RU2402604C1 - CELL LINE OF HUMAN MELANOMA mel H, APPLIED FOR OBTAINING ANTITUMOUR VACCINE - Google Patents

Abstract

FIELD: medicine.

SUBSTANCE: cell line of humans melanoma mel H has stable cultural and morphological characteristics, is stored in Specialised collection of cell cultures of vertebrates of Russian collection of cell cultures of Institute of Cytology RAS by number "РККК (П) 715 Д".

EFFECT: invention allows to extend arsenal of human melanoma lines, which are used for creation of antitumour vaccine, applied for treatment of melanoma and other malignant neoplasms.

1 tbl, 2 ex

Description

Изобретение относится к области медицинской биотехнологии, в частности к получению клеточных линий, используемых для создания противоопухолевых вакцин.The invention relates to the field of medical biotechnology, in particular to the production of cell lines used to create antitumor vaccines.

Вакцинотерапия является одним из иммунологических подходов в лечении онкологических заболеваний. Принцип данного метода основан на индукции противоопухолевого иммунитета после введения в организм опухолевого антигена.Vaccine therapy is one of the immunological approaches in the treatment of cancer. The principle of this method is based on the induction of antitumor immunity after the introduction of a tumor antigen into the body.

Центральным событием в процессе Т-клеточной иммунной реакции против опухолевых клеток является стимуляция распознавания Т-рецепторами антигенных детерминант, избирательно экспрессированных на опухолевых клетках. Опухолевые антигены, как правило, подвергаются процессингу перед их презентацией в контексте молекул гистосовместимости на клеточной поверхности. Различные категории опухолеассоциированных антигенов можно разделить на три главные группы: раково/тестикулярные антигены (MAGE, BAGE, FRAME, NY-ESO-1, HOM-MEL-40), дифференцировочные антигены меланоцитов (тирозиназа, Melan-A/MART-1, gp100, TRP-1, TRP-2), и мутированные антигены (MUC-1, CDK4, β-катенин gp100-in4, p15, N-ацетилглюкозоаминтрансфераза V). С иммунологической точки зрения раково/тестикулярные антигены могут быть хорошими мишенями для иммунотерапии опухолей, поскольку в нормальных тканях эта группа антигенов (MAGE и FRAME) не экспрессируется, за исключением ткани яичек, которые недоступны для клеток иммунной системы из-за отсутствия их прямого контакта с иммунокомпетентными клетками [1] и отсутствия на них экспрессии HLA антигенов I класса [2]. В отличие от раково/тестикулярных антигенов иммуногенность дифференцировочных антигенов меланоцитов невысока из-за иммунологической толерантности к этим "своим" антигенам. Однако такой антиген, как Melan-A/MART-1, содержит несколько эпитопов для узнавания ЦТЛ (цитотоксические лимфоциты) и способен индуцировать генерацию меланома-специфичных ЦТЛ.A central event in the T-cell immune response against tumor cells is the stimulation of T-receptor recognition of antigenic determinants selectively expressed on tumor cells. Tumor antigens, as a rule, are processed before their presentation in the context of histocompatibility molecules on the cell surface. The different categories of tumor-associated antigens can be divided into three main groups: cancer / testicular antigens (MAGE, BAGE, FRAME, NY-ESO-1, HOM-MEL-40), differentiation antigens of melanocytes (tyrosinase, Melan-A / MART-1, gp100 , TRP-1, TRP-2), and mutated antigens (MUC-1, CDK4, β-catenin gp100-in4, p15, N-acetylglucose amine transferase V). From an immunological point of view, cancer / testicular antigens can be good targets for immunotherapy of tumors, since in normal tissues this group of antigens (MAGE and FRAME) is not expressed, with the exception of testicular tissue, which is inaccessible to cells of the immune system due to the lack of direct contact with immunocompetent cells [1] and the absence of HLA expression of class I antigens on them [2]. Unlike cancer / testicular antigens, the immunogenicity of the differentiation antigens of melanocytes is low due to immunological tolerance to these “their” antigens. However, an antigen such as Melan-A / MART-1 contains several epitopes for the recognition of CTLs (cytotoxic lymphocytes) and is capable of inducing the generation of melanoma-specific CTLs.

