RU2499048C1 - Recombinant plasmid, recombinant strain, recombinant protein bmp-2 and extraction method of recombinant protein in dimeric form - Google Patents

Abstract

FIELD: biotechnologies.

SUBSTANCE: invention represents recombinant BMPRIA-CBD plasmid, and E.coli strain transformed with that plasmid. The invention also refers to recombinant BMPRIA-CBD protein that is used for production of BMP-2 protein.

EFFECT: invention allows producing chromatographic clean fractions of biologically active dimeric form of BMP-2 protein, which can be used as osteoinductive components of osteoplastic materials of new generation.

4 cl, 2 dwg, 6 ex

Description

Изобретение относится к биотехнологии, генной инженерии и медицине и может быть использовано для получения обладающей биологической активностью димерной формы рекомбинантного костного морфогенетического белка ВМР-2, которая может применяться в качестве остеоиндуктивного компонента костнопластических материалов медицинского назначения: имплантатов, покрытий и др.The invention relates to biotechnology, genetic engineering and medicine and can be used to obtain a dimeric form of the recombinant bone morphogenetic protein BMP-2, which has biological activity, which can be used as an osteoinductive component of bone-plastic medical materials: implants, coatings, etc.

Одним из ключевых компонентов современных костнопластических материалов, обеспечивающих их высокую остеоиндуктивность, являются костные морфогенетические белки. На сегодняшний день известно около двадцати видов костных морфогенетических белков, которые играют важную роль в регуляции роста, дифференцировки и апоптоза клеток различных типов, включая остеобласты, хондробласты, нервные клетки, эпителиальные клетки и др. [Sakou T. Bone morphogenetic proteins: from basic studies to clinical approaches. Bone. 1998, Vol.22, P.591-603].Bone morphogenetic proteins are one of the key components of modern bone-plastic materials providing their high osteoinductance. Today, about twenty types of bone morphogenetic proteins are known that play an important role in the regulation of growth, differentiation, and apoptosis of various types of cells, including osteoblasts, chondroblasts, nerve cells, epithelial cells, etc. [Sakou T. Bone morphogenetic proteins: from basic studies to clinical approaches. Bone 1998, Vol.22, P.591-603].

Ведущая роль в формировании и регенерации костной и хрящевой тканей принадлежит костным морфогенетическим белкам, обладающим выраженными остеоиндуктивными свойствами [Urist M.R., Strates B.S. Bone morphogenetic protein. J Dent Res. 1971, Vol.50, P.1392-1406; Urist M.R., Nogami H., Mikulski A. A bone morphogenetic polypeptide. Calcif Tissue Res. Suppl. 1976, P.81-87]. Среди всего многообразия костных морфогенетических белков ведущую роль в остеогенезе играют несколько факторов, в том числе BMP-2. В норме BMP-2 находится в костной ткани в комплексе с высокомолекулярными гликозоаминогликанами и высвобождается при повреждениях кости, что способствует миграции мезенхимальных клеток и их дифференцировке в остеобласты, а также стимулирует пролиферацию клеток. Основной функцией костного морфогенетического белка 2 является поддержание нормального остеогенеза в организме [Chen D., Zhao M., Mundy G.R. Bone morphogenetic proteins. Growth Factors. 2004, Vol.22, P.233-241; Bessa P.C., Casal M., Reis R.L. Bone morphogenetic proteins in tissue engineering: the road from the laboratory to the clinic, part I (basic concepts). J Tissue Eng Regen Med. 2008, Vol.2, P.1-13].The leading role in the formation and regeneration of bone and cartilage tissue belongs to bone morphogenetic proteins with pronounced osteoinductive properties [Urist M.R., Strates B.S. Bone morphogenetic protein. J Dent Res. 1971, Vol.50, P.1392-1406; Urist M.R., Nogami H., Mikulski A. A bone morphogenetic polypeptide. Calcif Tissue Res. Suppl. 1976, P.81-87]. Among the whole variety of bone morphogenetic proteins, several factors, including BMP-2, play the leading role in osteogenesis. Normally, BMP-2 is in the bone tissue in complex with high molecular weight glycosaminoglycans and is released during bone damage, which contributes to the migration of mesenchymal cells and their differentiation into osteoblasts, and also stimulates cell proliferation. The main function of bone morphogenetic protein 2 is to maintain normal osteogenesis in the body [Chen D., Zhao M., Mundy G.R. Bone morphogenetic proteins. Growth Factors. 2004, Vol.22, P.233-241; Bessa P.C., Casal M., Reis R.L. Bone morphogenetic proteins in tissue engineering: the road from the laboratory to the clinic, part I (basic concepts). J Tissue Eng Regen Med. 2008, Vol.2, P.1-13].

Нативный белок BMP-2 является гомодимером, который состоит из двух полипептидных цепей, соединенных S-S-связью остатков цистеина каждой субъединицы. Каждая мономерная единица в составе белка также имеет внутренние S-S-связи, образованные остатками цистеинов. Показано, что только в форме димера, стабилизированного S-S-связями, BMP-2 обладает биологической активностью и способен взаимодействовать с рецепторами остеогенных клеток - трансмембранными серин/треониновыми киназами, активируя пролиферацию и дифференцировку остеобластов [Reddi A.H. Morphogenesis and tissue engineering of bone and cartilage: inductive signals stem cells, and biomimetic biomaterials. Tissue Eng. 2000, Vol.6, P.351-359].The native BMP-2 protein is a homodimer that consists of two polypeptide chains linked by the S-S bond of the cysteine residues of each subunit. Each monomer unit in the protein also has internal S-S bonds formed by cysteine residues. It was shown that only in the form of a dimer stabilized by S-S bonds, BMP-2 has biological activity and is able to interact with osteogenic cell receptors - transmembrane serine / threonine kinases, activating the proliferation and differentiation of osteoblasts [Reddi A.H. Morphogenesis and tissue engineering of bone and cartilage: inductive signals stem cells, and biomimetic biomaterials. Tissue Eng. 2000, Vol.6, P.351-359].

Выделение и очистка рекомбинантного белка BMP-2, получаемого методом бактериального синтеза в клетках E.coli, сопряжено с рядом сложностей, связанных с необходимостью удаления липополисахаридов, балластных белков, ДНК и РНК штаммов-продуцентов, а также получения белка в функционально активной димерной форме, т.е. отделения фракций, содержащих мономеры, тримеры и т.д. [Шарапова Н.Е., Котнова А.П., Галушкина З.М., Лаврова Н.В., Полетаева Н.Н., Тухватулин А.Э., Семихин А.С., Громов А.В., Соболева Л.А., Ершова А.С., Зайцев В.В., Сергиенко О.В., Лунин В.Г., Карягина А.С. Получение рекомбинантного костного морфогенетического белка 2 человека в клетках Escherichia coli и тестирование его биологической активности in vitro и in vivo. Молекулярная биология. 2010, №6, С.1036-1044].Isolation and purification of the recombinant protein BMP-2, obtained by bacterial synthesis in E. coli cells, is associated with a number of difficulties associated with the need to remove lipopolysaccharides, ballast proteins, DNA and RNA of producer strains, as well as to obtain the protein in a functionally active dimeric form, those. separation of fractions containing monomers, trimers, etc. [Sharapova N.E., Kotnova A.P., Galushkina Z.M., Lavrova N.V., Poletaeva N.N., Tukhvatulin A.E., Semikhin A.S., Gromov A.V., Soboleva L.A., Ershova A.S., Zaitsev V.V., Sergienko O.V., Lunin V.G., Karyagina A.S. Obtaining recombinant bone morphogenetic protein 2 of a person in Escherichia coli cells and testing its biological activity in vitro and in vivo. Molecular biology. 2010, No. 6, S.1036-1044].

