RU2402602C1 - CELL LINE OF HUMAN MELANOMA mel Rac, APPLIED FOR OBTAINING ANTITUMOUR VACCINE - Google Patents

Abstract

FIELD: medicine.

SUBSTANCE: cell line of human melanoma mel Rac has stable cultural and morphological characteristics, is stored in Specialised collection of cell cultures of Institute of Cytology RAS by number "РККК (П) 710 Д".

EFFECT: invention allows to extend arsenal of cell lines of human melanoma, used for creation of antitumour vaccines, which are applied for treatment of melanoma and other malignant neoplasms.

1 tbl, 2 ex

Description

Изобретение относится к области медицинской биотехнологии, в частности к получению клеточных линий, используемых для создания противоопухолевых вакцин.The invention relates to the field of medical biotechnology, in particular to the production of cell lines used to create antitumor vaccines.

Вакцинотерапия является одним из иммунологических подходов в лечении онкологических заболеваний. Принцип данного метода основан на индукции противоопухолевого иммунитета после введения в организм опухолевого антигена.Vaccine therapy is one of the immunological approaches in the treatment of cancer. The principle of this method is based on the induction of antitumor immunity after the introduction of a tumor antigen into the body.

Центральным событием в процессе Т-клеточной иммунной реакции против опухолевых клеток является стимуляция распознавания Т-рецепторами антигенных детерминант, избирательно экспрессированных на опухолевых клетках. Опухолевые антигены, как правило, подвергаются процессингу перед их презентацией в контексте молекул гистосовместимости на клеточной поверхности. Различные категории опухолеассоциированных антигенов можно разделить на три главные группы: раково/тестикулярные антигены (MAGE, BAGE, PRAME, NY-ESO-1, HOM-MEL-40), дифференцировочные антигены меланоцитов (тирозиназа, Melan-A/MART-1, gp100, TRP-1, TRP-2), и мутированные антигены (MUM-1, CDK4, β-катенин gp100-in4, р15, N-ацетилглюкозоаминтрансфераза V). С иммунологической точки зрения раково/тестикулярные антигены могут быть хорошими мишенями для иммунотерапии опухолей, поскольку в нормальных тканях эта группа антигенов (MAGE и PRAME) не экспрессируется за исключением ткани яичек, которые недоступны для клеток иммунной системы из-за отсутствия их прямого контакта с иммунокомпетентными клетками [1] и отсутствия на них экспрессии HLA антигенов I класса [2]. В отличие от раково/тестикулярных антигенов иммуногенность дифференцировочных антигенов меланоцитов невысока из-за иммунологической толерантности к этим "своим" антигенам. Однако такой антиген? как Melan-A/MART-1 содержит несколько эпитопов для узнавания ЦТЛ (цитотоксические лимфоциты) и способен индуцировать генерацию меланомаспецифичных ЦТЛ.A central event in the T-cell immune response against tumor cells is the stimulation of T-receptor recognition of antigenic determinants selectively expressed on tumor cells. Tumor antigens, as a rule, are processed before their presentation in the context of histocompatibility molecules on the cell surface. The various categories of tumor-associated antigens can be divided into three main groups: cancer / testicular antigens (MAGE, BAGE, PRAME, NY-ESO-1, HOM-MEL-40), differentiating melanocyte antigens (tyrosinase, Melan-A / MART-1, gp100 , TRP-1, TRP-2), and mutated antigens (MUM-1, CDK4, β-catenin gp100-in4, p15, N-acetylglucose amine transferase V). From an immunological point of view, cancer / testicular antigens can be good targets for tumor immunotherapy, since in normal tissues this group of antigens (MAGE and PRAME) is not expressed except for testicular tissue, which is inaccessible to cells of the immune system due to the lack of direct contact with immunocompetent cells [1] and the absence of HLA expression of class I antigens on them [2]. Unlike cancer / testicular antigens, the immunogenicity of the differentiation antigens of melanocytes is low due to immunological tolerance to these “their” antigens. However, such an antigen? as Melan-A / MART-1 contains several epitopes for the recognition of CTLs (cytotoxic lymphocytes) and is able to induce the generation of melanomaspecific CTLs.

Таким образом, экспрессия различных опухолевых маркеров играет одну из ключевых ролей в индукции противоопухолевого иммунитета. Разнообразие соответствующих антигенов позволяет более «комплементарно» подбирать клеточные линии для создания противоопухолевых вакцин.Thus, the expression of various tumor markers plays a key role in the induction of antitumor immunity. A variety of appropriate antigens allows for a more “complementary” selection of cell lines to create antitumor vaccines.

