JP5340564B2 - Artificial skin and method for producing the same - Google Patents
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Description
本発明は人工皮膚およびその製造方法に関し、詳しくは、皮膚付属器を有し、皮膚移植用材料、ヒト皮膚の代替試験用、育毛剤および育毛有効成分の試験用として有用な人工皮膚およびその製造法に関するものである。 The present invention relates to artificial skin and a method for producing the same, and more particularly, to an artificial skin having a skin appendage and useful as a skin transplantation material, a human skin substitute test, a hair restorer, and a hair restorer active ingredient test. It is about the law.
従来、人工皮膚の製造方法としては、線維芽細胞をコラーゲン・ゲルに包埋して培養し、その上層に表皮角化細胞を播種することによりシャーレ内にて三次元的に培養皮膚を製造する方法が一般的に用いられている（非特許文献１）。また、シャーレ内ではなく、非ヒト動物の皮膚切開部に細胞を播種することにより培養皮膚を製造する方法についても報告されている（非特許文献２、特許文献１）。また、細胞材料として線維芽細胞と表皮角化細胞の他に毛乳頭細胞を用いて人工皮膚を製造する方法も報告されている（特許文献２） Conventionally, as a method for producing artificial skin, fibroblasts are embedded in collagen gel and cultured, and epidermal keratinocytes are seeded on the upper layer to produce cultured skin three-dimensionally in a petri dish. The method is generally used (Non-Patent Document 1). In addition, a method for producing cultured skin by seeding cells not in a petri dish but in a skin incision part of a non-human animal has also been reported (Non-Patent Document 2, Patent Document 1). In addition, a method for producing artificial skin using dermal papilla cells in addition to fibroblasts and epidermal keratinocytes as a cell material has been reported (Patent Document 2).
しかし、上記従来の方法で製造される組織には、毛包、皮脂腺、汗腺などの皮膚付属器は存在しない。また、特開２００５−３０５１７７号公報（特許文献２）で得られる人工組織は組織付属器官様構造体を含むとされているものの、文献中の実施例の結果の細胞像において毛包細胞塊として示されている箇所は別の組織である可能性が高く、実証はなされていないと推測される。生体皮膚組織中の毛包の毛球部では間葉系細胞の周囲を上皮系細胞が取り囲む構造をしているものであるが、特開２００５−３０５１７７号の図１、２はそのような構造をとっておらず、単なる上皮細胞の塊である。また図３、４で毛包様細胞塊と呼ばれている構造物についても間葉系細胞とのコンタクトは見られない。更に、毛包原基であるならば表皮と真皮の接触面に位置するはずであるが、この構造物は表皮中に存在するため明らかに毛包ではない。従って、組織付属器を有する人工皮膚をつくる技術はこれまでに報告されていなかった。 However, there are no skin appendages such as hair follicles, sebaceous glands, and sweat glands in the tissue produced by the conventional method. Moreover, although the artificial tissue obtained by Unexamined-Japanese-Patent No. 2005-305177 (patent document 2) is supposed to contain a structure | tissue appendage-like structure body, in the cell image of the result of the Example in literature, as a hair follicle cell mass, It is highly probable that the part shown is another organization and has not been demonstrated. The hair bulb portion of the hair follicle in the living skin tissue has a structure in which epithelial cells surround the mesenchymal cells. FIGS. 1 and 2 of JP-A-2005-305177 show such a structure. It is just a mass of epithelial cells. In addition, in the structures called hair follicle-like cell clusters in FIGS. 3 and 4, contact with mesenchymal cells is not observed. Further, if it is a hair follicle primordium, it should be located at the contact surface between the epidermis and the dermis, but this structure is clearly not a hair follicle because it exists in the epidermis. Therefore, no technique for producing artificial skin having a tissue appendage has been reported so far.
このため、現在火傷などで皮膚を損傷した患者の治療に利用される人工皮膚は、「皮膚付属器の存在しない人工皮膚」であったが、水分や脂質の蒸散などの機能面や皮膚の外見面から「皮膚付属器の存在する人工皮膚」を作成する技術の開発が切望されていた。すなわち、本発明の目的は、皮膚付属器の存在する人工皮膚を提供することにある。 For this reason, the artificial skin that is currently used to treat patients whose skin has been injured due to burns etc. was `` artificial skin without the skin appendages '', but functional aspects such as moisture and lipid transpiration and appearance of the skin From the aspect, the development of technology to create “artificial skin with skin appendages” was eagerly desired. That is, an object of the present invention is to provide an artificial skin having a skin appendage.
発明者は従来からある人工皮膚形成法（非特許文献２）を参考にし、非ヒト動物の皮膚切除部位にヒト線維芽細胞及び表皮角化細胞を播種し人工皮膚を作成した。本皮膚は表面が滑らかでヒトの生体皮膚に近い外観をしており表皮及び真皮構造を有していたが、毛包、皮脂腺などの皮膚付属器は有していなかった。 The inventor referred to a conventional artificial skin formation method (Non-Patent Document 2), and seeded human fibroblasts and epidermal keratinocytes at the skin excision site of a non-human animal to prepare artificial skin. This skin had a smooth surface and an appearance similar to that of human skin, and had an epidermis and dermis structure, but no skin appendages such as hair follicles and sebaceous glands.
