RU2358981C2 - Universal avian influenza virus vaccine - Google Patents
Universal avian influenza virus vaccine Download PDFInfo
- Publication number
- RU2358981C2 RU2358981C2 RU2007129962/13A RU2007129962A RU2358981C2 RU 2358981 C2 RU2358981 C2 RU 2358981C2 RU 2007129962/13 A RU2007129962/13 A RU 2007129962/13A RU 2007129962 A RU2007129962 A RU 2007129962A RU 2358981 C2 RU2358981 C2 RU 2358981C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- virus
- particles
- avian influenza
- influenza virus
- well well
- Prior art date
Links
Images
Landscapes
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Abstract
Description
Область примененияApplication area
Настоящее изобретение относится к иммунологии и белковой инженерии и, в частности, к созданию иммуногенных препаратов и вакцин, которые могут быть использованы для профилактики птичьего гриппа.The present invention relates to immunology and protein engineering and, in particular, to the creation of immunogenic preparations and vaccines that can be used to prevent bird flu.
АктуальностьRelevance
Грипп является одним из наиболее распространенных вирусных заболеваний человека и животных. Гриппозная инфекция часто протекает тяжело и иногда приводит к смертельному исходу. Некоторые штаммы вируса, например «испанка» в 1918-1920 годах, способны вызывать пандемии в мировом масштабе, сопровождающиеся высокой смертностью. Высокая изменчивость поверхностных белков вируса, гемаглютинина и нейраминидазы приводит к возникновению нового эпидемического штамма каждые 1-2 года, с такой же частотой требуется изготовление «стандартных» штамм-специфических вакцин.Influenza is one of the most common viral diseases in humans and animals. Influenza infection is often severe and sometimes fatal. Some strains of the virus, for example, "Spaniard" in 1918-1920, are capable of causing pandemics on a global scale, accompanied by high mortality. The high variability of the surface proteins of the virus, hemaglutinin and neuraminidase leads to the emergence of a new epidemic strain every 1-2 years, with the same frequency the production of “standard” strain-specific vaccines is required.
Одним из потенциальных источников антигенной изменчивости вируса гриппа человека является его рекомбинация с вирусами гриппа животных, которая может привести к возникновению нового высокопатогенного рекомбинантного вируса, «неизвестного» иммунной системе человека и потому способного вызвать пандемию. Одним из наиболее потенциально опасных вариантов будет рекомбинация с вирусами гриппа птиц, смертельно опасными как для домашней птицы, так и для млекопитающих, но в настоящее время пока не передающегося от человека к человеку. В то же время создание традиционной вакцины от нового штамма требует длительного времени (от 6 до 9 месяцев), в течение которого появление нового пандемического штамма гриппа может привести к гибели миллионов людей.One of the potential sources of antigenic variability of the human influenza virus is its recombination with animal influenza viruses, which can lead to the emergence of a new highly pathogenic recombinant virus that is “unknown” to the human immune system and therefore capable of causing a pandemic. One of the most potentially dangerous options would be recombination with avian influenza viruses, deadly for both poultry and mammals, but currently not yet transmitted from person to person. At the same time, the creation of a traditional vaccine against a new strain requires a long time (from 6 to 9 months), during which the emergence of a new pandemic strain of influenza can lead to the deaths of millions of people.
Одним из перспективных путей решения проблемы получения «пандемической» вакцины является создание «универсальных» вакцин, основанных на использовании консервативных иммунодоминантных пептидов, например внеклеточного домена М2 белка вируса гриппа, последовательность которого практически инвариантна у всех человеческих штаммов. Однако у вирусов птичьего гриппа эта последовательность заметно отличается от человеческой.One of the promising ways to solve the problem of obtaining a “pandemic” vaccine is to create “universal” vaccines based on the use of conservative immunodominant peptides, for example, the extracellular domain M2 of the influenza virus protein, the sequence of which is almost invariant in all human strains. However, in bird flu viruses this sequence is markedly different from the human one.
Таким образом, задача создания «универсальных» вакцин против вирусов гриппа птиц, продолжает оставаться актуальной. Такая вакцина, с одной стороны, может быть использована для вакцинации домашней птицы, для предотвращения распространения птичьего гриппа в птицеводческих хозяйствах и уменьшения, тем самым, вероятности появления вирусов гриппа птиц, адаптированных к человеку. С другой стороны, такая вакцина может обеспечить защиту человека от нового «гибридного» вируса, если рекомбинация между птичьим и человеческим вирусами с образованием нового пандемического штамма все-таки произойдет. Эпидемическая обстановка в странах Юго-Восточной Азии свидетельствует о том, что вероятность этих событий и появления пандемического вируса возрастает с каждым днем циркуляции вируса H5N1.Thus, the task of creating “universal” vaccines against avian influenza viruses continues to be relevant. Such a vaccine, on the one hand, can be used to vaccinate poultry, to prevent the spread of bird flu in poultry farms and, thereby, reduce the likelihood of the emergence of bird flu viruses adapted to humans. On the other hand, such a vaccine can protect a person from a new “hybrid” virus if recombination between avian and human viruses with the formation of a new pandemic strain does occur. The epidemic situation in Southeast Asia suggests that the likelihood of these events and the emergence of a pandemic virus increases with each passing day of the H5N1 virus.
Уровень техники.The prior art.
1) Современные противогриппозные вакцины1) Modern influenza vaccines
ВАКСИГРИП, Pasteur-Merieux (Франция)
БЕГРИВАК, Chiron Behring (Германия)FLUARIX, SmithKline Beecham (Germany)
WAXIGRIP, Pasteur-Merieux (France)
BEGRIWAK, Chiron Behring (Germany)
АГРИППАЛ S1, Chiron Behring (Германия)GRIPPOL, FSUE "Microgen", Ufa INFLUWAK, Solvay Duphar (Netherlands)
AGRIPPAL S1, Chiron Behring (Germany)
В таблице 1 представлены перечень и характеристики противогриппозных вакцин, зарегистрированных и использующихся в России.Table 1 presents the list and characteristics of influenza vaccines registered and used in Russia.
Все вакцины могут быть разделены на следующие типы:All vaccines can be divided into the following types:
1. Живые1. Live
2. Инактивированные2. Inactivated
- цельновирионные- whole virion
- расщепленные (тоже цельновирионные)- split (also whole virion)
- субъединичные- subunit
Из этого перечня видно, что для таких актуальных вакцин, как противогриппозные, вообще не разрабатывались рекомбинантные эпиотопные вакцины. Однако преимущество генно-инженерных технологий в решении проблем эффективности и безопасности гриппозных вакцин очевидны и их можно перечислить в следующем порядке по степени важности:From this list, it is clear that for topical vaccines such as influenza, recombinant epiotope vaccines were not developed at all. However, the advantage of genetic engineering technologies in solving the problems of the efficacy and safety of influenza vaccines is obvious and can be listed in the following order of importance:
1. Гарантированно полное отсутствие яичного белка (овальбумина) - основного аллергена в современных вакцинах.1. Guaranteed complete absence of egg white (ovalbumin) - the main allergen in modern vaccines.
2. Индивидуальность избранных эпиотопов - гарантии отсутствия аутоиммунных реакций и осложнений. Эта опасность особенно велика для живых и цельновирионных вакцин и не исключается для субъединичных.2. The individuality of the selected epiotopes is a guarantee of the absence of autoimmune reactions and complications. This danger is especially great for live and whole-virion vaccines and is not excluded for subunit vaccines.
3. Относительная простота производства, отсутствие зависимости от природного сырья, например куриных эмбрионов, и полное соответствие требованиям безопасности (отсутствие вирусных компонентов). Хорошие экономические показатели производства.3. Relative ease of production, lack of dependence on natural raw materials, such as chicken embryos, and full compliance with safety requirements (absence of viral components). Good economic performance.
4. Возможность быстрого развертывания масштабного производства на случай роста потребностей в вакцине в предпандемический и пандемический периоды.4. The ability to quickly deploy large-scale production in the event of increased demand for vaccines in the pre-pandemic and pandemic periods.
2) Биологически активные наноструктуры на основе капсидов вирусов животных2) Biologically active nanostructures based on capsules of animal viruses
Способность биологических макромолекул к самосборке и самоорганизации является одной из отличительных черт живых систем и предоставляет поистине неисчерпаемые возможности для использования биомолекул в качестве «строительных» блоков «молекулярного конструктора» для направленного создания новых наноархитектур с заданными пространственными и функциональными свойствами. Одним из наиболее ярких примеров таких структур, обладающих четкой симметрией, обширными возможностями направленной модификации, современными методами генной инженерии являются вирусные частицы.The ability of biological macromolecules to self-assemble and self-organize is one of the distinguishing features of living systems and provides truly inexhaustible possibilities for using biomolecules as “building” blocks of the “molecular constructor” for the directed creation of new nanoarchitectures with given spatial and functional properties. One of the most striking examples of such structures with clear symmetry, extensive possibilities for directional modification, and modern methods of genetic engineering are viral particles.
