid sample (in g) and 1/10 (v / v) of 10X Complete Protease Inhibitor Cocktail EDTA-free solution (Roche, USA), and triturated in a Duns homogenizer (20 strokes of a tight-fitting pestle) in ice. The resulting homogeneous homogenate is shaken on a shaker at a temperature of + 4 ° C for 10 minutes.
К обработанным лизоцимом образцам добавляют 1/10 раствора, содержащего 100 мМ трис-HCl рН 7,5, 5% TritonX-100, 100 мкг/мл ДНКазы и 10 мМ хлорида магния. Образцы перемешивают встряхиванием и выдерживают при комнатной температуре в течение 5 минут, после чего к обработанным образцам добавляют 1/50 (v/v) 0,5 M раствора ЭДТА и удаляют дебрис центрифугированием при +4°С и 18000 об/мин в течение 15 минут. Тестирование проводят с отобранным супернатантом.1/10 solution containing 100 mM Tris-HCl pH 7.5, 5% TritonX-100, 100 μg / ml DNase and 10 mM magnesium chloride was added to lysozyme-treated samples. The samples are mixed by shaking and kept at room temperature for 5 minutes, after which 1/50 (v / v) 0.5 M EDTA solution is added to the treated samples and debris is removed by centrifugation at + 4 ° C and 18000 rpm for 15 minutes. Testing is performed with a selected supernatant.
Хранят подготовленные образцы при температуре +4°С в течение 4 часов до проведения анализа или замораживают при -70°С для длительного хранения.Prepared samples are stored at a temperature of + 4 ° С for 4 hours prior to analysis or frozen at -70 ° С for long-term storage.
Пример 2. Выделение, очистка и биотинилирование антител, специфичных к бактериям E.coli O157:Н7.Example 2. Isolation, purification and biotinylation of antibodies specific for E.coli O157: H7 bacteria.
Моноклональные антитела, специфичные к бактериям E.coli O157:Н7 [Лунева Н.М., Шайхутдинова Р.З. с соавт. // Биотехнология. - 2011. - №5. - С. 85-92] выделяют из асцитной жидкости. Асцитную жидкость центрифугируют при 10000 об/мин в течение 15 минут для удаления клеточного дебриса. К полученному супернатанту добавляют равный объем буфера, содержащего 40 мМ трис-HCl рН 7,5, 200 мМ хлорида натрия, и проводят высаливание антитела из раствора добавлением насыщенного раствора сульфата аммония до концентрации 50%. Полученный сульфатный осадок собирают центрифугированием при 12000 об/мин в течение 15 минут и растворяют в буфере, содержащем 50 мМ трис-HCl рН 7,5, 100 мМ хлорида натрия. Белковый раствор центрифугируют при 12000 об/мин в течение 15 минут для удаления нерастворенных примесей и наносят на колонку Protein G (GE Healthcare, США), уравновешенную 10 объемами буфера, использованного для растворения белка. Колонку промывают 10 объемами того же буфера для удаления не связавшегося белка и элюируют белок антитела раствором, содержащим 100 мМ глицин-HCl рН 2,6 и 100 мМ хлорида натрия. Приводят значение рН раствора к 8.0 добавлением раствора 1 M трис-основание. Определяют концентрацию полученного белка антитела спектрофотометрически и анализируют его чистоту электрофорезом в денатурирующем полиакриламидном геле по методике Laemmli.Monoclonal antibodies specific for E.coli O157 bacteria: H7 [Luneva N.M., Shaykhutdinova R.Z. et al. // Biotechnology. - 2011. - No. 5. - S. 85-92] isolated from ascites fluid. The ascitic fluid is centrifuged at 10,000 rpm for 15 minutes to remove cell debris. An equal volume of buffer containing 40 mM Tris-HCl pH 7.5, 200 mM sodium chloride was added to the obtained supernatant, and the antibody was salted out of the solution by adding a saturated solution of ammonium sulfate to a concentration of 50%. The resulting sulfate precipitate was collected by centrifugation at 12000 rpm for 15 minutes and dissolved in a buffer containing 50 mm Tris-HCl pH 7.5, 100 mm sodium chloride. The protein solution was centrifuged at 12,000 rpm for 15 minutes to remove undissolved impurities and applied to a Protein G column (GE Healthcare, USA), balanced with 10 volumes of buffer used to dissolve the protein. The column is washed with 10 volumes of the same buffer to remove unbound protein and the antibody protein is eluted with a solution containing 100 mM glycine-HCl pH 2.6 and 100 mM sodium chloride. The pH of the solution was adjusted to 8.0 by adding a solution of 1 M Tris base. The concentration of the obtained antibody protein is determined spectrophotometrically and its purity is analyzed by denaturing polyacrylamide gel electrophoresis according to the Laemmli method.
