RU2322504C1 - Способ получения генно-инженерного инсулина человека - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к получению генно-инженерного инсулина человека для изготовления лекарственных препаратов, применяемых при лечении сахарного диабета. Способ осуществляют путем культивирования штамма-продуцента гибридного белка, содержащего проинсулин человека, Escherichia coli BL21/pPINS07(BL07) или Escherichia coli JM109/pPINS07, разрушения клеток дезинтеграцией, отделения телец включения, содержащих гибридный белок. Далее проводят предварительную отмывку телец включения, одновременное растворение белка и восстановление дисульфидных связей в буфере с 5-10 мМ дитиотреитола и 1 мМ ЭДТА, ренатурацию и очистку ренатурированного гибридного белка ионообменной хроматографией. Расщепление гибридного белка проводят совместным гидролизом трипсином и карбоксипептидазой Б при массовом соотношении гибридного белка, трипсина и карбоксипептидазы Б 4000:0,6:0,9. Очистку инсулина проводят гидрофобной хроматографией или обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографией с последующей гель-фильтрацией, а выделение инсулина - кристаллизацией в присутствии солей цинка. Изобретение позволяет сократить процесс получения генно-инженерного инсулина человека и увеличить его выход.

Description

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к получению генно-инженерного инсулина человека для изготовления лекарственных препаратов, применяемых при лечении сахарного диабета.

С учетом основных достижений современной диабетологии и рекомендаций Всемирной организации здравоохранения европейские страны к 2001 году завершили переход на использование человеческих инсулинов. В связи с этим разработка способов получения инсулина с использованием методов ДНК-рекомбинантной технологии является актуальной задачей.

Известен способ получения генно-инженерного инсулина человека, состоящий в культивировании штамма-продуцента Е. Coli, продуцирующего проинсулин, содержащий последовательность двух синтетических IgG связывающих доменов стафилококкового белка А. Способ заключается в разрушении бактериальных клеток, получении телец включения, содержащих проинсулин, растворении телец включения, окислительном сульфитолизе проинсулина, его ренатурации, очистке ренатурированного белка аффинной хроматографией, расщеплении проинсулина протеолитическими ферментами (трипсином и карбоксипептидазой Б) и заключительной очистке инсулина высокоэффективной обращенно-фазовой жидкостной хроматографией (Nilson J., Jonasson P., Samuelsson E., Stahl S., Uhlen M. "Integrated production of human insulin and its C-peptide", Journal of biotechnology, 1996, v.48, p.241-250).

Недостатками данного способа являются высокая себестоимость продукта и использование при получении инсулина детергента, который может присутствовать в целевом продукте.

Известен способ получения генно-инженерного инсулина человека, состоящий в том, что культивируют клетки штамма-продуцента Е. Coli ДН5^а / pVK100, разрушают бактериальные клетки ультразвуковой дезинтеграцией, отделяют тельца включения, содержащие гибридный белок, от водорастворимых примесей при помощи центрифугирования, растворяют тельца включения в буфере, содержащем 8 М мочевину, 1 мМ дитиотреитол, 0,1 М трис-HCl, pH 8,0, в течение 12-16 часов. Нерастворившиеся примеси удаляют центрифугированием, после чего увеличивают концентрацию дитиотреитола до 10 мМ и восстанавливают дисульфидные связи при 37°С в течение 1 часа. Раствор разбавляют в 5 раз холодной водой, доводят pH до 4,5 и выдерживают 2 часа при 4°С для формирования осадка. Осадок, содержащий гибридный белок, отделяют центрифугированием и ренатурируют, быстро растворяют в холодной воде при pH 10-12, после чего разводят 10 мМ глициновым буфером pH 10,8 и выдерживают при 4°С в течение ночи. После ультрафильтрации раствор подвергают гель-фильтрации на колонке с сефадексом G-50 и элюируют 10 мМ глициновым буфером. Собирают фракции, содержащие гибридный белок, проводят ультрафильтрацию и лиофильно высушивают. Полученный гибридный белок растворяют в 0,08 М трис-HCl буфере, pH 7,5 до концентрации 10 мг/мл и расщепляют одновременно трипсином и карбоксипептидазой Б (соотношение карбоксипептидаза Б:трипсин:гибридный белок 0,3:1:10) при 37°С в течение 30 минут. Затем добавляют изопропанол до 40%. Смесь подвергают хроматографической очистке на колонке с DEAE-сефадексом А-25 и элюируют 0,05М трис-HCl буфером, pH 7,5 с 40% изопропанола с линейным градиентом хлористого натрия от 0 до 0,1 м. После удаления изопропанола концентрацию хлористого натрия увеличивают до 25%, сдвигают pH до 2,0 и собирают осадок инсулина.

