KR101302245B1 - Novel supplemented influenza vaccine having broad cross protective activity - Google Patents

Abstract

본 발명은 M2 단백질이 막에 부착된 형태의 바이러스-유사 입자 (VLP: Virus-Like Particle) 및 불활성화 또는 약독화된 인플루엔자 백신을 함유하는 보강 인플루엔자 백신을 제공한다. 본 발명의 보강 인플루엔자 백신은 넓은 범위의 교차 방어능력을 가지며, 동형 뿐 아니라 이형 인플루엔자 바이러스의 감염까지 예방하는 작용효과를 나타낸다. The present invention provides augmented influenza vaccine containing a virus-like particle (VLP) in the form of M2 protein attached to the membrane and an inactivated or attenuated influenza vaccine. The augmented influenza vaccine of the present invention has a wide range of cross-protective ability, and exhibits the effect of preventing not only isoform but also infection of heterologous influenza virus.

Description

넓은 범위의 교차 방어능력을 갖는 신규한 보강 인플루엔자 백신 {Novel supplemented influenza vaccine having broad cross protective activity}Novel supplemented influenza vaccine having broad cross protective activity

본 발명은 넓은 범위의 교차 방어능력을 갖는 보강 인플루엔자 백신에 관한 것이다. The present invention relates to augmented influenza vaccines having a broad range of cross-protective capabilities.

독감은 독감바이러스 (Influenza virus)의 감염에 의한 호흡기 질병으로 매년 전 세계 10-20% 인구에서 발생한다. 이중 약 200만 명의 사상자와 미국에서만 매년 약 120 억불의 경제적 손실이 발생한다. 독감바이러스는 생물학적 특성상 다양한 아형(subtype)이 존재한다. 이는 바이러스의 면역원성을 결정하는 두가지 단백질 헤마글루티닌(Hemagglutinin: HA)과 뉴라미니다아제 (Neuraminidase: NA) 단백질의 다양성에 기인하는데, 일 예로 A형 인플루엔자에 대해서 HA 16종, NA 9종이 존재하고 또 이들의 변이가 빈번히 발생한다. 따라서, 독감백신을 개발하기 위해서는 그 해에 유행할 것으로 예상되는 균주를 미리 예측하고 이를 이용하여 백신을 제작해야 한다. 따라서 유행균주에 맞춰 백신을 매년 반복적으로 제작해야 할 뿐 아니라 실제 유행하는 균주가 백신 제작시 사용한 균주와 일치하지 않거나, 변이가 큰 새로운 균주가 유행할 경우 기존의 백신은 효과가 현저히 낮다는 문제점을 갖고 있다. 최근의 가장 좋은 예가 전 세계적으로 2009년 대유행한 신종 플루이었다. The flu is a respiratory illness caused by the influenza virus, which affects 10-20% of the world's population each year. About 2 million casualties and about $ 12 billion in economic losses occur annually in the United States alone. Influenza viruses have various subtypes due to their biological characteristics. This is due to the diversity of the two proteins Hemagglutinin (HA) and Neuraminidase (NA) proteins, which determine the immunogenicity of the virus.For example, 16 HA and 9 NA for influenza A. And their variations occur frequently. Therefore, in order to develop the flu vaccine, it is necessary to predict in advance the strains that are expected to occur in the year and to use them to produce vaccines. Therefore, the vaccine should be produced every year according to the epidemic strain, and the existing vaccine would be significantly less effective if the actual strain did not match the strain used in the vaccine production, or if a new strain with a large variation was prevalent. Have The best example of recent years has been the pandemic of 2009 swine flu worldwide.

현재 2종의 치료제가 개발되어 사용되고 있으나 공급 수량이 제한되어 있고 내성균이 발생하여 치료제가 무력화되는 경우가 많아 심각한 보건상의 문제를 야기하게 된다. 따라서 이를 극복하기 위해 넓은 범위의 교차 방어능력을 갖는 범용 백신을 개발하고자 많은 연구가 진행되고 있다.Currently, two kinds of therapeutic agents have been developed and used, but the supply quantity is limited, and resistant bacteria are generated and the therapeutic agents are often incapacitated, causing serious health problems. Therefore, in order to overcome this, a lot of researches are being conducted to develop a general-purpose vaccine having a wide range of cross-protective ability.

인플루엔자 A 바이러스는 입자 표면에 M2 단백질이 존재하며 이는 바이러스 생장에 필수적인 역할을 하여 서로 다른 아형의 인플루엔자 바이러스간에 동일한 항원성을 지니고 있다. 기존의 연구에서 M2 단백질의 세포외 영역에 해당하는 펩타이드를 합성하여 전달체에 결합한 형태로 백신을 제작한 바 있다 (Fu 등, Vaccine 27, 2009, p.1440-7, Comparative immunogenicity evaluations of influenza A virus M2 peptide as recombinant virus like particle or conjugate vaccines in mice and monkeys; Huleatt 등, Vaccine 26, 2008, p.201-14, Potent immunogenicity and efficacy of a universal influenza vaccine candidate comprising a recombinant fusion protein linking influenza M2e to the TLR5 ligand flagellin; Neirynck 등, Nat Med 5, 1999, p.1157-63, A universal influenza A vaccine based on the extracellular domain of the M2 protein). 이렇게 제작된 백신은 동물실험을 통해 M2에 대한 항체가 형성되는 것이 확인되었다. Influenza A viruses have an M2 protein on the particle surface, which plays an essential role in virus growth and has the same antigenicity between different subtypes of influenza viruses. Previous studies have produced vaccines in which the peptides corresponding to the extracellular domain of the M2 protein are synthesized and bound to the carrier (Fu et al., Vaccine 27, 2009, p.1440-7, Comparative immunogenicity evaluations of influenza A virus). M2 peptide as recombinant virus like particle or conjugate vaccines in mice and monkeys; Huleatt et al., Vaccine 26, 2008, p.201-14, Potent immunogenicity and efficacy of a universal influenza vaccine candidate comprising a recombinant fusion protein linking influenza M2e to the TLR5 ligand flagellin; Neirynck et al., Nat Med 5, 1999, p. 1157-63, A universal influenza A vaccine based on the extracellular domain of the M2 protein). The vaccine thus produced was confirmed to form antibodies against M2 through animal experiments.

하지만 백신을 접종한 동물이 바이러스 공격접종에 대해 방어능력을 획득하기 위해서는 콜레라 톡신, 열 민감성 엔도톡신 유도체, 사포닌 QS21, 프로인트 항원보강제, 박테리아 단백질 (De Filette 등, Vaccine 24, 2006, p.544-51, The universal influenza vaccine M2e-HBc administered intranasally in combination with the adjuvant CTA1-DD provides complete protection; Eliasson 등, Vaccine 26, 2008, p.1243-52, CTA1-M2e-DD: A novel mucosal adjuvant targeted influenza vaccine; Fu 등, Vaccine 27, 2009, p.1440-7, Comparative immunogenicity evaluations of influenza A virus M2 peptide as recombinant virus like particle or conjugate vaccines in mice and monkeys; Huleatt 등, Vaccine 26, 2008, p.201-14, Potent immunogenicity and efficacy of a universal influenza vaccine candidate comprising a recombinant fusion protein linking influenza M2e to the TLR5 ligand flagellin; Mozdzanowska 등, Virol J 4, 2007, p.118. Roles of adjuvant and route of vaccination in antibody response and protection engendered by a synthetic matrix protein 2-based influenza A virus vaccine in the mouse)와 같은 면역향상조절제(adjuvants)가 필요하며, 그럼에도 불구하고 동물 실험에서 체중감소를 동반한 임상증상이 발생하고 특히 백신과 서로 다른 아형의 공격접종에 대해서 높은 치사율을 나타낸다. 또한 이러한 면역향상조절제는 안정성의 염려로 인해 인간에 대한 사용이 허가되어 있지 않다. 따라서 이러한 선행연구는 기존에 제작된 M2 백신을 통한 면역반응 만으로는 충분한 방어능력이 형성될 수 없음을 입증하고 있다. 따라서 기존의 백신에 비해 면역력이 높고 더불어 전국적 유행병과 같은 예측하지 못한 바이러스의 확산 상황에 효과적으로 대처할 수 있는 넓은 범위의 교차 방어능력을 갖는 백신의 개발의 개발이 요구되고 있다.However, vaccinated animals are required to be protected against viral challenge by cholera toxin, heat sensitive endotoxin derivatives, saponin QS21, Freund's adjuvant, and bacterial proteins (De Filette et al., Vaccine 24, 2006, p.544-). 51, The universal influenza vaccine M2e-HBc administered intranasally in combination with the adjuvant CTA1-DD provides complete protection; Eliasson et al., Vaccine 26, 2008, p.1243-52, CTA1-M2e-DD: A novel mucosal adjuvant targeted influenza vaccine Fu et al., Vaccine 27, 2009, p.1440-7, Comparative immunogenicity evaluations of influenza A virus M2 peptide as recombinant virus like particle or conjugate vaccines in mice and monkeys; Huleatt et al., Vaccine 26, 2008, p.201-14 , Potent immunogenicity and efficacy of a universal influenza vaccine candidate comprising a recombinant fusion protein linking influenza M2e to the TLR5 ligand flagellin; Mozdzanowska et al., Virol J 4, 2007, p.118.Roles of adjuvant and route of vaccination in antibody response and protection engendered by a synthetic matrix protein 2-based influenza A virus vaccine in the mouse. And high mortality, particularly against challenge with vaccines and subtypes of different subtypes. In addition, such immunomodulators are not licensed for human use due to stability concerns. Therefore, these previous studies demonstrate that the immune response with the existing M2 vaccine alone cannot form sufficient protective capacity. Therefore, the development of a vaccine having a higher immunity than the existing vaccine and having a wide range of cross-defense ability to effectively cope with the unpredictable spread of viruses such as a national pandemic is required.

본 발명은 넓은 범위의 교차 방어능력을 가지며, 동형 뿐 아니라 이형 인플루엔자 바이러스 감염을 효과적으로 예방할 수 있는 보강 인플루엔자 백신을 제공하고자 한다.The present invention has a broad range of cross-protective ability, and to provide a boosted influenza vaccine that can effectively prevent heterozygous influenza virus infection.

이에 본 발명자들은 인플루엔자 바이러스 M2 단백질을 발현하고 있는 바이러스 유사입자 (Virus like particle: M2-VLP)를 제조하였으며, 또한, M2-VLP 백신을 불활성화시킨 바이러스 백신과 혼합하여 마우스 비강에 2차에 걸쳐 면역한 경우 혈액과 점막 내 인플루엔자 바이러스에 대한 항체 수치가 불활성화시킨 바이러스 백신만 투여한 그룹에 비해 현저히 증가하는 것을 최초로 확인하였다. 놀랍게도 치사량의 인플루엔자 바이러스 감염으로부터 마우스(생쥐)를 완벽하게 보호한다는 사실을 발견하였으며, 또한, 상기 M2-VLP에 의한 효과가 동형의 인플루엔자 바이러스 감염에 대해서만 국한되지 않고, 서로 다른 아형의 이형 인플루엔자 바이러스 감염에 대해서도 동일한 방어 면역 효과를 나타내는 것을 확인하여 본 발명을 완성하였다. Therefore, the present inventors prepared a virus like particle (M2-VLP) expressing the influenza virus M2 protein, and also mixed the virus vaccine inactivated with the M2-VLP vaccine to the mouse nasal cavity for 2 times. For the first time, immunization significantly increased the levels of antibodies against influenza virus in the blood and mucous membranes compared to the group that received only the inactivated virus vaccine. Surprisingly, it was found that mice (mouse) are completely protected from lethal doses of influenza virus infection, and the effects of M2-VLP are not limited to homozygous influenza virus infections, but also heterozygous influenza virus infections of different subtypes. The present invention was completed by confirming that the same protective immune effect was obtained.