線維芽細胞及び、角化細胞を用いた既存の方法において皮膚付属器が形成されない理由は「既に分化の方向性が決定している細胞を用いていること」ではないかと発明者は考えた。そこで発明者は、人工皮膚の構築にあたっての未分化な細胞の利用に着目した。近年、脂肪組織に成体幹細胞が多く含まれることが発見されていること、また皮下脂肪より比較的容易に吸引脂肪液を得ることができる簡便性から、脂肪由来幹細胞を用いた「皮膚付属器の存在する人工皮膚」の形成を試みた。その結果、脂肪由来幹細胞、表皮細胞、および真皮細胞を用いることにより皮膚付属器形成能を有する人工皮膚を製造することが可能であることを見出した。本発明は係る知見に基づくものである。 The inventor thought that the reason why the skin appendages were not formed in the existing method using fibroblasts and keratinocytes was that “the cells whose direction of differentiation had already been determined were used”. Therefore, the inventor paid attention to the use of undifferentiated cells in constructing artificial skin. In recent years, it has been discovered that adipose tissue contains many adult stem cells, and because it is easy to obtain aspirated lipids more easily than subcutaneous fat, Attempted to form “existing artificial skin”. As a result, it has been found that artificial skin having the ability to form a skin appendage can be produced by using fat-derived stem cells, epidermal cells, and dermal cells. The present invention is based on such knowledge.
本発明は以下の発明を提供するものである。
〔１〕 脂肪由来幹細胞、表皮ケラチノサイト、および線維芽細胞を含む、皮膚付属器形成能を有する培養細胞塊。
〔２〕 脂肪由来幹細胞、表皮ケラチノサイト、および線維芽細胞を含み、皮膚付属器を有する人工皮膚。
〔３〕 皮膚移植用材料である、〔２〕に記載の人工皮膚。
〔４〕 ヒト皮膚の代替試験用である、〔２〕に記載の人工皮膚。
〔５〕 育毛剤および育毛有効成分の試験用である、〔２〕に記載の人工皮膚。
〔６〕 脂肪由来幹細胞、表皮ケラチノサイト、および線維芽細胞を共培養することを特徴とする、皮膚付属器を有する人工皮膚の製造方法。
〔７〕 前記共培養は、脂肪由来幹細胞、表皮ケラチノサイト、および線維芽細胞をコラーゲン・ゲルに懸濁して行う、〔６〕に記載の人工皮膚の製造方法。
〔８〕 脂肪由来幹細胞、表皮ケラチノサイト、および線維芽細胞を懸濁させたコラーゲン・ゲルをヒト以外の動物の皮膚切除部位に注入することにより共培養する、〔６〕または〔７〕に記載の人工皮膚の製造方法。
The present invention provides the following inventions.
[1] A cultured cell mass having the ability to form a skin appendage, including adipose-derived stem cells, epidermal keratinocytes, and fibroblasts.
[2] Artificial skin comprising adipose-derived stem cells, epidermal keratinocytes, and fibroblasts and having a skin appendage.
[3] The artificial skin according to [2], which is a material for skin transplantation.
[4] The artificial skin according to [2], which is for a human skin substitute test.
[5] The artificial skin according to [2], which is used for testing a hair restoring agent and a hair restoring active ingredient.
[6] A method for producing artificial skin having a skin appendage, comprising co-culturing adipose-derived stem cells, epidermal keratinocytes, and fibroblasts.
[7] The method for producing artificial skin according to [6], wherein the co-culture is performed by suspending fat-derived stem cells, epidermal keratinocytes, and fibroblasts in a collagen gel.
[8] The culture according to [6] or [7], wherein co-culture is performed by injecting a collagen gel in which fat-derived stem cells, epidermal keratinocytes, and fibroblasts are suspended into a skin resection site of a non-human animal. A method for producing artificial skin.
本発明によれば、皮膚付属器形成能を有し、人工皮膚の調製に適した培養細胞塊が提供される。また、皮膚付属器を有する人工皮膚、および皮膚付属器を有する人工皮膚を効率よく製造するための方法も提供される。 According to the present invention, a cultured cell mass having a skin appendage forming ability and suitable for the preparation of artificial skin is provided. Also provided are artificial skin having a skin appendage and a method for efficiently producing artificial skin having a skin appendage.
従って、本発明によれば、皮膚移植用材料、ヒト皮膚の代替試験用材料、育毛剤および育毛有効成分の試験用としての人工皮膚が提供される。更には、自身の細胞を用いて構築した皮膚付属器を有する人工皮膚を用い、育毛試験や皮膚の保湿試験を行い、自身に適した育毛剤や保湿剤などを選択できるオーダーメイド医療への応用も可能である。 Therefore, according to the present invention, a skin graft material, a human skin substitute test material, a hair restorer, and an artificial skin for testing a hair restorer active ingredient are provided. In addition, using artificial skin with skin appendages constructed using its own cells, hair growth tests and skin moisturizing tests can be performed, and it is possible to select suitable hair restoring agents and moisturizing agents, etc. Is also possible.
また皮膚刺激性試験、薬剤経皮吸収性試験に現行の「皮膚付属器の存在しない人工皮膚」が使われているが、より生体皮膚に近い条件の備わった人工皮膚を用いることにより現実に近い試験が期待できる。 In addition, the current “artificial skin without skin appendages” is used for skin irritation tests and drug transdermal absorbability tests, but it is closer to reality by using artificial skin with conditions closer to living skin. The test can be expected.
〔培養細胞塊〕
本発明の培養細胞塊は、脂肪由来幹細胞、表皮ケラチノサイト、および線維芽細胞を含むことを特徴とする。
[Cultivated cell mass]
The cultured cell mass of the present invention is characterized by containing adipose-derived stem cells, epidermal keratinocytes, and fibroblasts.
本発明における脂肪由来幹細胞とは、脂肪組織に含まれる幹細胞である。 The adipose-derived stem cells in the present invention are stem cells contained in adipose tissue.