(Chen J.-Q., Zhang H.-T., Hu М.-Н., Tang J.-G., "Production of human insulin in an E. Coli system with met-lys-human proinsulin as the expressed precursor" Applied Biochemistry and Biotechnology, 1995, v. 55, p.5-15).

К недостаткам известного способа относится применение гель-фильтрации на начальных стадиях, что требует значительных объемов сорбента и большое количество ферментов, используемых при расщеплении гибридного белка.

Известен способ получения генно-инженерного инсулина человека, включающий культивирование штамма-продуцента Escherichia coli JM109/pPINS07, разрушение бактериальных клеток дезинтеграцией, отделение телец включения, содержащих гибридный белок, их растворение в буфере, содержащем мочевину и дитиотреитол, ренатурацию и очистку ренатурированного гибридного белка путем осаждения примесных соединений в 40%-ном изопропаноле с последующей хроматографией на КМ-сефарозе, его последовательное расщепление трипсином и карбоксипептидазой Б, при этом продукты трипсинолиза хроматографируют на СП-сефарозе, уравновешенной 0,03-0,1 М аммоний-ацетатным буфером pH 5,0-6,0, содержащим 6 М мочевины, с элюцией белка линейным градиентом хлористого натрия от 0 до 0,5 М в стартовом буфере, а полученную после расщепления карбоксипептидазой Б фракцию инсулина очищают методом обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии (ОФ ВЭЖХ) с последующей гель-фильтрацией (Пат. РФ №2141531, МКИ С12Р 21/02, опубл. 1999 г.)

К недостаткам способа следует отнести использование значительных количеств мочевины и органических растворителей на стадии очистки гибридного белка.

Известен способ получения инсулина человека, включающий культивирование штамма-продуцента Escherichia coli JM109/pPINS07 в промышленном ферментере объемом 200-1500 л, разрушение бактериальных клеток дезинтеграцией, отделение телец включения, содержащих гибридный белок, их растворение в буфере, содержащем 8 М мочевину и дитиотреитол в течение 10-12 часов, ренатурацию, разбавление в 5-10-кратном объеме 0,1 М Na-глицинового буфера при pH 9-11 и 10-14°С, очистку ренатурированного гибридного белка после кислотного осаждения и микрофильтрации хроматографией на КМ-сефарозе, уравновешенной 0,05 М трисовым буфером с pH 7,0-7,5, элюированием гибридного белка исходным буфером, содержащим 0,25 М хлористого натрия и 1,5 М мочевины, последовательное расщепление гибридного белка сначала трипсином в соотношении трипсин : гибридный белок 1:(500-100), а затем карбоксипептидазой Б в соотношении фермент : гибридный белок 1:(500-1000), при этом промежуточные продукты трипсинолиза хроматографируют на СП-сефарозе, уравновешенной 0,03 М аммоний-ацетатным буфером pH 5,0, содержащим 3 М мочевину, и элюцией белка линейным градиентом хлористого калия от 0 до 0,5 М в стартовом буфере. Полученный после гидролиза инсулин очищают методом препаративной обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии, фракции с чистотой инсулина не менее 98% объединяют, осаждают 10% уксуснокислым цинком при pH раствора 6,3-6,5, осадок центрифугируют, растворяют в 1 М растворе уксусной кислоты и подвергают гель-фильтрации, а целевой продукт кристаллизуют (Пат. РФ №223813 от 18.02.2003, опубл. 20.07.2004).