본 발명은 M2 단백질이 막에 부착된 형태의 바이러스-유사 입자 (VLP: Virus-Like Particle) 및 불활성화된 인플루엔자 백신을 함유하는 보강 인플루엔자 백신을 제공한다. The present invention provides for augmented influenza vaccine containing Virus-Like Particles (VLPs) and inactivated influenza vaccines in the form of M2 protein attached to the membrane.

본 명세서에서, “바이러스 유사입자” 또는 “VLP”는 하나 이상의 바이러스 구조단백질을 포함하며, 대표적으로 표면단백질 (envelope protein)과 매트릭스단백질 (matrix protein)을 함유하는 반면, 바이러스의 유전물질은 함유하지 않는다. 이러한 VLP는 당 분야에 공지의 알려진 방법으로 제조할 수 있다. 예컨대, VLP의 조립은 해당 구조단백질을 암호화하는 재조합 DNA 분자를 이용하여 적당한 숙주세포에 형질전환시킨 후 배양하면 세포 안에서 발현된 구조단백질이 세포 표면에서 조립된 후 배양상층액으로 배출되는 과정을 거친다. 이 과정 중에 VLP에 포함된 표면단백질은 고정화 과정을 거치지 않고 자연 그대로의 형태를 유지하고 있어 바이러스와 유사한 형태를 지니고 있어 체내에서 바이러스에 대한 목적하는 면역반응을 도출할 수 있다.As used herein, “virus like particle” or “VLP” includes one or more viral structural proteins and typically contains surface proteins and matrix proteins, while not containing the genetic material of the virus. Do not. Such VLPs can be prepared by methods known in the art. For example, when VLP is transformed into a suitable host cell using a recombinant DNA molecule encoding the structural protein, the VLP is cultured, and then the structural protein expressed in the cell is assembled on the cell surface and then discharged to the culture supernatant . During this process, the surface proteins contained in the VLP are not immobilized and remain in their natural form, so they have a virus-like shape, which can lead to the desired immune response in the body to the virus.

VLP는 체내에서 항원으로 작용하며 수상돌기세포(dendritic cells)와 같은 항원표지세포와의 반응을 통해 T 또는 B 면역 세포에 항원을 표지하게 된다. VLP는 본래의 바이러스와 유사한 구조를 갖고 있으나 유전물질은 갖고 있지 않아 증식이 불가능하여 백신과 같은 용도로 사용함에 있어 안전성을 기대할 수 있다. VLP의 표면에 삽입된 바이러스 표면단백질은 순수하게 분리된 재조합단백질에 비해 높은 항원성을 갖고 있으며 효과적인 중화항체를 형성할 수 있다. VLP를 이용한 백신의 대표적인 예로 글락소스미스클라인(GSK) 에서 생산하고 있는 human papilloma virus type (HPV-16) L1 백신을 들 수 있다 (Markowitz et al., (2007). Quadrivalent Human Papillomavirus Vaccine: Recommendations of the Advisory Committee on Immunization Practices (ACIP). MMWR Recomm Rep 56: 1-24).VLPs act as antigens in the body and label antigens on T or B immune cells through reaction with antigen-labeled cells, such as dendritic cells. VLP has a structure similar to that of the original virus but has no genetic material, so that it can not be propagated, so safety can be expected for use in applications such as vaccines. Viral surface proteins inserted on the surface of VLPs have higher antigenicity than purely isolated recombinant proteins and can form effective neutralizing antibodies. A representative example of a vaccine using VLP is the human papilloma virus type (HPV-16) L1 vaccine produced by GlaxoSmithKline (GSK) (Markowitz et al., (2007) .Quadrivalent Human Papillomavirus Vaccine: Recommendations of the Advisory Committee on Immunization Practices (ACIP) .MMWR Recomm Rep 56: 1-24).

일반적으로 바이러스 단백질의 유전자 염기서열과 해당하는 아미노산서열은 미국 유전자정보데이터베이스 (National Center for Biotechnology Information: NCBI) 에서 확보할 수 있으며, 바이러스 단백질의 변이체나 상동성을 갖는 유사단백질을 VLP에 삽입하여 더 좋은 면역원성을 확보할 수 있다. In general, the gene sequence and the corresponding amino acid sequence of the viral protein can be obtained from the National Center for Biotechnology Information (NCBI), and the mutant or homologous protein of the viral protein is inserted into the VLP. Good immunogenicity can be obtained.

목적하는 VLP는 여러가지 단백질 발현시스템을 이용하여 제작할 수 있으며 대표적인 것으로 효모 발현시스템,(Markowitz et al., Quadrivalent Human Papillomavirus Vaccine: Recommendations of the Advisory Committee on Immunization Practices (ACIP). MMWR Recomm Rep 56: 1-24, (2007)), 베큘로바이러스 발현시스템, (Yamshchikov et al., Virology: 214, 50-58, (1995)), 변형된 재조합 폭스바이러스 발현시스템 (Modified Vaccinia Ankara: MVA) (Wyatt et al., Vaccine: 15, 1451-1458, (1996)), 재조합 수포성구내염 바이러스 발현시스템 (Vesicular Stomatitis Virus: VSV) , 재조합 아데노바이러스 발현시스템 등이 있다. The desired VLP can be produced using various protein expression systems and is representative of yeast expression systems (Markowitz et al., Quadrivalent Human Papillomavirus Vaccine: Recommendations of the Advisory Committee on Immunization Practices (ACIP) .MMWR Recomm Rep 56: 1- 24, (2007)), baculovirus expression system, (Yamshchikov et al., Virology: 214, 50-58, (1995)), modified recombinant poxvirus expression system (Modified Vaccinia Ankara: MVA) (Wyatt et al , Vaccine: 15, 1451-1458, (1996)), the recombinant vesicular stomatitis virus expression system (Vesicular Stomatitis Virus: VSV), and the recombinant adenovirus expression system.

통상적으로 VLP는 바이러스의 구조단백질 및 표면단백질 발현벡터와 추가적으로 면역보강물질의 발현벡터를 숙주세포 내로 형질전환시켜 제조된다. 이때 사용되는 숙주세포로는 곤충세포 (Spodoptera frugiperda Sf 9 and Sf21cells), 고등동물세포 (EL4 cells and HeLa cells) 등이 사용되나 여기에 국한되지는 않는다. 바이러스 단백질 및 면역보강물질을 발현시키는 벡터는 하나 또는 둘 이상의 벡터가 사용될 수 있다. In general, VLPs are prepared by transforming the expression vector of the viral structural and surface proteins and additionally the expression vector of the adjuvant into the host cell. The host cells used here include, but are not limited to, insect cells (Spodoptera frugiperda Sf 9 and Sf21 cells), high animal cells (EL4 cells and HeLa cells) and the like. One or two or more vectors may be used as the vector for expressing the viral protein and the immunostimulating substance.

B 형 간염백신, Human pappilomavirus 백신 등 허가된 백신들 또는 여러가지 실험 백신들이 바이러스 유사입자 (VLP) 기술을 이용한 백신개발에 시도되고 있다 (Kang et al., Influenza vaccines based on virus-like particles. Virus Res;143:140-6, (2009)).Licensed vaccines such as hepatitis B vaccine, human pappilomavirus vaccine, or various experimental vaccines have been attempted to develop vaccines using virus-like particle (VLP) technology (Kang et al., Influenza vaccines based on virus-like particles. 143: 140-6, (2009)).

이러한 VLP 기술은 이미 연구되어 공지되었으며, 일반적으로 연구및 백신 생산을 위해 많이 사용되는 방법이다. 이러한 관련 문헌의 예로는 [Kang et al., Influenza vaccines based on virus-like particles. Virus Res;143:140-6, 2009], [Kang et al., Influenza virus-like particles as pandemic vaccines. Curr Top Microbiol Immunol 2009; 333:269-89] 등이 있다. Such VLP technology has already been studied and known, and is a commonly used method for research and vaccine production. Examples of such related documents are [Kang et al., Influenza vaccines based on virus-like particles. Virus Res; 143: 140-6, 2009], Kang et al., Influenza virus-like particles as pandemic vaccines. Curr Top Microbiol Immunol 2009; 333: 269-89].

이러한 VLP 기반 백신은 살아있어 복제가능한 바이러스와 같은 면역효능을 지닌 것으로 알려져 있다. 즉, 바이러스 유사입자는 면역 세포를 효과적으로 활성화시키는 능력을 갖고 있어 높은 항체형성 유도와 효과적인 보호면역을 유도한다 (Song JM, et al., Protective immunity against H5N1 influenza virus by a single dose vaccination with virus-like particles. Virology 405: 165-175, (2010); Sailaja G et al., Human immunodeficiency virus-like particles activate multiple types of immune cells. Virology 362: 331-341, (2007)).Such VLP-based vaccines are known to have the same immunological efficacy as live and replicable viruses. In other words, virus-like particles have the ability to effectively activate immune cells, leading to induction of high antibody formation and effective protective immunity (Song JM, et al., Protective immunity against H5N1 influenza virus by a single dose vaccination with virus-like Virology 405: 165-175, (2010); Sailaja G et al., Human immunodeficiency virus-like particles activate multiple types of immune cells. Virology 362: 331-341, (2007)).

본 명세서에서, M2 단백질은 인플루엔자 A 바이러스의 입자 표면에 존재하며, 바이러스 성장에 필수적인 역할을 하여 서로 다른 아형의 인플루엔자 바이러스간에 동일한 항원성을 지니고 있다. 인플루엔자 바이러스 M2 단백질은 4분자체로 이루어진 3형 막단백질의 일종이다. M2 단백질은 바이러스가 세포에 감염되었을 때 바이러스 입자 내부로 수소이온을 공급하는 통로역할을 한다. 바이러스가 증식하는 과정 중에 세포 내에서 발현된 M2 단백질은 세포의 표면으로 이동하여 바이러스 조립과정에 참여하게 된다. 이때 M2 단백질에 대한 중화항체는 세포표면에 위치한 M2 단백질과 반응할 수 있으나 기존의 연구에 따르면 외부로 돌출되어 있는 단백질 부위가 작아 충분한 면역원성을 확보하기 어렵고, 다른 바이러스 단백질 (HA, NA)들이 세포 표면에 다수 존재하여 M2 단백질에 대한 중화항체만으로는 바이러스 감염을 방어하기에 충분하지 않음이 밝혀졌으며 최근에는 이를 극복하기 위한 다수의 연구가 이뤄지고 있다 (De Filette et al., Improved design and intranasal delivery of an M2e-based human influenza A vaccine. Vaccine; Eliasson et al., CTA1-M2e-DD: A novel mucosal adjuvant targeted influenza vaccine. Vaccine 26: 1243-1252, (2008); Fan J, et al. Preclinical study of influenza virus A M2 peptide conjugate vaccines in mice, ferrets, and rhesus monkeys. Vaccine 22: 2993-3003, (2004); Heinen et al., (2002); Liu W, Zou P, Ding J, Lu Y, Chen YH (2005). Sequence comparison between the extracellular domain of M2 protein human and avian influenza A virus provides new information for bivalent influenza vaccine design. Microbes Infect 7: 171-177; Neirynck S, et al., A universal influenza A vaccine based on the extracellular domain of the M2 protein. Nat Med 5: 1157-1163, (1999)).In the present specification, the M2 protein is present on the particle surface of influenza A virus and plays an essential role in virus growth and has the same antigenicity between influenza viruses of different subtypes. Influenza virus M2 protein is a type 3 membrane protein composed of quadruple molecular sieves. M2 protein acts as a pathway for supplying hydrogen ions into virus particles when the virus is infected with a cell. During the process of virus proliferation, the M2 protein expressed in the cell migrates to the surface of the cell and participates in the virus assembly process. At this time, the neutralizing antibody against M2 protein can react with M2 protein located on the surface of the cell, but according to the existing research, it is difficult to secure sufficient immunogenicity due to the small protruding protein site, and other viral proteins (HA, NA) It has been found that neutralizing antibodies to M2 proteins alone are not sufficient to defend against viral infections due to their presence on the cell surface, and a number of studies have recently been made to overcome them (De Filette et al., Improved design and intranasal delivery of an M2e-based human influenza A vaccine.Vaccine; Eliasson et al., CTA1-M2e-DD: A novel mucosal adjuvant targeted influenza vaccine.Vaccine 26: 1243-1252, (2008); Fan J, et al. Preclinical study of influenza virus A M2 peptide conjugate vaccines in mice, ferrets, and rhesus monkeys.Vaccine 22: 2993-3003, (2004); Heinen et al., (2002); Liu W, Zou P, Ding J, Lu Y, Chen YH (2005) .Sequence compariso n between the extracellular domain of M2 protein human and avian influenza A virus provides new information for bivalent influenza vaccine design.Microbes Infect 7: 171-177; Neirynck S, et al., A universal influenza A vaccine based on the extracellular domain of the M2 protein.Nat Med 5: 1157-1163, (1999)).