Полученный белок антитела троекратно диализуют против 100 объемов фосфатного буфера, содержащего 20 мМ Na2HPO4 и 100 мМ хлорида натрия. Готовят раствор NHS-биотина в DMSO из расчета 1 мг/мл и добавляют полученный раствор к раствору антитела в объемном соотношении 1:8. Проводят реакцию биотинилирования при +4°С в течение ночи со встряхиванием и троекратно диализуют против 100 объемов фосфатного буфера, содержащего 20 мМ Na2HPO4 и 100 мМ хлорида натрия для удаления несвязавшегося биотина.The resulting antibody protein is dialyzed three times against 100 volumes of phosphate buffer containing 20 mM Na 2 HPO 4 and 100 mM sodium chloride. Prepare a solution of NHS-Biotin in DMSO at the rate of 1 mg / ml and add the resulting solution to the antibody solution in a volume ratio of 1: 8. The biotinylation reaction is carried out at + 4 ° C overnight with shaking and dialysed three times against 100 volumes of phosphate buffer containing 20 mM Na 2 HPO 4 and 100 mM sodium chloride to remove unbound biotin.
Полноту биотинилирования контролируют постановкой иммуноблота с детекцией биотинилированного антитела коньюгатом нейтравидин-пероксидаза (Pierce, США).The completeness of biotinylation is monitored by setting up an immunoblot with the detection of a biotinylated antibody by a conjugate of neutravidin peroxidase (Pierce, USA).
Пример 3. Подготовка магноиммуносорбентов Dynabeads anti-E.coli O157:Н7 для определения Ε.coli O157:Н7 способом иммунодетекции, сопряженной с ПЦР-амплификацией.Example 3. Preparation of Dynabeads anti- E.coli O157: H7 magneto-immunosorbents for the determination of Ε.coli O157: H7 by immunodetection coupled with PCR amplification.
1 мл магноиммуносорбента Dynabeads anti - E.coli O157:Н7 (DynalAs, Oslo, Norway) промывают ФСБ (137 мМ NaCl, 2,7 мМ KCl, 10 мМ Na2HPO4, 1,8 мМ KH2PO4, рН 7,4) и инкубируют с 2,5% раствором сухого молока в ФСБ, содержащего 0,02% азида натрия, в течение 1 часа. Для адсорбции частиц из раствора используют магнитный штатив Dyna Mag-2 (Life Technologies, США). По окончании инкубации частицы троекратно промывают ФСБ, содержащим 0,05% Tween-20 (ФСБ-Tween), и суспендируют в 0,5 мл ФСБ.1 ml of the magnetic immunosorbent Dynabeads anti - E. coli O157: H7 (DynalAs, Oslo, Norway) is washed with FSB (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na 2 HPO 4 , 1.8 mM KH 2 PO 4 , pH 7 , 4) and incubated with a 2.5% solution of milk powder in the FSB containing 0.02% sodium azide for 1 hour. To adsorb particles from a solution, a magnetic tripod Dyna Mag-2 (Life Technologies, USA) is used. At the end of the incubation, the particles are washed three times with PBS containing 0.05% Tween-20 (PBS-Tween) and suspended in 0.5 ml of PBS.