幹細胞とは、多分化能を有する細胞を意味する。例えば骨組織、軟骨組織、筋肉組織などの各組織を構成する細胞への分化能をも保持するものを挙げることができる。これらの各組織を構成する細胞への分化の確認は、各種組織化学的染色法、例えば、Ｖｏｎ Ｋｏｓｓａ染色、アルシアンブルー染色、ミオシン抗体染色法、ＭｙｏＤ１抗体染色などにより行うことができる。 A stem cell means a cell having multipotency. Examples thereof include those that retain the ability to differentiate into cells constituting each tissue such as bone tissue, cartilage tissue, and muscle tissue. Confirmation of differentiation into cells constituting each tissue can be performed by various histochemical staining methods such as Von Kossa staining, Alcian blue staining, myosin antibody staining method, MyoD1 antibody staining, and the like.
脂肪組織とは、脂肪細胞により構成される生体組織の一種である。脂肪組織の生物由来は特に限定されず、ヒトのほかマウス、ラットなどの実験動物等の非ヒト動物であってもよい。また、生物の年齢、性別は特に限定されない。また、脂肪組織の部位も特に限定されないが、皮下に位置する脂肪組織（皮下脂肪）が好ましく用いられる。 Adipose tissue is a type of biological tissue composed of adipocytes. The biological origin of the adipose tissue is not particularly limited, and it may be nonhuman animals such as laboratory animals such as mice and rats in addition to humans. Moreover, the age and sex of the organism are not particularly limited. The site of the adipose tissue is not particularly limited, but adipose tissue located under the skin (subcutaneous fat) is preferably used.
脂肪組織の調製方法は特に限定されず、美容整形の際の脂肪吸引手術により吸引される組織片や、外科手術などの際に生体から切除される組織に含まれる切除脂肪組織から調製することができる。脂肪由来幹細胞は太い血管の周囲に存在するため脂肪吸引液よりも切除脂肪組織から多く得ることができる。一方、脂肪吸引液から幹細胞を調製したほうが、手術跡が小さく済みドナーの負担が小さい。 The preparation method of the adipose tissue is not particularly limited, and can be prepared from a tissue piece sucked by liposuction surgery during cosmetic surgery or ablated adipose tissue contained in tissue excised from a living body during surgery or the like it can. Since adipose-derived stem cells exist around thick blood vessels, they can be obtained more from excised adipose tissue than lipoaspirate. On the other hand, if stem cells are prepared from lipoaspirate, the surgical trace is smaller and the burden on the donor is smaller.
脂肪由来幹細胞は、脂肪組織から調製することができる。例えば脂肪吸引液からの脂肪由来幹細胞の調製は、以下のようにして行うことができる。脂肪吸引液に１０％のウシ胎児血清を含むＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）、Ｆ１２などの培地を添加して希釈することによりコラゲナーゼ活性を中和する。その後、遠心して上清を除去し、除去後得られるペレットに上記の培地を加えて再懸濁した後、更に遠心して上清を除去する。同様の洗浄操作をもう一度繰り返す。この洗浄操作により非接着性の赤血球細胞を除き、脂肪由来幹細胞を得ることができる。また、こうして得られた幹細胞は抗生物質／抗菌剤および１０％のウシ胎児血清を含むＤＭＥＭまたはＦ１２培地に懸濁し、３７℃、５％ＣＯ２条件下にて培養することができる。 Adipose-derived stem cells can be prepared from adipose tissue. For example, the preparation of fat-derived stem cells from a lipoaspirate can be performed as follows. Collagenase activity is neutralized by adding and diluting a medium such as Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) or F12 containing 10% fetal bovine serum to the lipoaspirate. Thereafter, the supernatant is removed by centrifugation, the above-mentioned medium is added to the pellet obtained after the removal, the suspension is suspended again, and then the supernatant is removed by further centrifugation. Repeat the same washing procedure once more. By this washing operation, non-adherent red blood cells are removed, and adipose-derived stem cells can be obtained. The stem cells thus obtained can be suspended in DMEM or F12 medium containing an antibiotic / antibacterial agent and 10% fetal bovine serum and cultured under conditions of 37 ° C. and 5% CO 2 .
一方、上述の方法と同様にコラゲナーゼ活性を中和した後の遠心操作後に、最上部に浮遊した細胞を採取し、新生仔牛血清を１０％含むＤＭＥＭまたはＦ１２培地を利用した天井培養に供しても、脂肪由来幹細胞を得ることができる。
本方法は既に報告されている方法（Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｕｎｉｌｏｃｕｌａｒ ｆａｔ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｔｈｅ ｐｒｉｍａｒｙ ｃｕｌｔｕｒｅ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｈａｊｉｍｅ Ｓｕｇｉｈａｒａ，１９８７, ｖｏｌ２８，ｐ１０３８−１０４５、日本再生医療学会雑誌，２００６，ｖｏｌ．５，Ｎｏ．１，加野浩一郎 他、など。）であり、広く脂肪細胞研究者に用いられている方法である。
On the other hand, after the centrifugation after neutralizing the collagenase activity as in the above method, the cells suspended at the top are collected and subjected to ceiling culture using DMEM or F12 medium containing 10% of newborn calf serum. Adipose-derived stem cells can be obtained.
This method has already been reported (Proliferation of uniform fat cells in the primary culture, Journal of Lipid Research, Hajime Sugihara, 1987, Vol. 28, p1038-1045. 1, Kanoichiro Kano et al.) And is a method widely used by adipocyte researchers.
皮膚は、表皮および真皮と皮膚付属器とから構成される。表皮ケラチノサイト（表皮角化細胞）とは表皮を構成する主たる細胞であり、線維芽細胞とは真皮を構成する主たる細胞である。 The skin consists of the epidermis and dermis and a skin appendage. Epidermal keratinocytes (epidermal keratinocytes) are the main cells that make up the epidermis, and fibroblasts are the main cells that make up the dermis.
上記表皮ケラチノサイトおよび線維芽細胞の生物由来は特に限定されず、ヒトでなくともマウス、ラットなど実験動物等の非ヒト動物であってもよい。 The biological origin of the above-mentioned epidermal keratinocytes and fibroblasts is not particularly limited, and may be a non-human animal such as a mouse, a rat, or an experimental animal.