К недостаткам способа следует отнести многостадийность процесса, связанную с раздельным гидролизом гибридного белка, использование больших количеств трипсина и карбоксипептидазы Б и значительных количеств мочевины и растворителя на стадиях очистки продукта.

Известен наиболее близкий к заявленному способ получения генно-инженерного инсулина человека, включающий культивирование штамма-продуцента Escherichia coli JM109/pPINS07 до достижения культурой оптической плотности 30 ОЕ, разрушение клеток дезинтеграцией, отделение телец включения, содержащих гибридный белок, предварительную отмывку телец включения, одновременное растворение белка и восстановление дисульфидных связей в буфере с 5-10 мМ дитиотреитола и 1 мМ ЭДТА в течение 3-7 часов, очистку регенерированного гибридного белка в одну стадию ионообменной хроматографией, расщепление гибридного белка совместным гидролизом трипсином и карбоксипептидазой Б при массовом соотношении гибридного белка, трипсина и карбоксипептидазы Б 4000:(1-2):1, очистку инсулина гидрофобной хроматографией с последующей гель-фильтрацией и выделение инсулина кристаллизацией в присутствии солей цинка.

(Пат. РФ №2208637, МКИ С12N 15/00, опубл. 2003 г.)

К недостаткам способа следует отнести низкий выход целевого продукта и большую продолжительность процесса.

Изобретение решает задачу повышения выхода инсулина и сокращения длительности процесса.

Поставленная задача решается за счет того, что в способе получения генно-инженерного инсулина человека, включающем ферментацию штамма-продуцента гибридного белка, содержащего проинсулин человека, разрушение клеток дезинтеграцией, отделение телец включения, содержащих гибридный белок, предварительную отмывку телец включения, одновременное растворение белка и восстановление дисульфидных связей в буфере с 5-10 мМ дитиотреитола и 1 мМ ЭДТА, ренатурацию и очистку ренатурированного гибридного белка ионообменной хроматографией, расщепление гибридного белка совместным гидролизом трипсином и карбоксипептидазой Б, очистку инсулина гидрофобной хроматографией или обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографией с последующей гель-фильтрацией и выделение инсулина кристаллизацией в присутствии солей цинка, в качестве штамма-продуцента используют штамм бактерий Escherichia coli BL21/pPINS07(BL07) или Escherichia coli JM109/pPINS07, ферментацию проводят до достижения культурой оптической плотности 15 ОЕ, ренатурацию осуществляют в течение 48 часов, а расщепление гибридного белка проводят совместным гидролизом трипсином и карбоксипептидазой Б при массовом соотношении гибридного белка, трипсина и карбоксипептидазы Б 4000:0,6:0,9.

Техническим результатом изобретения является повышение выхода конечного продукта до 120-180 г фармакопейной субстанции инсулина человека с 1000 л культуральной жидкости по сравнению с 50 г с 1000 л в известном способе и сокращение времени проведения процесса на 24 часа.

Способ осуществляют следующим образом.

Для получения генно-инженерного инсулина человека используют штамм-продуцент гибридного белка, содержащего проинсулин человека, Escherichia coli BL 21PINS07(BL07) или Escherichia coli JM109/pPINS07.

Биосинтез продуцента проводят культивированием.

При культивировании клеток штамма-продуцента гибридного белка для получения инокулята питательную среду на основе гидролизата казеина и экстракта пекарских дрожжей засевают культурой штамма-продуцента, затем выращивают посевной материал в ферментере объемом 20 л. Полученный посевной материал используют для засева ферментера объемом 1000 л. Ферментацию проводят до достижения культурой оптической плотности 15 ОЕ, проводя индукцию синтеза гибридного белка 1-изопропил-β-D-1-тиогалактопиранозидом. После окончания ферментации клетки штамма-продуцента гибридного белка (биомассу) отделяют центрифугированием, разрушают на дезинтеграторе Гаулина и выделяют центрифугированием тельца включения.

