RU2328526C1 - Способ выявления микобактерий туберкулеза крупного рогатого скота - Google Patents
Способ выявления микобактерий туберкулеза крупного рогатого скота Download PDFInfo
- Publication number
- RU2328526C1 RU2328526C1 RU2006139239/13A RU2006139239A RU2328526C1 RU 2328526 C1 RU2328526 C1 RU 2328526C1 RU 2006139239/13 A RU2006139239/13 A RU 2006139239/13A RU 2006139239 A RU2006139239 A RU 2006139239A RU 2328526 C1 RU2328526 C1 RU 2328526C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- mycobacteria
- revealing
- growth
- tuberculosis
- agar
- Prior art date
Links
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в ветеринарной и медицинской микробиологии. Способ выявления микобактерий предусматривает подготовку диагностического материала. Подготовленный диагностический материал засевают на плотную питательную среду, представляющую собой смесь стандартного мясопептонного агара и вазелинового масла. Инкубируют микобактерий в термостате. После инкубации осуществляют регистрацию результатов через 24-48-72-96 часов. Изобретение позволяет сократить сроки выявления микобактерий. 1 табл.
Description
Изобретение относится к ветеринарной и медицинской микробиологии, а именно к культуральным методам выявления микобактерий комплекса M.tuberculosis, и может быть использовано при проведении противотуберкулезных мероприятий, в научно-исследовательских и производственных лабораториях медицинского и ветеринарного профиля.
Традиционно культуральные исследования диагностического материала осуществляют на плотных яичных и полусинтетических жидких средах, поскольку микобактерии туберкулеза требовательны к составу питательных сред и растут только на специальных, содержащих необходимый набор солей и аминокислот. Это отличает их от ряда других микобактерий, менее требовательных к питательным средам и растущих на стандартном мясопептонном агаре.
Известен культуральный способ выявления микобактерий методом прямого посева, при котором для получения чистых культур микобактерий контаминированный или биоматериал каждой исследуемой пробы после предварительной обработки высевают в 10 пробирок с селективной плотной яичной средой Левенштейна-Йенсена и одновременно по 10 пробирок еще не менее как на две из следующих селективных сред: Гельберга, Петраньяни, Финн-2, Мордовского, Новую, Фаст-3. В процессе инкубации еженедельно регистрируют результаты роста микобактерий (Наставление по диагностике туберкулеза. Утверждено Департаментом ветеринарии, 18 ноября 2002 г., п.6, стр.26-29).
Известный способ выявления микобактерий в чистом виде методом прямого посева на селективные питательные среды из любых биоматериалов ввиду своеобразия их биологических свойств имеет ряд существенных недостатков:
- макроскопический рост микобактерий выявляется чрезвычайно поздно, в сроки от трех недель до трех месяцев;
- накопление биомассы в первой генерации скудное;
- кроме того, при незначительном контаминировании микобактериями исследуемого биоматериала или в случае их ослабленной жизнеспособности видимые невооруженным глазом колонии этих микроорганизмов вообще могут не появиться;
- способы прямого посева на селективные плотные яичные питательные среды недостаточно информативны, трудоемки, малоэффективны, требуют значительных затрат времени и средств.
Задача изобретения - разработка эффективного высокоинформативного способа выявления микобактерий, обеспечивающего сокращение времени диагностики туберкулеза и снижение трудоемкости и материальных затрат на бактериологические исследования.
Технический результат - создание благоприятных условий для жизнедеятельности и эффективного роста микобактерий туберкулеза на питательной среде на основе стандартного мясопептонного агара, снижение продолжительности инкубирования посевов диагностического материала до 4-х суток.
Технический результат достигается тем, что в способе выявления микобактерий туберкулеза крупного рогатого скота, предусматривающем подготовку диагностического материала, его посев на плотную питательную среду, инкубацию и регистрацию результатов, в качестве питательной среды используют смесь стандартного мясопептонного агара и вазелинового масла при следующем соотношении компонентов, мас.%: мясопептонный агар - 95%, вазелиновое масло - 5%, а регистрацию результатов осуществляют через 24-48-72-96 часов.
