RU2320720C2 - Method for culturing fibroblasts for substitution therapy - Google Patents

Abstract

FIELD: biotechnology.

SUBSTANCE: invention relates to a method for preparing cells used for cosmetic aims (for example, for rejuvenation and/or improvement of a patient skin state). In particular, invention concerns culturing autologous fibroblasts for their following using as an agent for substitution therapy. Method involves isolation of fibroblast cells from human skin bioptates by enzymatic treatment in solution of DMEM/5% EBS(embrional bovine serum)/0.2% dispase/0.1 mg/ml of collagenase of type I followed by centrifugation of cellular suspension, resuspending precipitated cells in medium DMEM/10% EBS/100 U/ml of penicillin, 100 U/ml of streptomycin, 100 U/ml of fungizone and prolonged culturing fibroblasts in medium with a patient serum: DMEM/10% MPS/100 U/ml of streptomycin, 100 U/ml of fungizone, or in therapeutic medium AIM-V. Invention allows averting the possible immune response and to obtain the better adaptability of cells in carrying out the substitution therapy.

EFFECT: improved culturing method.

2 cl, 1 tbl, 4 dwg, 1 ex

Description

Изобретение относится к биологии и к технологии получения клеток, используемых в косметических целях (например, с целью омоложения и/или улучшения состояния кожи пациентов). В частности, изобретение касается культивирования фибробластов, выделенных из биоптатов кожи, для последующего использования в качестве средства для регенеративной терапии в косметологии.The invention relates to biology and to a technology for producing cells used for cosmetic purposes (for example, with the aim of rejuvenating and / or improving the skin condition of patients). In particular, the invention relates to the cultivation of fibroblasts isolated from skin biopsies for subsequent use as a means for regenerative therapy in cosmetology.

Клетки, выращенные in vitro, способны при культивировании в соответствующих условиях сохранять свои физиологические функции и могут использоваться при замещении, восстановлении, корректировке функций поврежденных тканей или в косметических целях для омоложения или улучшения состояния кожи.Cells grown in vitro, capable of culturing under appropriate conditions, maintain their physiological functions and can be used to replace, restore, adjust the functions of damaged tissues or for cosmetic purposes to rejuvenate or improve skin condition.

Известен способ внутрикожного введения эмбриобласта с целью омоложения и биостимуляции кожи (RU 2197952, 2001). Однако недостатком данного способа является аллогенность вводимого препарата, включающего клеточные экстракты эмбрионов овцы, и соответственно возможность побочных эффектов в виде иммунной реакции в организме пациента.A known method of intradermal administration of an embryoblast to rejuvenate and biostimulate the skin (RU 2197952, 2001). However, the disadvantage of this method is the allogeneity of the administered drug, including cell extracts of sheep embryos, and, accordingly, the possibility of side effects in the form of an immune reaction in the patient's body.

Известен штамм диплоидных клеток легкого эмбриона человека - штамм ЛЭЧ-4(81) и способ его культивирования. (RU 2213775, 2003). Способ заключается в том, что культура клеток в виде монослоя используется для получения гомогенной взвеси клеток, которую наносят на специально подготовленную рану. Как правило, взвесь клеток стимулирует собственные процессы заживления в ране, а затем отторгается. Недостатком этого способа является недостаточная эффективность в результате невозможности интеграции имплантанта в окружающие ткани из-за аллогенности наносимых клеток.A known strain of diploid cells of a human lung embryo is strain LEC-4 (81) and a method for its cultivation. (RU 2213775, 2003). The method consists in the fact that the cell culture in the form of a monolayer is used to obtain a homogeneous suspension of cells, which is applied to a specially prepared wound. As a rule, a suspension of cells stimulates its own healing processes in the wound, and then is rejected. The disadvantage of this method is the lack of effectiveness as a result of the inability to integrate the implant into the surrounding tissue due to the allogeneity of the applied cells.

Также известен способ введения гиалуроновой кислоты внутрикожно (RU 2194512, 2001), который используется для улучшения структуры кожи. Недостатком данного способа является уникальность вводимого компонента внеклеточного матрикса, в то время как в состав компонентов внеклеточного матрикса, который обеспечивает нормальные обменные процессы и поддерживает тургор кожи, входят десятки компонентов. Предлагаемый способ существенно расширяет спектр компонентов внеклеточного матрикса, которые начинают синтезироваться при введении фибробластов.Also known is a method of administering hyaluronic acid intradermally (RU 2194512, 2001), which is used to improve the structure of the skin. The disadvantage of this method is the uniqueness of the introduced component of the extracellular matrix, while the components of the extracellular matrix, which ensures normal metabolic processes and supports skin turgor, include dozens of components. The proposed method significantly expands the range of extracellular matrix components that begin to be synthesized with the introduction of fibroblasts.

Наиболее близким по технической сущности и достигаемому результату является способ омоложения кожи (патент WO 2004048557), включающий терапию аутологическими недифференцированными мезенхимальными клетками, кератиноцитами и фибробластами. В данном способе предлагается вводить охарактеризованную культуру фибробластов. Недостатком способа является культивирование клеток в среде, содержащей эмбриональную сыворотку быка, с последующей отмывкой в бессывороточной среде в течение 12 часов перед введением пациенту. Такая кратковременная отмывка не может обеспечивать полноценное избавление от чужеродных белков эмбриональной сыворотки, что может вызывать иммунную реакцию пациента на вводимые клетки.The closest in technical essence and the achieved result is a method of skin rejuvenation (patent WO 2004048557), including therapy with autologous undifferentiated mesenchymal cells, keratinocytes and fibroblasts. In this method, it is proposed to introduce a characterized fibroblast culture. The disadvantage of this method is the cultivation of cells in a medium containing fetal bovine serum, followed by washing in serum-free medium for 12 hours before administration to the patient. Such a short-term washing can not provide complete disposal of foreign proteins of fetal serum, which can cause the patient's immune response to the introduced cells.

Технический результат, достигаемый предлагаемым способом, заключается в повышении эффективности и тканеспецифичности получаемого продукта, улучшении качества получаемых клеток, повышении эффективности способа их получения и эффективности терапии в целом.The technical result achieved by the proposed method is to increase the efficiency and tissue specificity of the obtained product, improve the quality of the obtained cells, increase the efficiency of the method of their production and the effectiveness of therapy in general.