表皮ケラチノサイトおよび線維芽細胞の調製方法は特に限定されず、例えば形成外科、皮膚科、外科手術等の余剰皮膚などの皮膚切除片から初代培養して用いてもよく、またそれぞれの細胞を純化して用いてもよい。さらに、継代培養して増殖させたものを使用することも出来る。継代培養する場合には、６０〜８０％コンフルエント未満で継代する。また６回以上の継代培養は、細胞の毛包誘導能が低下するため好ましくない。表皮ケラチノサイトを調製する場合は、必要に応じて皮膚切除片を適当な大きさに裁断後、例えば０．２５％トリプシン中で４℃、２４時間処理した後に遠心操作を行うことにより表皮からケラチノサイトを分離することが出来る。分離した表皮ケラチノサイトは無血清・低カルシウム濃度を特徴とするＫＧＭ（Ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｍｅｄｉｕｍ）、もしくは市販のＨｕｍｅｄｉａ ＫＧ２培地（ＴＯＹＯＢＯ）等を用いて３７℃、５％ＣＯ２の存在下で培養して調製することができる。また、線維芽細胞を調製する場合は、必要に応じて皮膚切除片を適当な大きさに裁断後、例えば培養シャーレに固定後、１０％ＦＢＳ添加ＤＭＥＭ培地を静かに加え、３７℃、５％ＣＯ２の存在下でインキュベートをする。培養開始4日から7日目頃より皮膚片の周囲より線維芽細胞が増殖することが確認でき、こうして線維芽細胞を調製することができる。 The method for preparing epidermal keratinocytes and fibroblasts is not particularly limited. For example, primary culturing may be used from skin excision pieces such as excess skin in plastic surgery, dermatology, surgery, etc., and each cell may be purified. May be used. Furthermore, what was propagated by subculture can also be used. When subcultured, subculture at 60 to less than 80% confluence. In addition, subculturing 6 times or more is not preferable because the ability of cells to induce hair follicles decreases. When preparing epidermal keratinocytes, cut the skin excised pieces into an appropriate size as necessary, for example, by treating the keratinocytes from the epidermis by performing a centrifugation operation at 4 ° C. for 24 hours in 0.25% trypsin. Can be separated. The isolated epidermal keratinocytes are prepared by culturing in the presence of 37%, 5% CO 2 using KGM (Keratinocyte Growth Medium) characterized by serum-free and low calcium concentration, or commercially available Humdia KG2 medium (TOYOBO). can do. When preparing fibroblasts, cut the skin excised pieces into an appropriate size if necessary, for example, fix to a culture dish, and gently add 10% FBS-added DMEM medium at 37 ° C., 5% Incubate in the presence of CO 2 . From around the 4th to 7th day from the start of the culture, it can be confirmed that fibroblasts proliferate from around the skin piece, and thus fibroblasts can be prepared.
本発明の培養細胞塊は、上述した脂肪由来幹細胞、線維芽細胞および表皮ケラチノサイトを含むものであればよく、皮膚付属器形成能を害しない範囲でその他の細胞を含むものであってもよい。 The cultured cell mass of the present invention only needs to contain the aforementioned adipose-derived stem cells, fibroblasts and epidermal keratinocytes, and may contain other cells as long as it does not impair the ability to form skin appendages.
本発明の培養細胞塊は、上記の脂肪由来幹細胞、線維芽細胞および表皮ケラチノサイトを含むものであればよく、その調製方法は特に限定されない。例えば、これらの細胞を適当な培地、例えばコラーゲン・ゲルなどの上に播種して調製され得る。ここでコラーゲン・ゲルとは、コラーゲンを主成分とするゲル状の物質を意味する。コラーゲンはＩ〜ＶＩＩＩ型まで様々なタイプがあるが、コラーゲンＩもしくはコラーゲンＩＶがこのましい。コラーゲン・ゲルとしては、組織培養用などのコラーゲンの市販品（例えば、新田ゼラチン社製のＣｅｌｌｍａｔｒｉｘ ＴｙｐｅＩＰ、Ｃｅｌｌｍａｔｒｉｘ ＴｙｐｅＩＡなど）を用いることができる。 The cultured cell mass of the present invention is not particularly limited as long as it contains the adipose-derived stem cells, fibroblasts and epidermal keratinocytes. For example, these cells can be prepared by seeding on an appropriate medium such as collagen gel. Here, the collagen gel means a gel-like substance containing collagen as a main component. There are various types of collagen from type I to VIII, but collagen I or collagen IV is preferred. As the collagen gel, commercially available collagen products for tissue culture (eg, Cellmatrix TypeIP, Cellmatrix TypeIA manufactured by Nitta Gelatin Co., Ltd.) can be used.
本発明の培養細胞塊は、皮膚付属器形成能を有する。すなわち、例えば培養細胞塊を生体に移植することなどにより、将来的に皮膚付属器を形成する能力を有していればよく、皮膚付属器が形成されていなくともよい。ここで皮膚付属器とは、皮膚を構成する表皮層と真皮層に付属している器官を意味し、毛包、汗腺、皮脂腺、爪などを挙げることができる。これらの皮膚付属器は、水分や皮脂を分泌して皮膚に潤いを与える、体温を調節する、外部から皮膚を保護するといった役割を担う。本発明の培養細胞塊は、上記皮膚付属器のうち毛包、汗腺、および皮脂腺の形成能を有することが好ましい。 The cultured cell mass of the present invention has a skin appendage forming ability. That is, the skin appendage need not be formed as long as it has the ability to form a skin appendage in the future, for example, by transplanting a cultured cell mass into a living body. Here, the skin appendage means organs attached to the epidermis layer and dermis layer constituting the skin, and examples thereof include hair follicles, sweat glands, sebaceous glands, and nails. These skin appendages play a role of secreting moisture and sebum to moisturize the skin, regulating body temperature, and protecting the skin from the outside. The cultured cell mass of the present invention preferably has the ability to form hair follicles, sweat glands, and sebaceous glands among the above-mentioned skin appendages.