Вакцины, приготовленные на основе опухолевых клеток, являются цельноклеточными вакцинами и представляют собой живые аллогенные или аутологичные опухолевые клетки.Tumor-based vaccines are whole-cell vaccines and are live allogeneic or autologous tumor cells.

Аутологичные/сингенные цельные опухолевые клетки заключают в себе практически все антигены, экспрессированные опухолью хозяина, что снижает риск появления аллергических реакций на чужеродные неопухолеспецифичные антигены, а также снижается риск контаминации патогенными вирусами и внутриклеточными паразитами. Вакцина, состоящая из нескольких клеточных линий (поливалентные вакцины), содержит широкий спектр опухолевых антигенов и используется как аллогенная. Такая поливалентная вакцина, как вакцина Mortona и соавт. [3], состоит из трех аллогенных меланомных клеточных линий с высокой экспрессией поверхностных иммуногенных глико- и липопротеинов и ганглиозидов. Клинические испытания такой вакцины показали, что развитие иммунного ответа, как клеточного, так и гуморального типа, на эти антигены коррелировало с повышением выживаемости пациентов. Другая вакцина, «Melacine» [4] (Corixa corp., Canada), состоящая из лизата аллогенных меланомных клеточных линий, вызывает противоопухолевый эффект у 5-10% больных меланомой.Autologous / syngeneic whole tumor cells contain almost all antigens expressed by the host tumor, which reduces the risk of allergic reactions to foreign non-tumor-specific antigens, as well as the risk of contamination by pathogenic viruses and intracellular parasites. A vaccine consisting of several cell lines (multivalent vaccines) contains a wide range of tumor antigens and is used as an allogeneic one. A multivalent vaccine such as Mortona et al. [3], consists of three allogeneic melanoma cell lines with high expression of surface immunogenic glyco- and lipoproteins and gangliosides. Clinical trials of such a vaccine showed that the development of an immune response, both cellular and humoral, to these antigens correlated with an increase in patient survival. Another vaccine, Melacine [4] (Corixa corp., Canada), consisting of a lysate of allogeneic melanoma cell lines, causes an antitumor effect in 5-10% of melanoma patients.

Задачей настоящего изобретения является получение новой опухолевой клеточной линии меланомы человека, несущей определенный набор антигенов, что позволит использовать ее в создании противоопухолевых вакцин.The objective of the present invention is to obtain a new tumor cell line of human melanoma carrying a specific set of antigens, which will allow its use in the creation of antitumor vaccines.

Технический результат, получаемый при использовании изобретения, выражается в расширении арсенала клеточных линий, используемых для создания противоопухолевых вакцин (цельноклеточных, генноинженерных), что дает возможность повысить эффективность лечения и увеличения продолжительности жизни больных злокачественными новообразованиями.The technical result obtained by using the invention is expressed in expanding the arsenal of cell lines used to create antitumor vaccines (whole-cell, genetically engineered), which makes it possible to increase the effectiveness of treatment and increase the life expectancy of patients with malignant neoplasms.

Поставленная задача решается тем, что получена новая клеточная линия mel Rac из опухолевого образца диссеминированной меланомы кожи человека.The problem is solved in that a new cell line mel Rac was obtained from a tumor sample of disseminated human skin melanoma.

Полученная клеточная линия обладает стабильными культуральными и морфологическими характеристиками. Хранится в коллекции клеточных культур института цитологии РАН под номером РККК(П) 710Д.The resulting cell line has stable cultural and morphological characteristics. It is stored in the collection of cell cultures of the Institute of Cytology RAS under the number RKKK (P) 710D.

Родословная клеточной линии mel RacPedigree of the mel Rac cell line

Линия клеток получена из опухолевого образца пациента Р.Д.М., и/б 95/5520, находившегося на лечении в 2002 г. с диагнозом диссеминированная меланома кожи правой голени. Предшествующее лечение - хирургическое.The cell line was obtained from a tumor sample of the patient R.M., and / b 95/5520, who was treated in 2002 with a diagnosis of disseminated melanoma of the skin of the right lower leg. The previous treatment is surgical.

Получение клеточной линии met RacObtaining met Rac cell line

Опухолевая ткань получена хирургическим путем при удалении метастатического узла из мягких тканей правого бедра. Из опухолевой ткани готовили суспензию клеток. Полученную суспензию клеток засевали во флаконы и культивировали в течение длительного времени. Стабильно растущая клеточная линия была получена на 20 пассаже.Tumor tissue was obtained surgically by removing a metastatic node from the soft tissues of the right thigh. A cell suspension was prepared from tumor tissue. The resulting cell suspension was seeded into vials and cultured for a long time. A stably growing cell line was obtained at passage 20.