Таким образом, экспрессия различных опухолевых маркеров играет одну из ключевых ролей в индукции противоопухолевого иммунитета. Разнообразие соответствующих антигенов позволяет более «комплементарно» подбирать клеточные линии для создания противоопухолевых вакцин.Thus, the expression of various tumor markers plays a key role in the induction of antitumor immunity. A variety of appropriate antigens allows for a more “complementary” selection of cell lines to create antitumor vaccines.

Вакцины, приготовленные на основе опухолевых клеток, являются цельноклеточными вакцинами и представляют собой живые аллогенные или аутологичные опухолевые клетки.Tumor-based vaccines are whole-cell vaccines and are live allogeneic or autologous tumor cells.

Аутологичные/сингенные цельные опухолевые клетки заключают в себе практически все антигены, экспрессированные опухолью хозяина, что снижает риск появления аллергических реакций на чужеродные неопухолеспецифичные антигены, а также снижается риск контаминации патогенными вирусами и внутриклеточными паразитами. Вакцина, состоящая из нескольких клеточных линий (поливалентная вакцина), содержит широкий спектр опухолевых антигенов и используется как аллогенная. Такая поливалентная вакцина, как вакцина Mortona и соавт. [3], состоит из трех аллогенных меланомных клеточных линий с высокой экспрессией поверхностных иммуногенных глико- и липопротеинов и ганглиозидов. Клинические испытания такой вакцины показали, что развитие иммунного ответа как клеточного, так и гуморального типа, на эти антигены коррелировало с повышением выживаемости пациентов. Другая вакцина, «Melacine» [4] (Corixa corp., Canada), состоящая из лизата аллогенных меланомных клеточных линий, вызывает противоопухолевый эффект у 5-10% больных меланомой.Autologous / syngeneic whole tumor cells contain almost all antigens expressed by the host tumor, which reduces the risk of allergic reactions to foreign non-tumor-specific antigens, as well as the risk of contamination by pathogenic viruses and intracellular parasites. A vaccine consisting of several cell lines (multivalent vaccine) contains a wide range of tumor antigens and is used as an allogeneic one. A multivalent vaccine such as Mortona et al. [3], consists of three allogeneic melanoma cell lines with high expression of surface immunogenic glyco- and lipoproteins and gangliosides. Clinical trials of such a vaccine showed that the development of an immune response, both cellular and humoral, to these antigens correlated with increased patient survival. Another vaccine, Melacine [4] (Corixa corp., Canada), consisting of a lysate of allogeneic melanoma cell lines, causes an antitumor effect in 5-10% of melanoma patients.

Задачей настоящего изобретения является получение новой опухолевой клеточной линии меланомы человека, несущей определенный набор антигенов, что позволит использовать ее в создании противоопухолевых вакцин.The objective of the present invention is to obtain a new tumor cell line of human melanoma carrying a specific set of antigens, which will allow its use in the creation of antitumor vaccines.

Технический результат, получаемый при использовании изобретения, выражается в расширении арсенала клеточных линий, используемых для создания противоопухолевых вакцин (цельноклеточных, генно-инженерных), что дает возможность повысить эффективность лечения и увеличения продолжительности жизни при лечении злокачественных новообразований.The technical result obtained by using the invention is expressed in expanding the arsenal of cell lines used to create antitumor vaccines (whole-cell, genetically engineered), which makes it possible to increase the effectiveness of treatment and increase life expectancy in the treatment of malignant neoplasms.

Поставленная задача решается тем, что получена новая клеточная линия mel Н из опухолевого образца диссеминированной меланомы кожи человека.The problem is solved in that a new cell line mel N was obtained from a tumor sample of disseminated human skin melanoma.