Сущность изобретения заключается в том, что вазелиновое масло (С5Н12 - С16Н24) обогащает стандартный мясопетонный агар водородом и углеродом. Обладая сильно выраженными адсорбционными свойствами в отношении микобактерий, масло выступает в роли стимулятора, обеспечивающего необходимое ускорение для значительного сокращения времени их роста. После приготовления и застывания смеси масло оказывается на наружной поверхности питательной среды и в поверхностном слое создаются благоприятные условия для размножения и роста колоний микобактерий, в том числе и за счет аэрации. Выбранное соотношение вазелинового масла (5%) и МПА (95%) в питательной среде установлено экспериментально и является оптимальным для высокой чистоты индикации микобактерий при посевах патологических материалов, увеличения скорости их выделения, роста и накопления биомассы.
Для осуществления способа в качестве питательной среды используют мясопептонный вазелиновый агар, который представляет смесь стандартного мясопептонного агара, содержащего 2-3% агар-агара, ph-7,4-7,6, и стерильного вазелинового масла при соотношении компонентов, мас.%: вазелиновое масло - 5, мясопептонный агар - 95. Для ее приготовления к расплавленному мясопептонному агару (МПА), интенсивно помешивая, добавляют стерильное вазелиновое масло. После тщательного перемешивания и встряхивания смесь разливают в большие бактериологические пробирки и чашки Петри, стерилизуют в автоклаве при 120°С, при 1 атм в течение 30 минут. После стерилизации горячие пробирки с полученной питательной средой раскладывали наклонно под углом 5-6°, а чашки Петри оставляют на ровной поверхности стола, и далее их охлаждают при комнатной температуре. При застывании питательной среды образуется плотная влажная поверхность. На нее вносят по 1 мл суспензии подготовленного диагностического материала, приготовленной на стерильном физиологическом растворе в концентрации 2 млрд. микробных тел/мл по оптическому бактериальному стандарту. Диагностический материал для посевов используют после предварительной обработки, включающей измельчение, тщательное растирание со стерильным песком, обработку 6% раствором серной кислоты (в соотношении 1:4), центрифугирование в течение 15 мин при 3000 об/мин, двойное отмывание осадка стерильным физиологическим раствором и приготовление суспензии путем добавления к отмытому осадку стерильного физиологического раствора (1:4).
Инкубирование проводят в термостате при температуре 37-38°С. Для выявления начального роста микобактерий посевы просматривают через 24-48-72-96 часов. У выделенных первичных культур изучают и описывают:
- сроки обнаружения первичного роста;
- характер роста (отдельные колонии, их скопление, сплошной рост);
- характеристика колонии (величина, форма, поверхность, рельеф, конституция, эмульгируемость, пигментообразование);
- тинкториальные свойства микобактерий в мазках, окрашенных по Цилю-Нильсену.
Для сравнительного изучения специфичности способа он был апробирован. В опыте использовали семь микобактериальных штаммов, полученных из музея ФГУ Всероссийского Государственного научно-исследовательского института контроля стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов (Mycobacterium tuberculosis №192, Mycobacterium bovis №14, Mycobacterium avium №961-97, Mycobacterium ihtracellularae №13, Mycobacterium scrofulaceum №13-S, Mycobacterium fortuitum №342 и Mycobacterium phlei №6-78); 15 проб биоматериала (средостенные лимфоузлы с типичными для туберкулеза изменениями), отобранные в условиях мясокомбината при убое туберкулинположительного крупного рогатого скота из неблагополучного по туберкулезу хозяйства Воронежской области и 9 проб не стерильной смеси земли и навоза из благополучной по туберкулезу крупного рогатого скота фермы, которые в условиях лаборатории кафедры искусственно контаминировали суспензиями 4-х музейных штаммов микобактерий: М. bovis-14, M.tuberculosis - 192, М. avium - 961-97, М. phlei-6-78. Для чего из каждой пробы готовили навески по 0,5 грамм, в которые параллельно добавляли по 10 мл суспензии, приготовленной на стерильном физиологическом растворе в концентрации 2 млрд. микробных тел/мл по оптическому бактериальному стандарту.
Музейные штаммы микобактерий для получения бактериальной массы выращивали на селективной среде Левенштейна-Йенсена в течение 3-4 недель. Чистоту культуры проверяли визуально и изучением мазков, окрашенных по Циль-Нильсену.
Для выявления первичных культур микобактерий использовали две плотные среды: стандартную, селективную яичную среду Левенштейна-Йенсена и мясопептонный вазелиновый агар (МПВА).