〔人工皮膚〕
本発明の人工皮膚は、脂肪由来幹細胞、線維芽細胞および表皮ケラチノサイトを含むことを特徴とし、皮膚付属器を有するものである。
[Artificial skin]
The artificial skin of the present invention is characterized by containing fat-derived stem cells, fibroblasts and epidermal keratinocytes, and has a skin appendage.
脂肪由来幹細胞、線維芽細胞および表皮ケラチノサイトについては、本発明の培養細胞塊の説明欄において前述した通りである。これらの細胞のうち、線維芽細胞および表皮ケラチノサイトについては、本発明の人工皮膚の使用目的に応じて自家の細胞（被験者の細胞）または市販の細胞を用いることができる。例えば、人工皮膚の使用目的が薬剤刺激性試験、経皮吸収性試験の場合には、自家の細胞を使用する必要はなく、メーカーより販売されている線維芽細胞および表皮ケラチノサイトを購入して用いることができる。 The adipose-derived stem cells, fibroblasts and epidermal keratinocytes are as described above in the explanation of the cultured cell mass of the present invention. Among these cells, for fibroblasts and epidermal keratinocytes, autologous cells (subject cells) or commercially available cells can be used depending on the purpose of use of the artificial skin of the present invention. For example, if the purpose of using artificial skin is a drug irritation test or a transdermal absorbability test, it is not necessary to use own cells, but purchase and use fibroblasts and epidermal keratinocytes sold by the manufacturer. be able to.
本発明の人工皮膚は、各種用途に用いることができ、例えば外科手術、美容形成手術などの際の皮膚移植用材料として用いることができる。また、経皮薬、化粧品などの薬効性試験、安全性試験などの際のヒト皮膚の代替試験用に用いることができる。本発明の人工皮膚は、毛包などの皮膚付属器官を有することから、特に育毛剤や、育毛有効成分の薬効性試験、安全性試験などの試験用に好ましく用いることができる。 The artificial skin of the present invention can be used for various applications, and can be used as a material for skin transplantation in, for example, surgery and cosmetic surgery. Moreover, it can be used for an alternative test of human skin at the time of medicinal efficacy tests such as transdermal drugs and cosmetics, and safety tests. Since the artificial skin of the present invention has a skin appendage organ such as a hair follicle, it can be preferably used for a test such as a hair restorer and a medicinal efficacy test and a safety test of a hair restorer active ingredient.
〔人工皮膚の製造方法〕
上記本発明の人工皮膚の製造方法は特に限定されないが、脂肪由来幹細胞、線維芽細胞および表皮ケラチノサイトを共培養して調製される。
[Method for producing artificial skin]
The method for producing the artificial skin of the present invention is not particularly limited, but it is prepared by co-culturing adipose-derived stem cells, fibroblasts and epidermal keratinocytes.
共培養は、脂肪由来幹細胞、線維芽細胞および表皮ケラチノサイトをコラーゲン・ゲルに懸濁して行うことが望ましい。コラーゲン・ゲルについては、前記した本発明の培養細胞塊の項で既に述べたとおりである。コラーゲン・ゲルに対し、懸濁させる脂肪由来幹細胞、線維芽細胞および表皮ケラチノサイトの量は、各細胞の継代数や形質などの諸条件により適宜調整すべきであり、細胞数や細胞比を数値範囲として限定することは困難である。一例を挙げると、コラーゲン・ゲル混合溶液１００μｌに対し脂肪由来幹細胞、皮膚細胞（線維芽細胞と表皮ケラチノサイト）の細胞数合計で５．０×１０４〜１．０×１０８であり、好ましくは５．０×１０５〜１．０×１０７の範囲で定めることができる。また脂肪由来幹細胞と皮膚細胞の細胞比も、目安としては５０：１〜１：１０００で混合することが好ましく、特に１０：１〜１：１００で混合することが好ましく、中でも１：１〜１：１００で懸濁（混合）することが最も好ましい。尚、コラーゲン・ゲル混合溶液に細胞を懸濁する際には氷上にて行い、ゲルを泡立てないように静かに混合する。 The co-culture is preferably performed by suspending adipose-derived stem cells, fibroblasts, and epidermal keratinocytes in a collagen gel. The collagen gel is as described above in the section of the cultured cell mass of the present invention. The amount of adipose-derived stem cells, fibroblasts, and epidermal keratinocytes to be suspended in collagen gel should be adjusted as appropriate according to various conditions such as the number of passages and traits of each cell. It is difficult to limit as. As an example, the total number of cells of adipose-derived stem cells and skin cells (fibroblasts and epidermal keratinocytes) per 100 μl of collagen / gel mixed solution is 5.0 × 10 4 to 1.0 × 10 8 , preferably It can be defined in the range of 5.0 × 10 5 to 1.0 × 10 7 . The cell ratio of fat-derived stem cells and skin cells is also preferably mixed at 50: 1 to 1: 1000, particularly preferably 10: 1 to 1: 100, particularly 1: 1 to 1. : It is most preferable to suspend (mix) at 100. In addition, when suspending cells in a collagen / gel mixed solution, it is performed on ice, and gently mixed so that the gel does not foam.