Высокая стабильность рекомбинантных вирусно-подобных частиц (VLP), их симметричная пространственная организация, легкость получения и очистки VLP, их безопасность, возможности направленной модификации структурных белков вирусов методами генной инженерии делают эти частицы идеальными векторами-носителями для представления чужеродных функционально значимых пептидов и целых белков. Представление антигенных детерминант-эпитопов на поверхности VLP обеспечивает их высокую иммуногенность за счет использования вириона в качестве адьюванта в сочетании с высоким выходом, легкостью очистки и стабильностью при хранении. Эффективность такого подхода иллюстрируется многочисленными примерами создания VLP для борьбы с такими инфекционными заболеваниями, как малярия, бешенство, вирусные гепатиты В, С и Е папилломавирусная инфекция (рак шейки матки), СПИД и т.д.The high stability of recombinant virus-like particles (VLPs), their symmetrical spatial organization, the ease of preparation and purification of VLPs, their safety, and the possibility of targeted modification of structural proteins of viruses by genetic engineering make these particles ideal carrier vectors for representing foreign functionally significant peptides and whole proteins . The presentation of antigenic determinant epitopes on the surface of VLPs ensures their high immunogenicity due to the use of the virion as an adjuvant in combination with high yield, ease of cleaning, and storage stability. The effectiveness of this approach is illustrated by numerous examples of creating a VLP to combat infectious diseases such as malaria, rabies, hepatitis B, C and E, human papillomavirus infection (cervical cancer), AIDS, etc.
Один из наиболее эффективных носителей антигенных детерминант является нуклеокапсидный белок вируса гепатита Б человека, а также близкородственных вирусов животных, в дальнейшем коллективно именуемых ВГБ. Мономеры этого белка, состоящие из 183-185 аминокислот, в инфицированных клетках собираются в стабильные агрегаты (вирусоподобные частицы), называемые НВс-частицы. Образуются два типа частиц: частицы диаметром около 30 нм, состоящие из 180 мономеров, и в большем количестве частицы диаметром 34 нм, состоящие из 240 субъединиц.One of the most effective carriers of antigenic determinants is the nucleocapsid protein of human hepatitis B virus, as well as closely related animal viruses, hereinafter collectively referred to as HBV. Monomers of this protein, consisting of 183-185 amino acids, are collected in infected cells into stable aggregates (virus-like particles) called HBc particles. Two types of particles are formed: particles with a diameter of about 30 nm, consisting of 180 monomers, and in a larger number of particles with a diameter of 34 nm, consisting of 240 subunits.
Известно, что НВс-частицы могут быть использованы в качестве высокоиммуногенного носителя чужеродных пептидов, стимулирующего Т-клеточный иммунный ответ. Два района НВс могут быть использованы для презентации чужеродных пептидов на поверхности НВс-частиц: N-конец белка и так называемая иммунодоминантная петля, расположенная между 75 и 85 аминокислотными остатками белка. Было показано, что С-концевая аргинин-богатая область белка (150-183 аминокислотные остатки) может быть удалена без нарушения самосборки частиц, более того, в отличие от образованных полноразмерным белком, такие частицы при сборке не включают нуклеиновые кислоты клетки-хозяина.It is known that HBc particles can be used as a highly immunogenic carrier of foreign peptides, stimulating the T-cell immune response. Two regions of HBc can be used to present foreign peptides on the surface of HBc particles: the N-terminus of the protein and the so-called immunodominant loop located between 75 and 85 amino acid residues of the protein. It was shown that the C-terminal arginine-rich region of the protein (150-183 amino acid residues) can be removed without disrupting the self-assembly of particles; moreover, unlike those formed by a full-sized protein, such particles do not include host cell nucleic acids during assembly.
Химерные НВс частицы часто имеют менее упорядоченную структуру, чем частицы, не содержащие эпитопов [Schodel et al., (1994) J. Exp. Med., 180:1037-1046]. Во многих случаях вставка эпитопа вызывает настолько сильную дестабилизацию, что гибридные частицы либо вообще не могут быть получены, либо оказываются настолько нестабильными, что не могут быть использованы в качестве компонента вакцин [Schodel et al. (1994) Infect. Immunol., 62:1669-1676]. Поэтому показанная ниже упорядоченная структура и стабильность созданных в настоящем изобретении рекомбинантных НВс-частиц, содержащих эпитопы вирусов гриппа птиц, не являются заранее ожидаемыми.Chimeric HBc particles often have a less ordered structure than particles lacking epitopes [Schodel et al., (1994) J. Exp. Med., 180: 1037-1046]. In many cases, the epitope insertion causes such a strong destabilization that hybrid particles either cannot be obtained at all or are so unstable that they cannot be used as a component of vaccines [Schodel et al. (1994) Infect. Immunol., 62: 1669-1676]. Therefore, the ordered structure and stability shown below of the recombinant HBc particles containing epitopes of avian influenza viruses created in the present invention are not anticipated.
Использование рекомбинантных НВс-частиц для получения противогриппозных вакцин описано в работе [Neirynck et al., (October 1999) Nature Med., 5(10):1157-1163] и последующих работах этой группы. Их авторами получена серия рекомбинантных НВс-частиц, содержащих внеклеточный домен М2 (М2Е) белка вируса гриппа человека, и показаны их высокая иммуногенность и защита от инфекции человеческими вирусами в опытах на лабораторных животных. В этих работах была использована М2Е последовательность S L L T E V E T P I R N E W G C R C N D S S D, присутствующая в практически неизменном виде во всех человеческих штаммах вируса начиная с изолированного в 1933 г. штамма A/WSN/33 (H1N1).The use of recombinant HBc particles for the preparation of influenza vaccines is described in [Neirynck et al., (October 1999) Nature Med., 5 (10): 1157-1163] and subsequent works of this group. Their authors obtained a series of recombinant HBc particles containing the extracellular domain of M2 (M2E) protein of the human influenza virus, and showed their high immunogenicity and protection against infection by human viruses in experiments on laboratory animals. In these studies, the M2E sequence S L L T E V E T P I R N E W G C R C N D S S D was used, which is present in almost unchanged form in all human virus strains starting from strain A / WSN / 33 (H1N1) isolated in 1933.
Белок М2 вирусов гриппа типа А принципиально важен для конструирования универсальных вакцин в связи с рядом недооцененных его свойств:Protein M2 of type A influenza viruses is fundamentally important for the construction of universal vaccines in connection with a number of its underestimated properties:
1. Локализация и экспонирование на поверхности вириона.1. Localization and exposure on the surface of the virion.
2. Критическая важность в процессах фьюжина и почкования (ранняя и поздняя стадии инфекции).2. Critical importance in the processes of fusion and budding (early and late stages of infection).
3. Высокий консерватизм среди всех подтипов вируса вируса гриппа А.3. High conservatism among all subtypes of influenza A virus.
Выбор высококонсервативного антигена предусматривал индукцию антител, способных к подавлению репродукции к большинству подтипов А вирусов гриппа. Такая вакцина получила название «универсальной» - предполагающей защиту фактически от всех вирусов гриппа типа А.The selection of a highly conserved antigen included the induction of antibodies capable of inhibiting reproduction to most subtypes A of influenza viruses. Such a vaccine is called "universal" - involving protection from virtually all type A influenza viruses.
Поэтому созданная этими авторами вакцина оказалась «универсальной» в отношении человеческого гриппа. Однако у вирусов гриппа животных последовательность М2Е отличается от приведенной выше. Например, последовательности S L L T E V E T P T R N G W E C K C S D S S D и S L L T E V E T P T R N E W E C R C S D S S D встречаются в различных штаммах птичьего гриппа (Фиг.1). Опубликованные данные об эффективности вакцин, созданных на основе человеческого М2Е, в отношении птичьего гриппа отсутствуют. Более того, полученные в ходе реализации настоящего изобретения результаты свидетельствуют о том, что М2Е-НВс частицы, содержащие «птичий» М2Е, эффективны против птичьего гриппа, но не человеческого штамма A/PR/8/34 (H1N1). Таким образом, существующие в настоящее время методы создания противогриппозных вакцин, имеющие в своей основе конструирование рекомбинантных М2Е-НВс частиц, содержащих «человеческий» М2Е, не решают задачу создания вакцины против вируса птичьего гриппа. В связи с этим целью изобретения являлась разработка подходов к созданию «универсальных» вакцин и, в частности, вакцины, обеспечивающей эффективную защиту против эволюционирующих вирусов гриппа птиц, представляющих особую опасность для людей в предпандемический период.Therefore, the vaccine created by these authors was "universal" in relation to human flu. However, in animal influenza viruses, the M2E sequence differs from the above. For example, the sequences SLLTEVETPTRN G WEC K CSDSSD and SLLTEVETPTRN E WEC R CSDSSD are found in various strains of bird flu (Figure 1). There are no published data on the efficacy of human M2E vaccines against bird flu. Moreover, the results obtained during the implementation of the present invention indicate that M2E-HBc particles containing avian M2E are effective against bird flu, but not human strain A / PR / 8/34 (H1N1). Thus, the currently existing methods for creating influenza vaccines, which are based on the construction of recombinant M2E-HBc particles containing "human" M2E, do not solve the problem of creating a vaccine against avian influenza virus. In this regard, the purpose of the invention was the development of approaches to the creation of "universal" vaccines, and in particular, a vaccine that provides effective protection against evolving avian influenza viruses, which are especially dangerous for people in the pre-pandemic period.