Установлено, что различные BMP способны связываться с рецепторами двух типов: типа I и типа II. Наиболее хорошо изучены условия взаимодействия BMP с рецепторами типа I, к которым относятся такие рецепторы, как BMPRIA (ALK3), BMPRIB (ALK6), ActRIA (ALK2) и др., способные взаимодействовать с этими белками только в форме димера и образовывать с ними комплексы [Kirsch T., Nickel J., Sebald W. Isolation of recombinant BMP receptor IA ectodomain and its 2:1 complex with BMP-2. FEBS Letters. 2000, Vol.468, P.215-219]. В работе коллектива ten Dijke P. показано, что в присутствии рецептора типа II (DAF4) ВМР-4 (ближайший аналог ВМР-2) максимально эффективно взаимодействует с BMPRIA и BMPRIB, a BMP-7 - с ActRIA и BMPRIB, и гораздо слабее - с BMPRIA [ten Dijke P., Yamashita H., Sampath T.K., Reddi A.H., Estevez M., Riddle D.L., Ichijo H., Heldin C.H., Miyazono K. Identification of type I receptors for osteogenicprotein-1 and bone morphogenetic protein-4. J Biol Chem. 1994, Vol.269 (25), P.16985-16988].It has been established that various BMPs are capable of binding to two types of receptors: type I and type II. The conditions for the interaction of BMP with type I receptors are most well studied, which include receptors such as BMPRIA (ALK3), BMPRIB (ALK6), ActRIA (ALK2), etc., capable of interacting with these proteins only in the form of a dimer and form complexes with them [Kirsch T., Nickel J., Sebald W. Isolation of recombinant BMP receptor IA ectodomain and its 2: 1 complex with BMP-2. FEBS Letters. 2000, Vol.468, P.215-219]. The work of ten Dijke P. showed that in the presence of type II receptor (DAF4) BMP-4 (the closest analogue of BMP-2) interacts with BMPRIA and BMPRIB as efficiently as possible, while BMP-7 interacts with ActRIA and BMPRIB, and much weaker with BMPRIA [ten Dijke P., Yamashita H., Sampath TK, Reddi AH, Estevez M., Riddle DL, Ichijo H., Heldin CH, Miyazono K. Identification of type I receptors for osteogenicprotein-1 and bone morphogenetic protein-4 . J Biol Chem. 1994, Vol.269 (25), P.16985-16988].

В другой работе изучалось связывание BMP с иммобилизованными рецепторами [Heinecke K., Seher A., Schmitz W., Mueller T.D., Sebald W., Nickel J. Receptor oligomerization and beyond: a case study in bone morphogenetic proteins. BMC Biol. 2009, Vol.7, P.59]. Результаты свидетельствуют о том, что BMP-2 и ВМР-7 связываются с BMPRIA и BMPRIB, при этом BMPRIA эффективно связывает BMP-2 (KDkin=0,8).Another study examined the binding of BMP to immobilized receptors [Heinecke K., Seher A., Schmitz W., Mueller T. D., Sebald W., Nickel J. Receptor oligomerization and beyond: a case study in bone morphogenetic proteins. BMC Biol. 2009, Vol.7, P.59]. The results indicate that BMP-2 and BMP-7 bind to BMPRIA and BMPRIB, while BMPRIA effectively binds BMP-2 (KDkin = 0.8).

Описанные свойства рецепторов могут быть использованы для выделения и очистки биологически активной димерной формы белка BMP-2.The described properties of the receptors can be used to isolate and purify the biologically active dimeric form of the BMP-2 protein.

В качестве ближайшего аналога может быть принято изобретение (патент №2408727 от 10.01.2011), в котором решена задача получения рекомбинантного белка ВМР-2 за счет его синтеза в бактериальных клетках в форме бифункционального белка Collbd-BMP2 с коллагенсвязывающим доменом, что позволяет иммобилизовать его на коллагенсодержащем носителе. Однако использование предлагаемого способа иммобилизации на коллагене для выделения белка затруднительно по двум причинам. Во-первых, при иммобилизации путем аффинного взаимодействия коллагенсвязывающего домена белка Collbd-BMP2 с коллагенсодержащим носителем будет происходить связывание всех форм белка: мономеров, димеров, тримеров и т.д., т.е., выделение биологически активной димерной формы таким образом невозможно. Во-вторых, следует отметить, что коллагенсодержащие носители довольно дороги.As the closest analogue, the invention can be adopted (patent No. 2408727 from 01/10/2011), in which the problem of producing the BMP-2 recombinant protein by synthesizing it in bacterial cells in the form of the bifunctional Collbd-BMP2 protein with a collagen binding domain is solved, which allows it to be immobilized on a collagen-containing carrier. However, the use of the proposed method of immobilization on collagen for protein isolation is difficult for two reasons. Firstly, upon immobilization of the Collbd-BMP2 protein by the affinity interaction of the collagen-binding domain with a collagen-containing carrier, all forms of the protein will bind: monomers, dimers, trimers, etc., i.e., the isolation of the biologically active dimeric form is thus impossible. Secondly, it should be noted that collagen-containing carriers are quite expensive.

Задачей, решаемой заявленной группой изобретений, является разработка эффективной технологии получения и очистки рекомбинантного белка BMP-2, обеспечивающей получение препарата белка в биологически активной форме димера высокой степени очистки.The problem solved by the claimed group of inventions is the development of an effective technology for the preparation and purification of recombinant protein BMP-2, which provides the preparation of the protein in the biologically active form of a highly purified dimer.

Упомянутая задача решается за счет получения рекомбинантного белка BMPRIA, являющегося рецептором BMP-2, в частности, за счет введения в его состав целлюлозосвязывающего домена (CBD), а также за счет введения между функциональными доменами спейсерной последовательности для сохранения возможности каждого домена связываться со своим лигандом. Помимо этого, упомянутая задача решается за счет возможности одностадийной иммобилизации рекомбинантного белка BMPRIA с целлюлозосвязывающим доменом (CBD), на целлюлозосодержащей колонке, а также способности димерной формы BMP-2 связываться с рецептором BMPRIA.This problem is solved by obtaining the recombinant BMPRIA protein, which is a BMP-2 receptor, in particular, by introducing a cellulose-binding domain (CBD) into its composition, as well as by introducing a spacer sequence between the functional domains to preserve the ability of each domain to bind its ligand . In addition, this problem is solved due to the possibility of a one-step immobilization of the recombinant protein BMPRIA with a cellulose-binding domain (CBD) on a cellulose-containing column, as well as the ability of the dimeric form of BMP-2 to bind to the BMPRIA receptor.