Морфологические признаки клеточной линии mel RacMorphological characteristics of the mel Rac cell line

Цитограмма клеточной линии mel Rac представлена полиморфным клеточным составом. Присутствуют клетки округлой, веретенообразной, вытянутой, удлиненной, многотросчатой и неправильной формы. Ядра клеток резко гиперхромные с зернистым и грубоглыбчатым строением хроматина, часто содержат гипертрофированные ядрышки. Наблюдается фрагментация и почкование ядер. Цитоплазма клеток негомогенная, интенсивно базофильная.The cytogram of the mel Rac cell line is represented by a polymorphic cell composition. There are cells of round, spindle-shaped, elongated, elongated, multi-branch and irregular shapes. The nuclei of the cells are sharply hyperchromic with a granular and coarse-grained chromatin structure, often contain hypertrophic nucleoli. Fragmentation and budding of nuclei is observed. The cytoplasm of cells is not homogeneous, intensively basophilic.

Кариологическая характеристика клеточной линии mel RacKaryological characteristics of the mel Rac cell line

Дата фиксации клеток: 17.11.05Cell fixation date: 11/17/05

Культура равномерна по диаметрам ядер, плотности окраски и состоянию хроматина. Проанализировано 18 метафаз. Число хромосом колеблется от 60 до 80. Модальное число хромосом соответствует триплоидному набору (3n). Обнаружен дополнительный хромосомный материал неизвестного происхождения на коротком плече хромосомы 1. Встречаются маркерные хромосомы (от 1 до 3 шт. в клетке). В целом в культуре наблюдаются сложные множественные перестройки, идентифицировать которые без применения молекулярно-цитогенетических методов невозможно. Практически во всех клетках обнаруживаются дицентрические хромосомы (от 1 до 5 шт. в клетке).The culture is uniform in core diameters, color density and chromatin state. Analyzed 18 metaphases. The number of chromosomes ranges from 60 to 80. The modal number of chromosomes corresponds to the triploid set (3n). An additional chromosome material of unknown origin was found on the short arm of chromosome 1. Marker chromosomes (from 1 to 3 pieces per cell) are found. In general, in culture, there are complex multiple rearrangements that cannot be identified without the use of molecular cytogenetic methods. In almost all cells, dicentric chromosomes are detected (from 1 to 5 pcs. In the cell).

Кариотип - 60~80<3n>, add(1)(p36),+1~3mar,incKaryotype - 60 ~ 80 <3n>, add (1) (p36), + 1 ~ 3mar, inc

Иммуногенетическое исследование (определение HLA фенотипов (I класс))Immunogenetic study (determination of HLA phenotypes (I class))

А23(9), А26(10); В39(16), В8.A23 (9), A26 (10); B39 (16), B8.

Культуральные свойства клеточной линии mel RacThe cultural properties of the mel Rac cell line

Клеточная линия mel Rac культивируется в питательной среде RPMI (90%), эмбриональной телячьей сыворотке 10%, содержащей антибиотики (пенициллин и стрептомицин в концентрации 100 ед/мл и 100 мкг/мл соответственно). В культуральные флаконы объемом 25 см² в 5 мл среды засевают 1×10⁶ клеток. Температура культивирования 37°С. Монослой клеток формируется через 3-4 дня. При посевной концентрации 70-100 тыс./мл монослой формируется на 2-3 сутки без смены среды. Клетки снимаются с использованием стандартных растворов: 0,25% раствора трипсина и 0,02% раствора Версена в соотношении 1:1. При посевной концентрации 500 тыс/мл индекс пролиферации через 48 часов культивирования составляет 3.6-4.6.The mel Rac cell line is cultured in RPMI culture medium (90%), 10% fetal calf serum containing antibiotics (penicillin and streptomycin at a concentration of 100 u / ml and 100 μg / ml, respectively). 1 × 10 ⁶ cells are seeded in culture vials of 25 cm ² volume in 5 ml of medium. The cultivation temperature is 37 ° C. A monolayer of cells forms in 3-4 days. At a seed concentration of 70-100 thousand / ml, a monolayer is formed on 2-3 days without changing the medium. Cells are removed using standard solutions: 0.25% trypsin solution and 0.02% Versen solution in a ratio of 1: 1. At a seeding concentration of 500 thousand / ml, the proliferation index after 48 hours of cultivation is 3.6-4.6.