Полученная клеточная линия обладает стабильными культуральными и морфологическими характеристиками. Хранится в коллекции клеточных культур института цитологии РАН под номером РККК(П) 715Д.The resulting cell line has stable cultural and morphological characteristics. It is stored in the collection of cell cultures of the Institute of Cytology RAS under the number RKKK (P) 715D.

Родословная клеточной линии mel HPedigree of the mel H cell line

Линия клеток получена из опухолевого образца пациента Х.Н.С., и/б 00/9865, находившегося на лечении в 2001 г. с диагнозом диссеминированная меланома кожи левой стопы. Опухолевый материал получен при удалении метастатического пахового л/узла. Предыдущее лечение пациента: хирургическое, иммуно- и химиотерапевтическое. Стабильно растущая клеточная линия была получена на 31 пассаже.The cell line was obtained from a tumor sample of the patient H.N. S., and / b 00/9865, who was treated in 2001 with a diagnosis of disseminated melanoma of the skin of the left foot. The tumor material was obtained by removal of the metastatic inguinal l / node. Previous patient treatment: surgical, immuno-and chemotherapeutic. A stably growing cell line was obtained at passage 31.

Морфологические признаки клеточной линии mel HMorphological characteristics of the mel H cell line

Клеточная линия mel H состоит из относительно мономорфных клеток мелкого и среднего размеров, округлой, овальной и удлиненной формы без четких цитоплазматических контуров. Цитоплазма обильная негомогенная, окрашена в базофильные тона с розоватым оттенком. Ядра клеток гипо- и нормохромные с зернистым строением хроматина, иногда содержат ядрышки. Редко встречаются 2-х ядерные и гигантские одноядерные и многоядерные клетки. Встречаются митозы.The mel H cell line consists of relatively monomorphic cells of small and medium sizes, round, oval and elongated, without clear cytoplasmic contours. The cytoplasm is plentiful non-homogeneous, colored in basophilic tones with a pinkish tinge. Cell nuclei are hypo- and normochromic with a granular chromatin structure, sometimes they contain nucleoli. Rarely there are 2 nuclear and giant mononuclear and multinuclear cells. There are mitoses.

Кариологическая характеристика клеточной линии mеl НKaryological characteristics of the cell line mel N

Культура характеризуется различающимися диаметрами ядер при одной и той же плотности окраски и состоянии хроматина, характерного для интерфазных ядер. Проанализировано 88 метафаз. Число хромосом в 69 клетках колеблется от 54 до 65 хромосом, что отражает триплоидный набор (3n). В 19 клетках обнаружен гексаплоидный (6n) набор (около 120 хромосом). Это клетки с реплицированными хромосомными наборами, в которых не произошло разделения цитоплазмы, т.е. наличие повышенной полиплоидизации. Обнаружен дополнительный хромосомный материал неизвестного происхождения на длинных плечах двух хромосом 19 и на длинных плечах хромосомы из группы D, инверсия участка хромосомы 16, транслокация хромосом 13 и 15. В 32 клетках отмечаются хромосомные аберрации, представленные дицентрическими (47), трицентрическими (1) и кольцевыми (3) хромосомами. Следовательно, данная культура характеризуется высокой хромосомной изменчивостью. Кариотип - 54~65<3n>,der(13;15)(q10;q10),add(Dq),inv(16)(p11q12),add(19)(q13.4).Culture is characterized by different diameters of the nuclei at the same color density and chromatin state, characteristic of interphase nuclei. 88 metaphases were analyzed. The number of chromosomes in 69 cells ranges from 54 to 65 chromosomes, which reflects the triploid set (3n). A hexaploid (6n) set (about 120 chromosomes) was found in 19 cells. These are cells with replicated chromosome sets, in which there was no separation of the cytoplasm, i.e. the presence of increased polyploidization. Additional chromosome material of unknown origin was found on the long arms of two chromosomes 19 and on the long arms of chromosomes from group D, inversion of chromosome 16, translocation of chromosomes 13 and 15. In 32 cells, chromosome aberrations represented by dicentric (47), tricentric (1) and ring (3) chromosomes. Therefore, this culture is characterized by high chromosomal variation. The karyotype is 54 ~ 65 <3n>, der (13; 15) (q10; q10), add (Dq), inv (16) (p11q12), add (19) (q13.4).