Сущность изобретения заключается в том, что способ получения рекомбинантного белка BMP-2 включает следующие стадии:The essence of the invention lies in the fact that the method for producing recombinant protein BMP-2 includes the following stages:

- подготовка сорбента с иммобилизованным белком BMPRIA, куда входят следующие операции: получение рекомбинантной плазмиды pBMPRIA, выращивание клеток штамма Escherichia coli M15 [pREP4, pBMPRIA], индукция синтеза белка BMPRIA-CBD, разрушение клеток и получение супернатанта, содержащего белок BMPRIA-CBD, иммобилизация белка BMPRIA-CBD и отмывание целлюлозосодержащего сорбента со связавшимся белком;- preparation of the sorbent with the immobilized BMPRIA protein, which includes the following operations: obtaining the recombinant plasmid pBMPRIA, growing cells of the strain Escherichia coli M15 [pREP4, pBMPRIA], inducing the synthesis of BMPRIA-CBD protein, disrupting cells and obtaining a supernatant containing BMPRIA-CBD protein, immobilization BMPRIA-CBD protein and washing the cellulose-containing sorbent with the bound protein;

- заполнение хроматографической колонки подготовленным сорбентом;- filling the chromatographic column with a prepared sorbent;

- сорбция димерной формы рекомбинантного белка BMP-2;- sorption of the dimeric form of the recombinant protein BMP-2;

- элюирование димерной формы сорбированного белка BMP-2;- elution of the dimeric form of the sorbed protein BMP-2;

- анализ собранной фракции методом электрофореза в неденатурирующих условиях по Лэммли;- analysis of the collected fraction by electrophoresis in non-denaturing conditions according to Laemmli;

и отличается тем, что рекомбинантная плазмида pBMPRIA-CBD размером 4408 п.н. обеспечивает экспрессию рекомбинантного белка BMPRIA-CBD, состоящего из сигнала L-аспарагиназы Е.coli, эктодомена рецептора BMPRIA человека, спейсера из остатков глицина и серина и целлюлозосвязывающего домена CBD, и содержит:and characterized in that the recombinant plasmid pBMPRIA-CBD size of 4408 BP provides expression of the recombinant protein BMPRIA-CBD, consisting of the E. coli L-asparaginase signal, the human BMPRIA receptor ectodomain, the spacer from glycine and serine residues, and the cellulose-binding domain of CBD, and contains:

- искусственный бактериальный оперон химерных белков, включающий: промоторную область раннего промотора бактериофага Т5 (7-87 п.н.), обеспечивающую эффективную транскрипцию контролируемой мРНК; рекомбинантный ген, обеспечивающий экспрессию целевого химерного белка (сигнал L-аспарагиназы - рецептор BMPRIA - спейсер - целлюлозосвязывающий домен CBD) (117-1124 п.н.); нетранслируемую область терминации транскрипции бактериального оперона, обеспечивающую эффективное окончание транскрипции (1164-1258 п.н.);- an artificial bacterial operon of chimeric proteins, including: the promoter region of the early promoter of the T5 bacteriophage (7-87 bp), which provides efficient transcription of controlled mRNA; a recombinant gene that provides expression of the target chimeric protein (L-asparaginase signal — BMPRIA receptor — spacer — CBD cellulose-binding domain) (117-1124 bp); the untranslated region of the transcription termination of the bacterial operon, which ensures the effective termination of transcription (1164-1258 bp);

- бактериальный оперон bla (3343-4203 п.н. комплементарной цепи), кодирующий белок бета-лактамазу, являющуюся селективным маркером для отбора клонов-трансформантов E.coli методом селекции на ампициллине;- the bacterial operon bla (3343-4203 bp of the complementary chain) encoding a beta-lactamase protein, which is a selective marker for selection of E. coli transforming clones by the method of selection on ampicillin;

- бактериальный участок инициации репликации типа ColEl, обеспечивающий репликацию плазмиды в штаммах E.coli (1630 п.н.).- a bacterial replication initiation site of the ColEl type, which provides plasmid replication in E. coli strains (1630 bp).

Рекомбинантный белок BMPRIA-CBD состоит из сигнального пептида из L-аспарагиназы AspB E.coli, эктодомена рецептора BMPRIA человека, спейсера из остатков глицина и серина и целлюлозосвязывающего домена CBD, и одновременно обладает способностью BMPRIA связываться со своим лигандом ВМР-2 в форме димера, а также способностью CBD взаимодействовать с целлюлозосодержащим сорбентом.The recombinant BMPRIA-CBD protein consists of a signal peptide of AspB E. coli L asparaginase, the human BMPRIA ectodomain, a spacer of glycine and serine residues, and the CBD cellulose-binding domain, and at the same time has the ability of BMPRIA to bind to its BMP-2 ligand in the form of a dimer, as well as the ability of CBD to interact with a cellulose-containing sorbent.

Штамм Escherichia coli M15 [pREP4, p BMPRIA-CBD], полученный трансформацией штамма Escherichia coli M15/pREP4 плазмидой pBMPRIA-CBD, который является продуцентом рекомбинантного белка BMPRIA-CBD, состоящего из сигнала L-аспарагиназы AspB E.coli, эктодомена рецептора BMPRIA человека, спейсера из остатков глицина и серина и целлюлозосвязывающего домена CBD.The strain Escherichia coli M15 [pREP4, p BMPRIA-CBD], obtained by transformation of the strain Escherichia coli M15 / pREP4 with the plasmid pBMPRIA-CBD, which is a producer of the recombinant BMPRIA-CBD protein, consisting of the human L asparaginase signal AspB E. coli, the ecto-domain of the human receptor , a spacer of glycine and serine residues and the CBD cellulose binding domain.

Техническим результатом заявленного изобретения является обеспечение получения хроматографически чистого белка BMP-2 в димерной форме высокой степени очистки, пригодного для использования в качестве компонентов костно-пластических материалов нового поколения.The technical result of the claimed invention is the provision of obtaining chromatographically pure protein BMP-2 in the dimeric form of a high degree of purification, suitable for use as components of osteoplastic materials of a new generation.

Таким образом, технический результат достигается за счет того, что разработана технология выделения и очистки BMP-2, основанная на его специфическом взаимодействии с рецептором BMPRIA.Thus, the technical result is achieved due to the fact that a technology for the isolation and purification of BMP-2 has been developed, based on its specific interaction with the BMPRIA receptor.

Также указанный технический результат достигается тем, что создана рекомбинантная плазмида pBMPRIA-CBD, кодирующая бифункциональный рекомбинантный белок BMPRIA-CBD, с одной стороны, содержащий аминокислотную последовательность рецептора BMPRIA, а с другой стороны - обладающий способностью связываться с целлюлозосодержащим сорбентом, благодаря наличию целлюлозосвязывающего домена CBD из Anaerocellum thermophillum.The indicated technical result is also achieved by the fact that a recombinant plasmid pBMPRIA-CBD was created, encoding the bifunctional recombinant protein BMPRIA-CBD, on the one hand, containing the amino acid sequence of the BMPRIA receptor, and on the other hand, having the ability to bind to the cellulose-containing sorbent, due to the presence of the cellulose-binding domain CBD from Anaerocellum thermophillum.

Упомянутый технический результат достигается с помощью создания штамма Escherichia coli M15 [pREP4, pBMPRIA-CBD], являющегося продуцентом рекомбинантного белка BMPRIA-CBD. При этом отсутствие в клетках E.coli белков, способных связываться с целлюлозой, служит гарантией того, что рекомбинантный белок BMPRIA-CBD является единственным белком штамма Escherichia coli M15 [pREP4, pBMPRIA-CBD], прочно связывающимся с целлюлозосодержащим сорбентом.The mentioned technical result is achieved by creating a strain of Escherichia coli M15 [pREP4, pBMPRIA-CBD], which is a producer of the recombinant protein BMPRIA-CBD. At the same time, the absence of proteins capable of binding to cellulose in E. coli cells ensures that the recombinant protein BMPRIA-CBD is the only protein of the Escherichia coli M15 strain [pREP4, pBMPRIA-CBD] that binds strongly to the cellulose-containing sorbent.