Для достижения указанного технического результата в способе культивирования фибробластов, включающем выделение клеток и инкубирование в питательной среде, выделение фибробластов осуществляют из биоптатов кожи путем ферментативной обработки. Для этого биоптат кожи после выделения в стерильных условиях обрабатывают раствором DMEM (Sigma)/5% ЭБС/0,2% диспазы (Gibco)/0.1 мг/мл коллагеназы I типа (Worthington Biochemical) и при постоянном помешивании и пипетировании инкубируют кусочки кожи при температуре 37°С в течение 1,5 часов. Полученную суспензию центрифугируют 5 мин при 200 g, супернатант сливают, осевшие клетки ресуспендируют в новой порции стандартной среды для фибробластов (DMEM/10% ЭБС /100 ед/мл пенициллина (Gibco), 100 ед/мл стрептомицина (Gibco), 100 ед/мл фунгизона (Gibco)) и высевают на чашки. После достижения монослоя фибробласты переводят на культивирование в среде с собственной сывороткой крови пациента (ССКП) (DMEM/10% ССКП/100 ед/мл стрептомицина (Gibco), 100 ед/мл фунгизона (Gibco)) или в терапевтической среде AIM-V (Gibco). AIM-V среда предназначена для культивирования клеток и тканей человека ex vivo и не содержит животных эмбриональных добавок, которые могли бы вызывать иммунный ответ при введении клеток пациентам.To achieve the specified technical result in a method of culturing fibroblasts, including the selection of cells and incubation in a nutrient medium, the selection of fibroblasts is carried out from skin biopsies by enzymatic treatment. To do this, the skin biopsy after isolation under sterile conditions is treated with a solution of DMEM (Sigma) / 5% EBS / 0.2% dispase (Gibco) /0.1 mg / ml type I collagenase (Worthington Biochemical) and incubated skin pieces with constant stirring and pipetting with temperature of 37 ° C for 1.5 hours. The resulting suspension was centrifuged for 5 min at 200 g, the supernatant was drained, the settled cells were resuspended in a new portion of standard fibroblast medium (DMEM / 10% EBS / 100 units / ml penicillin (Gibco), 100 units / ml streptomycin (Gibco), 100 units / ml of fungicone (Gibco)) and plated on cups. After reaching the monolayer, the fibroblasts are transferred to cultivation in a medium with the patient’s own blood serum (SSCP) (DMEM / 10% SSCP / 100 units / ml streptomycin (Gibco), 100 units / ml fungicone (Gibco)) or in AIM-V therapeutic medium ( Gibco). AIM-V medium is designed to cultivate human cells and tissues ex vivo and does not contain animal embryonic supplements that could elicit an immune response when cells are introduced to patients.

Целесообразно культивированные фибробласты дополнительно обрабатывать путем добавления rhTGF-β1 (R@D Systems) в концентрации 5 нг/мл в среду культивирования.Advantageously, cultured fibroblasts are further treated by adding rhTGF-β1 (R @ D Systems) at a concentration of 5 ng / ml to the culture medium.

Известно что часть фибробластов экспрессирует а-актин - сократительный белок, который характерен для миофибробластов - фибробластов сократительного фенотипа. Обычно миофибробласты появляются в коже при ее повреждении и способствуют стягиванию краев раны и ее заживлению. По мере культивирования фибробластов количество а-актин позитивных клеток увеличивается и достигает 30% при монослое, количество а-актин позитивных клеток не зависит от пассажа. Введение миофибробластов в кожу пациентам способствует эффекту подтягивания. Для увеличения количества миофибробластов и увеличения «эффекта подтягивания» при введении в кожу пациентам культуру клеток дополнительно обрабатывали добавлением rhTGF-β1 (R@D Systems) в среду культивирования в концентрации 5 нг/мл, что повышало количество миофибробластов в культуре (фиг.1) и увеличивало эффект подтягивания.It is known that some fibroblasts express a-actin, a contractile protein that is characteristic of myofibroblasts, fibroblasts of a contractile phenotype. Myofibroblasts usually appear in the skin when it is damaged and contribute to the contraction of the edges of the wound and its healing. As fibroblasts are cultured, the number of a-actin positive cells increases and reaches 30% with a monolayer, the number of a-actin positive cells does not depend on passage. The introduction of myofibroblasts into the skin of patients contributes to the pull-up effect. To increase the number of myofibroblasts and increase the “pull-up effect” when introduced into the skin of patients, the cell culture was further treated by adding rhTGF-β1 (R @ D Systems) to the culture medium at a concentration of 5 ng / ml, which increased the number of myofibroblasts in the culture (figure 1) and increased the pull-up effect.

Клетки несколько раз отмывали от среды в буфере Krebs-Ring (Sigma), обрабатывали раствором 0,25% трипсина /0,02% ЭДТА для снятия клеток с подложки, добавляли 1 мл Krebs-Ringer, суспендировали клетки и центрифугировали 5 мин при 200 g. Супернатант сливали, а клетки ресуспендировали в новой порции раствора Krebs-Ringer для введения пациентам.Cells were washed several times from the medium in Krebs-Ring buffer (Sigma), treated with a solution of 0.25% trypsin / 0.02% EDTA to remove cells from the substrate, 1 ml of Krebs-Ringer was added, the cells were suspended and centrifuged for 5 min at 200 g . The supernatant was discarded, and the cells were resuspended in a new portion of Krebs-Ringer solution for administration to patients.

Длительное культивирование клеток на среде, не содержащей животных эмбриональных добавок (культивирование на среде с собственной сывороткой крови пациента или на терапевтической среде AIM-V (Gibco)), позволяет избежать возможного иммунного ответа, а также достичь лучшей приживаемости клеток при заместительной терапии. Существенным фактором изобретения является характеристики используемых клеток, а именно их фенотип, секреция компонентов внеклеточного матрикса и факторов роста, что подтверждается нижеприведенным примером осуществления изобретения и результатами лабораторных исследований.Long-term cultivation of cells on a medium that does not contain animal embryonic additives (cultivation on a medium with the patient’s own blood serum or on AIM-V therapeutic medium (Gibco)) avoids a possible immune response, as well as to achieve better cell survival during replacement therapy. An essential factor of the invention is the characteristics of the cells used, namely their phenotype, secretion of the components of the extracellular matrix and growth factors, which is confirmed by the following embodiment of the invention and the results of laboratory studies.