야생형 M2 단백질(서열번호 1)은 세포밖 돌출부위 (an amino-terminal extracellular domain: M2e), 막투과부위 (Transmembrane domain: TM) 그리고 세포 안 말단부위 (cytoplasmic domain: CT)의 3개의 구조적 도메인으로 구성되며 각각 24, 19, 54개의 아미노산으로 이루어져 있다. 본 발명에서 사용된 M2 단백질은 최소 하나 이상의 세포밖 돌출부위를 가지고 있는 것이 바람직하며 야생형 M2 단백질 전체를 가지고 있는 것도 포함한다.The wild type M2 protein (SEQ ID NO: 1) is composed of three structural domains: an amino-terminal extracellular domain (M2e), transmembrane domain (TM), and cytoplasmic domain (CT). It consists of 24, 19 and 54 amino acids each. The M2 protein used in the present invention preferably has at least one extracellular protrusion and includes the whole wild type M2 protein.

또한, 본 발명에서는 M2e 단백질과 다른 이종단백질이 결합된 재조합 융합단백질이 사용될 수 있다. M2 단백질에 대한 면역원성을 증가시키기 위해 하나 이상의 M2 단백질이 연결된 형태를 구성할 수 있으며, 박테리아 플라젤린을 포함한 플라젤린(Flagellin), TLR작동제, GM-CSF를 포함한 사이토카인, 알럼 등과 같은 면역향상제를 VLP 내에 M2 단백질과 동시에 삽입할 수 있다. 이러한 면역보조 단백질이 포함된 VLP는 M2 특이적인 항원의 분비를 촉진시켜 인플루엔자 바이러스 감염에 대해 더 좋은 방어효능을 나타냄이 밝혀졌다 (Wang et al., (2011). Intranasal immunization with influenza VLPs incorporating membrane-anchored flagellin induces strong heterosubtypic protection. PLoS One 5: e13972).In addition, in the present invention, a recombinant fusion protein in which M2e protein and other heterologous proteins are combined may be used. One or more M2 proteins may be linked to increase the immunogenicity against the M2 protein. Immunizations, such as flagellin, including bacterial flagellin, TLR agonists, cytokines, including GM-CSF, and alum Enhancers can be inserted concurrently with the M2 protein in the VLPs. VLPs containing these adjuvant proteins have been shown to promote the secretion of M2-specific antigens, thus providing better protection against influenza virus infections (Wang et al., (2011) .Intranasal immunization with influenza VLPs incorporating membrane- anchored flagellin induces strong heterosubtypic protection.PLoS One 5: e13972).

야생형 M2 단백질의 구조는 도 1의 (1)에 나타난 바와 같으며, 본 발명에서 사용되는 재조합 융합 인플루엔자 M2 단백질은 당업자의 기술 수준 범위 내에 있으며, 바람직하게는 세포 표면으로 노출된 외부 M2 단백도메인(M2e) 부분이 병렬로 연결된, 막에 부착된 형태의 재조합 M2 단백질 (도1의 (2); 서열번호 2), 병렬로 연결되어 있는 M2e 부분이 헤마글루티닌의 HA2 도메인에 융합된 M2 단백질 (도1의 (3); 서열번호 3), 병렬 연결 M2e 부분이 플라젤린 (N-terminal domain of bacterial flagellin)과 다중융합단백질 (GCN4)에 융합된 M2 단백질 (도1의 (4); 서열번호 4), 면역향상제로써 GM-CSF (Granulocyte macrophage colony stimulating factor) 또는 야생형 박테리아 플라젤린을 M2 단백질 없이 인플루엔자 바이러스 HA 유래 막투과 부위와 세포질 말단부위에 결합된 단백질 (도 1-(5); 서열번호 5) 등과 같은 변형체가 사용될 수 있다. 상기한 재조합 단백질의 제조는 당 분야의 널리 알려진 재조합단백질 합성 기술을 이용하여 수행될 수 있다. 상기 M2e 단백질은 다양한 종에 대한 M2e 단백질을 사용할 수 있으며, 이러한 M2e 단백질에는 hM2e (인간), sM2e (돼지), a1M2e, a2M2e (조류) 등이 있다 (각각 서열번호 7 내지 10). The structure of the wild type M2 protein is as shown in (1) of Figure 1, the recombinant fusion influenza M2 protein used in the present invention is within the skill level of those skilled in the art, preferably the foreign M2 protein domain exposed to the cell surface ( Recombinant M2 protein in a membrane-attached form (M2e), in which parts are connected in parallel (M2e; SEQ ID NO: 2), M2 protein in which M2e parts connected in parallel are fused to the HA2 domain of hemagglutinin (Fig. 1 (3); SEQ ID NO: 3), the M2 protein in which the parallel-linked M2e moiety is fused to the flagellin (N-terminal domain of bacterial flagellin) and the polyfusion protein (GCN4) (Fig. 1 (4); sequence No. 4), a protein in which GM-CSF (Granulocyte macrophage colony stimulating factor) or wild type bacterial flagellin is bound to the influenza virus HA-derived transmembrane site and cytoplasmic end region as an immunostimulant (Fig. 1- (5); SEQ ID NO: 5) and so on There are variants can be used. The preparation of the recombinant protein can be carried out using recombinant protein synthesis techniques well known in the art. The M2e protein may use M2e protein for various species, and these M2e proteins include hM2e (human), sM2e (pig), a1M2e, a2M2e (algae), and the like (SEQ ID NOs. 7 to 10, respectively).

M2 에 대한 항체가 다양한 인플루엔자 바이러스에 대해 보호기능 및 바이러스 성장 억제 인자로 역할이 있음이 밝혀졌다 (Treanor et al., Passively transferred monoclonal antibody to the M2 protein inhibits influenza A virus replication in mice. J Virol 64: 1375-1377, (1990); Zebedee et al., Influenza A virus M2 protein: monoclonal antibody restriction of virus growth and detection of M2 in virions. J Virol 62: 2762-2772, (1988); Fu TM, et al., Characterizations of four monoclonal antibodies against M2 protein ectodomain of influenza A virus. Virology 385: 218-226, (2009)).It has been shown that antibodies against M2 act as protective and viral growth inhibitors against various influenza viruses (Treanor et al., Passively transferred monoclonal antibody to the M2 protein inhibits influenza A virus replication in mice.J Virol 64: 1375-1377, (1990); Zebedee et al., Influenza A virus M2 protein: monoclonal antibody restriction of virus growth and detection of M2 in virions.J Virol 62: 2762-2772, (1988); Fu TM, et al. , Characterizations of four monoclonal antibodies against M2 protein ectodomain of influenza A virus.Virology 385: 218-226, (2009)).

M2 단백질은 인플루엔자 백신 항원으로 연구가 진행되어 발표되었다. M2 단백질에 대한 항체만으로는 바이러스 감염을 방어하기에 충분하지 않음이 밝혀졌으며 최근에는 이를 극복하기 위한 다수의 연구가 이뤄지고 있다 (De Filette et al., Improved design and intranasal delivery of an M2e-based human influenza A vaccine. Vaccine; Eliasson et al., CTA1-M2e-DD: A novel mucosal adjuvant targeted influenza vaccine. Vaccine 26: 1243-1252, (2008); Fan J, et al., Preclinical study of influenza virus A M2 peptide conjugate vaccines in mice, ferrets, and rhesus monkeys. Vaccine 22: 2993-3003, (2004); Heinen et al., 2002; Liu W, Zou P, Ding J, Lu Y, Chen YH, Sequence comparison between the extracellular domain of M2 protein human and avian influenza A virus provides new information for bivalent influenza vaccine design. Microbes Infect 7: 171-177, (2005); Neirynck S, et al., A universal influenza A vaccine based on the extracellular domain of the M2 protein. Nat Med 5: 1157-1163, (1999); Schotsaert M et al., Universal M2 ectodomain-based influenza A vaccines: preclinical and clinical developments. Expert Rev Vaccines 2009;8: 499-508)The M2 protein has been published as a study of influenza vaccine antigens. Antibodies to the M2 protein alone have been found to be insufficient to defend against viral infections, and a number of studies have recently been made to overcome them (De Filette et al., Improved design and intranasal delivery of an M2e-based human influenza A). Vaccine; Eliasson et al., CTA1-M2e-DD: A novel mucosal adjuvant targeted influenza vaccine.Vaccine 26: 1243-1252, (2008); Fan J, et al., Preclinical study of influenza virus A M2 peptide conjugate vaccines in mice, ferrets, and rhesus monkeys.Vaccine 22: 2993-3003, (2004); Heinen et al., 2002; Liu W, Zou P, Ding J, Lu Y, Chen YH, Sequence comparison between the extracellular domain of M2 protein human and avian influenza A virus provides new information for bivalent influenza vaccine design.Microbes Infect 7: 171-177, (2005); Neirynck S, et al., A universal influenza A vaccine based on the extracellular domain of the M2 protein Nat Med 5: 1157-1163, (1999); Schotsaert M et al., Univer sal M2 ectodomain-based influenza A vaccines: preclinical and clinical developments.Expert Rev Vaccines 2009; 8: 499-508)

본 명세서에서 M2-VLP 는 M2 펩타이드 혹은 단백질을 포함하는 바이러스 유사입자 (VLP) 백신을 뜻한다. 또한, 바이러스 매트릭스단백질 (M1)과 하나 또는 그 이상의 표면 단백질 (M2 또는 M2e)을 인코딩하는 유전자와 하나 또는 그 이상의 면역조절물질 (플라젤린: FliC)을 인코딩하는 유전자가 단일 발현벡터 또는 둘 이상의 발현벡터에 삽입되어 있는 것을 사용할 수 있다. 상기 하나 이상의 발현벡터는 숙주세포 내로 형질전환되어 인코딩하고 있는 단백질이 세포 내에서 발현되고, 세포 밖에서 VLP가 조립되고 세포 밖으로 배출되게 된다. 이때 바이러스 구조단백질과 하나 또는 그 이상의 표면 당단백질 그리고 면역조절물질의 발현은 연결되어 있는 적당한 프로모터에 의해 작동이 개시되는데 이 때 사용되는 프로모터는 배큘로바이러스 프로모터, 재조합 MVA 프로모터, CMV (cytomegalovirus) 프로모터, EF (elongation factor) 프로모터, 아데노바이러스 프로모터, 재조합 VSV 프로모터, 재조합 아데노바이러스 프로모터, 재조합 알파바이러스 프로모터, 재조합 DNA 발현 백터 등으로부터 선택될 수 있다. As used herein, M2-VLP refers to a virus like particle (VLP) vaccine comprising an M2 peptide or protein. In addition, a gene encoding a viral matrix protein (M1) and one or more surface proteins (M2 or M2e) and a gene encoding one or more immunomodulators (flagellin: FliC) may be expressed in a single expression vector or two or more expressions. Anything inserted into the vector can be used. The one or more expression vectors are transformed into a host cell and the encoding protein is expressed in the cell, and the VLP is assembled outside the cell and discharged out of the cell. Expression of the viral structural protein, one or more surface glycoproteins, and immunomodulators is initiated by an appropriate promoter linked to the bacteriovirus promoter, recombinant MVA promoter, and CMV (cytomegalovirus) promoter. , EF (elongation factor) promoter, adenovirus promoter, recombinant VSV promoter, recombinant adenovirus promoter, recombinant alphavirus promoter, recombinant DNA expression vector and the like.