Таким образом, технический результат достигается за счет создания:Thus, the technical result is achieved by creating:

во-первых, рекомбинантной плазмиды pBMPRIA-CBD с последовательностью SEQ ID NO:1 размером 4408 п.н., обеспечивающей экспрессию рекомбинантного белка BMPRIA-CBD, состоящего из сигнала L-аспарагиназы Е.coli, эктодомена рецептора BMPRIA человека, спейсера из остатков глицина и серина и целлюлозосвязывающего домена CBD, и состоящей из следующих структурных элементов:firstly, the recombinant plasmid pBMPRIA-CBD with the sequence SEQ ID NO: 1 of size 4408 bp, providing expression of the recombinant protein BMPRIA-CBD, consisting of the signal of E. coli L-asparaginase, human BMPRIA receptor ectodomain, spacer from glycine residues and serine and the cellulose-binding domain of CBD, and consisting of the following structural elements:

- искусственный бактериальный оперон химерных белков, включающий: промоторную область раннего промотора бактериофага Т5 (7-87 п.н.), обеспечивающую эффективную транскрипцию контролируемой мРНК; рекомбинантный ген, обеспечивающий экспрессию целевого химерного белка (сигнал L-аспарагиназы - рецептор BMPRIA - спейсер - целлюлозосвязывающий домен CBD) (117-1124 п.н.); нетранслируемую область терминации транскрипции бактериального оперона, обеспечивающую эффективное окончание транскрипции (1164-1258 п.н.);- an artificial bacterial operon of chimeric proteins, including: the promoter region of the early promoter of the T5 bacteriophage (7-87 bp), which provides efficient transcription of controlled mRNA; a recombinant gene that provides expression of the target chimeric protein (L-asparaginase signal — BMPRIA receptor — spacer — CBD cellulose-binding domain) (117-1124 bp); the untranslated region of the transcription termination of the bacterial operon, which ensures the effective termination of transcription (1164-1258 bp);

- бактериальный оперон bla (3343-4203 п.н. комплементарной цепи), кодирующий белок бета-лактамазу, являющуюся селективным маркером для отбора клонов-трансформантов E.coli методом селекции на ампициллине;- the bacterial operon bla (3343-4203 bp of the complementary chain) encoding a beta-lactamase protein, which is a selective marker for selection of E. coli transforming clones by the method of selection on ampicillin;

- бактериальный участок инициации репликации типа ColEl, обеспечивающий репликацию плазмиды в штаммах Е.coli (1630 п.н.).- a bacterial site of ColEl-type replication initiation, which provides plasmid replication in E. coli strains (1630 bp).

Во-вторых, рекомбинантного штамма Escherichia coli M15 [pREP4, pBMPRIA-CBD], полученного трансформацией штамма Escherichia coli M15/pREP4 плазмидой по п.1, продуцента рекомбинантного белка BMPRIA-CBD, состоящего из сигнала L-аспарагиназы AspB E.coli, эктодомена рецептора BMPRIA человека, спейсера из остатков глицина и серина и целлюлозосвязывающего домена CBD.Secondly, the recombinant strain of Escherichia coli M15 [pREP4, pBMPRIA-CBD] obtained by transforming the strain of Escherichia coli M15 / pREP4 with the plasmid according to claim 1, a producer of the recombinant BMPRIA-CBD protein consisting of AspB E. coli L-asparaginase signal, ectode human BMPRIA receptor, spacer from glycine and serine residues, and the CBD cellulose binding domain.

В-третьих, рекомбинантного белка BMPRIA-CBD для выделения рекомбинантного белка BMP-2 в димерной форме из раствора, и состоящего из сигнального пептида из L-аспарагиназы AspB E.coli с последовательностью SEQ ID NO:2, эктодомена рецептора BMPRIA человека с последовательностью SEQ ID NO:3, спейсера из остатков глицина и серина с последовательностью SEQ ID NO:4 и целлюлозосвязывающего домена CBD с последовательностью SEQ ID NO:5, и одновременно обладает способностью BMPRIA связываться со своим лигандом ВМР-2 в форме димера, а также способностью CBD взаимодействовать с целлюлозосодержащим сорбентом.Thirdly, the recombinant BMPRIA-CBD protein for isolation of the recombinant BMP-2 protein in dimeric form from a solution, and consisting of a signal peptide from AspB E. coli L-asparaginase with the sequence SEQ ID NO: 2, human BMPRIA receptor ectodomain with the SEQ sequence ID NO: 3, a spacer of glycine and serine residues with the sequence SEQ ID NO: 4 and the cellulose binding domain of CBD with the sequence of SEQ ID NO: 5, and at the same time has the ability of BMPRIA to bind to its BMP-2 ligand in the form of a dimer, as well as the ability of CBD interact with cellulose holding sorbent.

В-четвертых, за счет способа выделения димерной формы рекомбинантного белка BMP-2, включающего следующие стадии:Fourth, due to the method for isolating the dimeric form of the recombinant protein BMP-2, comprising the following steps:

- подготовка сорбента с иммобилизованным белком BMPRIA-CBD, включающая: получение рекомбинантной плазмиды pBMPRIA-CBD, выращивание клеток штамма Escherichia coli M15 [pREP4, pBMPRIA- CBD], индукция синтеза белка BMPRIA-CBD, разрушение клеток и получение супернатанта, содержащего белок BMPRIA-CBD, иммобилизация белка BMPRIA-CBD и отмывание целлюлозосодержащего сорбента со связавшимся белком;- preparation of the sorbent with immobilized protein BMPRIA-CBD, including: obtaining a recombinant plasmid pBMPRIA-CBD, growing cells of the strain Escherichia coli M15 [pREP4, pBMPRIA-CBD], inducing protein synthesis BMPRIA-CBD, cell destruction and obtaining supernatant containing protein BMPRIA- CBD, immobilization of the BMPRIA-CBD protein and washing of the cellulose-containing sorbent with the bound protein;

- заполнение хроматографической колонки подготовленным сорбентом и раствором рекомбинантного белка BMP-2;- filling the chromatographic column with a prepared sorbent and a solution of recombinant protein BMP-2;

- сорбция димерной формы рекомбинантного белка BMP-2;- sorption of the dimeric form of the recombinant protein BMP-2;

- элюирование димерной формы сорбированного белка BMP-2;- elution of the dimeric form of the sorbed protein BMP-2;

- анализ собранной фракции методом электрофореза в неденатурирующих условиях.- analysis of the collected fraction by electrophoresis in non-denaturing conditions.

Штамм E.coli M15 [pREP4], содержащий плазмиду pBMPRIA-CBD, - продуцент рекомбинантного белка BMPRIA-CBD и штамм E.coli M15 [pREP4], содержащий плазмиду pBMPRIB-CBD, - продуцент рекомбинантного белка BMPRIB-CBD характеризуются следующими признаками.The E. coli strain M15 [pREP4] containing the plasmid pBMPRIA-CBD is the producer of the recombinant protein BMPRIA-CBD and the E. coli strain M15 [pREP4] containing the plasmid pBMPRIB-CBD is the producer of the recombinant protein BMPRIB-CBD characterized by the following features.

Культурально-морфологические признаки. Клетки прямые, палочковидные, неподвижные, грамотрицательные. При рассеве на чашке с 1,5% LB-агаром рост в виде отдельных колоний, иногда в R-форме с неровными краями. Хорошо растет на плотных и жидких питательных средах (LB-бульон, LB-arap, МПА, МПБ).Cultural and morphological characters. Cells are straight, rod-shaped, motionless, gram-negative. When sieving on a plate with 1.5% LB agar, growth in the form of separate colonies, sometimes in the R-form with uneven edges. It grows well in dense and liquid nutrient media (LB-broth, LB-arap, MPA, MPB).