Пример.Example.

Культуру дермальных фибробластов получали из биоптатов кожи размером 2×3×4 мм. Используя стерильные инструменты, биоптат кожи после выделения помещали в одноразовую пробирку со средой: DMEM (Sigma)/ 100 ед/мл пенициллина (Gibco), 100 ед/мл стрептомицина (Gibco), 100 ед/мл фунгизона (Gibco). Далее в стерильных условиях культурального бокса биоптат переносили в раствор DMEM/5% ЭСВ/0,2% диспазы (Gibco) 0.1 Мг/мл коллагеназы I типа (Worthington Biochemical) и при постоянном помешивании и пипетировании инкубировали кусочки кожи при 37°C в течение 1,5 часов. Далее полученную суспензию центрифугировали 5 мин при 200 g, супернатант сливали, осевшие клетки ресуспендировали в новой порции стандартной среды для фибробластов стандартной среды для фибробластов (DMEM/10% ЭСБ /100 ед/мл пенициллина (Gibco), 100 ед/мл стрептомицина (Gibco), 100 ед/мл фунгизона (Gibco)) и высевали на чашки. При достижении конфлюента клетки пассировали: монослой клеток обрабатывали раствором 0,25% трипсина/0,02% ЭДТА для снятия с подложки и рассаживали в соотношении 1:3. При достижении монослоя клетки переводили на культивирование в среде, содержащей собственную сыворотку крови пациента (ССКП): DMEM/10% ССКП/100 ед/мл пенициллина (Gibco), 100 ед/мл стрептомицина (Gibco), 100 ед/мл фунгизона (Gibco), или в терапевтической среде AIM-V (Gibco). Клетки несколько раз отмывали от среды в буфере Krebs-Ring (Sigma), обрабатывали раствором 0,25% трипсина/0,02% ЭДТА для снятия клеток с подложки, добавляли 1 мл Krebs-Ringer, суспендировали клетки и центрифугировали 5 мин при 200 g. Супернатант сливали, а клетки ресуспендировали в новой порции раствора Krebs-Ringer для введения пациентам.A dermal fibroblast culture was obtained from skin biopsies measuring 2 × 3 × 4 mm. Using sterile instruments, the skin biopsy after isolation was placed in a disposable tube with medium: DMEM (Sigma) / 100 units / ml penicillin (Gibco), 100 units / ml streptomycin (Gibco), 100 units / ml fungicone (Gibco). Then, under sterile conditions of the culture box, the biopsy was transferred to a solution of DMEM / 5% ESV / 0.2% dispase (Gibco) 0.1 Mg / ml type I collagenase (Worthington Biochemical) and, with constant stirring and pipetting, skin pieces were incubated at 37 ° C for 1.5 hours. Next, the resulting suspension was centrifuged for 5 min at 200 g, the supernatant was discarded, the settled cells were resuspended in a new portion of the standard medium for fibroblasts of the standard medium for fibroblasts (DMEM / 10% ESB / 100 units / ml penicillin (Gibco), 100 units / ml streptomycin (Gibco ), 100 u / ml fungicone (Gibco)) and plated on cups. When the confluent was reached, the cells were passaged: the cell monolayer was treated with a solution of 0.25% trypsin / 0.02% EDTA to be removed from the substrate and planted in a ratio of 1: 3. Upon reaching the monolayer, the cells were transferred to cultivation in a medium containing the patient's own blood serum (SSCP): DMEM / 10% SSCP / 100 u / ml penicillin (Gibco), 100 u / ml streptomycin (Gibco), 100 u / ml fungizon (Gibco ), or in AIM-V therapeutic medium (Gibco). Cells were washed several times from the medium in Krebs-Ring buffer (Sigma), treated with a solution of 0.25% trypsin / 0.02% EDTA to remove cells from the substrate, 1 ml of Krebs-Ringer was added, the cells were suspended and centrifuged for 5 min at 200 g . The supernatant was discarded, and the cells were resuspended in a new portion of Krebs-Ringer solution for administration to patients.

Для длительного хранения клетки замораживали в среде культивирования с добавлением 15-20% ЭБС и 10% ДМСО.For long-term storage, the cells were frozen in a culture medium with the addition of 15-20% EBS and 10% DMSO.

Для увеличения количества миофибробластов и увеличения "эффекта подтягивания" культуру клеток дополнительно обрабатывали добавлением rhTGF-β1 в концентрации 5 нг/мл в среду культивирования. Перед введением в кожу пациентам аликвоту клеток в среде культивирования собирали и тестировали на присутствие инфекции методом ОТ-ПЦР и в случае отрицательного результата использовали для подготовки к введению. Клетки несколько раз отмывали от среды в буфере Krebs-Ring (Sigma), обрабатывали раствором 0,25% трипсина/0,02% ЭДТА для снятия клеток с подложки, добавляли 1 мл Krebs-Ringer, суспендировали клетки и центрифугировали 5 мин при 200 g. Супернатант сливали, а клетки ресуспендировали в новой порции раствора Krebs-Ringer для введения пациентам.To increase the number of myofibroblasts and increase the “pull-up effect”, the cell culture was further treated by adding rhTGF-β1 at a concentration of 5 ng / ml to the culture medium. Before introducing into the skin of patients, an aliquot of cells in the culture medium was collected and tested for the presence of infection by RT-PCR and, in the case of a negative result, was used to prepare for administration. Cells were washed several times from the medium in Krebs-Ring buffer (Sigma), treated with a solution of 0.25% trypsin / 0.02% EDTA to remove cells from the substrate, 1 ml of Krebs-Ringer was added, the cells were suspended and centrifuged for 5 min at 200 g . The supernatant was discarded, and the cells were resuspended in a new portion of Krebs-Ringer solution for administration to patients.