Подготовленный магноиммуносорбент хранят при температуре +4°С не более 2 суток.The prepared magnetic immunosorbent is stored at a temperature of + 4 ° C for no more than 2 days.
Пример 4. Подготовка магноиммуносорбента Protein G Magnetic Beads для определения Ε.coli O157:H7 способом иммунодетекции, сопряженной с ПЦР-амплификацией.Example 4. Preparation of the magnetic immunosorbent Protein G Magnetic Beads for the determination of Ε.coli O157: H7 by immunodetection coupled to PCR amplification.
Магносорбент Protein G Magneti Beads (New England Biolabs, США) промывают ФСБ и инкубируют с очищенными моноклональными антителами к E.coli O157:H7, взятыми в концентрации 1 мг/мл, в течение 2 часов при +4°С. Затем частицы троекратно промывают ФСБ-Tween от несвязавшихся антител с использованием магнита и выдерживают с 2,5% раствором сухого молока в ФСБ, содержащего 0,02% азида натрия, в течение 1 часа, после чего снова троекратно промывают частицы раствором ФСБ-Tween и суспендируют в 0,5 мл ФСБ.The magnetosorbent Protein G Magneti Beads (New England Biolabs, USA) was washed with FSB and incubated with purified monoclonal antibodies to E. coli O157: H7 taken at a concentration of 1 mg / ml for 2 hours at + 4 ° C. Then the particles are washed three times with FSB-Tween from unbound antibodies using a magnet and kept with a 2.5% solution of milk powder in the FSB containing 0.02% sodium azide for 1 hour, after which the particles are washed three times with FSB-Tween solution and suspended in 0.5 ml of FSB.
Подготовленный магноиммуносорбент хранят при температуре +4°С не более 2 суток.The prepared magnetic immunosorbent is stored at a temperature of + 4 ° C for no more than 2 days.
Пример 5. Подготовка магноиммуносорбента на основе магносорбента (СтавНИПЧИ) для определения E.coli O157:Н7 способом иммунодетекции, сопряженной с ПЦР-амплификацией.Example 5. Preparation of a magnetic immunosorbent based on magnosorbent (StavNIPCHI) for the determination of E.coli O157: H7 by immunodetection coupled with PCR amplification.
К 1 г магносорбента производства СтавНИПЧИ (Патент РФ 2138813) добавляют 12 мл 24%-ного раствора хлорида натрия и 1 мл вторичного алкилсульфата натрия и инкубируют смесь 2 часа при температуре 37°С для активации поверхности магнитного носителя. К 1 мл активированного сорбента приливают 1 мл очищенных моноклональных антител к E.coli O157:Н7, взятых в концентрации 3 мг/мл, и инкубируют смесь при температуре 37°С в течение 2 часов, после чего надосадочную жидкость удаляют, а магноиммуносорбент троекратно промывают ФСБ. Свободные валентности поверхности сорбента блокируют 2,5% раствором сухого молока в ФСБ, содержащего 0,02% азида натрия, в течение 1 часа. По окончании блокировки магноиммуносорбент троекратно промывают ФСБ и суспендируют в 0,5 мл ФСБ.To 1 g of the magnetosorbent manufactured by StavNIPCHI (RF Patent 2138813) add 12 ml of a 24% solution of sodium chloride and 1 ml of secondary sodium alkyl sulfate and incubate the mixture for 2 hours at 37 ° C to activate the surface of the magnetic carrier. 1 ml of purified monoclonal anti- E.coli O157: H7 monoclonal antibody, taken at a concentration of 3 mg / ml, is added to 1 ml of activated sorbent, and the mixture is incubated at 37 ° C for 2 hours, after which the supernatant is removed and the magnetic immunosorbent is washed three times FSB. Free valencies of the surface of the sorbent are blocked with a 2.5% solution of milk powder in the FSB containing 0.02% sodium azide for 1 hour. At the end of the blocking, the magnetic immunosorbent is washed three times with FSB and suspended in 0.5 ml of FSB.