Физиолого-биохимические признаки. Клетки растут в пределах +4-42°C при оптимуме pH 6,8-7,5. Штаммы разлагают глюкозу, маннит с образованием кислоты, не разлагают сахарозу, арабинозу, галактозу, сбраживают мальтозу, ксилозу, сорбит, рамнозу. Существенным при использовании данных штаммов является их чувствительность к налидиксовой кислоте (25 мг/мл), стрептомицину (20 мг/мл) и рифампицину (25 мг/мл). Проявляют устойчивость к ампициллину (до 100 мкг/мл), обусловленную наличием плазмиды pBMPRIA-CBD, и к канамицину (до 25 мкг/мл), обусловленную наличием плазмиды pREP4. Указанный технический результат достигается также тем, что рекомбинантный белок BMPRIA-CBD, включающий в себя аминокислотную последовательность, определяющую его способность связывался с целлюлозосодержащим сорбентом, обеспечивает возможность его иммобилизации на сорбенте прямо из лизата, получаемого после разрушения и центрифугирования бактериальных клеток-продуцентов, и не требует проведения предварительной очистки.Physiological and biochemical characteristics. Cells grow between + 4-42 ° C with an optimum pH of 6.8-7.5. Strains decompose glucose, mannitol with the formation of acid, do not decompose sucrose, arabinose, galactose, ferment maltose, xylose, sorbitol, rhamnose. Significant when using these strains is their sensitivity to nalidixic acid (25 mg / ml), streptomycin (20 mg / ml) and rifampicin (25 mg / ml). Resistant to ampicillin (up to 100 μg / ml) due to the presence of plasmid pBMPRIA-CBD and to kanamycin (up to 25 μg / ml) due to the presence of plasmid pREP4. The indicated technical result is also achieved by the fact that the recombinant protein BMPRIA-CBD, which includes the amino acid sequence that determines its ability to bind to the cellulose-containing sorbent, makes it possible to immobilize it on the sorbent directly from the lysate obtained after destruction and centrifugation of bacterial producer cells, and not requires preliminary cleaning.

Также упомянутый технический результат достигается с помощью анализа полученных фракций белка ВМР-2 методом электрофореза в неденатурирующих условиях, что позволяет оценить соотношение и количество разных олигомерных форм белка (мономеров, димеров, тетрамеров и др. в анализируемом образце.Also, the mentioned technical result is achieved by analyzing the obtained fractions of BMP-2 protein by electrophoresis under non-denaturing conditions, which allows us to estimate the ratio and number of different oligomeric forms of the protein (monomers, dimers, tetramers, etc. in the analyzed sample.

Изобретение проиллюстрировано графическими материалами, на которых изображены: на фиг.1 - схема плазмиды pBMPRIA-CBD, на фиг.2 - электрофореграмма анализа собранной фракции белка BMP-2 методом электрофореза в неденатурирующих условиях по Лэммли (где 1 - препарат рекомбинантного белка BMP-2, до очистки; 2 - рекомбинантный белок BMPRIA-CBD, мол. масса 33,4 кДа; 3 - сорбированный белок BMP-2 (мол. масса 33,4 кДа) в комплексе с BMPRIA-CBD (мол. масса 33,4 кДа) и целлюлозосодержащим сорбентом; 4 - препарат белка BMP-2 (димер) после элюирования с сорбента, мол. масса 36 кДа; 5 - маркер молекулярной массы, 15 кДа, 23 кДа, 32 кДа, 45 кДа, 56 кДа.); последовательность нуклеотидов плазмиды pBMPRIA-CBD последовательность №1, последовательность аминокислот сигнального пептида L-asparaginase (AsnB) E.coli - последовательность №2, последовательность аминокислот эктодомена рецептора костного морфогенетического белка IA (BMPRIA) - последовательность №3, последовательность аминокислот глицин-серинового спейсера - последовательность №4, последовательность аминокислот целлюлозосвязывающего домена CBD - последовательность №5.The invention is illustrated by graphic materials, which depict: in Fig. 1 is a diagram of plasmid pBMPRIA-CBD, in Fig. 2 is an electrophoregram for analysis of the collected BMP-2 protein fraction by electrophoresis under non-denaturing Laemmli conditions (where 1 is a preparation of recombinant BMP-2 protein , before purification; 2 - recombinant protein BMPRIA-CBD, molecular weight 33.4 kDa; 3 - sorbed protein BMP-2 (molecular weight 33.4 kDa) in combination with BMPRIA-CBD (molecular weight 33.4 kDa ) and cellulose-containing sorbent; 4 - preparation of protein BMP-2 (dimer) after elution from the sorbent, mol. mass 36 kDa; 5 - marker molecule polar mass, 15 kDa, 23 kDa, 32 kDa, 45 kDa, 56 kDa.); the nucleotide sequence of plasmid pBMPRIA-CBD sequence No. 1, the amino acid sequence of the signal peptide L-asparaginase (AsnB) E. coli - sequence No. 2, the amino acid sequence of the ectodomain of the bone morphogenetic protein receptor IA (BMPRIA) - sequence No. 3, the amino acid sequence of the glycine-serine spacer - sequence No. 4, the amino acid sequence of the cellulose-binding domain of CBD - sequence No. 5.

Все стандартные генно-инженерные и микробиологические манипуляции, а также амплификацию и секвенирование ДНК проводили по известным методикам (Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж., Молекулярное клонирование. М., Мир, 1984; Под ред. Гловера Д., Клонирование ДНК. Методы. Пер. с англ. М., Мир, 1988; Saiki R.K., Gelfand D.H., Stoffel S., Sharf S.J., Higuchi R., Horn G.T., Mullis K.B., Erlich Н.А. Science. 1988, Vol.239, №4839, P.487-491; Sanger F., Nicklen S., Coulson A.R. Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1977, Vol.74, P.5463-5467).All standard genetic engineering and microbiological manipulations, as well as amplification and DNA sequencing, were performed according to well-known methods (Maniatis T., Fritsch E., Sambrook J., Molecular cloning. M., Mir, 1984; Edited by D. Glover, Cloning DNA, Methods, Translated from English by M., Mir, 1988; Saiki RK, Gelfand DH, Stoffel S., Sharf SJ, Higuchi R., Horn GT, Mullis KB, Erlich N.A. Science. 1988, Vol. 239, No. 4839, P.487-491; Sanger F., Nicklen S., Coulson AR Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1977, Vol.74, P.5463-5467).

Ниже приведены примеры, иллюстрирующие изобретение.The following are examples illustrating the invention.

Пример 1. Подготовка сорбента с иммобилизованным белком BMPRIA-CBD.Example 1. Preparation of the sorbent with immobilized protein BMPRIA-CBD.

а) Получение рекомбинантной плазмиды pBMPRIA-CBD. Фрагмент гена, кодирующий эктодомен рецептора BMPR-IA, получали синтетически. Для этого участок нуклеотидной последовательности гена BMPRIA, кодирующий эктодомен рецептора BMPRIA, разбивали на 8 олигонуклеотидов. Олигонуклеотиды спланированы таким образом, что при гибридизации они образуют двухцепочечный фрагмент ДНК, содержащий липкие концы, соответствующие сайтам гидролиза рестриктаз NcoI (CCATGG) и BglII (AGATCT). При синтезе олигонуклеотиды были фосфорилированы по 5'-концу.a) Obtaining a recombinant plasmid pBMPRIA-CBD. A gene fragment encoding the ectodomain of the BMPR-IA receptor was synthetically prepared. For this, the portion of the nucleotide sequence of the BMPRIA gene encoding the ectodomain of the BMPRIA receptor was partitioned into 8 oligonucleotides. Oligonucleotides are designed in such a way that upon hybridization they form a double-stranded DNA fragment containing sticky ends corresponding to the restriction enzyme hydrolysis sites NcoI (CCATGG) and BglII (AGATCT). In the synthesis, oligonucleotides were phosphorylated at the 5'-end.