Тельца включения, полученные после дезинтеграции биомассы, обрабатывают по следующей схеме:

1. Тельца включения подвергают отмывке водой и 50 мМ трисом при pH 9,0.

2. Отмытые тельца включения растворяют в буфере, содержащем 50 мМ трис, 8,0 М мочевину, 2 мМ ЭДТА, 0,2 М NaCl, 5-10 мМ дитиотреитола (ДТТ), при pH 8,0. Осадок отделяют центрифугированием.

3. Ренатурацию проводят следующим образом: супернатант, содержащий восстановленный гибридный белок, разбавляют 25 мМ трисовым буфером с pH 9,5 при 6-9°С так, чтобы концентрация общего белка составила 0,7-0,8 мг/мл. Раствор выдерживают при охлаждении и перемешивании в течение 48 часов.

4. Очистку гибридного белка проводят хроматографией на DEAE-сефарозе.

5. К полученному раствору очищенного гибридного белка прибавляют раствор, содержащий карбоксипептидазу Б и трипсин при массовом соотношении гибридного белка, трипсина и карбоксипептидазы Б 4000:0,6:0,9. По окончании реакции гидролиз останавливают подкислением раствора до pH 3,0, прибавляют хлористый натрий, центрифугируют. Осадок инсулина передают на стадию очистки.

6. Очистка инсулина может выполняться двумя альтернативными способами:

а) Осадок инсулина растворяют в 10 мМ лимонной кислоте, добавляют хлорид натрия до концентрации 0,5 М, повышают pH до 6,6 и раствор наносят на колонку, упакованную гидрофобным сорбентом. Сорбированный материал элюируют этанолом в цитратном буфере в градиентном режиме. Фракции, содержащие инсулин с чистотой не менее 98%, объединяют и передают на дальнейшую очистку.

б) Осадок инсулина растворяют в 10 мМ лимонной кислоте и наносят на препаративную колонну ОФ ВЭЖХ. Десорбируют инсулин этанолом в цитратном буфере с добавкой сульфата аммония. Фракции с чистотой не менее 98% объединяют и передают на дальнейшую очистку.

7. Готовят раствор инсулина в 0,5 М уксусной кислоте и передают на гель-фильтрацию. Гель-фильтрацию раствора инсулина проводят на колонке с сефадексом G-50 SF SG.

8. Полученный очищенный инсулин высаживают из раствора ацетатом цинка, подвергают цинковой кристаллизации, промывке кристаллического осадка на фильтре и последующей сушке под вакуумом при температуре 20°С.

Изобретение иллюстрируют примеры.

Пример 1.

Культивирование клеток штамма-продуцента Esherichia coli JM109/pPINS07 проводят следующим образом.

Первый этап - выращивание маточной культуры в колбах; второй - выращивание инокулята в ферментере объемом 20 л, на питательной среде, содержащей ферментативный гидролизат казеина, дрожжевой экстракт, минеральные соли, глюкозу и ампициллин. Среду готовят на основе деминерализованной воды. Заключительным этапом является выращивание основной культуры рекомбинантного штамма в ферментере объемом 1000 л. Состав питательной среды аналогичен, но без добавления ампициллина. В ходе процесса подают глюкозу и аммиак для поддержания pH, концентрацию растворенного кислорода поддерживают на уровне не менее 20%. При достижении значения оптической плотности 15 ОЕ проводят индукцию синтеза гибридного белка 1-изопропил-β-D-1-тиогалактозидом. Последующий биосинтез гибридного белка проводят в течение 5 часов.

После окончания процесса биосинтеза клетки штамма-продуцента гибридного белка в виде суспензии собирают на сепараторе. Суспензию клеток растворяют в 300 л буфера, содержащего трис 50 мМ, ЭДТА 50 мМ и мочевину 2 М, разрушают на дезинтеграторе Гаулин и собирают пасту телец включения на центрифугах при 16000 g. Далее тельца включения отмывают последовательно в воде, в буфере, содержащем 50 мМ трис при pH 9,0, и буфере, содержащем 1 М мочевину и 50 мМ трис при pH 9,0. Отмывки проводят с использованием сепаратора и центрифуги. Получают 18 кг отмытых телец включения, которые используют для дальнейшей очистки. Полученный продукт имеет влажность 75%, содержит 12% общего белка, 6,6% гибридного белка.