Подготовленный магноиммуносорбент хранят при температуре +4°С в течение 6 месяцев.The prepared magnetic immunosorbent is stored at a temperature of + 4 ° C for 6 months.
Пример 6. Приготовление коньюгата биотинилированной ДНК с нейтравидином.Example 6. Preparation of a conjugate of biotinylated DNA with neutravidin.
Для приготовления коньюгата с нейтравидином и матрицы для ПЦР-амплификации в режиме реального времени используют фрагмент геномной ДНК Fusariuma venaceum длиной 747 пар оснований. Праймеры для амплификации фрагмента на 5′-концах модифицируют биотином (Фиг.3). Наработку биотинилированного фрагмента ДНК проводят ПЦР амплификацией при помощи Taq-полимеразы при температуре отжига праймеров 56°С и времени элонгации фрагмента 1 минута. Продукты ПЦР-реакции осаждают 3 объемами этанола с добавлением 1/10 объема ацетата натрия рН 5,2 и растворяют в 0,5 мл буфера, содержащего 20 мМ трис-HCl рН 7,5 и 300 мМ хлорида натрия, 5 мМ ЭДТА. Раствор ДНК центрифугируют для удаления нерастворенных примесей и наносят на гельфильтрационную колонку Superdex-200 (GE-Healthcare, Великобритания), уравновешенную тем же буфером, для удаления побочных продуктов синтеза и не задействованных в синтезе олигонуклеотидов. Гельфильтрацию проходит при скорости потока 0,5 мл/мин, выход разделяемых продуктов контролируют спектрофотометрически. Определяют содержание целевого фрагмента ДНК во фракциях гельфильрации электрофорезом в агарозном геле. Фракции, содержащие синтезированный фрагмент, осаждают 3 объемами этанола с добавлением 1/10 объема ацетата натрия рН 5,2 и растворяют в буфере, содержащем 20 мМ трис-HCl, 100 мМ хлорида натрия и 5 мМ ЭДТА. Количество ДНК в полученном растворе определяют спектрофотометрически.To prepare a conjugate with neutravidin and a matrix for real-time PCR amplification, a F47ariuma venaceum genomic DNA fragment of 747 base pairs is used. Primers for amplification of the fragment at the 5′-ends are modified with biotin (Figure 3). The biotinylated DNA fragment is produced by PCR amplification using Taq polymerase at annealing temperature of the primers of 56 ° C and the fragment elongation time of 1 minute. PCR reaction products precipitated with 3 volumes of ethanol with the addition of 1/10 volume of sodium acetate pH 5.2 and dissolved in 0.5 ml of buffer containing 20 mm Tris-HCl pH 7.5 and 300 mm sodium chloride, 5 mm EDTA. The DNA solution is centrifuged to remove undissolved impurities and applied to a Superdex-200 gel filtration column (GE-Healthcare, UK), equilibrated with the same buffer, to remove synthesis by-products and not involved in the synthesis of oligonucleotides. Gel filtration takes place at a flow rate of 0.5 ml / min; the yield of the products to be separated is controlled spectrophotometrically. The content of the target DNA fragment in the gel filtration fractions by agarose gel electrophoresis was determined. Fractions containing the synthesized fragment are precipitated with 3 volumes of ethanol with the addition of 1/10 volume of sodium acetate pH 5.2 and dissolved in a buffer containing 20 mM Tris-HCl, 100 mM sodium chloride and 5 mM EDTA. The amount of DNA in the resulting solution is determined spectrophotometrically.