Раскрытие изобретенияDisclosure of invention
В настоящем изобретении ставилась задача создания «универсальной» кандидатной вакцины против вирусов птичьего гриппа. В основу решения поставленной задачи было положено конструирование рекомбинантных вирусоподобных частиц на основе ядерного антигена вируса гепатита В (НВС), представляющих на своей поверхности полипептиды внеклеточного домена М2 белка вируса гриппа птиц.The present invention was tasked with creating a "universal" candidate vaccine against avian influenza viruses. The solution to this problem was based on the construction of recombinant virus-like particles based on the hepatitis B virus antigen (NSA), which on its surface are the polypeptides of the extracellular domain M2 of the avian influenza virus protein.
Фактически задача была решена путем:In fact, the problem was solved by:
а) дизайна конструкции для экспрессии функционально важного и доступного эпитопа наиболее консервативного белка вирусов гриппа типа Аa) design design for the expression of a functionally important and affordable epitope of the most conserved protein of type A influenza viruses
б) синтеза генов, кодирующих гибридные белки, включающие М2Е и лишенный С-концевой области НВс антиген ВГБ,b) the synthesis of genes encoding hybrid proteins, including M2E and lacking the C-terminal region of the HBc HBV antigen,
в) создания штаммов Е. coli - продуцентов гибридных белков М2Е-НВс,C) the creation of strains of E. coli - producers of hybrid proteins M2E-HBc,
г) разработки протоколов выделения и очистки рекомбинантных М2Е-НВс частиц,g) development of protocols for the isolation and purification of recombinant M2E-HBc particles,
д) проведения испытаний полученных препаратов на лабораторных животных, результаты которых свидетельствуют о высокой иммуногенности М2Е-НВс частиц, антивирусной (вирус-нейтрализующей) активности сывороток иммунизированных животных и 100% защите животных от летальной гриппозной инфекции.e) testing the preparations obtained in laboratory animals, the results of which testify to the high immunogenicity of M2E-HBc particles, the antiviral (virus-neutralizing) activity of the sera of immunized animals and 100% protection of animals from lethal influenza infection.
Первый аспект настоящего изобретения связан с получением синтетических генов, кодирующих гибридные белки, аминокислотная последовательность которых, начиная с N-конца, состоит из остатка метионина, последовательности внеклеточного домена М2 (М2Е) белка вируса гриппа птиц от 2-й до 24-й аминокислоты, изображенной на Фиг.1, и последовательности ядерного антигена вируса гепатита Б (НВС) от 4-й до 149-й аминокислоты, относительно первого метионина в нативном НВС, за которой, при необходимости, может следовать один цистеин. В одном из конкретных воплощений изобретения в состав гибридного белка после первого метионина включена последовательность S L L T E V E T P T R N G W E C K C S D S S D из штамма A/Duck/Potsdam 1402-6/1986 (H5N2), в другом - последовательность S L L T E V E T P T R N E W E C R C S D S S D из штамма A/Chicken/Kurgan/05/2005 (H5N1).The first aspect of the present invention relates to the production of synthetic genes encoding hybrid proteins, the amino acid sequence of which, starting from the N-terminus, consists of the methionine residue, the sequence of the extracellular domain M2 (M2E) of the avian influenza virus protein from the 2nd to the 24th amino acids, 1 and the sequence of the hepatitis B virus nuclear antigen (NSA) from the 4th to the 149th amino acid, relative to the first methionine in the native NSA, which, if necessary, can be followed by one cysteine. In one specific embodiment of the invention, the sequence of SLLTEVETPTRN G WEC K CSDSSD from strain A / Duck / Potsdam 1402-6 / 1986 (H5N2) is included in the fusion protein after the first methionine, in another, the sequence SLLTEVETPTRN E WEC R CSDSSD from strain A / Chicken / Kurgan / 05/2005 (H5N1).
Вторым аспектом изобретения является получение экспрессионных векторов и штаммов Е. coli - продуцентов гибридных белков. С этой целью синтетические фрагменты ДНК, содержащие гены гибридных белков, были клонированы в экспрессионном векторе pQE60 под контролем РТ5-lac промотора, репрессируемого LacI и индуцируемого IPTG.A second aspect of the invention is the production of expression vectors and strains of E. coli, producers of fusion proteins. To this end, synthetic DNA fragments containing fusion protein genes were cloned into the pQE60 expression vector under the control of the PT5-lac promoter, repressed LacI and induced IPTG.
Соответственно, третий аспект изобретения относится к оптимизации условий продукции рекомбинантных белков в клетках Е. coli и разработке методов выделения и очистки М2Е-НВс частиц.Accordingly, a third aspect of the invention relates to optimizing production conditions for recombinant proteins in E. coli cells and developing methods for the isolation and purification of M2E-HBc particles.
Четвертый аспект изобретения связан с проведением испытаний полученных препаратов на лабораторных животных. При этом было показано, что (1) препараты М2Е-НВс частиц не токсичны для лабораторных животных (мышей), (2) иммунизация мышей приводит к образованию в их крови антител, специфически распознающих М2Е пептид в составе М2Е-НВс частиц, (3) сыворотки иммунизованных мышей подавляют репродукцию вирусов птичьего гриппа in vitro, (4) пассивная иммунизация мышей приводит к снижению уровня накопления вируса в легких после инфекции гомологичным по аминокислотной последовательности М2е штаммом A/Duck/Potsdam/4024/26 (H5N2) в 100-126 раз, гетерологичным (95,7% гомологии) штаммом A/Hon Kong/1073/99 (H9N2) в 16-20 раз, (5) двух- или трехкратная иммунизация мышей препаратом М2Е-НВс частиц обеспечивает их 100% защиту от летальной гриппозной инфекции.A fourth aspect of the invention relates to testing the resulting preparations in laboratory animals. It was shown that (1) preparations of M2E-HBc particles are not toxic to laboratory animals (mice), (2) immunization of mice leads to the formation of antibodies in their blood that specifically recognize the M2E peptide in the composition of M2E-HBc particles, (3) sera of immunized mice inhibit the reproduction of avian influenza viruses in vitro, (4) passive immunization of mice leads to a decrease in the level of virus accumulation in the lungs after infection with strain A / Duck / Potsdam / 4024/26 (H5N2) homologous to the amino acid sequence M2e 100-126 times heterologous (95.7% homology) strain A / Ho n Kong / 1073/99 (H9N2) 16-20 times, (5) two- or three-fold immunization of mice with M2E-HBc particles ensures their 100% protection against lethal influenza infection.
Для проведения иммунизации вирусоподобные частицы растворяли в физиологически приемлемом носителе, в качестве которого может быть использован буфер, содержащий 50 мМ Tris-HCl с рН 8,0, 0,5 М NaCl, 15 мМ ЭДТА и 20% сахарозы. При необходимости для повышения эффективности иммунного ответа могут быть использованы адъюванты, например, иммунизация может проводиться в форме подкожной инъекции эмульсий «вода в масле», полученной после смешивания 1:1 указанного выше раствора препарата М2Е-НВс частиц с адъювантом TiterMax® Gold Adjuvant (Sigma). Альтернативным вариантом является внутрибрюшинная иммунизация с использованием в качестве адъюванта смеси 25 мкг monophosphoryl lipid A (Sigma) + 25 мкг muramyl dipeptide (N-Acetylmuramyl-L-alanyl-D-isoglutamine hydrate, Sigma).For immunization, virus-like particles were dissolved in a physiologically acceptable carrier, which can be used as a buffer containing 50 mm Tris-HCl with a pH of 8.0, 0.5 M NaCl, 15 mm EDTA and 20% sucrose. If necessary, adjuvants can be used to increase the efficiency of the immune response, for example, immunization can be carried out in the form of a subcutaneous injection of water-in-oil emulsions obtained after mixing 1: 1 of the above solution of M2E-HBc particles with TiterMax® Gold Adjuvant adjuvant (Sigma ) An alternative option is intraperitoneal immunization using a mixture of 25 μg monophosphoryl lipid A (Sigma) + 25 μg muramyl dipeptide (N-Acetylmuramyl-L-alanyl-D-isoglutamine hydrate, Sigma) as an adjuvant.
Краткое описание чертежейBrief Description of the Drawings
Фиг.1 - Структура М2 белка вируса гриппа (внеклеточный домен выделен рамкой) и сравнение аминокислотных последовательностей внеклеточных доменов М2 белков различных штаммов вируса гриппа человека и животных. Несовпадающие аминокислоты выделены серым.Figure 1 - Structure of the M2 protein of the influenza virus (the extracellular domain is highlighted in a frame) and a comparison of the amino acid sequences of the extracellular domains of the M2 proteins of various strains of the human and animal influenza virus. Mismatching amino acids are highlighted in gray.
Фиг.2 - Аминокислотные последовательности гибридных белков М2Е-НВс.Последовательность аминокислот из М2 белка подчеркнута, аминокислоты, различающиеся в двух штаммах вируса гриппа, выделены серым.Figure 2 - Amino acid sequences of the M2E-HBc fusion proteins. The amino acid sequence of the M2 protein is underlined, amino acids that differ in the two strains of the influenza virus are highlighted in gray.