Иммуногенетическое исследование (определение HLA фенотипов (I класс))Immunogenetic study (determination of HLA phenotypes (I class))

А3, А30(19); В13, В7.A3, A30 (19); B13, B7.

Культуральные свойства клеточной линии mеl НThe cultural properties of the cell line mel N

Клеточная линия mel H культивируется в питательной среде RPMI (90%), эмбриональная телячья сыворотка 10%, содержащей антибиотики (пенициллин со стрептомицином в концентрации 100 ед/мл и 100 мкг/мл соответственно). В культуральные флаконы площадью 25 см² в 5 мл среды засевают 1×10⁶ клеток. Температура культивирования 37°С. Монослой клеток формируется через 3-4 дня. При посевной концентрации 70-100 тыс./мл монослой формируется на 2-3 сутки без смены среды. Клетки снимаются с использованием стандартных растворов 0,25% раствора трипсина и 0,02% раствора Версена в соотношении 1:1. При посевной концентрации 500 тыс./мл индекс пролиферации через 48 часов культивирования составляет 3.6-4.6.The mel H cell line is cultured in RPMI nutrient medium (90%), fetal calf serum 10% containing antibiotics (penicillin with streptomycin at a concentration of 100 u / ml and 100 μg / ml, respectively). In culture vials with an area of 25 cm ² in 5 ml of medium, 1 × 10 ⁶ cells are seeded. The cultivation temperature is 37 ° C. A monolayer of cells forms in 3-4 days. At a seed concentration of 70-100 thousand / ml, a monolayer is formed on 2-3 days without changing the medium. Cells are removed using standard solutions of 0.25% trypsin solution and 0.02% Versen solution in a ratio of 1: 1. At a seeding concentration of 500 thousand / ml, the proliferation index after 48 hours of cultivation is 3.6-4.6.

Условия криоконсервацииCryopreservation Conditions

Для длительного хранения клетки консервируют путем замораживания в жидком азоте. Клетки ресуспендируют в среде для замораживания - питательная среда RPMI (80%), эмбриональная телячья сыворотка 20%, 10%ДМСО. Режим замораживания: жидкий азот, снижение температуры на 1°С в минуту до минус 25°С, затем быстрое замораживание до минус 70°С. Хранение в жидком азоте при температуре минус 196°С. Размораживание быстрое, при 37°С. Клетки разводят в 10 мл бессывороточной среды и осаждают центрифугированием, ресуспендируют в 5 мл той же среды, содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки, и переносят в культуральный флакон объемом 25 см. Жизнеспособность клеток оценивают по включению трипанового синего. Жизнеспособность клеток после размораживания составляет 90%.For long-term storage, cells are preserved by freezing in liquid nitrogen. Cells are resuspended in freezing medium — RPMI culture medium (80%), fetal calf serum 20%, 10% DMSO. Freezing mode: liquid nitrogen, temperature decrease by 1 ° С per minute to minus 25 ° С, then quick freezing to minus 70 ° С. Storage in liquid nitrogen at a temperature of minus 196 ° C. Defrosting is quick at 37 ° C. Cells are diluted in 10 ml of serum-free medium and precipitated by centrifugation, resuspended in 5 ml of the same medium containing 10% fetal calf serum, and transferred to a 25 cm culture vial. Cell viability is assessed by the inclusion of trypan blue. Cell viability after thawing is 90%.

КонтаминацияContamination

При длительном наблюдении бактерии и грибы в культуре не обнаружены. Тест на микоплазму отрицателен.With prolonged observation, bacteria and fungi were not found in the culture. Mycoplasma test is negative.