上記共培養は、脂肪由来幹細胞、線維芽細胞および表皮ケラチノサイトを非ヒト動物の皮膚切除部位に注入し培養することが好ましい。特に脂肪由来幹細胞、線維芽細胞および表皮ケラチノサイトをコラーゲン・ゲルに懸濁させた状態で動物（好ましくは、非ヒト動物（ヒト以外の動物））の皮膚切除部位に注入し培養することが好ましい。これにより、非ヒト動物の皮膚切除部位に人工皮膚が形成される。 The co-culture is preferably performed by injecting adipose-derived stem cells, fibroblasts, and epidermal keratinocytes into the skin excision site of a non-human animal. In particular, it is preferable to inject and culture adipose-derived stem cells, fibroblasts, and epidermal keratinocytes at the skin excision site of an animal (preferably a non-human animal (non-human animal)) in a state suspended in collagen gel. Thereby, artificial skin is formed at the skin excision site of the non-human animal.
非ヒト動物としては、マウス、ラット、モルモットなどの実験動物等を用いることができる。非ヒト動物の中でも免疫不全非ヒト動物が好ましい。また、非ヒト動物の皮膚組織であれば特に切除する部位は限定されないが、例えばラット等の実験動物の場合には処置の容易さから背部の皮膚組織が好ましい。 As non-human animals, experimental animals such as mice, rats, guinea pigs, and the like can be used. Among non-human animals, immunodeficient non-human animals are preferred. In addition, the site of excision is not particularly limited as long as it is a skin tissue of a non-human animal, but in the case of a laboratory animal such as a rat, for example, the skin tissue on the back is preferable for ease of treatment.
脂肪由来幹細胞、線維芽細胞および表皮ケラチノサイトを非ヒト動物の皮膚切除部位において共培養する際には、表面の乾燥を防ぎ異物の混入を防ぐために蓋付の小型培養チャンバーを皮膚切除部位に固定してなされることが好ましい。チャンバーは、湿度を保てる構造のものであり、動物が足で触れたり口で舐めることができないようになっており、床敷きなどの異物が混入しないようなものであればよく、移植用の細胞を保持する空隙部分と、移植用の細胞導入口および皮膚組織への開口部とを有する構造のものを用いることができる。例えば、皮膚組織への開口部周辺につば状の突出部を有するチャンバーは、皮膚組織中につば部分を挿入してチャンバーを固定することができるので好ましく用いられる。チャンバーの材質は特に制限されるものではなく、例えばポリプロピレン、シリコン製のものが使用できる。チャンバーの大きさも特に制限されるものではない。 When co-culturing adipose-derived stem cells, fibroblasts, and epidermal keratinocytes at the skin excision site of non-human animals, a small culture chamber with a lid is fixed to the skin excision site in order to prevent surface drying and contamination. Is preferably done. The chamber has a structure that can maintain humidity, so that animals cannot be touched by the feet or licked by the mouth, and should not be contaminated with foreign matter such as flooring. A structure having a void portion for holding the cell, a cell introduction port for transplantation, and an opening to the skin tissue can be used. For example, a chamber having a collar-like protrusion around the opening to the skin tissue is preferably used because the chamber can be fixed by inserting the collar portion into the skin tissue. The material of the chamber is not particularly limited, and for example, a material made of polypropylene or silicon can be used. The size of the chamber is not particularly limited.
体表面へのチャンバーの固定の例を挙げると以下の通りである。移植対象の動物の皮膚をチャンバーのサイズに合わせて切除し、周囲の皮膚表面をつまみ、皮膚下にチャンバーのつばを挿入し、チャンバーの周辺部の皮膚を縫合または医療用クリップ、医療用接着剤を用いてチャンバーを固定することができる。 An example of fixing the chamber to the body surface is as follows. Cut the skin of the animal to be transplanted according to the size of the chamber, pinch the surface of the surrounding skin, insert the collar of the chamber under the skin, suture the skin around the chamber or medical clip, medical adhesive Can be used to fix the chamber.
チャンバーを用いて細胞を播種する際、面積当たりの細胞数が少ないと人工皮膚中の毛包構造の形成に不十分であり、反対に面積当たりの細胞数が多すぎても細胞死が起きたり、チャンバー内でのケラチノサイトの正常な角化を妨げてしまうため好ましくない。チャンバーの大きさは非ヒト動物の体の大きさにより様々なものを用いることが出来るため特に規定されないが、大きすぎると皮膚切除部位への固定が困難である。従って、作成したい人工皮膚の大きさに合わせてチャンバーと非ヒト動物を選択することが好ましい。チャンバーは、皮膚の創傷治癒作用により自然に脱離するが、固定の度合いが強く自然に脱離されない場合は固定に用いた器具を外すことによりチャンバーを脱離させても良い。 When cells are seeded using a chamber, if the number of cells per area is small, the formation of hair follicle structures in the artificial skin is insufficient, and cell death may occur even if the number of cells per area is too large. This is not preferable because it prevents normal keratinocyte keratinization in the chamber. The size of the chamber is not particularly specified because various chambers can be used depending on the size of the non-human animal body, but if it is too large, it is difficult to fix it to the skin resection site. Therefore, it is preferable to select the chamber and the non-human animal according to the size of the artificial skin to be created. The chamber is naturally detached due to the wound healing action of the skin, but if the degree of fixation is strong and not naturally detached, the chamber may be detached by removing the instrument used for fixation.
非ヒト動物の皮膚切除部位に形成された人工皮膚は、そのままヒト皮膚の代替試験用、特に育毛剤や育毛有効成分の試験用に用いることができる。また、皮膚移植用材料として、動物から組織を採取してヒトなど他の個体に移植することも可能である。 Artificial skin formed at the skin excision site of a non-human animal can be used as it is for an alternative test of human skin, in particular, a test for a hair restorer or a hair restorer active ingredient. In addition, as a material for skin transplantation, tissue can be collected from animals and transplanted to other individuals such as humans.
以下、本発明を実施例により具体的に説明する。尚、実施例は本発明の一例を示すものであり、本発明を限定するものではない。 Hereinafter, the present invention will be specifically described by way of examples. In addition, an Example shows an example of this invention and does not limit this invention.