Для получения двухцепочечного фрагмента ДНК смесь олигонуклетидов в эквимолярном количестве (по 20 пкМ) прогревали при 95°C (10 мин) и в течение 4 часов охлаждали до 25°C.To obtain a double-stranded DNA fragment, a mixture of oligonucleotides in an equimolar amount (20 pcM) was heated at 95 ° C (10 min) and cooled to 25 ° C for 4 hours.

Затем плазмидный вектор ptt10, содержащий участок, кодирующий глицин-сериновый спейсер - целлюлозосвязывающий домен CBD, гидролизовали эндонуклеазами рестрикции NcoII и BamHI при 37°C в буфере, содержащем 66 мМ Трис-ацетата (pH 7,9 при 37°C), 20 мМ ацетата магния, 132 мМ ацетата калия и 0,2 мг/мл BSA в течение 1,5 ч.Then, the ptt10 plasmid vector containing the region encoding the glycine-serine spacer, the CBD cellulose-binding domain, was hydrolyzed with restriction endonucleases NcoII and BamHI at 37 ° C in a buffer containing 66 mM Tris-acetate (pH 7.9 at 37 ° C), 20 mM magnesium acetate, 132 mm potassium acetate and 0.2 mg / ml BSA for 1.5 hours

Полученную смесь, содержащую двухцепочечные фрагменты гена эктодомена рецептора BMPRIA размером 255 п.н., объединяли с фрагментом плазмиды ptt10 (4153 п.н.), гидролизованной эндонуклеазами рестрикции NcoI и BamHI. Лигирование проводили с помощью ДНК-лигазы фага Т4 в буфере, содержащем 40 мМ Трис-HCl (pH 7,8 при 25°C), 10 мМ хлористого магния, 10 мМ ДТТ и 5 мМ АТФ. Лигированную смесь ДНК использовали для трансформации клеток E.coli M15 [pREP4] методом электропорации. Трансформированные клетки отбирали на агаризованной среде LB с антибиотиками канамицином (25 мкг/мл) и ампициллином (100 мкг/мл). Из отобранных рекомбинантных клонов выделяли плазмидную ДНК pBMPRIA-CBD методом щелочного лизиса. Отобранные клоны секвенировали и подтвердили наличие вставки, кодирующей эктодомен рецептора BMPRIA человека.The resulting mixture containing 255 bp double-stranded fragments of the BMPRIA receptor ectodomain gene was combined with a fragment of ptt10 plasmid (4153 bp) hydrolyzed by restriction endonucleases NcoI and BamHI. Ligation was performed using T4 phage DNA ligase in a buffer containing 40 mM Tris-HCl (pH 7.8 at 25 ° C), 10 mM magnesium chloride, 10 mM DTT, and 5 mM ATP. The ligated DNA mixture was used to transform E. coli M15 [pREP4] cells by electroporation. Transformed cells were selected on LB agar medium with antibiotics kanamycin (25 μg / ml) and ampicillin (100 μg / ml). PBMPRIA-CBD plasmid DNA was isolated from the selected recombinant clones by alkaline lysis. Selected clones were sequenced and confirmed the presence of an insert encoding the ectodomain of the human BMPRIA receptor.

б) Выращивание клеток штамма Escherichia coli M15 [pREP4, pBMPRIA-CBD].b) Growing cells of the strain Escherichia coli M15 [pREP4, pBMPRIA-CBD].

Для получения штамма E.coli - продуцента рекомбинантного белка BMPRIA-CBD, клетки штамма E.coli M15 [pREP4] (Nal^s, Str^s, rif^s, lac^-, ara^-, gal^-, mtl^-, F^-, recA⁺, uvr⁺) трансформировали плазмидой pBMPRIA-CBD. Трансформированные клетки выращивали в 500 мл среды LB при 37°C до оптической плотности, соответствующей 1 ед. поглощения при длине волны 600 нм.To obtain a strain of E. coli, a producer of the recombinant protein BMPRIA-CBD, cells of the strain E. coli M15 [pREP4] (Nal ^s , Str ^s , rif ^s , lac ^- , ara ^- , gal ^- , mtl ^- , F ^- , recA ⁺ , uvr ⁺ ) was transformed with the plasmid pBMPRIA-CBD. Transformed cells were grown in 500 ml of LB medium at 37 ° C to an optical density corresponding to 1 unit. absorption at a wavelength of 600 nm.

в) Индукция синтеза белка BMPRIA-CBD.c) Induction of BMPRIA-CBD protein synthesis.

По достижении культурой оптической плотности, соответствующей 1 ед. поглощения при длине волны 600 нм, индуцировали синтез рекомбинантного белка BMPRIA-CBD путем добавления в среду 150 мкл 0,1 М раствора изопропил-бета-D-тиогалактопиранозида. Затем культуру выращивали в течение 4 часов.Upon reaching the culture of optical density corresponding to 1 unit absorbance at a wavelength of 600 nm, the synthesis of the recombinant BMPRIA-CBD protein was induced by adding 150 μl of a 0.1 M solution of isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside to the medium. Then the culture was grown for 4 hours.

г) Разрушение клеток и получение супернатанта, содержащего белок BMPRIA-CBD.g) Destruction of cells and obtaining a supernatant containing protein BMPRIA-CBD.

Биомассу клеток (1,5 г) суспендировали в 50 мл буфера, содержащего 1% тритона X-100, 100 мМ NaCl, 25 мМ трис-HCl, pH 8,0. Добавляли лизоцим до концентрации 10 мкг/мл, инкубировали в течение 15-30 мин и разрушали клетки ультразвуком (амплитуда 45%, 1,5 мин дважды с перерывом в 10 мин). Лизат осветляли центрифугированием при 13000 g в течение 30 мин. Супернатант содержал растворимый рекомбинантный белок BMPRIA-CBD.Cell biomass (1.5 g) was suspended in 50 ml of buffer containing 1% Triton X-100, 100 mM NaCl, 25 mM Tris-HCl, pH 8.0. Lysozyme was added to a concentration of 10 μg / ml, incubated for 15-30 min and the cells were destroyed by ultrasound (amplitude 45%, 1.5 min twice with an interval of 10 min). The lysate was clarified by centrifugation at 13,000 g for 30 minutes. The supernatant contained soluble recombinant protein BMPRIA-CBD.

д) Иммобилизация белка BMPRIA-CBD и отмывание целлюлозосодержащего сорбента со связавшимся белком.d) Immobilization of the BMPRIA-CBD protein and washing of the cellulose-containing sorbent with the bound protein.

Полученный супернатант, содержащий белок BMPRIA-CBD, инкубировали с 20 мл 50% суспензии целлюлозосодержащего сорбента (perloza MT 200, Iontosorb, Чехия) в течение 4-18 часов. Затем сорбент тщательно и многократно отмывали от несвязавшегося белка раствором, содержащим 1% тритона Х-100, 100 мМ NaCl, 25 мМ трис-HCl, pH 8,0, путем суспендирования сорбента в буфере и последующего центрифугирования. Полученный сорбент содержал в качестве аффинного лиганда иммобилизованный BMPRIA-CBD (приблизительно 1 мг белка на 1 мл сорбента) (фиг.2, дорожка 2).The resulting supernatant containing BMPRIA-CBD protein was incubated with 20 ml of a 50% suspension of cellulose-containing sorbent (perloza MT 200, Iontosorb, Czech Republic) for 4-18 hours. Then, the sorbent was thoroughly and repeatedly washed from an unbound protein with a solution containing 1% Triton X-100, 100 mM NaCl, 25 mM Tris-HCl, pH 8.0, by suspending the sorbent in a buffer and subsequent centrifugation. The resulting sorbent contained immobilized BMPRIA-CBD as an affinity ligand (approximately 1 mg protein per 1 ml of sorbent) (FIG. 2, lane 2).