Примеры использования клеточной линии mеl НExamples of the use of the cell line mel N

Пример 1. Культивирование клеточной линии mel H. Опухолевую ткань, полученную при хирургическом удалении метастазов меланомы кожи, разделяли механически на фрагменты величиной 2-3 мм³ в среде RPMI-1640, затем, используя «Cell dissociation sieve-tissue kit» (Sigma), получали суспензию клеток. Количество жизнеспособных клеток определяли по стандартной методике в камере Горяева, используя 0,5% раствор трипанового синего в PBS. В культуральные флаконы площадью 25 см в 5 мл среды засевали 1×10⁶ клеток. Температура культивирования 37°С. Клетки культивировали в среде RPMI 1640, содержащей 10% телячьей эмбриональной сыворотки, 2 мМ L-глутамина, 1% HEPES, пенициллин (100 ед/мл), стрептомицин (100 мкг/мл) и комплекс аминокислот и витаминов (Flow Lab.) в культуральных флаконах (Costar). После 31 пассажа получена стабильно растущая клеточная линия.Example 1. Cultivation of the mel H. cell line. Tumor tissue obtained by surgical removal of skin melanoma metastases was mechanically divided into fragments of 2-3 mm ³ in RPMI-1640 medium, then using the Cell dissociation sieve-tissue kit (Sigma) received a suspension of cells. The number of viable cells was determined by the standard method in the Goryaev chamber using a 0.5% solution of trypan blue in PBS. 1 × 10 ⁶ cells were seeded in culture vials of 25 cm area in 5 ml of medium. The cultivation temperature is 37 ° C. Cells were cultured in RPMI 1640 medium containing 10% fetal calf serum, 2 mM L-glutamine, 1% HEPES, penicillin (100 u / ml), streptomycin (100 μg / ml) and an amino acid and vitamin complex (Flow Lab.) culture bottles (Costar). After passage 31, a stably growing cell line was obtained.

Пример 2. Определение антигенов, экспрессированных на клеточной линии mеl Н. Полученная клеточная линия mel H, обладающая стабильными культуральными и морфологическими характеристиками, с помощью методов иммунофлюоресценции, иммуногистохимии, ПЦР (полимеразно-цепной реакции) анализа была исследована на экспрессируемые гены (дифференцировочные, опухолеассоциированные и гистосовместимости). Дифференцировочные меланомные маркеры, определяющие отношение данной линии к меланоме, исследованы с помощью моноклональных антител CD63, НМВ45, MelanA, Tyrosinaza, HMW. Антигены гистосовместимости определены с помощью моноклональных антител в реакции иммунофлюоресценции.Example 2. Determination of antigens expressed on the mel N. cell line. The obtained mel H cell line with stable cultural and morphological characteristics was tested using immunofluorescence, immunohistochemistry, PCR (polymerase chain reaction) analysis for expressed genes (differentiating, tumor-associated and histocompatibility). Differentiation melanoma markers that determine the ratio of this line to melanoma were studied using monoclonal antibodies CD63, HMB45, MelanA, Tyrosinaza, HMW. Histocompatibility antigens are determined using monoclonal antibodies in an immunofluorescence reaction.

Данная клеточная линия характеризуется экспрессией меланомных (дифференцировочных) маркеров: HMW и CD63, антигенов гистосовместимости первого класса, подчеркивающих специфичность данной клеточной линии. Отмечена отрицательная эксперссия дифференцировочных маркеров НМВ45, MelanA, Tyrosinaza. Положительная экспрессия раково-тестикулярных генов MAGE соответствует онкологическому профилю и позволяет широко использовать данную линию для создания противоопухолевой вакцины. Полученные данные отражены в таблице 1.This cell line is characterized by the expression of melanoma (differentiation) markers: HMW and CD63, histocompatibility antigens of the first class, emphasizing the specificity of this cell line. Negative expression of differentiation markers HMB45, MelanA, Tyrosinaza was noted. The positive expression of the cancer-testicular MAGE genes corresponds to the oncological profile and allows the wide use of this line to create an antitumor vaccine. The data obtained are shown in table 1.