При введении фибробластов в кожу пациентам необходимо, чтобы количество вводимых фибробластов, полученных вышеописанным способом, было достаточно для достижения максимального терапевтического эффекта, но не превышало оптимальную дозу и не вызывало их склеивания или травмирования ни в капсуле, ни при прохождении через иглу. Оптимальная концентрация, по нашим данным, соответствует 1 миллиону фибробластов в 1 мл физиологического раствора или буфера Krebs-Ring (Sigma). За один сеанс в соответствии с медицинскими показаниями во избежание побочных явлений объем вводимой жидкости при косметических процедурах не должен превышать 10 мл (физ. раствора). Поэтому при на основании поученных данных оптимальная доза вводимых клеток не должна превышать 10 млн клеток в 10 мл физ. раствора за один сеанс.When fibroblasts are introduced into the skin, patients need the number of introduced fibroblasts obtained by the above method to be sufficient to achieve the maximum therapeutic effect, but not exceed the optimal dose and not cause them to stick or injure either in the capsule or when passing through the needle. The optimal concentration, according to our data, corresponds to 1 million fibroblasts in 1 ml of physiological saline or Krebs-Ring buffer (Sigma). In one session, in accordance with medical indications, in order to avoid side effects, the volume of injected liquid during cosmetic procedures should not exceed 10 ml (saline solution). Therefore, based on the data obtained, the optimal dose of introduced cells should not exceed 10 million cells in 10 ml of physical. solution in one session.

Для профилактики и коррекции процесса старения кожи могут использоваться различные способы введения.Various methods of administration can be used to prevent and correct skin aging.

Мультиинъекция - интродермальные инъекции с образованием мелкой папулы диаметром 0,1-0,2 мм для создания «депо» фибробластов с целью удержания их в эпидерме и последующим распределением в ней. Подобная микротравма активизирует процессы микровоспаления в эпидерме, которые в свою очередь стимулируют экспрессию и секрецию факторов роста, синтезируемых вводимыми фибробластами, а также стимулируют синтез гликозоамингликанов и, следовательно, гиалуроновой кислоты, рецепция к которой повышена у фибробластов, полученных заявляемым способом. Подобные инъекции можно выполнять на любых участках кожи, где имеются следы возрастных изменений - морщины, дряблость ткани, провисание, а также в местах с тенденцией к образованию морщин для предупреждения их развития. Папулы делаются на расстоянии примерно 0,5 см друг от друга.Multi-injection - intradermal injection with the formation of a small papule with a diameter of 0.1-0.2 mm to create a "depot" of fibroblasts in order to keep them in the epidermis and subsequent distribution in it. Such a microtrauma activates the processes of microinflammation in the epidermis, which in turn stimulate the expression and secretion of growth factors synthesized by the introduced fibroblasts, and also stimulate the synthesis of glycosoamine glycans and, therefore, hyaluronic acid, the reception of which is increased in fibroblasts obtained by the claimed method. Such injections can be performed on any area of the skin where there are traces of age-related changes - wrinkles, sagging tissue, sagging, and also in places with a tendency to wrinkles to prevent their development. Papules are made at a distance of about 0.5 cm from each other.

Инъекции под мелкие морщины рекомендуется делать с меньшим интервалом между уколами. Папулы должны быть расположены в непосредственной близости друг от друга, практически касаясь одна другой. Подобная частота введения фибробластов сама по себе стимулирует фиброз, который дает эффект «подтирания морщины», что дает дополнительный положительный результат и клинический эффект от вводимых в эту зону фибробластов.Small wrinkle injections are recommended with a shorter interval between injections. Papules should be located in close proximity to each other, practically touching one another. Such a frequency of fibroblast administration in itself stimulates fibrosis, which gives the effect of “wiping wrinkles”, which gives an additional positive result and the clinical effect of fibroblasts introduced into this zone.

Линейный способ заполнения морщин. Этот способ заключается во введении всей иглы подкожно вдоль морщины и инъекции фибробластов по мере извлечения иглы. Этот способ может быть использован не только при коррекции глубоких мимических морщин, но также при введении фибробластов по контуру овала лица и в местах выраженного прободения ткани.A linear way to fill in wrinkles. This method consists in introducing the entire needle subcutaneously along wrinkles and injecting fibroblasts as the needle is removed. This method can be used not only for the correction of deep facial wrinkles, but also for the introduction of fibroblasts along the contour of the oval of the face and in places of pronounced perforation of the tissue.

В местах прободения эпидермы, как правило, в зонах боковых поверхностей лица под скулой, целесообразно вводить фибробласты по параллельным, а затем по перпендикулярным линиями по всей длине иглы, формируя «сетку». Ширина между линиями введения зависит от размера восстанавливаемой области и может быть от 0,2-0,4 мм и более.In places where the epidermis is perforated, as a rule, in areas of the lateral surfaces of the face under the cheekbone, it is advisable to introduce fibroblasts along parallel and then along perpendicular lines along the entire length of the needle, forming a “mesh”. The width between the lines of administration depends on the size of the restored area and can be from 0.2-0.4 mm or more.

Комбинированный метод - это сочетание одновременно нескольких способов введения фибробластов. Такой подход приводит к хорошим результатам при терапии глубоких мимических морщин при терапии в нижней части лица, в местах «провисания» кожи и в области декольте.The combined method is a combination of several methods of introducing fibroblasts simultaneously. This approach leads to good results in the treatment of deep facial wrinkles during therapy in the lower part of the face, in places of “sagging” of the skin and in the decollete.

Все перечисленные методы введения фибробластов могут применяться для любых участков дермы. Исключения составляют невусы, новообразования, келоидные рубцы.All of the above methods for the introduction of fibroblasts can be used for any part of the dermis. Exceptions are nevi, neoplasms, keloid scars.

Введение фибробластов совместно с гиалуроновой кислотой.The introduction of fibroblasts in conjunction with hyaluronic acid.