Подготовленные для исследования биоматериалы параллельно высевали на обе питательные среды. Посевы инкубировали в термостате при температуре 37-38°С в течение 30-45 суток.
Для выявления начального роста микобактерий посевы просматривали каждые сутки и регистрировали результаты.
На мясопептонном вазелиновом агаре появление начального роста патогенных микобактерий - M.tuberculosis, M.bovis:
- в посевах музейных штаммов отмечено через 24-36-48 часов;
- в посевах биоматериалов (от животных и объектов внешней среды животноводческих ферм, искусственно контаминированных данными микобактериями) - через 48-72-96 часа;
Для M.avium - intracellularae, M.phlei - (во всех случаях) через 24-36-48 часов.
Кроме ускоренного роста всех видов микобактерий отмечено обилие колоний на поверхности питательной среды и интенсивное накопление их бактериальной массы.
Результаты исследований представлены в таблице, из которой видно, что скорость и интенсивность роста микобактерий разных видов зависит от способа выделения культуры, что указывает на специфичность способа в соответствии с изобретением.
Диапазоны сроков выявления первичных культур и интенсивности их роста в эти сроки существенно отражают различие способов выделения патогенных и непатогенных микобактерий в чистом виде из различных патологических материалов.
Использование предложенного способа выявления микобактерий туберкулеза позволяет значительно сократить сроки проведения диагностических исследований, в весьма короткие сроки получить значительное количество бактериальной массы в первой генерации, что имеет большое значение при изготовлении биопрепаратов (антигенов, аллергенов).
Предложенный способ экспрессен, обладает значительной разрешающей способностью и позволяет эффективно, в кратчайшие сроки, с наименьшими затратами средств и труда получить культуры микобактерий в чистом виде, что создает основу для своевременного и успешного проведения комплекса противотуберкулезных мероприятий.
Таблица | ||||
Виды микобактерий | Способ выявления микобактерий туберкулеза | |||
Известный (на питательной среде Левенштейна-Йенсена) | Заявленный на питательной среде мясопептонный агар+вазелиновое масло | |||
Скорость роста (сут) | интенсивность роста | Скорость роста (час) | интенсивность роста | |
M.bovis-14 | 24-30 | + | 24-48 | +++ |
М.tuberculosis-192 | 23-28 | + | 24-48 | +++ |
M.avium-961-97 | 8-10 | + | 24-48 | +++ |
M.intracellularae-3 | 8-10 | + | 24-48 | +++ |
M.scrofixlaceum-13-s | 9-10 | + | 24-48 | +++ |
M.fortuitum-342 | 9-11 | ++ | 24-48 | +++ |
M.phlei-6-78 | 5-6 | 24-48 | +++ | |
Биоматериал от КРС | 23-30 | 48-72-96 | +++ | |
Биоматериал из внешней среды искусственно контаминированный | 25-30,8-12 | 48-72-96 | +++ | |
Примечание: интенсивность роста: (+) - единичные колонии (++) - 10-15 колоний (+++) - от 15-20 и более колоний |
Claims (1)
- Способ выявления микобактерий туберкулеза крупного рогатого скота, предусматривающий подготовку диагностического материала, его посев на плотную питательную среду, инкубацию и регистрацию результатов, отличающийся тем, что в качестве питательной среды используют смесь стандартного мясопептонного агара и вазелинового масла при следующем соотношении компонентов, мас.%:
мясопептонный агар 95 вазелиновое масло 5, а регистрацию результатов осуществляют через 24-48-72-96 ч.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2006139239/13A RU2328526C1 (ru) | 2006-11-07 | 2006-11-07 | Способ выявления микобактерий туберкулеза крупного рогатого скота |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2006139239/13A RU2328526C1 (ru) | 2006-11-07 | 2006-11-07 | Способ выявления микобактерий туберкулеза крупного рогатого скота |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2328526C1 true RU2328526C1 (ru) | 2008-07-10 |
Family
ID=39680714
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2006139239/13A RU2328526C1 (ru) | 2006-11-07 | 2006-11-07 | Способ выявления микобактерий туберкулеза крупного рогатого скота |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