18 кг отмытых телец включения суспендируют, а затем растворяют при постоянном перемешивании в течение 2 часов в 72 л буферного раствора, содержащего 50 мМ трис, 8,0 М мочевину, 2 мМ ЭДТА, 0,2 М NaCl. После этого в раствор вводят 5 мМ ДТТ и проводят реакцию восстановления в течение 2,5 часов. Процесс проводят при комнатной температуре и pH реакционной смеси 8,0.

Раствор восстановленного гибридного белка подвергают осветлению, используя проточную центрифугу. Суммарная концентрация белка 30 г/л.

Ренатурацию гибридного белка проводят в 25 мМ трис-буфере при температуре 6°С. Восстановленный белок постепенно вводят в предварительно охлажденный трис-буфер в соотношении 1:40, что обеспечивает создание концентрации белка в ренатурирующем буфере 0,7 г/л, pH 9,5. Рефолдинг ведут при непрерывном перемешивании в течение 48 часов. Степень ренатурации контролируют методом ОФ ВЭЖХ. Содержание ренатурированного гибридного белка (ГБ) составляет 80%. По окончании ренатурации pH снижается до 7,7.

Очистку ГБ проводят посредством ионообменной хроматографии. Для очистки применяют сорбент DEAE-сефароза FF. На колонну BPG 450 с объемом сорбента 50 л, предварительно уравновешенную 25 мМ трис-HCl буфером, pH 7,7, наносят раствор ренатурированного ГБ. Белок с колонны элюируют раствором хлористого натрия при концентрации NaCl от 0 до 0,2 М. По результатам электрофореза фракции с чистотой ГБ свыше 90% передают на стадию ферментативного гидролиза, остальные возвращают на повторную очистку. Выход очищенного ГБ составляет 940 г.

Ферментативный гидролиз ГБ выполняют совместным воздействием трипсина и карбоксипептидазы Б. Раствор гибридного белка в объеме 98 л вносят в реактор, pH раствора устанавливают на уровне 7,5. В раствор ГБ вводят сначала карбоксипептидазу Б, затем - трипсин при массовом соотношении гибридного белка, карбоксипептидазы Б и трипсина 4000:0,6:0,9. Процесс ведут при температуре реакционной смеси 6°С. Время проведения процесса 20 часов. Гидролиз контролируют посредством ОФ ВЭЖХ и прекращают при выходе концентрации инсулина и примесей на постоянный уровень. Останавливают гидролиз снижением pH до 3,0. Концентрация инсулина в реакционной смеси по данным ОФ ВЭЖХ составляет 2,5 г/л. По окончании ферментативного гидролиза инсулин осаждают добавлением в раствор хлористого натрия до концентрации 2 М, осадок центрифугируют. Полученную пасту, содержащую 240 г инсулина с чистотой около 90%, передают на стадию очистки.

Очистку инсулина выполняют посредством гидрофобной хроматографии низкого давления. Инсулин в количестве 120 г растворяют в 15 л раствора 10 мМ лимонной кислоты, добавляют хлорид натрия до концентрации 0,5 М и доводят pH до 6,6. Подготовленный таким образом раствор инсулина наносят на колонну с 30 л сорбента Butyl Toyopearl 650S, предварительно уравновешенную цитратным буфером с 0,5 М хлорида натрия, pH 6,6. Инсулин десорбируют этиловым спиртом в цитратном буфере (концентрация спирта от 10 до 23%). Фракции с чистотой инсулина 98% и выше объединяют и передают на следующую стадию. Материал с чистотой менее 98% возвращают на повторную очистку.