Таблица 1Table 1 Экспрессия антигенов на клеточной линии mel НExpression of antigens on the mel H cell line Дифференцировочные антигеныDifferentiation Antigens Раково-тестикулярные антигеныCancer Testicular Antigens Антигены гистосовместимостиHistocompatibility antigens CD63Cd63 положит.will put. MAGEMAGE положит.will put. HLA (I класс)HLA (I class) положит.will put. НМВ45HMB45 отр.neg.     HLA-DR(II класс)HLA-DR (II class) отр.neg. MelanAMelana отр.neg.         TyrosinazaTyrosinaza отр.neg.         HMWHmw положитwill put        

Как следует из табл. 1, данная клеточная линия характеризуется экспрессией меланомных маркеров: HMW и CD63, подчеркивающих специфичность данной клеточной линии. Положительная экспрессия раково-тестикулярных маркеров семейства MAGE соответствует онкологическому профилю и позволяет широко использовать данную линию для создания противоопухолевой вакцины. Антигены гистосовместимости представлены молекулой первого класса (HLA).As follows from the table. 1, this cell line is characterized by the expression of melanoma markers: HMW and CD63, emphasizing the specificity of this cell line. The positive expression of cancer-testicular markers of the MAGE family corresponds to the oncological profile and allows the wide use of this line to create an antitumor vaccine. Histocompatibility antigens are represented by a first-class molecule (HLA).

Таким образом, данная клеточная линия меланомы кожи человека mel Н имеет свой индивидуальный фенотип опухолевых маркеров, заключающийся в наличии дифференцировочных антигенов - HMW, CD63, раково-тестикулярных генов класса MAGE, а также молекулы гистосовместимости первого класса и отсутствии таких дифференцировочных маркеров, как MelanA, HMB45, Tyrosinaza. Данный фенотип позволяет применять полученную клеточную линию для создания противоопухолевых вакцин (цельноклеточных, генно-инженерных), используемых для лечения меланомы и других злокачественных новообразований.Thus, this cell line of human skin melanoma mel H has its own individual phenotype of tumor markers, consisting in the presence of differentiation antigens - HMW, CD63, cancer-testicular genes of the MAGE class, as well as histocompatibility molecules of the first class and the absence of differentiation markers such as MelanA, HMB45, Tyrosinaza. This phenotype allows the use of the obtained cell line to create antitumor vaccines (whole-cell, genetically engineered) used to treat melanoma and other malignant neoplasms.

Список литературыBibliography

1. Barker C.F. et al. Immunologically privileged sites. ADV. Immunol. 1977, 25: 1-54.1. Barker C.F. et al. Immunologically privileged sites. ADV. Immunol. 1977, 25: 1-54.

2. Tomita Y. et al. Immunohistochemical detection of intracellular adhesion molecule-1 (ICAM-1) and major histocompatibility complex class I antigens in seminoma J. Urol. 149: 659-663, 1993.2. Tomita Y. et al. Immunohistochemical detection of intracellular adhesion molecule-1 (ICAM-1) and major histocompatibility complex class I antigens in seminoma J. Urol. 149: 659-663, 1993.

3. Morton DL et al. Ann N Y Acad Sci 1993; 690: 120.3. Morton DL et al. Ann N Y Acad Sci 1993; 690: 120.

4. Sondak V.K., Sosman J.A. Results of clinical trials with an allogenic melanoma tumor cell lysate vaccine: Melacine/ Semin cancer Biol. 2003. Dec. 13(6): 409-15.4. Sondak V.K., Sosman J.A. Results of clinical trials with an allogenic melanoma tumor cell lysate vaccine: Melacine / Semin cancer Biol. 2003. Dec. 13 (6): 409-15.

Claims (1)

Клеточная линия меланомы человека mel H, используемая для получения противоопухолевых вакцин, хранится в Специализированной коллекции культур клеток позвоночных Российской коллекции клеточных культур Института Цитологии РАН под номером РККК (П) 715Д. The human melanoma cell line mel H used to produce antitumor vaccines is stored in the Specialized Collection of Vertebrate Cell Culture of the Russian Cell Culture Collection of the Institute of Cytology RAS under the number RKKK (P) 715D.