본 발명의 M2-VLP 의 제조는 당업자가 통상의 기술 수준의 범주 내에 속한다. 예컨대, 야생형 M2 혹은 도1에 나타난 다양한 구조의 M2를 발현하는 유전자를 배큘로바이러스 셔틀 벡터 플라즈미드 (pFastBac vector plasmid, Invitrogen, Carlsbad, CA) 에 클로닝하고, 재조합 배큘로바이러스 유전체 (recombinant Bacmid baculovirus) DNA를 얻기 위해 박테리아(DH10Bac competent cells, rAcNPV, Invitrogen, Carlsbad, CA)에 도입하여 스크리닝한다. 이렇게 해서 얻어진 재조합 배큘로바이러스 유전체를 곤충세포 (SF9 insect cells)에 형질감염시킨다. M2 단백질을 발현하는 재조합 배큘로바이러스를 다시 곤충세포에 감염시켜 M2-VLP를 얻을 수 있다. 여기서, M2-VLP를 포함하는 배양 상층액을 QuixStand hollow fiber (GE Healthcare, Piscataway, NJ)를 사용하여 농축하여 사용할 수 있다. 보다 자세히는 논문 [Song JM, et al., Influenza virus-like particles containing M2 induce broadly cross protective immunity. PLoS One 6: e14538, (2011)]을 참조할 수 있다.Preparation of the M2-VLP of the present invention is within the scope of ordinary skill in the art. For example, a gene expressing wild type M2 or M2 of various structures shown in FIG. 1 was cloned into a baculovirus shuttle vector plasmid (pFastBac vector plasmid, Invitrogen, Carlsbad, Calif.), And the recombinant baculovirus genome (recombinant Bacmid baculovirus) DNA. Introduce and screen bacteria (DH10Bac competent cells, rAcNPV, Invitrogen, Carlsbad, CA) to obtain. The recombinant baculovirus genome thus obtained is transfected into SF9 insect cells. Recombinant baculovirus expressing M2 protein can be infected by insect cells again to obtain M2-VLP. Here, the culture supernatant containing M2-VLP may be concentrated and used using QuixStand hollow fiber (GE Healthcare, Piscataway, NJ). For more details, see Song JM, et al., Influenza virus-like particles containing M2 induce broadly cross protective immunity. PLoS One 6: e14538, (2011).

본 발명의 M2-VLP 의 예시적 구조는 도2 에 제시된 바와 같으나, 이에 국한되지는 않는다. An exemplary structure of the M2-VLP of the present invention is as shown in FIG. 2, but is not limited to such.

본 발명에서 M2-VLP는 기존의 인플루엔자 백신과 혼합 투여할 경우 여러 아형의 인플루엔자 A 바이러스에 대해 혁신적으로 향상된 교차방어 효능을 나타낸다. In the present invention, M2-VLP shows an innovatively improved cross-protective effect against several subtypes of influenza A virus when administered in combination with an existing influenza vaccine.

여기서, M2-VLP와 혼합 투여되는 기존의 인플루엔자 백신은 인플루엔자 바이러스를 불활성화 (바이러스 백신 혹은 바이러스 입자를 파괴한 스플릿 백신을 포함) 또는 약독화시킨 형태이며, H1N1형과 H3N2 형을 포함한다. 이러한 불활성화된 바이러스 백신, 바이러스 입자를 분쇄파괴한 형태의 스플릿 백신, 또는 약독화된 인플루엔자 백신은 당업자에게 널리 알려져 있으며, 예컨대 시판되는 것들을 사용할 수 있다. Here, existing influenza vaccines mixed with M2-VLP are inactivated (including viral vaccines or split vaccines that destroy virus particles) or attenuated influenza viruses, and include H1N1 and H3N2 types. Such inactivated virus vaccines, split vaccines in the form of crushing virus particles, or attenuated influenza vaccines are well known to those skilled in the art, and commercially available ones can be used, for example.

현재 미국에는 두 가지 종류의 인플루엔자 백신이 식품의약품안전청 (Food and Drug Administration: FDA)의 허가를 받아 판매 중이다. 이들은 모두 삼가(Trivalent)의 불활성화 백신 (포르말린 (0.01% formalin) 불활성화된 인플루엔자 바이러스 백신 혹은 계면활성제를 사용해서 바이러스입자를 파괴한 스플릿 백신) 또는 약독화된 인플루엔자 백신이다. 이 두가지 형태의 계절형 백신은 매년 백신균주로 지정된 H3N2 형과 H1N1형 그리고 B형, 총 3종의 균주가 혼합된 삼가(Trivalent) 백신 형태로 제작되어 사용된다. Currently, two types of influenza vaccines are sold in the United States with the approval of the Food and Drug Administration (FDA). These are all trivalent inactivated vaccines (formalin (0.01% formalin) inactivated influenza virus vaccines or split vaccines that destroyed virus particles using surfactants) or attenuated influenza vaccines. These two types of seasonal vaccines are produced and used in the form of trivalent vaccines in which three strains, H3N2, H1N1 and B, designated as vaccine strains are mixed each year.

시판되고 있는 불활성화 백신(바이러스 백신 혹은 바이러스 입자를 파괴한 스플릿 백신을 포함)으로는 AGRIFLU (Novartis), FLUZONE (Sanofi Pasteur), AFLURIA (CS Limited), FLULAVAL (ID Biomedical Corporation of Quebec), FLUARIX (GlaxoSmithKline), FLUVIRIN (Novartis) 등이 있으며 약독화 백신으로는 FLUMIST (MedImmune Vaccines)가 있다.Commercially available inactivated vaccines (including virus vaccines or split vaccines that destroy virus particles) include AGRIFLU (Novartis), FLUZONE (Sanofi Pasteur), AFLURIA (CS Limited), FLULAVAL (ID Biomedical Corporation of Quebec), FLUARIX ( GlaxoSmithKline), FLUVIRIN (Novartis), and attenuated vaccines include FLUMIST (MedImmune Vaccines).

불활성화 삼가백신은 일반적으로 팔 또는 허벅지 근육에 주사하여 접종하며 6개월 이상이 된 건강한 영·유아 및 성인을 대상으로 하고 임산부에게도 접종이 가능하다. 여기서 건강한 사람이란 독감증상을 나타내지 않는 경우를 의미한다. Inactivated trivalent vaccines are usually injected by injection into the arm or thigh muscles, and are intended for healthy infants, infants and adults older than 6 months, and can also be given to pregnant women. Here, a healthy person refers to a case of not exhibiting flu symptoms.

약독화 백신은 비강 스프레이 형태로 접종하며 2세부터 49세까지를 접종대상으로 하며 임산부에게는 사용하지 않는다.Attenuated vaccines are given in the form of nasal sprays. The vaccine is intended for ages 2 to 49 years and is not intended for pregnant women.

현재 시판되어 사용하고 있는 백신은 불활성화된 전체 인플루엔자 바이러스 백신 혹은 계면활성제를 사용해서 바이러스입자를 파괴한 스플릿 백신, 또는 약독화 인플루엔자 백신으로 헤마글루티닌에 대한 항체형성을 통해 숙주의 보호능력을 부여한다. 따라서 보호 기능은 백신 균주에 한정되어 있다. 60여년 동안 인플루엔자 바이러스에 대한 백신을 접종하고 있지만, 매년 변이가 있는 혹은 변이가 예상되는 균주에 대해 새로운 균주의 백신을 새로이 제조해야 하는 단점이 지금까지 해결하지 못한 부분이다. 본 발명은 이러한 문제점을 해결하는 데에 초점이 있다. Commercially available vaccines are either inactivated whole influenza virus vaccines or split vaccines that destroy viral particles using surfactants, or attenuated influenza vaccines to protect the host's protective ability by forming antibodies against hemagglutinin. Grant. The protective function is therefore limited to vaccine strains. The vaccine has been vaccinated against influenza virus for more than 60 years, but the disadvantage of having to prepare a new strain of vaccine against a strain that is mutated or expected every year has not been solved until now. The present invention focuses on solving this problem.

공통된 항원 백신 (M2-VLP)을 기존 백신에 보강하므로서 이러한 문제점을 해결하는 교차보호 백신 개발 개념 및 헤마글루티닌에 대해 항체를 형성하는 기존의 인플루엔자 백신에 적용 가능하다는 점은 본 발명자의 최근 발표된 논문에 기술적 바탕을 두고 있다. (Song JM et al.,. Vaccination inducing broad and improved cross protection against multiple subtypes of influenza A virus. Proc Natl Acad Sci U S A 2011;108:757-61). 따라서, 본 발명에서는 변이가 많은 헤마글루티닌 항원에 바탕을 둔 다양한 형태의 백신에 변이가 없는 공통된 M2 항원을 첨가함으로써 상기한 문제를 해결한 것이다. The recent announcement of the present inventors has shown that the concept of a cross-protective vaccine that solves this problem by augmenting a common antigen vaccine (M2-VLP) with existing vaccines and applicable to existing influenza vaccines that form antibodies against hemagglutinin. Based on technical papers. (Song JM et al., Vaccination inducing broad and improved cross protection against multiple subtypes of influenza A virus. Proc Natl Acad Sci U S A 2011; 108: 757-61). Therefore, in the present invention, the above-mentioned problem is solved by adding a common M2 antigen without mutation to various types of vaccines based on mutant hemagglutinin antigen.

본 발명의 보강 인플루엔자 백신은 M2-VLP 를 1 ug/ml 내지 10 ug/ml 의 농도로 포함하고, 불활성화 또는 약독화 인플루엔자 백신을 0.5 ug/ml 내지 5 ug/ml 의 농도로 포함할 수 있으나, 본 발명은 이에 제한되지는 않는다. Reinforcing influenza vaccines of the present invention may include M2-VLP at a concentration of 1 ug / ml to 10 ug / ml and inactivated or attenuated influenza vaccine at a concentration of 0.5 ug / ml to 5 ug / ml. However, the present invention is not limited thereto.

본 발명의 백신은 기술 분야에 공지되고 사용되는 방법에 따라 제형화될 수 있다. 일반적인 약제학적 투여를 위한 지침은 예를 들어, 문헌[Modem Vaccinology, Ed. Kurstak, Plenum Med. Co. 1994; Remington's Pharrmaceutical Sciences 18th Edition, Ed. Gennaro, Mack Publishing, 1990; and Modern Pharmaceutics 2nd Edition, Eds. Banker and Rhodes, Marcel Dekker, Inc. , 1990] 등에 알려져 있다.Vaccines of the invention may be formulated according to methods known and used in the art. Instructions for general pharmaceutical administration are described, for example, in Modem Vaccinology, Ed. Kurstak, Plenum Med. Co. 1994; Remington's Pharrmaceutical Sciences 18th Edition, Ed. Gennaro, Mack Publishing, 1990; and Modern Pharmaceutics 2nd Edition, Eds. Banker and Rhodes, Marcel Dekker, Inc. , 1990, and the like.

본 발명에서, M2-VLP 및 불활성화 또는 약독화된 인플루엔자 백신을 함유하는 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체와 병용하여 치료적으로 사용될 수 있다. In the present invention, a composition containing M2-VLP and inactivated or attenuated influenza vaccine can be used therapeutically in combination with a pharmaceutically acceptable carrier.