Фиг.3 - Структура экспрессионного вектора pQE-M2HBc.Figure 3 - Structure of the expression vector pQE-M2HBc.
Фиг.4 - Анализ уровня продукции гибридного белка М2Е-НВс с помощью SDS-PAGE:Figure 4 - Analysis of the level of production of the hybrid protein M2E-HBc using SDS-PAGE:
1 - маркер молекулярной массы (в килодальтонах)1 - molecular weight marker (in kilodaltons)
2 - DLT12702 - DLT1270
3 - DLT1270/pQE-M2HBc-1 без индукции синтеза продукта3 - DLT1270 / pQE-M2HBc-1 without induction of product synthesis
4 - DLT1270/pQE-M2HBc-1 через 16 часов после индукции синтеза продукта.4 - DLT1270 / pQE-M2HBc-1 16 hours after induction of product synthesis.
Фиг.5 - Анализ структуры М2Е-НВс частиц с помощью электронной микроскопии:Figure 5 - Analysis of the structure of M2E-HBc particles using electron microscopy:
А - препарат рекомбинантных частиц М2НВс-1A - preparation of recombinant particles M2HBc-1
Б - препарат нерекомбинантных частиц НВс.B - a preparation of non-recombinant particles of HBc.
Фиг.6 - Результаты дот-блот анализа сывороток мышей, иммунизованных М2Е-НВс. На дот-блоты нанесены белковые препараты, выделенные из штаммов Е. coli - продуцентов:6 - Results of a dot blot analysis of sera of mice immunized with M2E-HBc. Protein preparations isolated from strains of E. coli, producers, are applied to dot blots:
1 - DLT1270/pQE-HBc (без индукции синтеза продукта)1 - DLT1270 / pQE-HBc (without induction of product synthesis)
2 - DLT1270/pQE-HBc (после индукции синтеза продукта)2 - DLT1270 / pQE-HBc (after induction of product synthesis)
3 - DLT1270/pQE-M2HBc-1 (без индукции синтеза продукта)3 - DLT1270 / pQE-M2HBc-1 (without induction of product synthesis)
4 - DLT1270/pQE-M2HBc-1 (после индукции синтеза продукта).4 - DLT1270 / pQE-M2HBc-1 (after induction of product synthesis).
Фиг.7 - Репродукция вируса гриппа птиц в легких мышей, зараженных после пассивной иммунизации:7 - Reproduction of avian influenza virus in the lungs of mice infected after passive immunization:
1 и 2 - опытные группы мышей, предварительно иммунизированные трехкратно с интервалом в три недели разными дозами химерного белка М2еНВс1 and 2 - experimental groups of mice pre-immunized three times with an interval of three weeks with different doses of the chimeric protein M2eHBc
3 и 4 - контрольные группы мышей.3 and 4 - control groups of mice.
Полосы погрешностей указывают доверительный интервал.Error bars indicate the confidence interval.
* р<0,05 - относительно контрольных групп мышей.* p <0.05 - relative to control groups of mice.
Фиг.8 - Динамика гибели мышей, иммунизированных М2НВс-1 частицами после заражения вирусом гриппа птиц A/Duck/Potsdam 1402-6/1986 (H5N2).Fig - Dynamics of the death of mice immunized with M2HBc-1 particles after infection with the avian influenza virus A / Duck / Potsdam 1402-6 / 1986 (H5N2).
Осуществление изобретенияThe implementation of the invention
Пример 1. Гибридные белки М2Е-НВсExample 1. Hybrid proteins M2E-HBc
Два типа гибридных белков, включающих внеклеточный домен М2 белка вируса гриппа птиц (М2Е домен), и фрагмент НВс антигена ВГБ, были использованы для получения иммуногенных вирусоподобных частиц. Первый белок, М2-НВс1, включал последовательно следующие элементы: N-концевой метионин, последовательность аминокислот SLLTEVETPTRNGWECKCSDSSD, соответствующую М2Е домену из штамма A/Duck/Potsdam 1402-6/1986 (H5N2) вируса гриппа птиц, аминокислотную последовательность НВс (Bichko, V., Pushko, P., Dreilina, D., Pumpen, P. and Gren, E. 1985 Subtype ayw variant of hepatitis В virus. DNA primary structure analysis. FEBS Lett. 185 (1), 208-212), начиная с аспарагина в положении +4 до валина в положении +149 (относительно первого метионина в нативном НВс), и цистеин на С- конце (Фиг.2). Введение С-концевого цистеина имело целью повысить стабильность рекомбинантных М2Е-НВс частиц, но не обязательно для получения высокоактивных вирусоподобных частиц. Второй белок, М2-НВс2, отличался от первого тем, что содержал последовательность SLLTEVETPTRNEWECRCSDSSD соответствующую М2Е домену из другого штамма птичьего гриппа, A/Chicken/Kurgan/05/2005 (H5N1).Two types of fusion proteins, including the extracellular domain M2 of the avian influenza virus protein (M2E domain), and the HBc fragment of the HBV antigen, were used to produce immunogenic virus-like particles. The first protein, M2-HBc1, consistently included the following elements: N-terminal methionine, amino acid sequence SLLTEVETPTRN G WEC K CSDSSD, corresponding to the M2E domain of strain A / Duck / Potsdam 1402-6 / 1986 (H5N2) of avian influenza virus, amino acid sequence HBc (Bichko, V., Pushko, P., Dreilina, D., Pumpen, P. and Gren, E. 1985 Subtype ayw variant of hepatitis B virus. DNA primary structure analysis. FEBS Lett. 185 (1), 208-212 ), starting from asparagine at position +4 to valine at position +149 (relative to the first methionine in native HBc), and cysteine at the C-terminus (Figure 2). The introduction of C-terminal cysteine was intended to increase the stability of recombinant M2E-HBc particles, but not necessarily to obtain highly active virus-like particles. The second protein, M2-HBc2, differed from the first in that it contained the sequence SLLTEVETPTRN E WEC R CSDSSD corresponding to the M2E domain from another strain of bird flu, A / Chicken / Kurgan / 05/2005 (H5N1).
Для получения описанных выше гибридных белков были синтезированы кодирующие их гены. На первом этапе часть последовательности НВс антигена была получена в результате проведения ПЦР с использованием праймеров M2F1 (С GGC TGG GAA TGC ААА TGC AGC GAT AGC AGC GAT GAC ССТ ТАТ ААА GAA TTT GGA GCT) и HBC-R (AAG АТС ТСА GCA AAC AAC AGT AGT CTC CGG AAG) и ДНК копии генома вируса гепатита Б в качестве матрицы. ПЦР проводили при следующих условиях: (1) 94°С - 30 сек, (2) 50°С - 60 сек, (3) 70°С - 90 сек, шаги 1-3 повторяли 40 раз. На следующем этапе полученный фрагмент ДНК был использован в качестве матрицы для проведения ПЦР-амплификации с праймерами M2F2 (CTC ATG AGC CTG CTG АСС GAA GTG GAA АСС CCG АСС CGT AAC GGC TGG GAA TGC ААА TGC) и HBC-R. ПЦР проводили при следующих условиях: (1) 94°С - 30 сек, (2) 50°С - 60 сек, (3) 70°С - 90 сек, шаги 1-3 повторяли 40 раз.To obtain the hybrid proteins described above, the genes encoding them were synthesized. At the first stage, part of the HBc antigen sequence was obtained by PCR using M2F1 primers (C GGC TGG GAA TGC AAA TGC AGC GAT AGC AGC GAT GAC CCT TAT AAA GAA TTT GGA GCT) and HBC-R (AAG ATA TCA GCA AAC AAC AAC AGT AGT CTC CGG AAG) and DNA copies of the hepatitis B virus genome as a template. PCR was performed under the following conditions: (1) 94 ° C for 30 sec, (2) 50 ° C for 60 sec, (3) 70 ° C for 90 sec, steps 1-3 were repeated 40 times. At the next stage, the obtained DNA fragment was used as a template for PCR amplification with M2F2 primers (CTC ATG AGC CTG CTG ACC GAA GTG GAA ACC CCG ACC CGT AAC GGC TGG GAA TGC AAA TGC) and HBC-R. PCR was performed under the following conditions: (1) 94 ° C for 30 sec, (2) 50 ° C for 60 sec, (3) 70 ° C for 90 sec, steps 1-3 were repeated 40 times.
После электрофоретического анализа выделяли ПЦР-фрагмент размером 0,52 т.п.н., который лигировали с ДНК вектора pUC19, предварительно обработанной рестриктазой SmaI. Полученную плазмиду, которая была отобрана по результатам рестрикционного анализа, обозначали pUC-M2HBC-1 и использовали для получения фрагмента, содержащего ген, кодирующий гибридный белок М2НВС-1. Для этого ее обрабатывали рестриктазами PagI и BglII, выделяли фрагмент размером 0,52 т.п.н. и клонировали его в экспрессионном векторе pQE60 по сайтам NcoI и BglII. Полученный экспрессионный вектор был обозначен как pQE-M2HBc-1 (Фиг.3) и использован в дальнейшей работе.After electrophoretic analysis, a 0.52 kb PCR fragment was isolated that was ligated with the DNA of pUC19 vector pretreated with SmaI restrictase. The obtained plasmid, which was selected according to the results of restriction analysis, was designated pUC-M2HBC-1 and used to obtain a fragment containing a gene encoding a hybrid protein M2HBC-1. For this, it was treated with restriction enzymes PagI and BglII, a 0.52 kb fragment was isolated. and cloned it in the pQE60 expression vector at the NcoI and BglII sites. The resulting expression vector was designated as pQE-M2HBc-1 (Figure 3) and used in further work.