RU (1) | RU2328526C1 (ru) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2473906C1 (ru) * | 2011-12-14 | 2013-01-27 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Белгородская государственная сельскохозяйственная академия имени В.Я. Горина" | Способ предпосевной обработки патологического материала для выделения l-форм микобактерий |
-
2006
- 2006-11-07 RU RU2006139239/13A patent/RU2328526C1/ru not_active IP Right Cessation
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
Наставление по диагностике туберкулеза животных. Утверждено департаментом ветеринарии Министерства сельского хозяйства Российской Федерации, 18.11.2002, с.26-29. ЛАБИНСКАЯ А.С. Практикум по микробиологическим методам исследования. - М.: Медгиз, 1963, с.350-357. Справочник по микробиологическим и вирусологическим методам исследования./Под ред. М.О. БИРГЕРА. - М.: Медицина, 1982, с.417-420. Справочник по микробиологическим и вирусологическим методам исследования./Под ред. М.О. БИРГЕРА. - М.: Медицина, 1982, с.268-269. * |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2473906C1 (ru) * | 2011-12-14 | 2013-01-27 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Белгородская государственная сельскохозяйственная академия имени В.Я. Горина" | Способ предпосевной обработки патологического материала для выделения l-форм микобактерий |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
EP2918672B1 (en) | Method for determining the sensitivity of microorganisms to antimicrobial substances | |
Jufri | Microbial isolation | |
RU2328526C1 (ru) | Способ выявления микобактерий туберкулеза крупного рогатого скота | |
CN115322921B (zh) | 一株对奶牛***炎致病菌有拮抗作用的芽孢杆菌及其应用 | |
CN115181690B (zh) | 一株对奶牛***炎致病菌有拮抗作用的解淀粉芽孢杆菌及其应用 | |
CN114410514B (zh) | 斯密氏芽孢杆菌及其用途 | |
US20180274005A1 (en) | Cord blood therapy to treat chronic disease caused by l-form bacteria | |
RU2518304C2 (ru) | ДВУХФАЗНАЯ ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ ТОНКОСЛОЙНОГО КУЛЬТИВИРОВАНИЯ Helicobacter pylori И СПОСОБ ЕГО ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ | |
Masover et al. | Detection of mycoplasmas in cell cultures by cultural methods | |
RU2428484C2 (ru) | Способ видовой дифференциации микобактерий туберкулеза | |
KR20210100153A (ko) | 비-동물성 배지에서의 박테리아 증식 | |
CN111040953B (zh) | 一种基于pet成像***快速筛选变异微生物的方法 | |
RU2465316C1 (ru) | Штамм бактерий haemophilus influenzae в №326, стабильный продуцент капсульного полисахарида | |
RU2177507C1 (ru) | Способ идентификации микобактерий | |
RU2778997C1 (ru) | Питательная среда для дифференциации парагемолитических вибрионов | |
Priya et al. | Biofilm formation by Streptococcus serotypes on dental plaques | |
Wahyuni et al. | Isolation and characterization of amylase-producing microbes from the digestive tract of tilapia | |
RU2350648C1 (ru) | Способ оценки антагонистической активности пробиотиков на основе лиофилизированной биомассы анаэробных бактерий по отношению к патогенным микобактериям | |
CN102827802B (zh) | 培养基添加剂、包含所述添加剂的培养基、及其应用 | |
RU2106879C1 (ru) | Способ культивирования медленнорастущих микобактерий | |
Dahms | Section 1 Traditional microbiological methods | |
Oudah et al. | INTERNATIONAL JOURNAL OF RESEARCH IN PHARMACEUTICAL SCIENCES | |
RU2320724C1 (ru) | Способ выявления антагонистических свойств по отношению к патогенным микобактериям у молочнокислых бактерий и бактерий группы кишечной палочки | |
Maroff | Determination of the inhibitory activity of some biological extracts agaiast multi rrsistans antibiotic Staphylococcus specis which and isolated from different sources of infechtion | |
RU2425872C1 (ru) | ШТАММ БАКТЕРИЙ Yersinia enterocolitica, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ В КАЧЕСТВЕ ИНДИКАТОРНОЙ КУЛЬТУРЫ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ УМЕРЕННЫХ БАКТЕРИОФАГОВ ЛИЗОГЕННЫХ ШТАММОВ О1, О3, О12 СЕРОВАРОВ |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20081108 |