상기 담체는 활성성분의 분해를 최소화하고, 대상체에 불리한 부작용 등을 최소화하는 것으로 선택되며, 이는 당 분야에 잘 알려진 것들을 사용할 수 있으며, 본 발명의 백신 조성물은 특정 담체의 사용에 국한하지 않는다. The carrier is selected to minimize degradation of the active ingredient, to minimize adverse side effects and the like, which can be used in the art well known in the art, the vaccine composition of the present invention is not limited to the use of a specific carrier.

본 발명의 M2-VLP 및 불활성화 또는 약독화된 인플루엔자 백신을 함유하는 백신의 제형으로, 안정제 또는 완충제 혹은 면역향상제 (adjuvants)와 함께 물에서 혼합하여 용액 또는 현탁액으로 제조하고, 이를 앰플 또는 바이알의 단위 투여 양으로 제제화할 수 있다.Formulations of vaccines comprising M2-VLPs of the invention and inactivated or attenuated influenza vaccines, prepared in solution or suspension by mixing in water with stabilizers or buffers or adjuvants, which are prepared in ampoules or vials. It may be formulated in unit dosage amounts.

본 발명의 백신 조성물 내 유효성분의 양은 개체에 따라 차이가 있으며 이는 종, 나이, 체중, 일반적인 건강상태 그리고 특히 접종하는 경로에 따라 적절히 선택되나, 일반적으로 성인에게 1일 체중 1kg 당 M2-VLP 의 양 0.1-45mg 및 불활성화 또는 약독화 인플루엔자 백신 1-45mg 의 양으로 1회 내지 수회 나누어 투여할 수 있다. The amount of active ingredient in the vaccine composition of the present invention varies depending on the individual and is appropriately selected depending on the species, age, weight, general health condition, and especially the route of vaccination, but in general, the amount of M2-VLP per kg of body weight per day in adults The dose may be administered once to several times in an amount of 0.1-45 mg and inactivated or attenuated influenza vaccine 1-45 mg.

본 발명의 백신은 비경구 또는 경구로 투여할 수 있으며, 비경구 투여는 근육주사, 피하주사, 정맥주사, 미세바늘주사 및 비강스프레이 방식에 의한다. 적절한 투여경로는 당업자가 용이하게 채택할 수 있다. The vaccine of the present invention can be administered parenterally or orally, and parenteral administration is by intramuscular injection, subcutaneous injection, intravenous injection, micro needle injection and nasal spray method. Appropriate administration routes can be readily adapted by those skilled in the art.

본 발명의 백신의 적용대상이 되는 환자 또는 대상체는 동물이다. 포유동물 및 새, 특히 가금류는 백신 접종을 위해 적합한 대상이다. 바람직하게 환자는 사람이다. 환자는 본 발명의 백신의 접종에 응답하여 면역 반응을 생성시킬 수 있는 임의의 연령일수 있다. 생성된 면역 반응은 인플루엔자 바이러스의 감염에 의해 발병된 질환 및 쇠약 증상으로부터 완전히 또는 부분적으로 보호해줄 수 있다.The subject or subject to which the vaccine of the present invention is applied is an animal. Mammals and birds, especially poultry, are suitable for vaccination. Preferably the patient is a human. The patient can be of any age capable of producing an immune response in response to the vaccination of the vaccine of the present invention. The resulting immune response may completely or partially protect against diseases and debilitating symptoms caused by influenza virus infection.

투여 시점은 기술분야에 널리 공지된 인자에 의존한다. 예컨대, 초기 투여 후, 이어서 1회 이상의 부스터 용량을 투여하여 항체 역가를 유지할 수 있다. 투여 섭생의 예는 제1일 첫번째 투여후 1 또는 2개월에 2번째 투여, 이후 4, 6 또는 12개월에 3번째 투여하고, 추가의 부스터 투여는 필요에 따라 긴 투여 시점을 두고 투여될 수 있다. The time of administration depends on factors well known in the art. For example, after the initial administration, the antibody titer can be maintained by subsequent administration of one or more booster doses. An example of a dose regimen is a second dose at 1 or 2 months after the first day of the first day, a third dose at 4, 6, or 12 months after the first dose, and an additional booster dose may be administered at a longer dosage as needed .

본 발명의 신규한 보강 인플루엔자 백신은 기존의 백신에 비해 면역력이 높고 더불어 전국적 유행병과 같은 예측하지 못한 바이러스의 확산 상황에 효과적으로 대처할 수 있는 넓은 범위의 교차 방어능력을 가진다. The novel augmented influenza vaccine of the present invention has a high immunity compared to the existing vaccine and has a wide range of cross-protective ability to effectively cope with the spread of unexpected viruses such as a pandemic.

도1은 본 발명에 사용된 M2단백질의 구조를 나타낸 도로써, (1) 야생형 M2단백질의 구조, (2) 세포 표면으로 노출된 외부 M2 단백도메인(M2e) 부분이 병렬로 연결된, 막에 부착된 형태의 재조합 M2단백질의 구조, (3) 병렬로 연결되어 있는 M2e 부분이 헤마글루티닌의 HA2 도메인에 융합된 M2 단백질의 구조, (4) 병렬 연결 M2e 부분이 플라젤린 (N-terminal domain of bacterial flagellin)과 다중융합단백질 (GCN4)에 융합된 M2 단백질의 구조, (5) 면역향상제가 막에 부착될 수 있도록 재조합 단백질의 구조 (Bacterial flagellin or Granulo-macrophage colony stimulating factor)를 나타낸 도이다.
도 2는 면역향상제가 M2단백질과 동시에 발현된 바이러스 유사입자 (M2-VLP)의 모식도이다.
도 3은 야생형 M2-VLP의 전자현미경 사진이다 (크기막대= 100 nm).
도 4은 웨스턴 블롯팅(Western blot)을 통해 바이러스 및 제작된 M2-VLP 내 M2 단백질의 발현을 확인한 도이다 (화살표는 야생형 또는 재조합 융합 M2 단백질을 나타냄).
도 5는 재조합 M2-VLP 또는 수용성 M2 단백질을 숙주동물에 접종한 후 면역원성을 ELISA 법으로 검출한 도이다.
도6는 재조합 M2-VLP를 불활성화 바이러스 백신과 혼합하여 투여했을 때 M2단백질에 대한 항체 역가를 측정한 도이다.
도7은 재조합 M2-VLP를 불활성화 바이러스 백신과 혼합하여 투여했을 때 이형 인플루엔자 바이러스 감염에 대해 교차방어면역 반응을 나타낸 도이다. (이형 인플루엔자 바이러스 감염; Phil: H3N2 A/Philippines/2/82, VN04: 고병워성 조류 H5N1 A/Vietnam/04/05, Cal/09: 2009 신종인플루엔자 바이러스 A/California/04/2009).
도 8 은 M2-VLP 백신의 다른 형태의 인플루엔자 백신에 대해 M2 특이 항체 형성 효과 및 증가 효과를 나타낸 도이다. 1 is a diagram showing the structure of the M2 protein used in the present invention, (1) the structure of the wild type M2 protein, (2) the external M2 protein domain (M2e) portion exposed to the cell surface is attached to the membrane in parallel Structure of the recombinant M2 protein, (3) the structure of the M2 protein in which the M2e moieties are connected in parallel to the HA2 domain of hemagglutinin, and (4) the N-terminal domain is the parallel M2e moiety. The structure of M2 protein fused to of bacterial flagellin and multifusion protein (GCN4), and (5) the structure of recombinant protein (Bacterial flagellin or Granulo-macrophage colony stimulating factor) to allow immunostimulants to adhere to the membrane. .
2 is a schematic diagram of virus like particles (M2-VLP) in which an immunostimulant is expressed simultaneously with M2 protein.
3 is an electron micrograph of wild type M2-VLP (size bar = 100 nm).
4 is a diagram confirming the expression of the virus and M2 protein in the produced M2-VLP via Western blot (arrow indicates wild type or recombinant fusion M2 protein).
Figure 5 is a diagram detecting the immunogenicity by ELISA method after inoculating a host animal with recombinant M2-VLP or water-soluble M2 protein.
Figure 6 shows the antibody titer for M2 protein when the recombinant M2-VLP is administered in combination with the inactivated virus vaccine.
Figure 7 shows cross-protective immune response to heterologous influenza virus infection when recombinant M2-VLP is administered in combination with an inactivated virus vaccine. (Heterozygous Influenza Virus Infection; Phil: H3N2 A / Philippines / 2/82, VN04: Hepatitis Avian H5N1 A / Vietnam / 04/05, Cal / 09: 2009 Swine Flu Virus A / California / 04/2009).
Figure 8 is a diagram showing the effect of forming and increasing the M2 specific antibody for influenza vaccines of other forms of the M2-VLP vaccine.

이하, 본 발명을 실시예 및 시험예를 통하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나 이들 실시예 및 시험예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예 및 시험예에 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail through examples and test examples. However, these Examples and Test Examples are for illustrating the present invention, and the scope of the present invention is not limited to these Examples and Test Examples.

<제조예 1> 재조합 M2 단백질을 암호화하는 DNA 의 디자인 및 제작Preparation Example 1 Design and Construction of DNA Encoding Recombinant M2 Protein

야생형 M2 단백질에 추가로, 야생형 M2 단백질과 비교하여 향상된 항원성을 갖는 재조합 M2 단백질을 다음과 같이 디자인하고, 제작하였다:In addition to wild type M2 protein, recombinant M2 protein with improved antigenicity compared to wild type M2 protein was designed and constructed as follows:

(i) 동형 또는 이형의 M2 단백질의 세포외 영역이 하나 이상 결합되어 있고, 막투과 부위와 세포질 말단부위가 인플루엔자 바이러스 HA 에서 유래한 것으로 치환된 M2 단백질 (도 1-(2); 서열번호 2); (i) an M2 protein in which at least one extracellular region of isotype or heteromorphic M2 protein is joined, and the transmembrane site and cytoplasmic terminal site are substituted with those derived from influenza virus HA (Fig. 1- (2); SEQ ID NO: 2 );

(ii) 동형 또는 이형의 M2단백질의 세포외 영역 5개가 HA2 서브유닛에 결합되고 막투과 부위와 세포질 말단부위가 인플루엔자 바이러스 HA 에서 유래한 것으로 치환된 M2 단백질 (도 1-(3); 서열번호 3); (ii) an M2 protein in which five extracellular regions of homologous or heterologous M2 protein are bound to the HA2 subunit and the transmembrane site and cytoplasmic terminal sites are derived from influenza virus HA (Fig. 1- (3); SEQ ID NO: 3);

(iii) 면역향상제로서 박테리아 플라젤린의 아미노기 말단 156번째 아미노산과 카르복실기 말단 140번째 아미노산 사이에 도1-(3)의 구조가 삽입되어 있고 M2 단백질의 자연구조 형성에 도움을 주는 Leucine zipper motif (tGCN4) 가 결합되어 있는 M2 단백질 (도 1-(4); 서열번호 4); (iii) A leucine zipper motif (tGCN4) is inserted between the amino acid terminal 156 amino acid and the carboxyl terminal 140 amino acid of bacterial flagellin as an immunostimulant and helps to form the natural structure of the M2 protein. ) Is bound to the M2 protein (Fig. 1- (4); SEQ ID NO: 4);

(iv) 면역향상제로써 GM-CSF (Granulocyte macrophage colony stimulating factor) 또는 야생형 박테리아 플라젤린을 M2 단백질 없이 인플루엔자 바이러스 HA 유래 막투과 부위와 세포질 말단부위에 결합된 단백질 (도 1-(5); 서열번호 5).(iv) a protein in which GM-CSF (Granulocyte macrophage colony stimulating factor) or wild-type bacterial flagellin is bound to the influenza virus HA-derived transmembrane site and cytoplasmic end region as an immunostimulant (Fig. 1- (5); SEQ ID NO: 5) ).