Синтез гена, кодирующего второй гибридный белок, М2-НВс-2, содержащий последовательность SLLTEVETPTRNEWECRCSDSSD из штамма A/Chicken/Kurgan/05/2005 (H5N1), осуществляли аналогичным образом, за исключением того, что вместо праймера M2F1 был использован праймер M2F3 (С GAA TGG GAA TGC CGT TGC AGC GAT AGC AGC GAT GAC ССТ), вместо M2F2 - праймер M2F4 (CTC ATG AGC CTG CTG АСС GAA GTG GAA АСС CCG АСС CGT AAC GAA TGG GAA TGC CGT TGC), а вместо HBC-R - праймер HBC-R2 (А GGA TCC ТСА GCA AAC AAC AGT AGT CTC CGG AAG). Полученный экспрессионный вектор был обозначен как pQE-M2HBc-2.The synthesis of the gene encoding the second hybrid protein, M2-HBc-2, containing the sequence SLLTEVETPTRN E WEC R CSDSSD from strain A / Chicken / Kurgan / 05/2005 (H5N1), was carried out in a similar manner, except that instead of primer M2F1 was used M2F3 primer (With GAA TGG GAA TGC CGT TGC AGC GAT AGC AGC GAT GAC CCT), M2F4 primer (CTC ATG AGC CTG CTG ACC GAA GTG GAA ACC CCG ACC CGT AAC GAA TGG GAA TGC CGT, instead of M2F2) -R - HBC-R2 primer (A GGA TCC TCA GCA AAC AAC AGT AGT CTC CGG AAG). The resulting expression vector was designated as pQE-M2HBc-2.
Отсутствие обусловленных ПЦР мутаций в синтезированных генах было подтверждено с помощью ДНК-секвенирования.The absence of PCR-induced mutations in the synthesized genes was confirmed by DNA sequencing.
Пример 2. Создание штаммов Е. coli - продуцентов гибридных белков М2Е-НВсExample 2. The creation of strains of E. coli - producers of hybrid proteins M2E-HBc
Для получения штаммов-продуцентов рекомбинантных белков плазмиды рОЕ-М2НВс-1 и pQE-M2HBc-2 вводили в клетки Е. coli штамма DLT1270 с помощью трансформации. Штамм DLT1270, являющийся производным штамма DH10B [Grant et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1990. v.87(12), p.4645-4649], содержит ген репрессора лактозного оперона laCI, интегрированный в хромосому. Культуры трансформированных клеток DLT1270/pQE-M2HBc-1 и DLT1270/pQE-M2HBc-2 выращивали в стандартных условиях, подходящих для экспрессии рекомбинантного белка, например в LB-бульоне, до середины логарифмической фазы роста (OD600=0,5) при 37°С, добавляли IPTG до концентрации 1 mM (достаточной для полной индукции промотора) и выращивали клетки еще в течение 16 часов при 37°С. Пробы для определения белка отбирали в начальный момент времени, а также через 16 часов после индукции. Определение уровня экспрессии гибридных белков проводили путем анализа суммарных белковых препаратов, выделенных из бактериальных культур с помощью SDS-PAGE. Максимальный уровень продукции гибридного белка составлял около 30-40% общего клеточного белка (Фиг.4).To obtain producer strains of recombinant proteins of the plasmid pOE-M2HBc-1 and pQE-M2HBc-2 were introduced into E. coli cells of strain DLT1270 by transformation. The strain DLT1270, which is a derivative of strain DH10B [Grant et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1990. v.87 (12), p.4645-4649], contains the repressor gene of the lactose operon laCI integrated into the chromosome. Cultures of transformed cells DLT1270 / pQE-M2HBc-1 and DLT1270 / pQE-M2HBc-2 were grown under standard conditions suitable for expression of a recombinant protein, for example, in LB broth, until the middle of the logarithmic growth phase (OD 600 = 0.5) at 37 ° C, IPTG was added to a concentration of 1 mM (sufficient for complete induction of the promoter) and cells were grown for another 16 hours at 37 ° C. Samples for protein determination were taken at the initial time, as well as 16 hours after induction. The expression level of the hybrid proteins was determined by analyzing the total protein preparations isolated from bacterial cultures using SDS-PAGE. The maximum level of production of the hybrid protein was about 30-40% of the total cellular protein (Figure 4).
Пример 3. Выделение и очистка М2Е-НВс частицExample 3. Isolation and purification of M2E-HBc particles
Клетки E. coli штамма-продуцента рекомбинантного белка М2Е-НВс после индукции (см. выше) осаждали центрифугированием 3000 об/мин 30 минут и ресуспендировали в 50 мМ Tris-HCl буфере рН 8,0, содержащим 0,5 М NaCl, 15 мМ ЭДТА и 20% сахарозы из расчета 1 мл буфера на 50 мл культуральной жидкости. Клеточную суспензию обрабатывали лизоцимом (1 мг/мл) в течение 15 минут при +4°С, затем клетки разрушали ультразвуком. К полученному лизату добавляли 1/20 объема раствора полиэтиленгликоля (50% вес/объем) и инкубировали 30 минут при +4°С. Затем проводили центрифугирование в течение 10 минут при 13000 об/мин. К супернатанту добавляли 1/5 объема насыщенного раствора сульфата аммония, перемешивали и оставляли на 30 минут при +4°С. Образовавшийся после центрифугирования осадок белков растворяли в 1 мл того же буфера и повторно осаждали сульфатом аммония в тех же условиях. Полученный осадок растворяли в 1 мл 50 мМ Tris-HCl буфера с рН 8,0, содержащего 0,5М NaCl, 15 мМ ЭДТА и 20% сахарозы. Полученный препарат М2Е-НВс частиц содержал по данным SDS-PAGE около 90% белка М2Е-НВс в концентрации примерно 0,5 мг/мл.Cells of E. coli strain producer of the recombinant protein M2E-HBc after induction (see above) were besieged by centrifugation at 3000 rpm for 30 minutes and resuspended in 50 mm Tris-HCl buffer pH 8.0 containing 0.5 M NaCl, 15 mm EDTA and 20% sucrose at the rate of 1 ml of buffer per 50 ml of culture fluid. The cell suspension was treated with lysozyme (1 mg / ml) for 15 minutes at + 4 ° C, then the cells were destroyed by ultrasound. To the resulting lysate was added 1/20 volume of a solution of polyethylene glycol (50% w / v) and incubated for 30 minutes at + 4 ° C. Then centrifuged for 10 minutes at 13,000 rpm. 1/5 of the volume of a saturated solution of ammonium sulfate was added to the supernatant, stirred and left for 30 minutes at + 4 ° С. The protein precipitate formed after centrifugation was dissolved in 1 ml of the same buffer and reprecipitated with ammonium sulfate under the same conditions. The resulting precipitate was dissolved in 1 ml of 50 mm Tris-HCl buffer with a pH of 8.0, containing 0.5 M NaCl, 15 mm EDTA and 20% sucrose. The resulting preparation of M2E-HBc particles contained, according to SDS-PAGE, about 90% protein of M2E-HBc at a concentration of about 0.5 mg / ml.
Указанные условия выделения и очистки подбирались экспериментальным путем и могут варьироваться в известных среднему специалисту в этой области значениях.The indicated conditions of isolation and purification were selected experimentally and can vary in the values known to the average person skilled in the art.
Структура выделенных частиц была проанализирована с помощью электронной микроскопии, в качестве контроля был использован препарат НВс-частиц, не содержащих М2Е полипептида, а в остальном эквивалентный частицам, описанным в Примерах 1 и 2. Электронно-микроскопический анализ (Фиг.5) подтвердил факт самосборки гибридных белков М2НВс в наноразмерные частицы, сходные с частицами, образуемыми эквивалентным НВс антигеном, не содержащим М2Е полипептида. Следует, однако, отметить, наряду с основной фракцией частиц нормального размера в случае М2НВс белков наблюдалась и незначительная примесь частиц меньшего диаметра, характерная для частиц с нарушениями сборки и/или пониженной структурной стабильностью.The structure of the isolated particles was analyzed using electron microscopy, as a control, the preparation of HBc particles that did not contain the M2E polypeptide, and otherwise equivalent to the particles described in Examples 1 and 2, was used. Electron microscopic analysis (Figure 5) confirmed the fact of self-assembly hybrid M2HBc proteins into nanosized particles similar to particles formed by the equivalent HBc antigen not containing the M2E polypeptide. It should be noted, however, that along with the main fraction of normal-sized particles in the case of M2HBc proteins, an insignificant admixture of particles of a smaller diameter was also observed, which is typical for particles with assembly disruptions and / or reduced structural stability.