Готовят раствор нейтравидина (Pierce, США) из расчета 1 мг/мл и смешивают его в эквимолярном соотношении с раствором ДНК. Смесь инкубируют при +4°С в течение ночи. Образование молекулярной ″сетки″ биотинилированной ДНК с нейтравидином контролируют электрофорезом ДНК в полиакриламидном геле по замедлению скорости миграции продуктов разделения против исходного фрагмента ДНК (Фиг.4). Полученный коньюгат биотинилированной ДНК с нейтравидином очищают от несвязанной ДНК и нейтравидина гельфильтрацией на колонке Superdex-200 (GE-Healthcare, Великобритания), уравновешенной буфером, содержащим 20 мМ трис-HCl рН 7,5, 300 мМ хлорида натрия и 5 мМ ЭДТА. Содержание коньюгата во фракциях гельфильтрации контролируют электрофорезом в агарозном геле. Очищенный коньюгат концентрируют с использованием Microcon YM-50 (Millipore, США). Спектрофотометрически определяют концентрацию коньюгата по ДНК и белку и на основании этих данных рассчитывают соотношение ДНК к белку в полученной молекулярной ″сетке″. Оптимальное молярное соотношение ДНК к белку составляет 1:2 (Фиг.4). К полученному коньюгату добавляют глицерин до 50% и хранят по аликвотам при температуре -70°С.Prepare a solution of neutravidin (Pierce, USA) at a rate of 1 mg / ml and mix it in an equimolar ratio with a solution of DNA. The mixture was incubated at + 4 ° C overnight. The formation of a molecular ″ grid ″ of biotinylated DNA with neutravidin is controlled by polyacrylamide gel electrophoresis of DNA to slow down the rate of migration of separation products against the original DNA fragment (Figure 4). The resulting conjugate of biotinylated DNA with neutravidin was purified from unbound DNA and neutravidin by gel filtration on a Superdex-200 column (GE-Healthcare, UK), equilibrated with a buffer containing 20 mM Tris-HCl pH 7.5, 300 mM sodium chloride and 5 mM EDTA. The conjugate content in the gel filtration fractions is controlled by agarose gel electrophoresis. The purified conjugate was concentrated using Microcon YM-50 (Millipore, USA). The concentration of the conjugate is determined spectrophotometrically from the DNA and the protein, and based on these data, the ratio of DNA to protein in the resulting molecular "grid" is calculated. The optimal molar ratio of DNA to protein is 1: 2 (Figure 4). Up to 50% glycerol is added to the resulting conjugate and stored in aliquots at a temperature of -70 ° C.
Пример 7. Постановка иммунодетекции E.coli O157:Н7 и связывание его с ДНК-матрицей для последующей ПЦР-амплификации в режиме реального времени.Example 7. Immunodetection of E. coli O157: H7 and its binding to a DNA template for subsequent real-time PCR amplification.
В пробирки типа «эппендорф» вносят по 20 мкл суспензии подготовленных магноиммуносорбентов и по 100 мкл подготовленных исследуемых образцов, а также подготовленных образцов, искусственно инфицированных бактериями E.coli O157:Н7 в серии понижающихся концентраций от 106 до 1 м.к./мл образца (положительный контроль). В пробирки, служащие отрицательным контролем, добавляют раствор ФСБ-Tween либо экспериментальные образцы, заведомо не содержащие антиген E.coli O157:Н7. Инкубируют пробирки при встряхивании в течение 1 часа при комнатной температуре. Троекратно промывают парамагнитные частицы раствором ФСБ-Tween с использованием магнитного штатива Dyna Mag-2 (Life Technologies, США). В пробирки добавляют по 100 мкл раствора, содержащего биотинилированное антитело и инкубируют пробирки при встряхивании в течение 30 минут при комнатной температуре. Троекратно промывают парамагнитные частицы раствором ФСБ-Tween. В пробирки добавляют по 50 мкл раствора, содержащего 20 мМ трис-HCl рН 7,5, 100 мМ хлорида натрия, 5 мМ ЭДТА и коньюгат биотинилированной ДНК с нейтравидином (конечная концентрация ДНК 2 мкг/мл) и инкубируют пробирки при встряхивании в течение 30 минут при комнатной температуре, после чего троекратно промывают парамагнитные частицы буфером, содержащим 20 мМ трис-HCl рН 7,5 и 300 мМ хлорида натрия.Eppendorf tubes are filled with 20 μl of a suspension of prepared magnetic immunosorbents and 100 μl of prepared test samples, as well as prepared samples artificially infected with bacteria E.coli O157: H7 in a series of decreasing concentrations from 10 6 to 1 m.c. / ml sample (positive control). In tubes serving as a negative control, add a solution of FSB-Tween or experimental samples, obviously not containing antigen E.coli O157: H7. The tubes are incubated with shaking for 1 hour at room temperature. Paramagnetic particles were washed three times with FSB-Tween solution using a Dyna Mag-2 magnetic tripod (Life Technologies, USA). 