야생형 M2 단백질 및 상기 디자인된 재조합 M2 단백질을 암호화하는 각각의 유전자를 다음과 같이 제작하였다.Each gene encoding the wild type M2 protein and the recombinant M2 protein designed above was constructed as follows.

야생형 M2 단백질 (서열번호 1) 및 상기 재조합 융합 M2 단백질 (서열번호 2 내지 5)의 전장 서열을 암호화하는 DNA 를 먼저 아미노산 서열에 따라서 곤충세포 혹은 동물세포에서 최적발현을 위해 코돈-최적화 DNA 서열을 작성하였다. 코돈-최적화 과정에서 정해진 재조합 융합 M2 단백질의 전장 서열 DNA는 DNA 합성전문회사인 “GeneScript” (http://www.genscript.com/)에서 주문하여 제조하였다. 재조합 융합 M2 단백질의 전장 서열을 운반하는 플라스미드의 제조를 위해서, 재조합 배큘로바이러스 셔틀 백터 플라즈미드 (pFastBac vector plasmid, Invitrogen, Carlsbad, CA) 에 클론하였다. 상기 (i) 내지 (iii)의 재조합 M2 구조의 구축물은 제한효소 BamHI(NEB, Ipswich, MA) 과 HindIII(NEB, Ipswich, MA) 서열에 클로닝 될 수 있도록 이들 제한효소가 인식할 수 있는 DNA 서열을 포함하였다. 반면 (iv)의 변형된 플라젤린의 구축물은 제한효소 SalII(NEB, Ipswich, MA)과 HindIII(NEB, Ipswich, MA) 서열에 클로닝 될 수 있도록 이들 제한효소가 인식할 수 있는 DNA 서열을 포함하였다. 재조합 배큘로바이러스 유전체 (recombinant Bacmid baculovirus) DNA 를 얻기 위해 박테리아에 (DH10Bac competent cells, rAcNPV, Invitrogen, Carlsbad, CA) 주입해 스크리닝 하였다. 스크리닝은 제한효소 인식 패턴 (pattern) 과 DNA 염기서열 결정으로 수행하였다. 자세한 제조 방법은 논문 [Song JM, et al., Influenza virus-like particles containing M2 induce broadly cross protective immunity. PLoS One 6: e14538, (2011)] 및 [Kang SM, et al.,Induction of long-term protective immune responses by influenza H5N1 virus-like particles. PLoS ONE 4: e4667, (2009)]를 참조할 수 있다.DNA encoding the full-length sequence of the wild-type M2 protein (SEQ ID NO: 1) and the recombinant fusion M2 protein (SEQ ID NOs: 2 to 5) is first subjected to a codon-optimized DNA sequence for optimal expression in insect or animal cells according to the amino acid sequence. Created. The full-length sequence DNA of the recombinant fusion M2 protein determined during codon-optimization was prepared by ordering from DNA synthesis company “GeneScript” (http://www.genscript.com/). For the preparation of plasmids carrying the full length sequence of the recombinant fusion M2 protein, the recombinant baculovirus shuttle vector plasmid (pFastBac vector plasmid, Invitrogen, Carlsbad, Calif.) Was cloned. The constructs of the recombinant M2 structures of (i) to (iii) can be cloned into restriction enzymes BamHI (NEB, Ipswich, MA) and HindIII (NEB, Ipswich, MA) sequences so that these restriction enzymes can recognize DNA sequences. It included. In contrast, the constructs of the modified flagellin of (iv) contained DNA sequences that could be recognized by these restriction enzymes so that they could be cloned into the restriction enzymes SalII (NEB, Ipswich, MA) and HindIII (NEB, Ipswich, MA). . Bacteria (DH10Bac competent cells, rAcNPV, Invitrogen, Carlsbad, Calif.) Were screened by injection into bacteria to obtain recombinant baculovirus genome DNA. Screening was performed with restriction enzyme recognition patterns and DNA sequencing. Detailed preparation methods are described in Song JM, et al., Influenza virus-like particles containing M2 induce broadly cross protective immunity. PLoS One 6: e14538, (2011)] and Kang SM, et al., Induction of long-term protective immune responses by influenza H5N1 virus-like particles. PLoS ONE 4: e4667, (2009).

[실시예][Example]

<실시예 1> 야생형 M2-VLP 제조 및 분리Example 1 Preparation and Isolation of Wild-type M2-VLP

재조합 M2-VLP를 참조문헌 (Kang SM, et al. (2009) PLoS ONE 4:e4667; Song JM, et al. (2010) Virology 405:165-175)에 기술한 바와 같은 방법으로 제작하였으며 다음과 같이 설명할 수 있다.Recombinant M2-VLP was constructed by the method as described in Kang SM, et al. (2009) PLoS ONE 4: e4667; Song JM, et al. (2010) Virology 405: 165-175. This can be explained together.

상기 제조예 1에서 제작한 서열번호 1의 야생형 M2 단백질을 발현하는 유전자를 배큘로바이러스 셔틀 벡터 플라즈미드 (pFastBac vector plasmid, Invitrogen, Carlsbad, CA) 에 클로닝하였다. 재조합 배큘로바이러스 유전체 (recombinant Bacmid baculovirus) DNA를 얻기 위해 박테리아(DH10Bac competent cells, rAcNPV, Invitrogen, Carlsbad, CA)에 도입하고 스크리닝하였다. 이렇게 해서 얻어진 재조합 배큘로바이러스 유전체를 곤충세포 (SF9 insect cells; CRL-1711; American Type Culture Collection)에 3 MOI(multiplicity of infection)의 농도로 형질감염하였다. 27℃ 배양기에서 48시간 진탕배양하였다. M2 단백질을 발현하는 재조합 배큘로바이러스를 다시 곤충세포에 감염시켰다. 배양배지를 수거하여 저속 원심분리하였다(4℃, 2000xg 에서 30분간). 침강된 세포는 제거하고 M2-VLP를 포함하는 배양 상층액을 QuixStand hollow fiber (GE Healthcare, Piscataway, NJ)를 사용하여 전체 부피를 1/5~1/10으로 농축하였다. 농축된 배양액으로부터 VLP를 분리하기 위해 수크로스 구배 초원심분리(Beckman ultracentrifuge, USA)를 수행하였다. 이를 위해 20-60% (wt/wt) 수크로스 상에 층을 형성시킨 다음 4℃, 28000 x g 에서 1시간동안 원심분리시킨다. 원심분리 후 20/60% 층에 형성된 VLP포함층을 수집하여 PBS 로 투석하고 (Slide-A-Lyzer Dialysis Cassettes 10K MWCO, Pierce, 4℃, 24시간), M2 단백질 VLP 함유농도를 측정하고, 냉장 또는 냉동 보관하였다.The gene expressing the wild type M2 protein of SEQ ID NO: 1 prepared in Preparation Example 1 was cloned into a baculovirus shuttle vector plasmid (pFastBac vector plasmid, Invitrogen, Carlsbad, CA). In order to obtain recombinant Bacmid baculovirus DNA, bacteria were introduced and screened (DH10Bac competent cells, rAcNPV, Invitrogen, Carlsbad, Calif.). The recombinant baculovirus genome thus obtained was transfected into insect cells (SF9 insect cells; CRL-1711; American Type Culture Collection) at a concentration of 3 multiplicity of infection (MOI). Shake culture was performed for 48 hours in a 27 ℃ incubator. Recombinant baculovirus expressing M2 protein was again infected with insect cells. The culture medium was harvested and centrifuged at low speed (30 min at 4 ° C., 2000 × g). The precipitated cells were removed and the culture supernatant containing M2-VLP was concentrated to 1 / 5-1 / 10 using QuixStand hollow fiber (GE Healthcare, Piscataway, NJ). A sucrose ultracentrifuge (Beckman ultracentrifuge, USA) was performed to separate the VLPs from the concentrated culture. To this end, a layer is formed on 20-60% (wt / wt) sucrose and then centrifuged at 4 ° C., 28000 × g for 1 hour. After centrifugation, the VLP-containing layer formed on the 20/60% layer was collected and dialyzed with PBS (Slide-A-Lyzer Dialysis Cassettes 10K MWCO, Pierce, 4 ° C, 24 hours), and the concentration of M2 protein VLP was measured and refrigerated. Or frozen.

<실시예 2> 재조합 M2-VLP 제조 및 분리Example 2 Preparation and Separation of Recombinant M2-VLP

야생형 M2 단백질을 발현하는 유전자 대신 상기 제조예 1에서 제작한 (i) 내지 (iv)의 재조합 M2단백질을 발현하는 유전자를 이용한 것을 제외하고, 실시예 1과 같은 방법으로 재조합 M2-VLP 를 제작하였다. A recombinant M2-VLP was prepared in the same manner as in Example 1, except that the gene expressing the recombinant M2 protein of (i) to (iv) prepared in Preparation Example 1 was used instead of the gene expressing the wild type M2 protein. .

[실험예][Experimental Example]

<실험예 1> M2-VLP의 전자현미경 확인Experimental Example 1 Electron Microscope Confirmation of M2-VLP

분리, 정제한 M2-VLP를 일정량 채취하여 (0.1mg/ml, 10ul) 1% PTA (Phosphotungustic acid, Sigma, USA), pH 6.5 를 처리하여 네거티브 염색한 다음 전자현미경으로 관찰하였다 (도 3). 네거티브 염색된 인플루엔자 M2-VLP의 전자현미경 사진을 도3 에 나타내었다 (size bar=100nm).Separated and purified M2-VLP was collected in a certain amount (0.1mg / ml, 10ul) 1% PTA (Phosphotungustic acid, Sigma, USA), treated with pH 6.5 and negatively stained and observed with an electron microscope (Fig. 3). Electron micrographs of negatively stained influenza M2-VLP are shown in FIG. 3 (size bar = 100 nm).

<실험예 2> 야생형 M2-VLP 및 재조합 M2-VLP의 발현효율 평가 Experimental Example 2 Evaluation of Expression Efficiency of Wild-type M2-VLP and Recombinant M2-VLP

야생형 M2-VLP (1ug) 및 다양한 재조합 M2-VLP (각 1ug)을 이용하여 이들의 발현을 웨스턴 블롯팅을 통해 확인하였다. 대조군으로 바이러스 M2 단백질을 측정하였다. 그 결과를 도 4에 나타내었다.Wild type M2-VLP (1ug) and various recombinant M2-VLPs (1ug each) were used to confirm their expression via Western blotting. The viral M2 protein was measured as a control. The results are shown in FIG.

구체적으로, 도4의 1번, 2번 레인은 바이러스 5ug, 1ug을 시료로 하여 M2 단백질을 검출한 그림이며 도4의 3번, 4번, 5번, 6번, 7번은 각각의 야생형 (wt) 또는 재조합 M2-VLP 1ug을 시료로 하여 M2 단백질을 검출한 그림이다. 도4의 8번, 9번은 동형 또는 이형의 M2단백질의 세포외 영역 5개가 플라젤린 단백질과 결합되어 있고 막투과 부위와 세포질 말단부위가 vpu 또는 인플루엔자 바이러스 HA 에서 유래한 것으로 치환된 재조합 M2-VLP 1ug을 시료로 하여 M2 단백질을 검출한 그림이다. 도4에서 확인되는 바와 같이, M2-VLP(3번 레인)에서 검출되는 M2 단백질의 양이 바이러스 (1, 2번 레인)에서 검출되는 M2 단백질의 양에 비해 더 많은 것으로 나타났다. 특히 M2 단백질의 세포외 영역을 하나 또는 그 이상 가진 재조합M2-VLP (레인4)의 경우 M2 함량이 10 배 이상 증가함을 확인할 수 있었다. 이는 변형된 M2-VLP 백신이 M2에 대한 항체형성을 향상시킬 수 있음을 의미한다. Specifically, lanes 1 and 2 of FIG. 4 are M2 protein detected using 5ug and 1ug of viruses as samples, and 3, 4, 5, 6, and 7 of FIG. 4 are wild type (wt Or M2 protein detected using recombinant M2-VLP 1ug as a sample. Nos. 8 and 9 of FIG. 4 are recombinant M2-VLPs in which 5 extracellular regions of homo or hetero M2 protein are associated with flagellin protein, and transmembrane sites and cytoplasmic terminals are derived from vpu or influenza virus HA. The figure shows the detection of M2 protein using 1ug as a sample. As shown in FIG. 4, the amount of M2 protein detected in M2-VLP (lane 3) was higher than the amount of M2 protein detected in virus (lanes 1 and 2). In particular, in the case of recombinant M2-VLP (lane 4) having one or more extracellular regions of M2 protein, it was confirmed that the M2 content increased more than 10 times. This means that modified M2-VLP vaccines can enhance antibody formation against M2.