Пример 4. Иммуногенность М2Е-НВс частицExample 4. Immunogenicity of M2E-HBc particles
Испытание препарата М2НВс-1 частиц на токсичностьToxicity test of M2HBc-1 particles
Для проверки препарата рекомбинантных частиц М2НВс-1 на токсичность были использованы белые беспородные мыши, обоего пола, массой 18-20 г, полученные в питомнике «Рапполово» РАМН. Все мыши были распределены на 3 группы (две опытных и одна контрольная) по 5 особей в каждой. Препарат вводили внутрибрюшинно 5-ти мышам опытных групп в дозе 10 мкг и 100 мкг/мышь в объеме 0,2 мл. Контрольной группе животных вводили физиологический раствор хлористого натрия. Препарат вводили стерильным шприцем, вместимостью 1 мл. Наблюдение за животными осуществляли ежедневно в течение 7 суток.To test the preparation of the recombinant particles M2HBc-1 for toxicity, we used white outbred mice, of both sexes, weighing 18-20 g, obtained in the Rappolovo nursery of the Russian Academy of Medical Sciences. All mice were divided into 3 groups (two experimental and one control), 5 animals each. The drug was administered intraperitoneally to 5 mice of the experimental groups at a dose of 10 μg and 100 μg / mouse in a volume of 0.2 ml. The control group of animals was injected with physiological solution of sodium chloride. The drug was administered with a sterile syringe with a capacity of 1 ml. Observation of animals was carried out daily for 7 days.
Результаты испытания, представленные в таблице 2, показали, что в течение всего периода наблюдений все животные остались живы и ни у одного из них не были выявлены видимые признаки заболевания. Отмечался прирост массы всех животных в день окончания наблюдения по сравнению с исходными параметрами. Таким образом, обе дозы испытуемого препарата (10 и 100 мкг/мышь) не оказывает токсического действия на мышей.The test results presented in table 2 showed that during the entire observation period all animals remained alive and not one of them showed visible signs of the disease. There was an increase in the mass of all animals on the day of the end of observation compared with the initial parameters. Thus, both doses of the test drug (10 and 100 μg / mouse) have no toxic effect on mice.
Иммунизация мышей препаратом М2НВс-1 частицImmunization of mice with M2HBc-1 particles
Препарат вводили внутрибрюшинно 5-ти мышам опытных групп в дозе 10 мкг и 100 мкг/мышь в объеме 0,2 мл. Контрольной группе животных вводили физиологический раствор хлористого натрия. Иммунизацию повторяли дважды с интервалом 3 недели. По окончании эксперимента опытные и контрольные мыши были использованы для получения сывороток.The drug was administered intraperitoneally to 5 mice of the experimental groups at a dose of 10 μg and 100 μg / mouse in a volume of 0.2 ml. The control group of animals was injected with physiological solution of sodium chloride. Immunization was repeated twice with an interval of 3 weeks. At the end of the experiment, experimental and control mice were used to obtain sera.
Дот-блот анализ сывороток мышей, иммунизованных препаратами М2НВс-1 частицDot blot analysis of mouse sera immunized with M2HBc-1 particle preparations
Сыворотки мышей, иммунизированных препаратами частиц М2НВс-1, были проанализированы на наличие в них специфических антител к М2 белку. Для этого сыворотки опытных и контрольных мышей были использованы для дот-блот анализа суммарных белковых препаратов, выделенных из клеток DLT1270/pQE-M2HBc-1 или DLT1270/pQE-HBc до и после начала продукции М2НВс-1 белка. Дот-блот анализ проводился в условиях, исключающих денатурацию белков и разрушения М2НВс частиц. В результате было установлено (Фиг.6), что (1) сыворотки иммунизированных препаратом М2НВс-1 частиц мышей, в отличие от сывороток контрольных мышей, специфически связываются с М2НВс-1 и (2) иммунный ответ против нерекомбинантного НВс антигена практически отсутствует. Таким образом, иммунизация мышей препаратом М2НВс-1 частиц вызывает образование специфических антител, распознающих М2Е полипептид.The sera of mice immunized with M2HBc-1 particle preparations were analyzed for the presence of specific antibodies to the M2 protein. For this, the sera of the experimental and control mice were used for dot blot analysis of total protein preparations isolated from DLT1270 / pQE-M2HBc-1 or DLT1270 / pQE-HBc cells before and after the start of production of M2HBc-1 protein. Dot blot analysis was carried out under conditions excluding protein denaturation and destruction of M2HBc particles. As a result, it was found (Fig. 6) that (1) the sera of mouse particles immunized with the preparation M2HBc-1, unlike the sera of control mice, specifically bind to M2HBc-1 and (2) the immune response against non-recombinant HBc antigen is practically absent. Thus, immunization of mice with M2HBc-1 particles causes the formation of specific antibodies that recognize the M2E polypeptide.
Пример 5. Подавление репродукции вируса гриппа птиц сыворотками иммунизированных мышей in vitroExample 5. Inhibition of reproduction of avian influenza virus in vitro sera of immunized mice
Инфекционную активность вирусов гриппа оценивали в культуре клеток МДСК, выращенной в 96-луночной панели в присутствии ростовой среды альфа 2 MEM с 2% прогретой эмбриональной сывороткой телят. Клетки предварительно инфицировали десятикратными разведениями вирусов. Через 1 ч после заражения клеточный монослой дважды отмывали от неадсорбировавшегося вируса средой альфа 2 MEM. Далее в каждую лунку вносили по 100 мкл мышиной поликлональной сыворотки, полученной путем трехкратной внутрибрюшинной иммунизации животных химерным белком М2еНВс, в дозе, нетоксичной для клеток МДСК. Для этого сыворотку разводили 1:20 поддерживающей средой альфа 2 MEM с добавлением гистидина, глютамина, антибиотиков, без трипсина. Клетки инкубировали в течение 72 ч при 37°С в CO2-инкубаторе.Infectious activity of influenza viruses was evaluated in a culture of MDSK cells grown in a 96-well panel in the presence of
Инфекционную активность вируса определяли путем забора из каждой лунки 50 мкл культуральной жидкости, переноса материала в аналогичную чистую планшетку и добавления 50 мкл 1% эритроцитов кур. Титр вируса рассчитывали по методу Рида и Менча. Результаты представлены в таблице 3.Infectious activity of the virus was determined by taking 50 μl of culture fluid from each well, transferring the material to a similar clean plate and adding 50 μl of 1% chicken erythrocytes. The titer of the virus was calculated by the method of Reed and Mench. The results are presented in table 3.
В данных условиях эксперимента отмечается достоверное подавление в культуре клеток МДСК репродукции вируса гриппа птиц A/Duck/Potsdam (H5N2) поликлональной иммунной мышиной сывороткой, содержащей М2е-антитела к химерному белку М2еНВс, в котором аминокислотная последовательность М2е-фрагмента на 100% гомологична аминокислотной последовательности М2е домена этого штамма вируса гриппа.Under these experimental conditions, a reliable suppression of the reproduction of A / Duck / Potsdam (H5N2) avian influenza virus polyclonal mouse serum containing M2e antibodies to the chimeric M2eHBc protein in which the amino acid sequence of the M2e fragment is 100% homologous to the amino acid sequence M2e domain of this strain of influenza virus.
Достоверное снижение титра гемагглютинирующей активности вируса A/Hong Kong (H7N2) в группе, в которой использована сыворотка мышей, иммунизированных дозой 100 мкг/мышь, также свидетельствует о снижении репродукции этого штамма вируса гриппа птиц, последовательность М2е домена которого отличается несколькими аминокислотными заменами. В отношении «человеческого» вируса A/PR/8/34 (H1N1) данная поликлональная иммунная мышиная сыворотка не проявляет достоверную противовирусную активность.A significant decrease in the titer of hemagglutinating activity of A / Hong Kong virus (H7N2) in the group in which the serum of mice immunized with a dose of 100 μg / mouse was used also indicates a decrease in the reproduction of this strain of avian influenza virus, the M2e domain sequence has several amino acid changes. In relation to the "human" virus A / PR / 8/34 (H1N1), this polyclonal immune mouse serum does not show significant antiviral activity.