100 μl of a solution containing biotinylated antibody are added to the tubes and the tubes are incubated with shaking for 30 minutes at room temperature. Paramagnetic particles are washed three times with a solution of FSB-Tween. 50 μl of a solution containing 20 mM Tris-HCl pH 7.5, 100 mM sodium chloride, 5 mM EDTA and a conjugate of biotinylated DNA with neutravidin (
После полного удаления промывочного раствора к частицам приливают по 50 мкл раствора глицин-HCl рН 2.6 и инкубируют пробирки при комнатной температуре в течение 5 минут. Частицы изолируют от раствора, используя магнитный штатив, отбирают раствор в отдельные пробирки и нейтрализуют добавлением 1М раствора трис-основание.After complete removal of the wash solution, 50 μl of a solution of glycine-HCl pH 2.6 is added to the particles and the tubes are incubated at room temperature for 5 minutes. Particles are isolated from the solution using a magnetic tripod, the solution is taken into separate tubes and neutralized by the addition of a 1M Tris-base solution.
Аликвоты нейтрализованного раствора, содержащего ДНК-матрицу, переносят по 5 мкл в пробирки для ПЦР-амплификации и добавляют на одну пробирку по 10 мкл смеси для ПЦР-амплификации в режиме реального времени («Синтол», Россия), специфические праймеры (по 300 нМ каждого вида праймеров), пробу TaqMan (по 200 нМ) и по 1 EдTaq-полимеразы («Евроген», Россия). Конечный объем реакции ПЦР-амплификации составляет 25 мкл.Aliquots of the neutralized solution containing the DNA template were transferred in 5 μl tubes to PCR amplification tubes and 10 μl of real-time PCR amplification mixture were added per tube (Syntol, Russia), specific primers (300 nM each) each type of primer), TaqMan sample (200 nM each) and 1 Ed Taq polymerase (Eurogen, Russia). The final volume of the PCR amplification reaction is 25 μl.
Пример 8. Проведение ПЦР-амплификации с флуоресцентной детекцией сигнала в режиме реального времени.Example 8. Carrying out PCR amplification with fluorescence detection of the signal in real time.
Реакцию амплификации проводят на приборе для ПЦР амплификации в режиме реального времени Mini Opticon Real-Time PCR Detection Sistem (Bio-Rad, США) с использованием следующего протокола:The amplification reaction is carried out on a Mini Opticon Real-Time PCR Detection Sistem (Bio-Rad, USA) instrument for real-time PCR amplification using the following protocol:
Регистрацию нарастания флуоресценции ведут при длине волны 520 нм. Пробы, содержащие образцы, инфицированные бактериями E.coli O157:Н7 в концентрации 1 м.к./мл образца и выше, показывают возрастание флуоресценции с 5 по 30 цикл реакции амплификации (Фиг.5). В пробах, являющихся отрицательным контролем, нарастания флуоресценции в данном диапазоне циклов реакции не происходит. Применив калибровочную шкалу, построенную на основании зависимости номера цикла, на котором начинает регистрироваться изменение флуоресценции, от значений концентрации бактерий в образцах, являющихся положительным контролем, определяют концентрацию антигена в исследуемых пробах.The increase in fluorescence is recorded at a wavelength of 520 nm. Samples containing samples infected with E. coli O157: H7 bacteria at a concentration of 1 mc / ml sample and above show an increase in fluorescence from 5 to 30 of the amplification reaction cycle (Figure 5). In samples that are a negative control, no increase in fluorescence in this range of reaction cycles occurs. Applying the calibration scale, built on the basis of the dependence of the cycle number on which the change in fluorescence begins to be recorded, on the concentration of bacteria in the samples, which are a positive control, determine the concentration of antigen in the studied samples.