또한, 병렬로 연결되어 있는 M2e 부분이 HA 단백질의 막투과부위와 세포질 꼬리(HA TM)에 결합된 M2 단백질인 경우 (5번, 7번 레인), 야생형 M2-VLP (3번 레인: wT M2-VLP) 보다 20 내지 30 배 이상 증가함을 보였다. 따라서 기존 인플루엔자 백신의 공통항원 첨가물로서 효과적인 M2-VLP 백신으로 사용된다. 또한 M2e 부분이 헤마글루티닌의 HA2 도메인에 융합된 M2 단백질인 경우도 (5번 레인) 바이러스 유사입자 (VLP) 에 비하여 효과적으로 발현되고 있음을 알 수 있다. M2단백질의 면역학적 항원 특성을 높이기 위한 방안으로 박테리아 플라젤린 면역향상 단백질에 융합된 M2 구조도 바이러스 유사입자 (VLP) 에 발현 잘 되었음이 확인되었다 (8번, 9번 레인).In addition, when the M2e moieties connected in parallel are M2 proteins bound to the transmembrane region of the HA protein and the cytoplasmic tail (HA TM) (lanes 5 and 7), wild-type M2-VLP (lane 3: wT M2 -VLP) 20 to 30 times more than. Therefore, it is used as an effective M2-VLP vaccine as a common antigen additive of the existing influenza vaccine. In addition, it can be seen that the M2e moiety is an M2 protein fused to the HA2 domain of hemagglutinin (lane 5), which is more effectively expressed compared to the virus like particle (VLP). In order to enhance the immunological antigenic properties of the M2 protein, it was confirmed that the M2 structure fused to the bacterial flagellin immunostimulating protein was well expressed on the virus like particle (VLP) (lanes 8 and 9).

<실험예3> 재조합 M2-VLP 및 박테리아 플라젤린의 면역증강 효과 확인Experimental Example 3 Confirmation of Immunostimulating Effect of Recombinant M2-VLP and Bacterial Flagellin

재조합 M2 단백질(4xM2e) 또는 플라젤린 단백질(4M2etFliC)을 실험동물에 접종함으로써 면역원성을 확인하고자 하였다. 재조합 M2 단백질 (4xM2e)과 플라젤린 수용성 단백질(4M2etFliC)은 대장균에서 발현 정제하였다. 또한 재조합 M2VLP(4xM2e_tFliC VLP) 및 플라젤린 VLP(tFliC VLP)는 배큘로바이러스 발현시스템을 이용하여 곤충세포에서 실시예 1의 방법으로 발현 및 정제하였다.Immunogenicity was determined by inoculating recombinant M2 protein (4xM2e) or flagellin protein (4M2etFliC) into experimental animals. Recombinant M2 protein (4xM2e) and flagellin soluble protein (4M2etFliC) were expressed and purified in E. coli. In addition, recombinant M2VLP (4xM2e_tFliC VLP) and flagellin VLP (tFliC VLP) was expressed and purified in insect cells by the method of Example 1 using a baculovirus expression system.

6-8주령 암컷 마우스 (BALB/C, Harlan company, USA)를 사용하였으며 항원으로 2종의 재조합 M2 수용성 단백질 (4xM2e, 4xM2etFliC), 재조합 M2-VLP (4xM2e-tFliC VLP) 그리고 M2수용성 단백질과 플라젤린을 혼합한 조성물 (4M2e+tFliC VLP)을 각각 10ug씩 근육주사(IM), 미세바늘주사(MN) 및 비강(IN) 경로로 4주 간격으로 총 3회를 접종하였다. 마지막 접종 후 4주가 지난 뒤 시료용 혈액을 채취하고 ELISA 법을 통해 혈액내 존재하는 M2 단백질에 대한 항체 역가를 검사하였다. 그 결과를 도 5에 나타내었다. 6-8 week old female mice (BALB / C, Harlan company, USA) were used and two recombinant M2 soluble proteins (4xM2e, 4xM2etFliC), recombinant M2-VLP (4xM2e-tFliC VLP), and M2 soluble protein and plastic were used as antigens. A total of 10 μg each of the mixed composition (4M2e + tFliC VLP) was inoculated three times at four week intervals in the intramuscular (IM), microneedle (MN) and nasal (IN) routes. Four weeks after the last inoculation, blood samples were taken and tested for antibody titers against M2 protein present in the blood by ELISA. The results are shown in Fig.

도 5에서 확인되는 바와 같이 M2 단백질 특이적인 항체가 형성되는 것을 확인하였다. 또한 M2가 플라젤린에 융합되거나 플라젤린 VLP를 면역향상제로 사용했을 경우 M2에 대한 면역반응이 증가함을 관찰하였다.As confirmed in FIG. 5, it was confirmed that M2 protein-specific antibodies were formed. It was also observed that when M2 is fused to flagellin or when flagellin VLP is used as an immunostimulant, the immune response to M2 increases.

본 실험을 통해, 재조합 M2-VLP를 유효성분으로 하는 조성물을 마우스에 투여할 경우 M2 단백질 특이적인 항체가 형성되고 있음이 확인되었다. 또한 플라젤린 단백질은 면역향상물질로서 M2 에 대한 면역력이 증가함을 확인되었다.Through this experiment, it was confirmed that when a composition containing recombinant M2-VLP as an active ingredient is administered to mice, M2 protein specific antibodies are formed. Flagellin protein was also confirmed to increase immunity to M2 as an immunostimulant.

<실험예4> 재조합 M2-VLP백신 함유 보강 백신의 M2 항체 생성효과 확인Experimental Example 4 Confirmation of M2 Antibody Production Effect of Recombinant M2-VLP Vaccine-Containing Enhanced Vaccine

실시예 1에서 제조한 재조합 M2-VLP 를 불활성화시킨 인플루엔자 A 바이러스백신과 혼합하여 제조한 독감바이러스 백신 조성물의 면역원성 및 방어능력을 확인하고자 하였다. 본 실험에 사용된 독감바이러스 (A/PR8바이러스) 백신은 포르말린을 사용하여 불활성화된 인플루엔자 바이러스 백신을 실험실에서 제조하였다. 구체적으로, 인플루엔자 A/PR/8/34 (H1N1) 바이러스를 유정란에 10 HAU (hemaggulutination units)을 접종한 후 37℃ 배양기에서 3일간 배양하였다. 유정란의 요막액을 채취하여 저속원심분리(1000 x g, 30 분) 하고. 상층액을 QuixStand hollow fiber (GE Healthcare, Piscataway, NJ)를 사용하여 전체 부피를 1/5~1/10으로 농축하였다. 농축된 배양액으로부터 바이러스를 분리하기 위해 수크로스 구배 초원심분리를 수행하였다. 이를 위해 20-60% (wt/wt) 수크로스 상에 층을 형성시킨 다음 4℃, 28000 x g 에서 1시간동안 원심분리하였다. 원심분리 후 20/60% 층에 형성된 바이러스 포함층을 수집하여 PBS 로 투석하고 (Slide-A-Lyzer Dialysis Cassettes 10K MWCO, Pierce, 4℃, 24시간), 바이러스 불활성화를 위해 포르말린 (0.01% formalin, Sigma, USA)을 혼합한 후 12시간 동안 교반하였다. 포르말린을 제거하기 위해PBS 로 투석하고 (Slide-A-Lyzer Dialysis Cassettes 10K MWCO, Pierce, 4℃, 24시간) 단백질 정량하여 최종 불활성화 백신을 완성하였다.The immunogenicity and protective ability of the influenza A virus vaccine prepared by mixing the recombinant M2-VLP prepared in Example 1 with the inactivated influenza A virus vaccine was determined. The flu virus (A / PR8 virus) vaccine used in this experiment was prepared in the influenza virus vaccine inactivated using formalin in the laboratory. Specifically, influenza A / PR / 8/34 (H1N1) virus was inoculated with 10 HAU (hemaggulutination units) in the fertilized egg and incubated in a 37 ° C. incubator for 3 days. Collect the fertilized egg from the fertilized egg and slow centrifugation (1000 x g, 30 minutes). The supernatant was concentrated to 1 / 5-1 / 10 using QuixStand hollow fiber (GE Healthcare, Piscataway, NJ). Sucrose gradient ultracentrifugation was performed to separate the virus from the concentrated culture. To this end a layer was formed on 20-60% (wt / wt) sucrose and then centrifuged at 4 ° C., 28000 × g for 1 hour. After centrifugation, the virus-containing layer formed in the 20/60% layer was collected and dialyzed with PBS (Slide-A-Lyzer Dialysis Cassettes 10K MWCO, Pierce, 4 ° C, 24 hours), and formalin (0.01% formalin) for virus inactivation. , Sigma, USA) were mixed and stirred for 12 hours. The final inactivation vaccine was completed by dialysis with PBS (Slide-A-Lyzer Dialysis Cassettes 10K MWCO, Pierce, 4 ° C., 24 hours) to remove formalin and protein quantification.

동물실험을 위해 6-8주령 암컷 마우스 (BALB/C)를 사용하였으며 2ug의 불활성화 인플루엔자 바이러스 백신(PR8i) 과 10ug의 재조합 M2-VLP를 혼합한 백신을 비강경로로 4주 간격, 2회 투여 하였다. 대조군으로는 백신이 없는 용액(PBS) 또는 M2 단백질 대신 M2와 상동성이 없는 곤충세포 발현HIV 유래 VLP를 동량 혼합하여 사용하였다. 6-8 week old female mice (BALB / C) were used for animal experiments, and 2 ug inactivated influenza virus vaccine (PR8i) and 10 ug of recombinant M2-VLP were administered twice a week by nasal route. It was. As a control, the same amount of VLP-derived insect cell expression HIV-derived VLPs having no homology with M2 was used instead of vaccine-free solution (PBS) or M2 protein.

최종 백신 접종 후 4주가 지난 뒤 시료용 혈액을 채취하고 ELISA 법을 통해 혈액내 존재하는 M2 단백질에 대한 항체 역가를 검사하였다. 그 결과를 도 6에 나타내었다. 그 결과, 도6 에서 보는 바와 같이 재조합 M2-VLP가 포함된 백신 조성물에서는 M2단백질 특이적인 항체가 검출되었으나 M2-VLP가 포함되지 않은 대조군(PBS, HIVVLP)에서는 검출되지 않았다. 즉, M2-VLP 백신의 보강은 불활성화된 인플루엔자 바이러스백신의 M2 항체 생성을 증가시키는 효과를 나타냄을 확인하였다. Four weeks after the last vaccination, blood samples were taken and tested for antibody titers against M2 protein present in the blood by ELISA. The results are shown in Fig. As a result, as shown in FIG. 6, M2 protein-specific antibody was detected in the vaccine composition containing recombinant M2-VLP, but not in the control group (PBS, HIVVLP) without M2-VLP. That is, it was confirmed that the reinforcement of the M2-VLP vaccine showed an effect of increasing the M2 antibody production of the inactivated influenza virus vaccine.