Пример 6. Репродукция вируса гриппа птиц в легких мышей, зараженных после пассивной иммунизацииExample 6. Reproduction of avian influenza virus in the lungs of mice infected after passive immunization
Сыворотки, полученные из мышей, 3-кратно иммунизированных препаратом М2НВс-1 частиц (дозы 10 и 100 мкг), а также сыворотки контрольных мышей или эквивалентный объем физиологического раствора хлористого натрия, были введены здоровым мышам, которые затем были заражены 5 LD вируса птичьего гриппа. В этом эксперименте были использованы два штамма: гомологичный по аминокислотной последовательности М2е фрагмента штамм A/Duck/Potsdam/4024/26 (H5N2) и гетерологичный (замена Р на L в положении +10 белка М2НВс-1) штамм A/Hong Kong/1073/99 (H9N2).Sera obtained from
Предварительное введение здоровым мышам сыворотки, полученной после внутрибрюшинной трехкратной иммунизации опытных мышей дозой 100 мкг/мышь химерного белка М2еНВс (пассивная иммунизация), привело к статистически достоверному (p<0,05) снижению титра вируса гриппа птиц в легких к штамму A/Duck/Potsdam/4024/26 (H5N2) в 100-126 раз, а к штамму A/HongKong/1073/99 (H9N2) в 16-20 раз (Фиг.7). Полученные данные свидетельствуют о сильном заметном эффекте и нейтрализующей активности антител, продуцирующихся в ответ на иммунизацию М2еНВс.Следовательно, полученный препарат может рассматриваться в качестве кандидата на универсальную вакцину против гриппа типа А.The preliminary administration to healthy mice of the serum obtained after intraperitoneal triple immunization of experimental mice with a dose of 100 μg / mouse chimeric protein M2eHBc (passive immunization) led to a statistically significant (p <0.05) decrease in avian influenza virus titer to strain A / Duck / Potsdam / 4024/26 (H5N2) by 100-126 times, and by strain A / HongKong / 1073/99 (H9N2) by 16-20 times (Figure 7). The data obtained indicate a strong noticeable effect and neutralizing activity of antibodies produced in response to immunization with M2eHBc. Consequently, the resulting preparation can be considered as a candidate for a universal type A influenza vaccine.
Пример 7. Изучение in silico последовательности пептидов (эпитопов) внеклеточного домена М2е белка вирусов гриппа типа А и их способности связываться с молекулами МНСExample 7. In silico study of the sequence of peptides (epitopes) of the extracellular domain of M2e protein of influenza type A viruses and their ability to bind to MHC molecules
Проведенные исследования позволяют сделать выбор панели эпитопов, перспективных для создания универсальной вакцины против вирусов гриппа типа А. Существенно, что при проведении скрининга эпитопов использовался комплексный подход, сочетая вышеперечисленные методы с предсказанием протеосомного расщепления исследуемого белка и связывания пептидов с ТАР-белками.Studies have made it possible to choose a panel of epitopes that are promising for the creation of a universal vaccine against type A influenza viruses. It is significant that when conducting epitope screening, a comprehensive approach was used, combining the above methods with the prediction of proteosome cleavage of the studied protein and peptide binding to TAP proteins.
Обобщенные результаты исследования, приведенные в таблице 4, свидетельствуют о том, что наряду с использованной в испытанной конструкции эпитопа дополнительный интерес может представлять последовательность а.к. 3-12, которая является наиболее вероятным участком локализации антигенной детерминанты как для человека, так и для мыши. Сочетание этих двух последовательностей может повысить показатели предлагаемой универсальной вакцины.The generalized results of the study, shown in Table 4, indicate that, along with the epitope used in the tested design, the a.k. sequence can be of additional interest. 3-12, which is the most likely site for the localization of the antigenic determinant for both humans and mice. The combination of these two sequences can increase the performance of the proposed universal vaccine.
Пример 8. Протективное действие М2Е-НВс частиц на модели летальной гриппозной инфекцииExample 8. The protective effect of M2E-HBc particles on a model of lethal influenza infection
Были использованы самки мышей линии Balb/c, 7-8 недельного возраста, полученные из ФГУП «Питомник лабораторных животных «Рапполово» РАМН (Ленинградская обл.). Животных содержали в виварии ГУ НИИ гриппа РАМН в соответствии с действующими правилами.We used female mice of the Balb / c line, 7-8 weeks old, obtained from the Federal State Unitary Enterprise "Kennel of laboratory animals" Rappolovo "RAMS (Leningrad region). The animals were kept in the vivarium of the Research Institute of Influenza RAMS in accordance with the current rules.
Все мыши были разделены на 5 групп. Препарат М2НВс-1 частиц вводили в дозе 10 мкг/мышь по следующей схеме:All mice were divided into 5 groups. The preparation of M2HBc-1 particles was administered at a dose of 10 μg / mouse according to the following scheme:
- первая иммунизация - подкожная инъекция по 25 мкл в четыре места (общий объем 100 мкл) в виде эмульсии «вода в масле», полученной после смешивания 1:1 раствора образца кандидатной вакцины с адъювантом TiterMax® Gold Adjuvant (Sigma);- the first immunization - subcutaneous injection of 25 μl in four places (
- вторую и третью иммунизацию проводили с помощью внутрибрюшинного введения образцов по 100 мкл/мышь. В качестве адъюванта использовали смесь 25 мкг monophosphoryl lipid A (Sigma) + 25 мкг muramyl dipeptide (N-Acetylmuramyl-L-alanyl-D-isoglutamine hydrate, Sigma). Все инъекции проводили с интервалом в три недели.- the second and third immunization was carried out using intraperitoneal injection of samples of 100 μl / mouse. A mixture of 25 μg monophosphoryl lipid A (Sigma) + 25 μg muramyl dipeptide (N-Acetylmuramyl-L-alanyl-D-isoglutamine hydrate, Sigma) was used as an adjuvant. All injections were performed at intervals of three weeks.
Одну группу животных иммунизировали интраназально по 50 мкл под легким эфирным наркозом 1/100 LD/50 дозой живого вируса A/Duck/Potsdam/1402-6/1986 (H5N2). Контрольной группе животных вводили аналогичные адъюванты по вышеупомянутой схеме.One group of animals was immunized intranasally at 50 μl under light ether anesthesia with a 1/100 LD / 50 dose of live virus A / Duck / Potsdam / 1402-6 / 1986 (H5N2). The control group of animals was administered similar adjuvants according to the above scheme.
Таким образом, все мыши были разделены на пять групп:Thus, all mice were divided into five groups:
1. Трехкратная иммунизация М2еНВс;1. Three-fold immunization M2eNVs;
2. Двукратная иммунизация М2еНВс;2. Double immunization M2eNVs;
3. Однократная иммунизация М2еНВс;3. Single immunization with M2eHBC;
4. Однократная иммунизация живой вакциной, содержащей вирус гриппа птиц A/Duck/Potsdam/1402-6/1986 (H5N2);4. Single immunization with a live vaccine containing avian influenza virus A / Duck / Potsdam / 1402-6 / 1986 (H5N2);
5. Контрольная группа (трехкратная иммунизация с соответствующими адъювантами).5. Control group (three times immunization with appropriate adjuvants).
Для изучения протективного действия М2НВс-1 частиц через две недели после последней иммунизации проводили заражение мышей интраназально под легким эфирным наркозом 5 LD/50 вируса гриппа птиц A/Duck/Potsdam 1402-6/1986 (H5N2). Аминокислотная последовательность экстрацеллюлярного домена М2 белка этого штамма вируса гриппа птиц гомологична аминокислотной последовательности М2е фрагмента в составе гибридного белка М2НВс-1.To study the protective effect of M2HBc-1 particles, two weeks after the last immunization, mice were infected intranasally under light ether anesthesia with 5 LD / 50 avian influenza virus A / Duck / Potsdam 1402-6 / 1986 (H5N2). The amino acid sequence of the extracellular domain of the M2 protein of this strain of avian influenza virus is homologous to the amino acid sequence of the M2e fragment in the fusion protein M2HBc-1.
На Фиг.8 показаны результаты основного показателя, по которому оценивается эффективность протективного действия М2НВс-1 частиц - динамика гибели мышей после заражения 5 LD/50 вируса гриппа птиц A/Duck/Potsdam 1402-6/1986 (H5N2). Полученные данные однозначно свидетельствуют о высоком (100%) протективном действии М2НВс-1 после двукратной или трехкратной иммунизации. За весь период наблюдения все животные в этих группах, а также в группе мышей, вакцинированных живым вирусом A/Duck/Potsdam 1402-6/1986 (H5N2), остались живыми. В контрольной группе мышей при этих условиях заражения осталось в живых лишь 20% животных, что существенно ниже (Р<0,0001), чем в вышеуказанных опытных группах. Однократная иммунизация мышей препаратом М2НВс-1 оказалась недостаточной, так как в этой группе на восьмые сутки осталось в живых лишь 30% животных, что сравнимо с аналогичным показателем в контрольной группе.On Fig shows the results of the main indicator by which the effectiveness of the protective action of M2HBc-1 particles is evaluated - the dynamics of the death of mice after infection with 5 LD / 50 of the avian influenza virus A / Duck / Potsdam 1402-6 / 1986 (H5N2). The data obtained unambiguously indicate a high (100%) protective effect of M2HBc-1 after double or triple immunization. Over the entire observation period, all animals in these groups, as well as in the group of mice vaccinated with the live virus A / Duck / Potsdam 1402-6 / 1986 (H5N2), remained alive. In the control group of mice under these infection conditions, only 20% of the animals survived, which is significantly lower (P <0.0001) than in the above experimental groups. A single immunization of mice with M2HBc-1 was not enough, since in this group only 30% of the animals remained alive on the eighth day, which is comparable to that in the control group.
Таким образом, показано 100% протективное действие кандидатной вакцины на основе М2НВс частиц на модели летальной гриппозной инфекции после заражения гомологичным по М2е пептиду штаммом вируса гриппа птиц.Thus, the 100% protective effect of the candidate vaccine based on M2HBc particles on a model of lethal influenza infection after infection with a strain of avian influenza homologous to M2e peptide was shown.