Пример 2. Заполнение хроматографической колонки подготовленным сорбентом.Example 2. Filling the chromatographic column with a prepared sorbent.

В колонку вносили 5 мл сорбента с BMPRIA-CBD и для уравновешивания пропускали через нее десятикратный объем буферного раствора, содержащего 100 мМ NaCl, 25 мМ трис-HCl, pH 8,0.5 ml of a sorbent with BMPRIA-CBD was added to the column, and for equilibration a ten-fold volume of a buffer solution containing 100 mM NaCl, 25 mM Tris-HCl, pH 8.0 was passed through it.

Пример 3. Сорбция димерной формы рекомбинантного BMP-2.Example 3. Sorption of the dimeric form of recombinant BMP-2.

Раствор рекомбинантного белка BMP-2, содержащий мономерные, димерные и другие олигомерные формы белка (фиг.2, дорожка 1), пропускали через подготовленную колонку со скоростью 1 мл в минуту. Димерная форма ВМР-2 связывалась с иммобилизованным на сорбенте белком BMPRIA-CBD (фиг.2, дорожка 3).A solution of the recombinant BMP-2 protein containing monomeric, dimeric, and other oligomeric forms of the protein (FIG. 2, lane 1) was passed through a prepared column at a rate of 1 ml per minute. The dimeric form of BMP-2 was associated with the BMPRIA-CBD protein immobilized on the sorbent (Fig. 2, lane 3).

Пример 4. Элюирование димерной формы сорбированного белка BMP-2.Example 4. Elution of the dimeric form of the sorbed protein BMP-2.

Колонку со связавшимся белком BMP-2 промывали пятикратным объемом буфера, содержащего 100 мМ NaCl, 25 мМ трис-HCl, pH 8,0. Элюирование связавшейся димерной формы белка BMP-2 проводили с помощью пропускания через колонку 20 мл буферного раствора, содержащего 1,5 М NaCl в 25 мМ трис-HCl, pH 8,0, со скоростью 1 мл в минуту (фиг.2, дорожка 4).The BMP-2 bound protein column was washed with five times the volume of buffer containing 100 mM NaCl, 25 mM Tris-HCl, pH 8.0. The bound dimeric form of the BMP-2 protein was eluted by passing through a column 20 ml of a buffer solution containing 1.5 M NaCl in 25 mM Tris-HCl, pH 8.0, at a rate of 1 ml per minute (FIG. 2, lane 4 )

Пример 5. Анализ собранных фракций методом электрофореза в неденатурирующих условиях по Лэммли.Example 5. Analysis of collected fractions by electrophoresis under non-denaturing conditions according to Laemmli.

Для анализа собранных фракций рекомбинантного белка BMP-2 в димерной форме применяли метод электрофореза в ПААГ в неденатурирующих условиях. Разделение белков проводили в 12% полиакриламидном геле в стандартной системе буферов (электродный буфер: 25 мМ Трис-HCl, 192 мМ глицина, 0,1% додецилсульфата натрия, pH 8,3; буфер для геля: 375 мМ Трис-HCl, pH 8,8). Образцы вносили в лунки концентрирующего геля (4% акриламида и 3% N,N-метиленбисакриламида, 0,125 М трис-HCl, pH 6,8) в лизирующем буфере, содержащем 50 мМ Трис-HCl, pH 6,8, 10% глицерина, 0,01% бромфенолового синего. Электрофоретическое разделение проводили при токе 20 мА до достижения бромфеноловым синим нижней границы разделяющего геля. Белковые зоны окрашивали красителем Кумасси R 250, растворенным в смеси вода/спирт/уксусная кислота в соотношении 5:3:1, а затем неокрашенные зоны отмывали раствором, содержащим 10% ледяной уксусной кислоты и 10% изопропанола (фиг.2).To analyze the collected fractions of the recombinant protein BMP-2 in dimeric form, the SDS page electrophoresis method under non-denaturing conditions was used. Protein separation was carried out on a 12% polyacrylamide gel in a standard buffer system (electrode buffer: 25 mM Tris-HCl, 192 mM glycine, 0.1% sodium dodecyl sulfate, pH 8.3; gel buffer: 375 mm Tris-HCl, pH 8 ,8). Samples were added to the wells of a concentration gel (4% acrylamide and 3% N, N-methylenebisacrylamide, 0.125 M Tris-HCl, pH 6.8) in lysis buffer containing 50 mm Tris-HCl, pH 6.8, 10% glycerol, 0.01% bromophenol blue. Electrophoretic separation was carried out at a current of 20 mA until bromphenol blue reached the lower boundary of the separating gel. Protein zones were stained with Coomassie R 250 dye, dissolved in a 5: 3: 1 ratio of water / alcohol / acetic acid, and then the unpainted zones were washed with a solution containing 10% glacial acetic acid and 10% isopropanol (Fig. 2).

Пример 6. Определение биологической активности препарата рекомбинантного белка ВМР-2 в форме димера. Проверку биологической активности препаратов рекомбинантных белков BMP-2 и ВМР-7 осуществляли в системе in vitro в культурах клеток линий С2С12 и С3Н10Т1/2 [Шарапова Н.Е., Котнова А.П., Галушкина З.М., Лаврова Н.В., Полетаева Н.Н., Тухватулин А.Э., Семихин А.С., Громов А.В., Соболева Л.А., Ершова А.С., Зайцев В.В., Сергиенко О.В., Лунин В.Г., Карягина А.С. Получение рекомбинантного костного морфогенетического белка 2 человека в клетках Escherichia coli и тестирование его биологической активности in vitro и in vivo. Молекулярная биология. 2010, №6. С.1036-1044].Example 6. Determination of the biological activity of the preparation of the recombinant protein BMP-2 in the form of a dimer. The biological activity of the preparations of the recombinant proteins BMP-2 and BMP-7 was verified in an in vitro system in cultures of C2C12 and C3H10T1 / 2 cell lines [Sharapova N.E., Kotnova A.P., Galushkina Z.M., Lavrova N.V. ., Poletaeva N.N., Tukhvatulin A.E., Semikhin A.S., Gromov A.V., Soboleva L.A., Ershova A.S., Zaitsev V.V., Sergienko O.V., Lunin V.G., Karyagina A.S. Obtaining recombinant bone morphogenetic protein 2 of a person in Escherichia coli cells and testing its biological activity in vitro and in vivo. Molecular biology. 2010, No.6. S.1036-1044].

Клетки мышей линий С2С12 и С3Н10Т1/2 засевали в концентрации 10⁴ клеток на лунку в 48-луночном планшете и культивировали с использованием среды DMEMF12 (Biofluids, США), содержащей 10% фетальной сыворотки крупного рогатого скота (Gibco, США), при 37°C во влажной камере в атмосфере 5% СО₂ в течение 24 часов. Затем клетки в течение трех суток инкубировали в 400 мл среды DMEMF12, содержащей 0,5% фетальной сыворотки крупного рогатого скота и рекомбинантный белок BMP-2 (1, 10, 100 мкг). Отмывали клетки фосфатно-солевым буферным раствором и разрушали их с помощью добавления 0,1% раствора Тритон-Х-100 в фосфатно-солевом буферном растворе и трехкратной процедуры замораживания-оттаивания для разрушения клеточных мембран. Активность щелочной фосфатазы определяли по общепринятой методике с использованием р-нитрофенилфосфата в качестве субстрата. Концентрацию белка определяли по методу Бредфорд. В качестве положительного контроля использовали коммерческий препарат белка BMP-2 человека (BioVision Research Products), в качестве отрицательного - буферный раствор.Cells of C2C12 and C3H10T1 / 2 mice were seeded at a concentration of 10 ⁴ cells per well in a 48-well plate and cultured using DMEMF12 medium (Biofluids, USA) containing 10% fetal cattle serum (Gibco, USA) at 37 ° C in a humid chamber in an atmosphere of 5% CO ₂ for 24 hours. Then the cells were incubated for three days in 400 ml of DMEMF12 medium containing 0.5% fetal bovine serum and recombinant protein BMP-2 (1, 10, 100 μg). The cells were washed with phosphate-buffered saline and destroyed by adding 0.1% Triton-X-100 solution in phosphate-buffered saline and a three-fold freeze-thaw procedure to destroy cell membranes. The activity of alkaline phosphatase was determined by the standard method using p-nitrophenyl phosphate as a substrate. Protein concentration was determined by the Bradford method. A commercial preparation of human BMP-2 protein (BioVision Research Products) was used as a positive control, and a buffer solution as a negative control.