65 г очищенного инсулина осаждают 3 М хлоридом натрия, осадок центрифугируют и передают на стадию гель-фильтрации. Инсулин растворяют в 0,5 М уксусной кислоте. Для гель-фильтрации используют колонну, заполненную 25 л сорбента Сефадекс G50. На предварительно уравновешенную колонну за 1 цикл наносят 30 г инсулина. Инсулин элюируют раствором 0,5 М уксусной кислоты. Фракции выделяют в соответствии с хроматографическими зонами на кривой оптической плотности. Чистоту инсулина в выделенной фракции контролируют методом ОФ ВЭЖХ.

Полученный очищенный инсулин высаживают из раствора ацетатом цинка, кристаллизуют в присутствии солей цинка с последующей сушкой под вакуумом при температуре 20°С. Выход кристаллического инсулина составляет 60 г. Полный выход очищенного инсулина из 18 кг тел включения (1 м³ культуральной жидкости) составляет 120 г.

Пример 2.

Культивирование клеток штамма-продуцента Esherichia coli BL 21/pPINS07(BL07) проводят следующим образом.

Первый этап - выращивание маточной культуры в колбах; второй - выращивание инокулята в ферментере объемом 20 л, на питательной среде, содержащей ферментативный гидролизат казеина, дрожжевой экстракт, минеральные соли, глюкозу и ампициллин. Среду готовят на основе деминерализованной воды. Заключительным этапом является выращивание основной культуры рекомбинантного штамма в ферментере объемом 1000 л. Состав питательной среды аналогичен, но без добавления ампициллина. В ходе процесса подают глюкозу и аммиак для поддержания pH, концентрацию растворенного кислорода поддерживают на уровне не менее 20%. При достижении оптической плотности 15 ОЕ проводят индукцию синтеза гибридного белка 1-изопропил-β-D-1-тиогалактозидом. Последующий биосинтез гибридного белка проводят в течение 5 часов.

После окончания процесса биосинтеза клетки штамма-продуцента гибридного белка в виде суспензии собирают на сепараторе. Суспензию клеток растворяют в 300 л буфера, содержащего трис 50 мМ, ЭДТА 50 мМ и мочевину 2М, и разрушают на дезинтеграторе Гаулин и собирают пасту телец включения на проточной центрифуге при 16000 g. Далее тельца включения отмывают последовательно в воде, в буфере, содержащем 50 мМ трис при pH 9,0, и буфере, содержащем 1 М мочевину и 50 мМ трис при pH 9,0. Отмывки проводят с использованием сепаратора и центрифуги. Получают 18 кг отмытых телец включения, которые используют для дальнейшей очистки. Полученный продукт имеет влажность 75%, содержит 12% общего белка, 6,6% гибридного белка.

18 кг отмытых телец включения суспендируют, а затем растворяют при постоянном перемешивании в течение 2 часов в 72 л буферного раствора, содержащего 50 мМ трис, 8,0 М мочевину, 2 мМ ЭДТА, 0,2 М NaCl. После этого в раствор вводят 5 мМ ДТТ и проводят реакцию восстановления в течение 2,5 часов. Процесс проводят при комнатной температуре и pH реакционной смеси 8,0.

Раствор восстановленного гибридного белка подвергают осветлению, используя проточную центрифугу. Суммарная концентрация белка 30 г/л.

Ренатурацию гибридного белка проводят в 25 мМ трисовом буфере при температуре 9°С. Восстановленный белок постепенно вводят в предварительно охлажденный трисовый буфер в соотношении 1:40, что обеспечивает создание концентрации белка в ренатурирующем буфере 0,8 г/л, pH 9,5. Рефолдинг ведут при непрерывном перемешивании в течение 48 часов. Степень ренатурации контролируют методом ОФ ВЭЖХ. Содержание ренатурированного гибридного белка (ГБ) составляет 80%. По окончании ренатурации pH снижается до 7,7.

Очистку ГБ проводят посредством ионообменной хроматографии. Для очистки применяют сорбент DEAE-сефароза FF. На колонну с объемом сорбента 50 л, предварительно уравновешенную 25 мМ трис-HCl буфером, pH 7,7, наносят раствор ренатурированного ГБ. Белок с колонны элюируют раствором хлористого натрия с концентрацией от 0 до 0,2 М. По результатам электрофореза фракции с чистотой ГБ свыше 90% передают на стадию ферментативного гидролиза, остальные возвращают на повторную очистку. Выход очищенного ГБ составляет 940 г.