実施例１〜３および比較例１〜３
［脂肪由来幹細胞の調製］調製例１
３２歳、ＢＭＩ値２２ｋｇ／ｍ２の女性の腹部皮下脂肪の吸引手術により脂肪吸引液を得た。まず末梢血のコンタミネーションを最小化にするためエピネフリンを腹部皮下脂肪に投与し、その後に脂肪組織を２００ｃｃ吸引した。ＰＢＳバッファーを用いて吸引された組織を洗浄した後、０．０７５％コラゲナーゼ中にて３７℃、３０分間インキュベートした。ここに１０％ ＦＢＳを含むＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）を等量加えることによりコラゲナーゼ活性を中和した後、ポアサイズ１５０μｍのメッシュを用いてろ過した。このろ液を１２００×ｇにて１０分間遠心後、上清を除き、ペレットを１０％ ＦＢＳを含むＤＭＥＭに再懸濁した。これを再び１２００×ｇにて１０分間遠心し、上清を除いた。得られたペレットを１０％ ＦＢＳ、１％ ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ／ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ ｓｏｌｕｔｉｏｎを含むＤＭＥＭに再懸濁し、６０ｍｍ ｄｉｓｈに播種して３７℃、５％ＣＯ２存在下にて一晩培養した。翌日、ＰＢＳバッファーを用いてプレートを洗浄することにより非接着性の赤血球細胞を除いた。こうして得られた細胞は脂肪組織のみでなく骨組織、軟骨組織、筋肉組織へ分化する、つまり成体幹細胞であることを確認した（Ｖｏｎ Ｋｏｓｓａ ｓｔａｉｎ，Ａｌｃｉａｎ Ｂｌｕｅ ｓｔａｉｎ，Ｍｙｏｓｉｎ抗体染色、ＭｙｏＤ１抗体染色により確認）。
Examples 1-3 and Comparative Examples 1-3
[Preparation of fat-derived stem cells] Preparation Example 1
A lipoaspirate was obtained by aspiration surgery for abdominal subcutaneous fat in a 32-year-old woman with a BMI value of 22 kg / m 2 . First, epinephrine was administered to the abdominal subcutaneous fat to minimize contamination of peripheral blood, and then 200 cc of adipose tissue was aspirated. The aspirated tissue was washed with PBS buffer and then incubated in 0.075% collagenase at 37 ° C. for 30 minutes. The collagenase activity was neutralized by adding an equal amount of Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) containing 10% FBS, followed by filtration using a mesh having a pore size of 150 μm. The filtrate was centrifuged at 1200 × g for 10 minutes, the supernatant was removed, and the pellet was resuspended in DMEM containing 10% FBS. This was again centrifuged at 1200 × g for 10 minutes, and the supernatant was removed. The obtained pellet was resuspended in DMEM containing 10% FBS and 1% antibiotic / anticolytic solution, seeded in a 60 mm dish, and cultured overnight at 37 ° C. in the presence of 5% CO 2 . The next day, non-adherent red blood cells were removed by washing the plate with PBS buffer. The cells thus obtained were confirmed to differentiate into not only adipose tissue but also bone tissue, cartilage tissue, and muscle tissue, that is, adult stem cells (Von Kossa stain, Alcian Blue stain, Myosin antibody staining, MyoD1 antibody staining) ).
［線維芽細胞の調製］
ヒト皮膚の線維芽細胞は以下に示す一般的な手法により調製した。無菌的手法により得たヒト皮膚片（形成外科・皮膚科・外科手術での余剰皮膚など）を抗生物質含有のＰＢＳ（−）中にて洗浄した後、メスを用いて１．５〜２ｃｍ角の小片とした。この皮膚小片を培養シャーレに固定し、培地（１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ）を静かに加え、インキュベータ内（３７℃、５％ＣＯ２）にて培養を開始した。培地交換は週に２回行った。培養開始３日〜７日頃より皮膚片の周囲から細胞増殖が見られた。細胞は６０〜８０％コンフルエントで回収した。
[Preparation of fibroblasts]
Human skin fibroblasts were prepared by the following general procedure. Human skin pieces obtained by aseptic techniques (plastic surgery, dermatology, surgical surplus skin, etc.) are washed in PBS (-) containing antibiotics, and then a 1.5-2 cm square using a scalpel It was a small piece. The skin pieces were fixed to a culture dish, medium (DMEM containing 10% FBS) was gently added, and culture was started in an incubator (37 ° C., 5% CO 2 ). The medium was changed twice a week. From about 3 to 7 days after the start of the culture, cell proliferation was observed around the skin piece. Cells were harvested at 60-80% confluence.
［表皮ケラチノサイトの調製］
ヒト皮膚の表皮ケラチノサイトは以下に示す一般的な手法により調製した。無菌的手法により得たヒト皮膚片を抗生物質含有のＰＢＳ（−）中にて洗浄した後、メスを用いて１〜２ｃｍ角の小片とした。これらは１０００Ｕ／ｍＬディスパーゼ中にて４℃、２４時間処理した。その後、ＤＭＥＭ培地に浸して軽く洗浄し、ピンセットで表皮を真皮から剥離した。こうして得られた表皮を０．１％トリプシン溶液１０ｍＬ中にて３７℃、３分間振とうすることにより表皮ケラチノサイトを溶液中に落とした。トリプシンインヒビターを２ｍｇ含有するＤＭＥＭ培地１０ｍＬ加え、遠心により細胞を回収後、ＫＧＭ培地を用いて細胞を播種した。インキュベータ内（３７℃、５％ＣＯ２）にて培養を開始し、培地交換は２日に１回行った。こうして培養した表皮ケラチノサイトは６０〜８０％コンフルエントで回収した。
[Preparation of epidermal keratinocytes]
Human skin epidermal keratinocytes were prepared by the following general procedure. Human skin pieces obtained by an aseptic technique were washed in PBS (-) containing antibiotics and then cut into 1-2 cm square pieces using a scalpel. These were treated in 1000 U / mL dispase at 4 ° C. for 24 hours. Then, it was immersed in DMEM culture medium and lightly washed, and the epidermis was peeled from the dermis with tweezers. The epidermis keratinocytes were dropped into the solution by shaking the epidermis thus obtained in 10 mL of a 0.1% trypsin solution at 37 ° C. for 3 minutes. 10 mL of DMEM medium containing 2 mg of trypsin inhibitor was added, the cells were collected by centrifugation, and then seeded using KGM medium. The culture was started in an incubator (37 ° C., 5% CO 2 ), and the medium was changed once every two days. The epidermal keratinocytes thus cultured were collected at 60-80% confluence.