Полученные данные об эффективности вакцины на млекопитающих позволяют экстраполировать достигнутый эффект и на птиц, поскольку механизмы функционирования иммунной системы у птиц и млекопитающих в основном сходны (например, Alberts et al., Molecular biology of the cell, Garland Publishing Inc, 1989), a лабораторные животные являются стандартной моделью для создания вакцин для птиц (например, University of Pittsburgh Medical Center. "Vaccine Provides 100 Percent Protection Against Avian Flu Virus In Animal Study." ScienceDaily 26 January 2006; Fauci AS. Pandemic influenza threat and preparedness. Emerg Infect Dis 2006 Jan; 12(1): 73-6).The data obtained on the effectiveness of the vaccine in mammals allow extrapolating the achieved effect in birds, since the mechanisms of the immune system in birds and mammals are basically similar (e.g., Alberts et al., Molecular biology of the cell, Garland Publishing Inc, 1989), and laboratory animals are the standard model for creating vaccines for birds (e.g. University of Pittsburgh Medical Center. "Vaccine Provides 100 Percent Protection Against Avian Flu Virus In Animal Study." ScienceDaily January 26, 2006; Fauci AS. Pandemic influenza threat and preparedness. Emerg Infect Dis 2006 Jan; 12 (1): 73-6).
Таким образом, создание принципиально новой уникальной и высокоэффективной вакцины против инфекции, вызываемой вирусом гриппа птиц, позволит пополнить ряд вакцинных препаратов против гриппа, что чрезвычайно необходимо в создавшейся неблагоприятной эпидемической ситуации по гриппу в мире.Thus, the creation of a fundamentally new unique and highly effective vaccine against infection caused by avian influenza virus will allow replenishing a number of vaccines against influenza, which is extremely necessary in the current unfavorable epidemic situation of influenza in the world.
Claims (7)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2007129962/13A RU2358981C2 (en) | 2007-08-07 | 2007-08-07 | Universal avian influenza virus vaccine |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2007129962/13A RU2358981C2 (en) | 2007-08-07 | 2007-08-07 | Universal avian influenza virus vaccine |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2007129962A RU2007129962A (en) | 2009-02-20 |
| RU2358981C2 true RU2358981C2 (en) | 2009-06-20 |
Family
ID=40531160
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2007129962/13A RU2358981C2 (en) | 2007-08-07 | 2007-08-07 | Universal avian influenza virus vaccine |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2358981C2 (en) |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2460796C2 (en) * | 2010-11-24 | 2012-09-10 | Учреждение Российской академии наук Центр "Биоинженерия" РАН | Recombinant viral vector and expression system in plant cells of hybrid protein containing extracellular domain of protein m2 of influenza virus attached to core antigen of hepatitis b virus |
| WO2014126510A3 (en) * | 2013-02-15 | 2014-10-16 | Universal Biosystems Limited Company (Ubs Ltd) | Polyvalent fusion protein vaccine against influenza |
| RU2571944C1 (en) * | 2014-10-17 | 2015-12-27 | Общество с ограниченной ответственностью "НТфарма" | Broad-spectrum m2 protein ectodomain avian influenza type a vaccine |
| RU2579903C2 (en) * | 2009-09-22 | 2016-04-10 | Медикаго Инк. | Method of production of virus-like particles of plants |
| RU2618918C2 (en) * | 2015-10-14 | 2017-05-11 | федеральное государственное бюджетное учреждение "Федеральный научно-исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи" Министерства здравоохранения Российской Федерации | Universal anti-infectious vaccine |
-
2007
- 2007-08-07 RU RU2007129962/13A patent/RU2358981C2/en active
Cited By (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2579903C2 (en) * | 2009-09-22 | 2016-04-10 | Медикаго Инк. | Method of production of virus-like particles of plants |
| RU2460796C2 (en) * | 2010-11-24 | 2012-09-10 | Учреждение Российской академии наук Центр "Биоинженерия" РАН | Recombinant viral vector and expression system in plant cells of hybrid protein containing extracellular domain of protein m2 of influenza virus attached to core antigen of hepatitis b virus |
| WO2014126510A3 (en) * | 2013-02-15 | 2014-10-16 | Universal Biosystems Limited Company (Ubs Ltd) | Polyvalent fusion protein vaccine against influenza |
| RU2531235C2 (en) * | 2013-02-15 | 2014-10-20 | Общество с ограниченной ответственностью "Универсальные БиоСистемы" (ООО "УБС") | Hybrid protein-based polyvalent influenza vaccine |
| US9480737B2 (en) | 2013-02-15 | 2016-11-01 | Universal Biosystems Limited Company (Ubs Ltd) | Polyvalent fusion protein vaccine against influenza |
| EA027463B1 (en) * | 2013-02-15 | 2017-07-31 | Общество с ограниченной ответственностью "Универсальные БиоСистемы" (ООО "УБС") | Polyvalent fusion protein vaccine against influenza |
| RU2571944C1 (en) * | 2014-10-17 | 2015-12-27 | Общество с ограниченной ответственностью "НТфарма" | Broad-spectrum m2 protein ectodomain avian influenza type a vaccine |
| RU2618918C2 (en) * | 2015-10-14 | 2017-05-11 | федеральное государственное бюджетное учреждение "Федеральный научно-исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи" Министерства здравоохранения Российской Федерации | Universal anti-infectious vaccine |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RU2007129962A (en) | 2009-02-20 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP7250878B2 (en) | Vaccines based on novel multivalent nanoparticles | |
| US9777045B2 (en) | Immunogenic compositions and methods | |
| Johansson et al. | Dissociation of influenza virus hemagglutinin and neuraminidase eliminates their intravirionic antigenic competition | |
| JP2015502353A (en) | Influenza virus vaccine and use thereof | |
| RU2358981C2 (en) | Universal avian influenza virus vaccine | |
| JP2023052092A (en) | immunogenic composition | |
| CN111556896A (en) | Cross immunity antigen vaccine and its preparation method | |
| Frangione-Beebe et al. | Enhanced immunogenicity of a conformational epitope of human T-lymphotropic virus type 1 using a novel chimeric peptide | |
| JP2009022186A (en) | Antigen peptide and use thereof | |
| JP5730204B2 (en) | Modified peptide vaccine derived from influenza M2 | |
| EP3333178A1 (en) | Recombinant hemagglutinin protein of influenza virus and vaccine containing the same | |
| EP3226893A1 (en) | Vaccines based on hepatitis b core antigens | |
| WO2023207717A1 (en) | Development and use of broad-spectrum vaccine for h5n8 avian influenza | |
| US20230372466A1 (en) | Universal mammalian influenza vaccine | |
| KR102529010B1 (en) | Modification of Engineered Influenza Hemagglutinin Polypeptides | |
| KR20120131725A (en) | A novel virus like particle of high pathogenic avian Influenza virus H5N1 and vaccine for high pathogenic avian Influenza comprising the same | |
| WO2023018817A1 (en) | Truncated influenza neuraminidase and methods of using the same | |
| JP2018052953A (en) | Influenza vaccines and uses thereof | |
| RU2451027C2 (en) | Recombinant swine influenza virus h1n1 vaccine and method for preparing it | |
| CN101087808A (en) | Compositions of influenza viral proteins and methods of use thereof | |
| WO2023236822A1 (en) | Development and use of h5n6 avian influenza broad-spectrum vaccine | |
| CA2090005C (en) | Cross-reactive influenza a immunization | |
| CN113527443B (en) | Influenza A virus PB1 protein T cell epitope polypeptide segment and application thereof | |
| KR101302245B1 (en) | Novel supplemented influenza vaccine having broad cross protective activity | |
| Kotlyarov et al. | Development of recombinant vaccine against A (H1N1) 2009 influenza based on virus-like nanoparticles carrying the extracellular domain of M2 protein |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PC41 | Official registration of the transfer of exclusive right |
Effective date: 20110823 |
|
| HE4A | Notice of change of address of a patent owner | ||
| QB4A | Licence on use of patent |
Free format text: PLEDGE Effective date: 20140528 |
|
| QZ41 | Official registration of changes to a registered agreement (patent) |
Free format text: PLEDGE FORMERLY AGREED ON 20140528 Effective date: 20151002 |
|
| QZ41 | Official registration of changes to a registered agreement (patent) |
Free format text: PLEDGE FORMERLY AGREED ON 20140528 Effective date: 20151230 |
|
| QZ41 | Official registration of changes to a registered agreement (patent) |
Free format text: PLEDGE FORMERLY AGREED ON 20140528 Effective date: 20161006 |
|
| QZ41 | Official registration of changes to a registered agreement (patent) |
Free format text: PLEDGE FORMERLY AGREED ON 20140528 Effective date: 20170817 |
|
| QZ41 | Official registration of changes to a registered agreement (patent) |
Free format text: PLEDGE FORMERLY AGREED ON 20140528 Effective date: 20180604 |
|
| QZ41 | Official registration of changes to a registered agreement (patent) |
Free format text: PLEDGE FORMERLY AGREED ON 20140528 Effective date: 20190514 |