При введении в кожу пациентам выращенные заявляемым способом фибробласты могут быть смешаны с гиалуроновой кислотой и физраствором в определенных пропорциях или только с гиалуроновой кислотой или введение фибробластов может сопровождаться инъекциями гиалуроновой кислоты. Культивируемые в условиях in vitro фибробласты обладают повышенной экспрессией рецептора к гиалуроновой кислоте (экспрессируют рецептор CD44 на поверхности мембраны). Гиалуроновая кислота участвует в процессах регуляции клеточной пролиферации, миграции и регенерации тканей, а также является важным регулятором ангиогенеза и участвует в удержании воды в эпидерме. За счет своей вязкости гиалуроновая кислота может «задерживать» фибробласты в зоне инъекции, а также обеспечивать лучшее взаимодействие фибробластов с компонентами внеклеточного матрикса, тем самым повышая выживаемость вводимых клеток в условиях in situ. Совместное введение фибробластов с гиалуроновой кислотой возможно по всем перечисленным выше методикам.When introduced into the skin of patients, the fibroblasts grown by the claimed method can be mixed with hyaluronic acid and saline in certain proportions or only with hyaluronic acid, or the introduction of fibroblasts can be accompanied by injections of hyaluronic acid. In vitro cultured fibroblasts have increased expression of the hyaluronic acid receptor (expressing the CD44 receptor on the membrane surface). Hyaluronic acid is involved in the regulation of cell proliferation, migration and tissue regeneration, and is also an important regulator of angiogenesis and is involved in the retention of water in the epidermis. Due to its viscosity, hyaluronic acid can “retain” fibroblasts in the injection zone, as well as provide better interaction of fibroblasts with the components of the extracellular matrix, thereby increasing the survival of the introduced cells in situ. The joint introduction of fibroblasts with hyaluronic acid is possible according to all the methods listed above.

Исследования проводились на добровольцах в возрасте от 35 до 60 лет. Положительный результат при введении фибробластов в кожу пациентов описанным способом с целью предупреждения и коррекции возрастных изменений проявляется не сразу, а спустя 3-5 недель после инъекции. При введении суммарной дозы фибробластов 5-7 млн в объеме 5-7 мл на лицо у большинства пациентов омолаживающий эффект сохранялся в течение 1,5-2 года (общий срок наблюдений составил 2 года). Учитывая особенности биохимических процессов в коже (активность факторов ангиогенеза и интенсивность обменных процессов во внеклеточном матриксе), повторную процедуру введения фибробластов целесообразно проводить не ранее чем через 4 месяца. Процедуру рекомендуется повторять только пациентам с выраженными возрастными изменениями в коже, при глубоких морщинах и выраженной дряблости, используя описанные оптимизированные концентрации фибробластов в соответствующем объеме физ. раствора.The studies were conducted on volunteers aged 35 to 60 years. A positive result with the introduction of fibroblasts into the skin of patients in the described manner with the aim of preventing and correcting age-related changes is not immediately apparent, but 3-5 weeks after injection. With the introduction of a total dose of 5-7 million fibroblasts in a volume of 5-7 ml per face in most patients, the rejuvenating effect persisted for 1.5-2 years (the total observation period was 2 years). Given the peculiarities of biochemical processes in the skin (the activity of angiogenesis factors and the intensity of metabolic processes in the extracellular matrix), it is advisable to carry out a repeated procedure for the introduction of fibroblasts no earlier than 4 months later. The procedure is recommended to be repeated only to patients with pronounced age-related changes in the skin, with deep wrinkles and pronounced sagging, using the described optimized concentrations of fibroblasts in an appropriate volume of physical. solution.

Для подтверждения достигаемого эффекта нами были проведены исследования, при которых клетки выделяли из биоптатов кожи с внутренней поверхности предплечья у 10 здоровых женщин в возрасте от 30 до 60 лет. Выделенные клетки культивировали вышеописанным способом и анализировали на ранних и поздних пассажах. Оценка фенотипа, экспрессии и секреции различных факторов проводилась методом иммуногистохимии с использованием панели специфических антител. Типирование клеток, анализ экспрессионной активности в этих клетках и в среде культивирования проводили на разных пассажах, начиная с 5 и до 15 пассажа.To confirm the achieved effect, we conducted studies in which cells were isolated from skin biopsies from the inner surface of the forearm in 10 healthy women aged 30 to 60 years. The isolated cells were cultured as described above and analyzed in the early and late passages. Assessment of the phenotype, expression and secretion of various factors was carried out by immunohistochemistry using a panel of specific antibodies. Cell typing, analysis of expression activity in these cells and in the culture medium was carried out in different passages, starting from 5 to 15 passage.

Перед окрашиванием клетки фиксировали в 4% формалине (Sigma) 4 мин при комнатной температуре, затем обрабатывали 0,2% Triton X100 в течение 10 минут. Затем промывали PBS буфером (137 мМ NaCl, 2,7 мМ KCl, 4,3 мМ Na₂HPO₄·2H₂O, 1,4 мМ KH₂PO₄) и инкубировали в 1% растворе БСА (бычий сывороточный альбумин), содержащего 10% сыворотки донора вторых антител для забивки неспецифического связывания (60 минут). Далее на клетки наносили соответствующие первые антитела против исследуемого антигена на 60 минут. После отмывки в PBS клетки помещали в раствор вторых антител, конъюгированных с флюорохромом Alexa 595 (Molecular Probes), на 1% растворе БСА и инкубировали в течение 60 мин. Для визуализации ядер клетки докрашивали флюоресцентым красителем DAPI (Dako). После отмывки в PBS клетки заключали в среду Mounting Medium Vectashield (Vector Laboratories Inc.). Готовые препараты хранили при +4°С в темноте. Полученные препараты анализировали при помощи флуоресцентного микроскопа Axiovert 200M (Zeiss). Документирование изображений производили с помощью цифровой видеокамеры Ахюсат HRC (Zeiss, Германия) и обработки изображения в программе Axiovision 3.1.Before staining, the cells were fixed in 4% formalin (Sigma) for 4 minutes at room temperature, then treated with 0.2% Triton X100 for 10 minutes. Then washed with PBS buffer (137 mm NaCl, 2.7 mm KCl, 4.3 mm Na ₂ HPO ₄ · 2H ₂ O, 1.4 mm KH ₂ PO ₄ ) and incubated in 1% solution of BSA (bovine serum albumin), containing 10% of the serum of the donor of the second antibodies for clogging non-specific binding (60 minutes). Next, the corresponding first antibodies against the test antigen were applied to the cells for 60 minutes. After washing in PBS, the cells were placed in a solution of the second antibodies conjugated with fluorochrome Alexa 595 (Molecular Probes) in a 1% BSA solution and incubated for 60 min. To visualize nuclei, cells were stained with DAPI fluorescent dye (Dako). After washing in PBS, the cells were enclosed in Mounting Medium Vectashield (Vector Laboratories Inc.). Finished preparations were stored at + 4 ° C in the dark. The resulting preparations were analyzed using an Axiovert 200M fluorescence microscope (Zeiss). Image documentation was performed using the Achiusat HRC digital video camera (Zeiss, Germany) and image processing using Axiovision 3.1 software.