Условия криоконсервацииCryopreservation Conditions

Для длительного хранения клетки консервируют путем замораживания в жидком азоте. Клетки ресуспендируют в среде для замораживания - питательная среда RPMI (80%), эмбриональная телячья сыворотка (20%), ДМСО (10%). Режим замораживания: жидкий азот, снижение температуры на 1°С в минуту до минус 25°С, затем быстрое замораживание до температуры минус 70°С. Хранение в жидком азоте при температуре минус 196°С. Размораживание быстрое, при 37°С. Клетки разводят в 10 мл бессывороточной среды, осаждают центрифугированием, ресуспендируют в 5 мл той же среды, содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки, и переносят в культуральный флакон объемом 25 см. Жизнеспособность клеток оценивают по включению трипанового синего. Жизнеспособность клеток после размораживания составляет 90%.For long-term storage, cells are preserved by freezing in liquid nitrogen. Cells are resuspended in freezing medium — RPMI culture medium (80%), fetal calf serum (20%), DMSO (10%). Freezing mode: liquid nitrogen, lowering the temperature by 1 ° С per minute to minus 25 ° С, then quick freezing to a temperature of minus 70 ° С. Storage in liquid nitrogen at a temperature of minus 196 ° C. Defrosting is quick at 37 ° C. Cells are diluted in 10 ml of serum-free medium, precipitated by centrifugation, resuspended in 5 ml of the same medium containing 10% fetal calf serum, and transferred to a 25 cm culture vial. Cell viability is assessed by the inclusion of trypan blue. Cell viability after thawing is 90%.

КонтаминацияContamination

При длительном наблюдении бактерии и грибы в культуре не обнаружены. Тест на микоплазму отрицателен.With prolonged observation, bacteria and fungi were not found in the culture. Mycoplasma test is negative.

Примеры использования клеточной линии mel RacExamples of use of the mel Rac cell line

Пример 1. Культивирование клеточной линии mel Rac. Опухолевую ткань, полученную хирургическим путем, разделяли механически на фрагменты величиной 2-3 мм³ в среде RPMI-1640, затем, используя «Cell dissociation sieve-tissue kit» (Sigma), получали суспензию клеток. Количество жизнеспособных клеток определяли по стандартной методике в камере Горяева, используя 0,5% раствор трипанового синего в PBS. В культуральные флаконы объемом 25 см² в 5 мл среды засевали 1×10⁶ клеток. Температура культивирования 37°С. Клетки культивировали в среде RPMI 1640, содержащей 20% телячьей эмбриональной сыворотки, 2 мМ L-глутамина, 1% HEPES, пенициллин (100 ед/мл), стрептомицин (100 мкг/мл) и комплекс аминокислот и витаминов (Flow Lab.) в культуральных флаконах (Costar). После 20 пассажа получена стабильно растущая клеточная линия.Example 1. The cultivation of the cell line mel Rac. Surgical tumor tissue was mechanically divided into fragments of 2-3 mm ³ in RPMI-1640 medium, then using a Cell dissociation sieve-tissue kit (Sigma), a cell suspension was obtained. The number of viable cells was determined by the standard method in the Goryaev chamber using a 0.5% solution of trypan blue in PBS. 1 × 10 ⁶ cells were seeded in culture vials of 25 cm ² volume in 5 ml of medium. The cultivation temperature is 37 ° C. Cells were cultured in RPMI 1640 medium containing 20% fetal calf serum, 2 mM L-glutamine, 1% HEPES, penicillin (100 u / ml), streptomycin (100 μg / ml) and an amino acid and vitamin complex (Flow Lab.) culture bottles (Costar). After passage 20, a stably growing cell line was obtained.

Пример 2. Определение антигенов, экспрессированных на клеточной линии mel Рас. Полученная клеточная линия mel Рас, обладающая стабильными культуральными и морфологическими характеристиками, с помощью методов иммунофлюоресценции, иммуногистохимии, ПЦР (полимеразно-цепной реакции) анализа была исследована на экспрессируемые антигены (дифференцировочные, опухолеассоциированные и гистосовместимости). Дифференцировочные меланомные маркеры, определяющие отношение данной линии к меланоме, исследованы с помощью моноклональных антител CD63, НМВ45, MelanA, HMW, Tyrosinaza. Раково-тестикулярные маркеры класса MAGE, которые могут быть экспрессированы на опухолях различного гистогенеза, исследованы в реакции ПЦР. Антигены гистосовместимости определены с помощью моноклональных антител в реакции иммунофлюоресценции. Полученные данные отражены в таблице 1.Example 2. The definition of antigens expressed on the cell line mel Ras. The obtained mel Ras cell line possessing stable cultural and morphological characteristics, using immunofluorescence, immunohistochemistry, and PCR (polymerase chain reaction) analysis methods, was tested for expressed antigens (differentiating, tumor-associated and histocompatibilities). Differentiating melanoma markers determining the ratio of this line to melanoma were studied using monoclonal antibodies CD63, HMB45, MelanA, HMW, Tyrosinaza. Cancer-testicular markers of the MAGE class, which can be expressed on tumors of various histogenesis, were investigated in the PCR reaction. Histocompatibility antigens are determined using monoclonal antibodies in an immunofluorescence reaction. The data obtained are shown in table 1.