Ферментативный гидролиз ГБ выполняют совместным воздействием трипсина и карбоксипептидазы Б. Раствор гибридного белка в объеме 100 л вносят в реактор, pH раствора устанавливают на уровне 7,5. В раствор ГБ вводят сначала карбоксипептидазу Б, затем - трипсин при соотношении гибридного белка, карбоксипептидазы Б и трипсина 4000:0,6:0,9. Процесс ведут при температуре реакционной смеси 9°С. Время проведения процесса 22 часа. Гидролиз контролируют посредством ОФ ВЭЖХ и прекращают при выходе концентрации инсулина и примесей на постоянный уровень. Останавливают гидролиз снижением pH до 3,0. Концентрация инсулина в реакционной смеси по данным ОФ ВЭЖХ составляет 2,5 г/л. По окончании ферментативного гидролиза инсулин высаживают добавлением в раствор хлористого натрия до концентрации 2 М. Через 20 часов осадок центрифугируют. Полученную пасту, содержащую 240 г инсулина с чистотой около 90%, передают на стадию очистки.

Очистку инсулина выполняют методом препаративной ОФ ВЭЖХ. Для очистки используют сорбент на силикагелевой основе с привитой фазой С₈, размер частиц сорбента 15 мкм.

На колонну наносят 35 г инсулина, растворенного в 10 мМ лимонной кислоте. Десорбируют инсулин этанолом в цитратном буфере с добавкой сульфата аммония pH 3,0. Чистоту фракций контролируют ОФ ВЭЖХ. Фракции с чистотой не менее 98% объединяют и передают на стадию гель-фильтрации.

Инсулин растворяют в 0,5 М уксусной кислоте. Для гель-фильтрации используют колонну, заполненную 25 л сорбента Сефадекс G50. На предварительно уравновешенную колонну за 1 цикл наносят 30 г инсулина. Инсулин элюируют раствором 0,5 М уксусной кислоты. Фракции объединяют в соответствии с хроматографическими зонами на кривой оптической плотности. Чистоту инсулина в объединенной фракции контролируют методом ОФ ВЭЖХ.

Полученный очищенный инсулин осаждают ацетатом цинка, подвергают цинковой кристаллизации, промывке кристаллического осадка на фильтре и последующей сушке под вакуумом при температуре 20°С. Выход кристаллического инсулина (после 2 циклов гель-фильтрации) составляет 60 г. Полный выход очищенного инсулина из 18 кг тел включения (1 м³ культуральной жидкости) составляет 180 г.

Claims (1)

1. Способ получения генно-инженерного инсулина человека, включающий ферментацию штамма-продуцента гибридного белка, содержащего проинсулин человека, разрушение клеток дезинтеграцией, отделение телец включения, содержащих гибридный белок, предварительную отмывку телец включения, одновременное растворение белка и восстановление дисульфидных связей в буфере с 5-10 мМ дитиотреитола и 1 мМ ЭДТА, ренатурацию и очистку ренатурированного гибридного белка ионообменной хроматографией, расщепление гибридного белка совместным гидролизом трипсином и карбоксипептидазой Б, очистку инсулина гидрофобной хроматографией или обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографией с последующей гель-фильтрацией и выделение инсулина кристаллизацией в присутствии солей цинка, отличающийся тем, что в качестве штамма-продуцента используют штамм бактерий Escherichia coli BL21/pPINS07(BL07) или Escherichia coli JM109/pPINS07, ферментацию проводят до достижения культурой оптической плотности 15 ОЕ, ренатурацию осуществляют в течение 48 ч, а расщепление гибридного белка проводят совместным гидролизом трипсином и карбоксипептидазой Б при массовом соотношении гибридного белка, трипсина и карбоксипептидазы Б 4000:0,6:0,9.