Культивируемые клетки были протестированы с помощью панели маркеров, характерных для разных типов клеток. Основной тип выделяемых клеток соответствует фибробластам клеткам мезенхимального происхождения, так как культивируемые клетки экспрессируют два стандартных маркера фибробластов - CD90 и виментин. Результаты исследований приведены в Таблице и на фиг.2.Cultured cells were tested using a panel of markers characteristic of different types of cells. The main type of secreted cells corresponds to fibroblasts of cells of mesenchymal origin, since cultured cells express two standard fibroblast markers - CD90 and vimentin. The research results are shown in the Table and figure 2.

Как видно из Таблицы, получаемая популяция является гетерогенной. Анализ клеточных популяций на присутствие зрелых кератиноцитов и стволовых клеток базального слоя эпидермиса показал, что в целом ряде образцов присутствуют β1-интегрин-позитивные клетки, которые представляют собой либо стволовые клетки базального слоя эпидермиса, либо гематопоэтические предшественники.As can be seen from the Table, the resulting population is heterogeneous. Analysis of cell populations for the presence of mature keratinocytes and stem cells of the basal layer of the epidermis showed that β1-integrin-positive cells, which are either stem cells of the basal layer of the epidermis or hematopoietic precursors, are present in a number of samples.

Тестируя культуру клеток на наличие гемопоэтических и эндотелиальных предшественников разной степени дифференцировки, были проанализированы антигены CD34, CD 105 и VE-кадгерин. В одном случае были обнаружены CD34 и VE-кадгерин-позитивные клетки; клетки из этого образца отличались высокой степенью роста в культуре, а терапия фибробластами была высоко эффективной. Все исследованные образцы были CD105 негативны, то есть не содержали эндотелиальных предшественников, экспрессирующих CD105. Эти данные показывают, что получаемая при длительном пассировании культура клеток гетерогенна и в ней могут присутствовать стволовые клетки базального слоя эпидермиса и гематопоэтические предшественники, а также, возможно, зрелые эндотелиальные клетки.Testing cell culture for the presence of hematopoietic and endothelial precursors of different degrees of differentiation, the CD34, CD 105 and VE-cadherin antigens were analyzed. In one case, CD34 and VE-cadherin-positive cells were detected; cells from this sample were characterized by a high degree of growth in culture, and fibroblast therapy was highly effective. All tested samples were CD105 negative, that is, did not contain endothelial precursors expressing CD105. These data show that the cell culture obtained by prolonged passage is heterogeneous and may contain stem cells of the basal layer of the epidermis and hematopoietic precursors, as well as, possibly, mature endothelial cells.

Для характеристики функциональной активности культивируемых клеток фибробласты тестировались на способность продуцировать компоненты внеклеточного матрикса: коллаген I типа, тропоэластин, коллаген IV типа и фибронектин (Таблица).To characterize the functional activity of cultured cells, fibroblasts were tested for their ability to produce extracellular matrix components: type I collagen, tropoelastin, type IV collagen, and fibronectin (Table).

Нами было выявлено, что культивируемые предлагаемым способом фибробласты активно синтезируют предшественник коллагена I типа - проколлаген I типа (фиг.3). Наиболее интенсивное окрашивание соответствует локализации аппарата Гольджи в цитоплазме и во внеклеточном матриксе. Известно, что старение кожи связанно со старением коллагена, что выражается в увеличении количества поперечных сшивок между фибриллами коллагена. Введение культивированных фибробластов в кожу позволяет активизировать процесс синтеза коллагена, что позитивно влияет на состояние внеклеточного матрикса и упругость кожи.We found that the fibroblasts cultured by the proposed method actively synthesize the type I collagen precursor, type I procollagen (Fig. 3). The most intense staining corresponds to the localization of the Golgi apparatus in the cytoplasm and in the extracellular matrix. It is known that aging of the skin is associated with aging of collagen, which is expressed in an increase in the number of cross-links between collagen fibrils. The introduction of cultured fibroblasts into the skin allows you to activate the process of collagen synthesis, which positively affects the state of the extracellular matrix and skin elasticity.

Широко известно, что синтез эластина постепенно прекращается по мере старения организма, что является одной из причин потери эластичности кожи и сосудов. Тропоэластин является компонентом эластиновых волокон и продуцируется при синтезе эластина de novo. Нами впервые было обнаружено, что культивируемые клетки синтезируют значительные количества тропоэластина (фиг.3). Эти данные свидетельствуют о том, что позитивный эффект, который оказывают фибробласты при введении в кожу, обусловлен также накоплением эластина во внеклеточном матриксе.It is widely known that the synthesis of elastin gradually ceases as the body ages, which is one of the reasons for the loss of elasticity of the skin and blood vessels. Tropoelastin is a component of elastin fibers and is produced during the synthesis of elastin de novo. We first discovered that cultured cells synthesize significant amounts of tropoelastin (figure 3). These data indicate that the positive effect of fibroblasts when introduced into the skin is also due to the accumulation of elastin in the extracellular matrix.

Обнаружено, что фибробласты в культуре синтезируют коллаген IV типа (фиг.3), который является основным компонентом базальной мембраны. Старение часто сопровождается нарушением состава или целостности базальной мембраны, поэтому синтез и секреция коллагена IV типа при введении в кожу культивируемых фибробластов способствует поддержанию нормальной организации дермы и эпидермиса.It was found that fibroblasts in culture synthesize type IV collagen (Fig. 3), which is the main component of the basement membrane. Aging is often accompanied by a violation of the composition or integrity of the basement membrane; therefore, the synthesis and secretion of type IV collagen when introduced into the skin of cultured fibroblasts helps maintain the normal organization of the dermis and epidermis.