Удельная активность препаратов рекомбинантного белка BMP-2 составила 10⁵ ед. акт. щелочной фосфатазы на 1 мг белка.The specific activity of the preparations of the recombinant protein BMP-2 was 10 ⁵ units. Act. alkaline phosphatase per 1 mg of protein.

Claims (4)

1. Рекомбинантная плазмида pBMPRIA-CBD с последовательностью SEQ ID NO: 1 размером 4408 п.н., обеспечивающая экспрессию рекомбинантного белка BMPRIA-CBD, состоящего из сигнала L-аспарагиназы E.coli, эктодомена рецептора BMPRIA человека, спейсера из остатков глицина и серина и целлюлозосвязывающего домена CBD, и состоящая из следующих структурных элементов:
искусственный бактериальный оперон химерных белков, включающий: промоторную область раннего промотора бактериофага Т5 (7-87 п.н.), обеспечивающую эффективную транскрипцию контролируемой мРНК; рекомбинантный ген, обеспечивающий экспрессию целевого химерного белка (сигнал L-аспарагиназы - рецептор BMPRIA - спейсер - целлюлозосвязывающий домен CBD) (117-1124 п.н.); нетранслируемую область терминации транскрипции бактериального оперона, обеспечивающую эффективное окончание транскрипции (1164-1258 п.н.);
бактериальный оперон bla (3343-4203 п.н. комплементарной цепи), кодирующий белок бета-лактамазу, являющуюся селективным маркером для отбора клонов-трансформантов E.coli методом селекции на ампициллине;
бактериальный участок инициации репликации типа ColEl, обеспечивающий репликацию плазмиды в штаммах E.coli (1630 п.н.).1. Recombinant plasmid pBMPRIA-CBD with a sequence of SEQ ID NO: 1, size 4408 bp, providing expression of the recombinant protein BMPRIA-CBD, consisting of a signal of L-asparaginase E. coli, ectodomain of the human BMPRIA receptor, spacer from glycine and serine residues and a cellulose binding domain of CBD, and consisting of the following structural elements:
an artificial bacterial operon of chimeric proteins, including: the promoter region of the early promoter of the T5 bacteriophage (7-87 bp), which provides efficient transcription of controlled mRNA; a recombinant gene that provides expression of the target chimeric protein (L-asparaginase signal — BMPRIA receptor — spacer — CBD cellulose-binding domain) (117-1124 bp); the untranslated region of the transcription termination of the bacterial operon, which ensures the efficient termination of transcription (1164-1258 bp);
the bacterial operon bla (3343-4203 bp of the complementary chain) encoding a beta-lactamase protein, which is a selective marker for selection of E. coli transforming clones by selection on ampicillin;
ColEl type bacterial replication initiation site, which provides plasmid replication in E. coli strains (1630 bp). 2. Рекомбинантный штамм Escherichia coli M15 [pREP4, pBMPRIA-CBD], полученный трансформацией штамма Escherichia coli M15/pREP4 плазмидой по п.1, продуцент рекомбинантного белка BMPRIA-CBD, состоящего из сигнала L-аспарагиназы AspB E.coli, эктодомена рецептора BMPRIA человека, спейсера из остатков глицина и серина и целлюлозосвязывающего домена CBD.2. The recombinant strain of Escherichia coli M15 [pREP4, pBMPRIA-CBD] obtained by transforming the strain of Escherichia coli M15 / pREP4 with the plasmid according to claim 1, the producer of the recombinant protein BMPRIA-CBD, consisting of the L-asparaginase signal AspB E. coli, ectodomain receptor BMPRIA BMPR a human spacer from glycine and serine residues and the CBD cellulose binding domain. 3. Рекомбинантный белок BMPRIA-CBD для выделения рекомбинантного белка ВМР-2 в димерной форме из раствора, состоящий из сигнального пептида из L-аспарагиназы AspB E.coli с последовательностью SEQ ID NO: 2, эктодомена рецептора BMPRIA человека с последовательностью SEQ ID NO: 3, спейсера из остатков глицина и серина с последовательностью SEQ ID NO: 4 и целлюлозосвязывающего домена CBD с последовательностью SEQ ID NO: 5, который одновременно обладает способностью BMPRIA связываться со своим лигандом BMP-2 в форме димера, а также способностью CBD взаимодействовать с целлюлозосодержащим сорбентом.3. Recombinant BMPRIA-CBD protein for isolation of recombinant BMP-2 protein in dimeric form from a solution consisting of a signal peptide from AspB E. coli L-asparaginase with the sequence SEQ ID NO: 2, human BMPRIA receptor ectodomain with the sequence SEQ ID NO: 3, a spacer of glycine and serine residues with the sequence SEQ ID NO: 4 and a cellulose-binding domain of CBD with the sequence SEQ ID NO: 5, which simultaneously has the ability of BMPRIA to bind its BMP-2 ligand in the form of a dimer, as well as the ability of CBD to interact with cellulose aschim sorbent. 4. Способ выделения рекомбинантного белка BMP-2 в димерной форме из раствора, включающий следующие стадии:
подготовку сорбента с иммобилизованным белком BMPRIA-CBD, включающую: получение рекомбинантной плазмиды pBMPRIA-CBD, выращивание клеток штамма Escherichia coli M15 [pREP4, pBMPRIA-CBD], индукция синтеза белка BMPRIA-CBD, разрушение клеток и получение супернатанта, содержащего белок BMPRIA-CBD, иммобилизация белка BMPRIA-CBD и отмывание целлюлозосодержащего сорбента со связавшимся белком;
заполнение хроматографической колонки подготовленным сорбентом и раствором рекомбинантного белка BMP-2;
сорбцию димерной формы рекомбинантного белка BMP-2;
элюирование димерной формы сорбированного белка BMP-2;
анализ собранной фракции методом электрофореза в неденатурирующих условиях. 4. A method of isolating a recombinant protein BMP-2 in dimeric form from a solution, comprising the following steps:
preparation of a sorbent with immobilized BMPRIA-CBD protein, including: obtaining recombinant plasmid pBMPRIA-CBD, growing cells of the strain Escherichia coli M15 [pREP4, pBMPRIA-CBD], inducing protein synthesis BMPRIA-CBD, cell destruction and obtaining a supernatant containing protein BMPRIA-CB immobilization of the BMPRIA-CBD protein and washing the cellulose-containing sorbent with the bound protein;
filling the chromatographic column with a prepared sorbent and a solution of recombinant protein BMP-2;
sorption of the dimeric form of the recombinant protein BMP-2;
elution of the dimeric form of the sorbed BMP-2 protein;
analysis of the collected fraction by electrophoresis in non-denaturing conditions.

Images