<실험예 5> 재조합 M2-VLP 보강 백신의 다양한 아형의 인플루엔자에 대한 교차보호능력 증가효과Experimental Example 5 Increasing Cross-Protection Capacity of Influenza of Various Subtypes of Recombinant M2-VLP Enriched Vaccine

재조합 M2-VLP 보강 백신의 교차보호기능의 범위를 다양한 아형의 인플루엔자에 대해 공격 접종방법으로 생쥐 실험에서 확인하였다. 6-8주령 암컷 마우스 (BALB/C)를 사용하였으며 2ug의 불활성화시킨 인플루엔자 바이러스 백신(PR8i)과 10ug의 재조합 M2-VLP를 혼합한 백신 조성물을 비강경로로 4주간격, 2회 투여 하였다. 대조군으로 M2-VLP를 혼합하지 않고 불활성화 시킨 인플루엔자 바이러스 백신만 접종한 그룹(PR8i)과 백신을 전혀 혼합되지 않은 PBS만 접종한 그룹(PBS)을 추가하였다. 백신 8 주 후, 접종한 백신과 서로 다른 아형의 인플루엔자 바이러스 H3N2 형 A/Philippines/82 (Phili), H5N1 고병원성 조류인플루엔자 바이러스 (A/Vietnam/1203/04: VN/04) 및 2009 신종인플루엔자 바이러스 (Val/09) 를 각각 치사량의 6배에 해당하는 양으로 공격접종 하였다. The extent of cross-protective function of recombinant M2-VLP enriched vaccines was confirmed in mouse experiments with challenge inoculation against various subtypes of influenza. Six to eight week old female mice (BALB / C) were used, and a vaccine composition containing 2 ug of inactivated influenza virus vaccine (PR8i) and 10 ug of recombinant M2-VLP was administered twice a week by nasal route. As a control group, the group inoculated with only influenza virus vaccine inactivated without mixing with M2-VLP (PR8i) and the group inoculated with only PBS with no vaccine at all (PBS) were added. After 8 weeks of vaccination, influenza virus H3N2 type A / Philippines / 82 (Phili), H5N1 highly pathogenic avian influenza virus (A / Vietnam / 1203/04: VN / 04) and 2009 swine flu virus Val / 09) were challenged with 6 times the lethal dose, respectively.

도 7에서 보는 바와 같이, M2-VLP 없이 기존의 불활성화 백신만을 접종한 마우스에서는 Philippines 바이러스의 감염으로 심각한 체중감소가 관찰된 반면(PR8i), M2-VLP가 첨가된 보강 백신을 투여한 그룹(PR8i+M2VLP)에서는 몸무게 감소 없이 효과적인 100% 교차 보호기능을 보였다. 이러한 교차보호 기능은 고병원성 조류인플루엔자 바이러스 (VN/04) 및2009 신종인플루엔자 바이러스 (Val/09)의 공격접종에 대해서도 동일하게 관찰되었다 (도7).As shown in FIG. 7, the mice inoculated with the existing inactivated vaccine only without M2-VLP showed severe weight loss due to infection with the Philippines virus (PR8i), whereas the group receiving the adjuvant vaccine with M2-VLP added ( PR8i + M2VLP) showed effective 100% cross protection without weight loss. This cross-protective function was also observed for the challenge of high pathogenic avian influenza virus (VN / 04) and 2009 swine flu virus (Val / 09) (FIG. 7).

<실험예 6> 다른 형태의 인플루엔자에 대한 M2 특이 항체 형성유도 및 증가효과 확인Experimental Example 6 M2 Specific Antibody Formation Induction and Increasing Effect on Influenza

생쥐 (BALB/c mice, Halan company, 18 mice per group)에 근육 주사를 통해 백신을 1차 투여하였다. 투여된 백신의 양은 다음과 같았다: 불활성화된 인플루엔자 전체 바이러스 백신 (Whole, 1 ug, 상기 PR8 불활성화 백신과 동일), 2009 신종 인플루엔자 스플릿 백신(Split, 1ug, Sanofi- Aventis, USA), WT M2-VLP (10 ug), 5XM2eVLP 백신 (10 ug, 도1-(4) (서열번호 5) Chimeric adjuvant fusion 5x M2e-TM.C 재조합 M2 단백질 VLP백신). 백신 투여 3주 후 마우스 혈액을 채취한 후 혈청을 분리하여 20배 희석한 후 존재하는 M2 특이 항체를 측정하였다.Vaccine was first administered to mice (BALB / c mice, Halan company, 18 mice per group) via intramuscular injection. The amount of vaccine administered was as follows: inactivated influenza whole virus vaccine (Whole, 1 ug, same as the PR8 inactivated vaccine), 2009 swine flu split vaccine (Split, 1ug, Sanofi-Aventis, USA), WT M2 -VLP (10 ug), 5XM2eVLP vaccine (10 ug, Figure 1- (4) (SEQ ID NO: 5) Chimeric adjuvant fusion 5x M2e-TM.C recombinant M2 protein VLP vaccine). Three weeks after the vaccine administration, mouse blood was collected, serum was isolated, diluted 20-fold, and the M2 specific antibody present was measured.

도 8에서 확인되는 바와 같이, 변형된 재조합 M2-VLP 백신(10 ug, 도1-(4) Chimeric adjuvant fusion 5x M2e-TM.C 재조합 M2 단백질 VLP백신)은 M2 특이 항체 유도에 있어서 야생형 M2-VLP 와 비교하여 탁월한 능력을 나타냈다. 실험예 2의 발현실험에서 VLP 바이러스 유사입자 형태로 잘 발현이 될 경우 M2 특이적 항체 유도에도 상응하는 효과가 있음을 뒷받침하는 결과이다. As shown in FIG. 8, the modified recombinant M2-VLP vaccine (10 ug, FIG. 1- (4) Chimeric adjuvant fusion 5x M2e-TM.C recombinant M2 protein VLP vaccine) is a wild type M2- induction of M2-specific antibodies. Excellent performance compared to VLP. In the expression experiment of Experimental Example 2, when well-expressed in the form of VLP virus analog particles, it is a result supporting that there is a corresponding effect on M2 specific antibody induction.

또한, 본 실험예에서는 사람에 사용되는 Sanofi 회사의 2009 신종 인플루엔자 스플릿 백신 (detergent split A/California/2009 vaccine used for human, Sanofi vaccine company)을 가장 보편적으로 이용하는 근육 주사 방법을 적용하였다 (도 8). In addition, in the present experimental example, the most commonly used intramuscular injection method was applied to Sanofi's 2009 new influenza split vaccine (detergent split A / California / 2009 vaccine used for human, Sanofi vaccine company) (FIG. 8). .

M2 VLP 보강백신을 첨가하지 않은 불활성화된 인플루엔자 전체 바이러스 백신 혹은 2009 신종 인플루엔자 스플릿 (Split) 백신 대조 그룹에 있어서 M2 특이적 항체는 유도되지 않았다. 다양한 아형의 M2 를 병렬로 연결되고, 막에 부착된 형태의 재조합 M2-VLP (fusion 5xM2e(PR8 TM) VLPs)를 보강 백신으로 사용했을 경우 M2 특이 항체가 현저하게 증가하였다(도 8).No M2 specific antibodies were induced in the inactivated influenza whole virus vaccine or 2009 new influenza split vaccine control group without the addition of the M2 VLP enrichment vaccine. When M2 of various subtypes were connected in parallel and recombinant M2-VLPs (fusion 5xM2e (PR8 ™) VLPs) in the form of membranes were used as adjuvant vaccines, M2-specific antibodies increased significantly (FIG. 8).

서열목록 전자파일 첨부Attach an electronic file to a sequence list

Claims (9)

보강백신(supplement vaccine)으로써 서열번호 1의 야생형 M2 단백질, 서열번호 7의 인간 M2 단백질의 세포밖 도메인 또는 서열번호 7 내지 10의 M2 단백질의 세포밖 도메인(M2 extracellular domain, M2e)의 둘 이상이 병렬적으로 연결된 융합 인플루엔자 M2 단백질이 막에 부착되어 있는 형태의 바이러스 유사입자(VLP); 및
불활성화 바이러스백신, 약독화 인플루엔자 백신, 서브유닛 백신 또는 이들의 혼합물을 포함하는 교차방어 능력이 향상된 인플루엔자 바이러스 백신.As a supplement vaccine two or more of the extracellular domain of the wild type M2 protein of SEQ ID NO: 1, the human M2 protein of SEQ ID NO: 7, or the M2 extracellular domain (M2e) of the M2 proteins of SEQ ID NOs: 7-10 Viral analogs (VLPs) in the form of fused influenza M2 proteins linked in parallel to the membrane; And
Influenza virus vaccines having improved cross-protective ability, including inactivated virus vaccines, attenuated influenza vaccines, subunit vaccines or mixtures thereof. 제1항에 있어서, 융합 인플루엔자 M2 단백질은 서열번호 6의 아미노산 서열을 가지는 인플루엔자 바이러스 백신.The influenza virus vaccine of claim 1, wherein the fusion influenza M2 protein has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6. 6. 제1항에 있어서, 상기 융합 인플루엔자 M2단백질은 M2 단백질 세포밖 도메인(M2e)과 면역향상 보조제 (molecular adjuvant)가 융합된 인플루엔자 바이러스 백신.The influenza virus vaccine of claim 1, wherein the fusion influenza M2 protein is a fusion of an M2 protein extracellular domain (M2e) and an immunoadjuvant (molecular adjuvant). 제3항에 있어서, 상기 면역향상 보조제는 플라젤린, TLR 작동제 (Toll-like receptor ligands), 사이토카인, 알럼 (Alum adjuvant) 또는 이들의 조합으로부터 선택되는 인플루엔자 바이러스 백신.The influenza virus vaccine of claim 3, wherein the immunostimulatory adjuvant is selected from flagellin, TLR-like receptor ligands, cytokines, Alum adjuvant, or a combination thereof. 삭제delete 제4항에 있어서, 상기 융합 인플루엔자 M2 단백질이 서열번호 4에 기재된 아미노산 서열로 이루어진 인플루엔자 바이러스 백신.The influenza virus vaccine according to claim 4, wherein the fusion influenza M2 protein consists of the amino acid sequence of SEQ ID NO. 제1항에 있어서, 상기 융합 인플루엔자 M2 단백질이 서열번호 2 또는 3에 기재된 아미노산 서열로 이루어진 인플루엔자 바이러스 백신.The influenza virus vaccine according to claim 1, wherein the fusion influenza M2 protein consists of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or 3. 서열번호 1의 야생형 M2 단백질, 서열번호 7의 인간 M2 단백질의 세포 밖 도메인, 또는 서열번호 7 내지 10의 M2 단백질의 세포밖 도메인(M2 extracellular domain, M2e)의 둘 이상이 병렬적으로 연결된 융합 인플루엔자 M2 단백질이 막에 부착되어 있는 형태의 바이러스 유사입자와 불활성화, 약독화 인플루엔자 백신 또는 서브유닛 백신을 혼합하는 것을 포함하는, 제1항 내지 4항, 제6항, 또는 제7항 중 어느 한 항의 인플루엔자 바이러스 백신의 제조방법.Fusion influenza in which two or more of the wild type M2 protein of SEQ ID NO: 1, the extracellular domain of the human M2 protein of SEQ ID NO: 7, or the M2 extracellular domain (M2e) of M2 proteins of SEQ ID NOs: 7-10 are connected in parallel The method according to any one of claims 1 to 4, 6 or 7, comprising mixing a virus like particle in a form in which the M2 protein is attached to the membrane and an inactivated, attenuated influenza vaccine or a subunit vaccine. Method for producing an influenza virus vaccine of the claim. 제1항 내지 제4항, 제6항, 또는 제7항 중 어느 한 항의 인플루엔자 바이러스 백신을 함유하는, 교차 보호기능을 갖는 백신 조성물.
A vaccine composition having a cross-protective function, comprising the influenza virus vaccine of any one of claims 1 to 4, 6 or 7.

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