Claims (1)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2014128165/10A RU2569196C1 (en) | 2014-07-10 | 2014-07-10 | METHOD TO DETECT AVAILABILITY OF BACTERIA Escherichia coli O157:H7 IN BIOLOGICAL AND FOOD SAMPLES BASED ON IMMUNODETECTION COUPLED WITH POLYMERASE CHAIN REACTION |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2014128165/10A RU2569196C1 (en) | 2014-07-10 | 2014-07-10 | METHOD TO DETECT AVAILABILITY OF BACTERIA Escherichia coli O157:H7 IN BIOLOGICAL AND FOOD SAMPLES BASED ON IMMUNODETECTION COUPLED WITH POLYMERASE CHAIN REACTION |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2569196C1 true RU2569196C1 (en) | 2015-11-20 |
Family
ID=54598354
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2014128165/10A RU2569196C1 (en) | 2014-07-10 | 2014-07-10 | METHOD TO DETECT AVAILABILITY OF BACTERIA Escherichia coli O157:H7 IN BIOLOGICAL AND FOOD SAMPLES BASED ON IMMUNODETECTION COUPLED WITH POLYMERASE CHAIN REACTION |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2569196C1 (en) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113655005A (en) * | 2021-08-12 | 2021-11-16 | 合肥工业大学 | Detection method for Escherichia coli O157H 7 based on core-shell type gold platinum nanocluster |
| US11268124B2 (en) | 2016-01-25 | 2022-03-08 | Bio-Rad Europe Gmbh | Digital microbiology |
| RU2772844C2 (en) * | 2016-01-25 | 2022-05-26 | Био-Рад Юроп Гмбх | Digital microbiology |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2470307C1 (en) * | 2011-11-09 | 2012-12-20 | Федеральное бюджетное учреждение науки Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии (ФБУН ГНЦ ПМБ) | Method of determining presence of anthrax protective antigen based on immunodetection, associated with polymerase chain reaction |
| CN103468797A (en) * | 2013-08-13 | 2013-12-25 | 无锡中德伯尔生物技术有限公司 | Kit for rapid and accurate detection of Escherichia coli O157:H7 live bacterium and its detection method |
-
2014
- 2014-07-10 RU RU2014128165/10A patent/RU2569196C1/en active
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2470307C1 (en) * | 2011-11-09 | 2012-12-20 | Федеральное бюджетное учреждение науки Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии (ФБУН ГНЦ ПМБ) | Method of determining presence of anthrax protective antigen based on immunodetection, associated with polymerase chain reaction |
| CN103468797A (en) * | 2013-08-13 | 2013-12-25 | 无锡中德伯尔生物技术有限公司 | Kit for rapid and accurate detection of Escherichia coli O157:H7 live bacterium and its detection method |
Non-Patent Citations (3)
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US11268124B2 (en) | 2016-01-25 | 2022-03-08 | Bio-Rad Europe Gmbh | Digital microbiology |
| RU2772844C2 (en) * | 2016-01-25 | 2022-05-26 | Био-Рад Юроп Гмбх | Digital microbiology |
| US11952610B2 (en) | 2016-01-25 | 2024-04-09 | Bio-Rad Europe Gmbh | Digital microbiology |
| CN113655005A (en) * | 2021-08-12 | 2021-11-16 | 合肥工业大学 | Detection method for Escherichia coli O157H 7 based on core-shell type gold platinum nanocluster |
| CN113655005B (en) * | 2021-08-12 | 2023-08-08 | 合肥工业大学 | Method for detecting escherichia coli O157:H27 based on core-shell type gold-platinum nanocluster |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Sohrabi et al. | State of the art: Lateral flow assays toward the point‐of‐care foodborne pathogenic bacteria detection in food samples | |
| Singh et al. | Evaluation of gold nanoparticle based lateral flow assays for diagnosis of enterobacteriaceae members in food and water | |