Из литературы известно, что нарушения синтеза фибронектина возникают при старении кожи, а также в культуре при длительном культивировании фибробластов. Фибробласты, культивируемые до 15 пассажа, синтезируют фибронектин во внеклеточный матрикс Вероятно, фибронектин, синтезируемый во внеклеточный матрикс, стимулирует миграцию макрофагов и лимфоцитов, клеток, секретирующих большое количество цитокинов и факторов роста, что активизирует обменные процессы в коже.From the literature it is known that violations of fibronectin synthesis occur during aging of the skin, as well as in culture during prolonged cultivation of fibroblasts. Fibroblasts cultivated before passage 15 synthesize fibronectin into the extracellular matrix. Probably, fibronectin synthesized into the extracellular matrix stimulates the migration of macrophages and lymphocytes, cells secreting a large number of cytokines and growth factors, which activates metabolic processes in the skin.

Суммируя полученные данные в Таблице, можно сделать вывод о том. что фибробласты в культуре синтезируют компоненты внеклеточного матрикса: коллагены I и IV типа, фибронектин. Особенно следует подчеркнуть важность синтеза тропоэластина в условиях in vitro, так как синтез тропоэластина de novo в нормальных условиях практически отсутствует и активируется в коже только при повреждении.Summing up the data in the Table, we can conclude that. that fibroblasts in culture synthesize the components of the extracellular matrix: type I and IV collagens, fibronectin. Especially it should be emphasized the importance of the synthesis of tropoelastin in vitro, since the synthesis of tropoelastin de novo under normal conditions is practically absent and is activated in the skin only when damaged.

Исследуя далее функциональную активность культивируемых предложенным способом кожных фибробластов, мы оценили их способность экспрессировать рецептор гиалуроновой кислоты CD44. Оказалось, что во всех образцах обнаружена 100% окраска на этот антиген (фиг.4). Известно, что гиалуроновая кислота является важнейшим компонентом внеклеточного матрикса, участвующим в поддержании тургора кожи, и ее содержание в коже снижается по мере старения. Введение клеток, экспрессирующих рецептор к гиалуроновой кислоте, способствует удержанию гиалуроновой кислоты в дерме в зоне введения и увлажнению кожи. Совместное введение культивируемых фибробластов и гиалуроновой кислоты в кожу пациентов повышает выживаемость фибробластов в коже в условиях in situ.Further investigating the functional activity of skin fibroblasts cultured by the proposed method, we evaluated their ability to express CD44 hyaluronic acid receptor. It turned out that in all samples detected 100% color on this antigen (figure 4). It is known that hyaluronic acid is an essential component of the extracellular matrix involved in maintaining skin turgor, and its content in the skin decreases with aging. The introduction of cells expressing the receptor for hyaluronic acid, helps to retain hyaluronic acid in the dermis in the injection area and moisturize the skin. The combined introduction of cultured fibroblasts and hyaluronic acid into the skin of patients increases the survival of fibroblasts in the skin in situ.

Методом электрофореза с последующим иммуноблоттингом мы оценивали экспрессию рецептора к трансформирующему фактору роста бета (TGF-β1) - ключевому регулятору синтеза белков матрикса. Оказалось, что культивируемы фибробласты не имеют рецептора TGF-β1, что позволяет предполагать, что стимуляция синтеза компонентов внеклеточного матрикса запускается в фибробластах через другой рецептор. Известно, что TGF-β1 стимулирует формирование фиброза в коже. В фетальной коже TGF-β1 практически не обнаруживается, что обуславливает безрубцовое заживление ран. Отсутствие рецептора к TGF-β1 на фибробластах позволяет предполагать, что введение этих клеток в кожу пациентам не будет приводить к осложнениям в виде фиброза.By electrophoresis followed by immunoblotting, we evaluated the expression of the receptor for transforming growth factor beta (TGF-β1), a key regulator of the synthesis of matrix proteins. It turned out that cultured fibroblasts do not have a TGF-β1 receptor, which suggests that stimulation of the synthesis of extracellular matrix components is triggered in fibroblasts through another receptor. TGF-β1 is known to stimulate the formation of fibrosis in the skin. In fetal skin, TGF-β1 is practically not detected, which leads to scarless wound healing. The lack of a receptor for TGF-β1 on fibroblasts suggests that the introduction of these cells into the skin of patients will not lead to complications in the form of fibrosis.

Обобщая полученные результаты можно заключить, что:Summarizing the results obtained, we can conclude that:

1. Клетки, полученные из кожных биоптатов и культивированные до 5-15 пассажей, по морфологическим характеристикам и экспрессии антигенов в подавляющем большинстве соответствуют фибробластам. Часть клеток имеет выраженный сократительный фенотип и соответствуют миофибробластам. Небольшое количество клеток имеет характеристики клеток-предшественников.1. Cells obtained from skin biopsies and cultured up to 5-15 passages, in terms of morphological characteristics and expression of antigens, in the vast majority correspond to fibroblasts. Some cells have a pronounced contractile phenotype and correspond to myofibroblasts. A small number of cells have the characteristics of progenitor cells.

2. Клетки имеют высокий уровень секреторной активности и продуцируют проколлаген I типа, коллаген IV типа, фибронектин и тропоэластин - компоненты адгезивной системы клетки и внеклеточного матрикса, участвующие в поддержании тургора и эластичности кожи.2. Cells have a high level of secretory activity and produce type I procollagen, type IV collagen, fibronectin and tropoelastin - components of the adhesive system of the cell and extracellular matrix, which are involved in maintaining turgor and skin elasticity.

3. Практически все клетки экспрессируют рецептор гиалуроновой кислоты (CD44).3. Almost all cells express a hyaluronic acid receptor (CD44).

4. В процессе культивирования, начиная с 5 и по 15 пассаж, изменений в уровне экспрессии изучаемых антигенов нет.4. During the cultivation process, starting from passage 5 and passage 15, there are no changes in the expression level of the studied antigens.

5. Введение аутологических фибробластов, выделенных из кожных биоптатов и культивируемых in vitro в кожу пациентов для коррекции морщин и с целью омоложения, оказывает позитивный эффект и может быть использовано для терапии возрастных изменений кожи в косметологии.5. The introduction of autologous fibroblasts isolated from skin biopsies and cultured in vitro into the skin of patients to correct wrinkles and to rejuvenate has a positive effect and can be used to treat age-related skin changes in cosmetology.