Таблица 1Table 1 Экспрессия антигенов на клеточной линии mel Rac.Expression of antigens on the mel Rac cell line. Дифференцировочные АнтигеныDifferentiation Antigens Раково-тестикулярные АнтигеныCancer Testicular Antigens Антигены гистосовместимостиHistocompatibility antigens CD63Cd63 положитwill put MAGEMAGE положитwill put HLA (I класс)HLA (I class) положитwill put НМВ45HMB45 отрneg     HLA-DR(II класс)HLA-DR (II class) положитwill put MelanAMelana отрneg         TyrosinazaTyrosinaza отрneg         HMWHmw положитwill put        

Как следует из табл.1, данная клеточная линия характеризуется экспрессией меланомных маркеров: CD63, HMW, подчеркивающих специфичность данной клеточной линии. Положительная экспрессия раково-тестикулярных маркеров семейства MAGE соответствует онкологическому профилю и позволяет широко использовать данную линию для создания противоопухолевой вакцины. Антигены гистосовместимости представлены молекулой первого и второго класса (HLA).As follows from table 1, this cell line is characterized by the expression of melanoma markers: CD63, HMW, emphasizing the specificity of this cell line. The positive expression of cancer-testicular markers of the MAGE family corresponds to the oncological profile and allows the wide use of this line to create an antitumor vaccine. Histocompatibility antigens are represented by a molecule of the first and second class (HLA).

Таким образом, данная клеточная линия меланомы кожи человека mel Rac имеет свой индивидуальный фенотип опухолевых маркеров, заключающийся в наличии дифференцировочных антигенов HMW, CD63 и раково-тестикулярных маркеров семейства MAGE; отсутствии антигенов MelanA, HMB45, Tyrosinaza, а также наличии молекул гистосовместимости первого и второго класса, что позволяет применять полученную клеточную линию для создания противоопухолевых вакцин (цельноклеточных, генноинженерных), используемых для лечения меланомы и других злокачественных новообразований.Thus, this cell line of melanoma of human skin mel Rac has its own individual phenotype of tumor markers, consisting in the presence of differentiating antigens HMW, CD63 and cancer-testicular markers of the MAGE family; the absence of antigens MelanA, HMB45, Tyrosinaza, as well as the presence of histocompatibility molecules of the first and second class, which allows the use of the obtained cell line to create antitumor vaccines (whole cell, genetically engineered) used to treat melanoma and other malignant neoplasms.

Список литературыBibliography

1. Barker C.F. et al. Immunologically privileged sites. ADV. Immunol. 1977; 25:1-54.1. Barker C.F. et al. Immunologically privileged sites. ADV. Immunol. 1977; 25: 1-54.

2. Tomita Y. et al. Immunohistochemical detection of intracellular adhesion molecule-1 (ICAM-1) and major histocompatibility complex class I antigens in seminoma J. Urol. 1993; 149:659-663.2. Tomita Y. et al. Immunohistochemical detection of intracellular adhesion molecule-1 (ICAM-1) and major histocompatibility complex class I antigens in seminoma J. Urol. 1993; 149: 659-663.

3. Morton DL et al. Ann N Y Acad Sci 1993; 690:120.3. Morton DL et al. Ann N Y Acad Sci 1993; 690: 120.

4. Sondak V.K. Sosman J.A. Results of clinical trials with an allogenic melanoma tumor cell lysate vaccine: Melacine/ Semin cancer Biol. 2003. Dec. 13(6): 409-15.4. Sondak V.K. Sosman J.A. Results of clinical trials with an allogenic melanoma tumor cell lysate vaccine: Melacine / Semin cancer Biol. 2003. Dec. 13 (6): 409-15.

Claims (1)

Клеточная линия меланомы человека mel Rac, используемая для создания противоопухолевых вакцин, хранится в Специализированной коллекции культур клеток позвоночных Российской коллекции клеточных культур под номером РККК (П) 710 Д. The mel Rac human melanoma cell line used to create antitumor vaccines is stored in the Specialized Collection of Vertebrate Cell Culture of the Russian Cell Culture Collection under the number RACC (P) 710 D.