| Wu et al. | A sensitive lateral flow biosensor for Escherichia coli O157: H7 detection based on aptamer mediated strand displacement amplification | |
| Yang et al. | Magnetic nano-beads based separation combined with propidium monoazide treatment and multiplex PCR assay for simultaneous detection of viable Salmonella Typhimurium, Escherichia coli O157: H7 and Listeria monocytogenes in food products | |
| Yu et al. | Sensitive and rapid detection of Staphylococcus aureus in milk via cell binding domain of lysin | |
| Nouri et al. | Designing a direct ELISA kit for the detection of Staphylococcus aureus enterotoxin A in raw milk samples | |
| Tims et al. | Confirmation of viable E. coli O157: H7 by enrichment and PCR after rapid biosensor detection | |
| CN101971032B (en) | Method for the real-time detection of microorganisms in a liquid culture medium by agglutination | |
| Peng et al. | Rapid fluorescent detection of Escherichia coli K88 based on DNA aptamer library as direct and specific reporter combined with immuno-magnetic separation | |
| Li et al. | Rapid detection of Listeria monocytogenes using fluorescence immunochromatographic assay combined with immunomagnetic separation technique | |
| Amani et al. | A review approaches to identify enteric bacterial pathogens | |
| Fratamico et al. | PCR detection of enterohemorrhagic Escherichia coli O145 in food by targeting genes in the E. coli O145 O-antigen gene cluster and the Shiga toxin 1 and Shiga toxin 2 genes | |
| Clotilde et al. | Microbead-based immunoassay for simultaneous detection of Shiga toxins and isolation of Escherichia coli O157 in foods | |
| Balakrishnan et al. | A rapid and highly specific immunofluorescence method to detect Escherichia coli O157: H7 in infected meat samples | |
| Reddy et al. | Development and evaluation of IgY ImmunoCapture PCR ELISA for detection of Staphylococcus aureus enterotoxin A devoid of protein A interference | |
| Bi et al. | A novel SDS rinse and immunomagnetic beads separation combined with real-time loop-mediated isothermal amplification for rapid and sensitive detection of Salmonella in ready-to-eat duck meat | |
| Karoonuthaisiri et al. | Bead array for Listeria monocytogenes detection using specific monoclonal antibodies | |
| Yang et al. | Point-of-care and visual detection of Salmonella spp. and Cronobacter spp. by multiplex loop-mediated isothermal amplification label-based lateral flow dipstick in powdered infant formula | |
| Lin et al. | Rapid detection of Staphylococcus aureus in food safety using an RPA-CRISPR-Cas12a assay | |
| RU2569196C1 (en) | METHOD TO DETECT AVAILABILITY OF BACTERIA Escherichia coli O157:H7 IN BIOLOGICAL AND FOOD SAMPLES BASED ON IMMUNODETECTION COUPLED WITH POLYMERASE CHAIN REACTION | |
| Jadeja et al. | Immunomagnetic separation of Vibrio vulnificus with antiflagellar monoclonal antibody | |
| Zhai et al. | Visual detection of Staphylococcus aureus based on immunomagnetic separation and polymerase spiral reaction | |
| Shin et al. | Hybrid microarray based on double biomolecular markers of DNA and carbohydrate for simultaneous genotypic and phenotypic detection of cholera toxin-producing Vibrio cholerae | |
| Wang et al. | Development of an immunomagnetic separation–propidium monoazide–polymerase chain reaction assay with internal amplification control for rapid and sensitive detection of viable Escherichia coli O157: H7 in milk | |
| Barizuddin et al. | Highly specific and rapid immuno-fluorescent visualization and detection of E. coli O104: H4 with protein-A coated magnetic beads based LST-MUG assay |