Полученные результаты позволяют предполагать, что терапевтический (омолаживающий) эффект при аутотрансплантации кожных фибробластов обусловлен тем, что в течение определенного времени после введения в кожу фибробласты сохраняют способность синтезировать компоненты внеклеточного матрикса - коллагены, тропоэластин и фибронектин, а также способность удерживать гиалуроновую кислоту за счет высокого уровня экспрессии рецептора CD44 на поверхности. Определенный вклад в терапевтический эффект может вносить и присутствие в культуре клеток-предшественников - стволовых клеток базального слоя эпидермиса и CD34 позитивных клеток.The obtained results suggest that the therapeutic (anti-aging) effect of autologous skin fibroblast transplantation is due to the fact that for a certain time after the introduction of fibroblasts into the skin, they retain the ability to synthesize extracellular matrix components - collagens, tropoelastin and fibronectin, as well as the ability to retain hyaluronic acid due to the high surface expression level of CD44 receptor. The presence of progenitor cells — stem cells of the basal layer of the epidermis and CD34 positive cells — can also contribute to the therapeutic effect.

ТаблицаTable CD90Cd90 Маркер фибробластовFibroblast marker ++ виментинvimentin Стандартный маркер цитоскелета клеток мезенхимального происхожденияStandard cytoskeletal marker of cells of mesenchymal origin ++ пан-кератинpan keratin Накапливается в кератиноцитах при созреванииAccumulates in keratinocytes during maturation ±± β1 интегринβ1 integrin Экспрессируется на стволовых клетках базального слоя эпидермисаExpressed on stem cells of the basal layer of the epidermis ±± CD 105CD 105 Рецептор TGFβ; экспессируется на незрелых эндотелиальных клеткахTGFβ receptor; expresses on immature endothelial cells -- α-актинα-actin Характерен для клеток сократительного фенотипаCharacteristic of contractile phenotype cells ±± проколлаген I типаtype I procollagen Синтезируется и секретируется фибробластами во внеклеточный матриксSynthesized and secreted by fibroblasts in the extracellular matrix ++ тропоэластинtropoelastin Синтезируется фибробластами и образует эластинIt is synthesized by fibroblasts and forms elastin. ++ коллаген IV типаtype IV collagen Основной компонент базальных мембранThe main component of the basement membranes ±± фибронектинfibronectin Компонент внеклеточного матрикса; его количество увеличивается при повреждении, старении кожи и длительном культивировании фибробластовExtracellular matrix component; its amount increases with damage, aging of the skin and prolonged cultivation of fibroblasts ++ HGF-αHGF-α Фактор роста - стимулирует ангиогенез, предотвращает апоптозGrowth factor - stimulates angiogenesis, prevents apoptosis -- CD44CD44 Рецептор гиалуроновой кислоты, компонента внеклеточного матриксаHyaluronic acid receptor, a component of the extracellular matrix ++ TGFβ1 рецепторTGFβ1 receptor Рецептор, регулирующий экспрессию внеклеточного матрикса. Фактор фиброзаExtracellular matrix expression receptor. Fibrosis factor -- CD34Cd34 Маркер гематопоэтических и эндотелиальных клеток-предшественников; может выявляться в разных типах стволовых клеток в норме и при патологииMarker of hematopoietic and endothelial progenitor cells; can be detected in different types of stem cells in normal and pathological conditions ±± VE-кадгеринVe cadherin Маркер зрелых эндотелиальных клетокMature endothelial cell marker ±±

Claims (2)

1. Способ культивирования фибробластов для заместительной терапии, включающий выделение клеток и инкубирование в питательной среде, отличающийся тем, что выделение фибробластов осуществляют из биоптатов кожи человека путем ферментативной обработки в растворе DMEM/5% ЭБС/0,2% диспазы/0.1 мг/мл коллагеназы I типа при постоянном помешивании и пипетировании при температуре 37°С в течение 1,5 ч в стерильных условиях, полученную суспензию клеток центрифугируют 5 мин при 200 g, супернатант сливают, осевшие клетки ресуспендируют в среде DMEM/10% ЭБС/100 ед/мл пенициллина, 100 ед/мл стрептомицина, 100 ед/мл фунгизона и высевают на чашки, затем фибробласты переводят на длительное культивирование в среде с собственной сывороткой крови пациента: DMEM/10% ССКП/100 ед/мл стрептомицина, 100 ед/мл фунгизона или в терапевтической среде AIM-V, перед введением пациентам клетки несколько раз отмывают в буфере Krebs-Ring, обрабатывают раствором 0,25% трипсина/0,02% ЭДТА для снятия клеток с подложки, добавляют 1 мл Krebs-Ringer, центрифугируют 5 мин при 200 g, супернатант сливают, клетки ресуспендируют в новой порции раствора Krebs-Ringer для введения пациентам.1. A method of cultivating fibroblasts for replacement therapy, including the selection of cells and incubation in a nutrient medium, characterized in that the selection of fibroblasts is carried out from biopsies of human skin by enzymatic treatment in a solution of DMEM / 5% EBS / 0.2% dispase / 0.1 mg / ml type I collagenase with constant stirring and pipetting at 37 ° C for 1.5 hours under sterile conditions, the resulting cell suspension is centrifuged for 5 min at 200 g, the supernatant is drained, the settled cells are resuspended in DMEM / 10% EBS / 100 u / ml ne nitsillin, 100 u / ml streptomycin, 100 u / ml fungizon and plated on cups, then the fibroblasts are transferred to long-term cultivation in a medium with the patient’s own blood serum: DMEM / 10% SSCP / 100 u / ml streptomycin, 100 u / ml fungicone or in AIM-V therapeutic medium, before administration to patients, cells are washed several times in Krebs-Ring buffer, treated with a solution of 0.25% trypsin / 0.02% EDTA to remove cells from the substrate, 1 ml of Krebs-Ringer is added, centrifuged for 5 min at 200 g, the supernatant is drained, the cells are resuspended in a new portion of Krebs-Ringer solution for administration niy to patients. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что культивированные фибробласты дополнительно обрабатывали добавлением rhTGF-β1 в концентрации 5 нг/мл в среду культивирования.2. The method according to claim 1, characterized in that the cultured fibroblasts are further processed by adding rhTGF-β1 at a concentration of 5 ng / ml to the culture medium.

Images