［細胞懸濁コラーゲン・ゲル混合溶液の調製］
新田ゼラチン社製のＣｅｌｌｍａｔｒｉｘ ＴｙｐｅＩＰを用いて添付のプロトコルを参考にコラーゲン・ゲル混合溶液を調製した。脂肪由来幹細胞、線維芽細胞、および表皮ケラチノサイトを、コラーゲン・ゲル混合溶液１００μｌに対し、表１に示した細胞数になるように細胞を懸濁した。これらの作業は氷上で行った。また、本試験で用いた脂肪由来幹細胞は人工皮膚中でその局在を検出できるようにＱｔｒａｃｋｅｒ ５２５ ｃｅｌｌ ｌａｂｅｌｉｎｇ ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製)を用いてＱ−ｄｏｔ５２５標識したものを用いた。
[Preparation of cell suspension collagen gel solution]
A collagen / gel mixed solution was prepared using Cellmatrix TypeIP manufactured by Nitta Gelatin Co., Ltd. with reference to the attached protocol. Adipose-derived stem cells, fibroblasts, and epidermal keratinocytes were suspended in 100 μl of collagen / gel mixed solution so that the number of cells shown in Table 1 was obtained. These operations were performed on ice. In addition, the adipose-derived stem cells used in this test were Q-dot525-labeled using Qtracker 525 cell labeling kit (manufactured by Invitrogen) so that the localization can be detected in artificial skin.
［ヌードマウスへの細胞播種］
ポリプロピレン製の内径１０ｍｍのつば付き円筒の上部に蓋を付着したチャンバーＡを用いた（図４）。ヌードマウスの背部皮膚から直径１２ｍｍの円状に皮膚を切除し、切除部位にチャンバーを設置し、それぞれ医療用クリップを用いて固定した。チャンバーＡの蓋１には１８ゲージの注射針を用いて穴を開け、細胞液の注入口２とした。チャンバーＡの注入口２から、表１に示した細胞懸濁コラーゲン・ゲル混合溶液を１ｍｌサイズのシリンジと２４Ｇサイズの注射針（ともにテルモ社製）を用いて１００μｌずつ注入した。細胞注入に用いたチャンバーは、皮膚の創傷治癒作用により、設置から７日後に自然に外れた。
[Cell seeding in nude mice]
A chamber A having a lid attached to the top of a 10 mm inner diameter cylinder made of polypropylene was used (FIG. 4). The skin was excised in a circular shape with a diameter of 12 mm from the dorsal skin of a nude mouse, a chamber was installed at the excision site, and each was fixed using a medical clip. The lid 1 of the chamber A was pierced using an 18-gauge injection needle, and used as an inlet 2 for cell fluid. From the injection port 2 of the chamber A, 100 μl of the cell suspension collagen / gel mixed solution shown in Table 1 was injected using a 1 ml syringe and a 24 G syringe needle (both from Terumo). The chamber used for cell infusion naturally removed 7 days after installation due to the wound healing action of the skin.
［形成した人工皮膚における皮膚付属器の有無の確認］
細胞播種２８日後に播種部位を切除し、ホルマリン固定、パラフィン包埋を行い、ＨＥ染色により組織学的検討を行った。その結果、脂肪由来幹細胞を播種した実施例１（図１）、実施例２（図５）、実施例３（図６）では細胞移植部位に毛包、皮脂腺が形成されていることが確認できた。また形成された毛包にはＱ−ｄｏｔ標識された細胞が検出されたことから、脂肪由来幹細胞が毛包細胞に分化したことが確認できた（実施例１の例：図２）。一方、脂肪由来幹細胞を播種していないほかは実施例１と同じように行った例を比較例１に示した。また、線維芽細胞を使用しない例を比較例２に、表皮ケラチノサイトを使用しない例を比較例３に示した。比較例１では細胞移植部位に毛包、皮脂腺などの皮膚付属器は確認できなかった（図３）ほか、比較例２、３においても、皮膚付属器はほとんど形成されなかった。
[Confirmation of presence or absence of skin appendages in the formed artificial skin]
The seeding site was excised 28 days after cell seeding, formalin fixation and paraffin embedding were performed, and histological examination was performed by HE staining. As a result, in Example 1 (FIG. 1), Example 2 (FIG. 5), and Example 3 (FIG. 6) in which fat-derived stem cells were seeded, it was confirmed that hair follicles and sebaceous glands were formed at the cell transplant site. It was. Moreover, since cells labeled with Q-dot were detected in the formed hair follicles, it was confirmed that fat-derived stem cells were differentiated into hair follicle cells (example of Example 1: FIG. 2). On the other hand, Comparative Example 1 shows an example performed in the same manner as Example 1 except that fat-derived stem cells were not seeded. An example in which no fibroblasts are used is shown in Comparative Example 2, and an example in which no epidermal keratinocytes are used is shown in Comparative Example 3. In Comparative Example 1, no skin appendages such as hair follicles and sebaceous glands could be confirmed at the cell transplantation site (FIG. 3). In Comparative Examples 2 and 3, almost no skin appendages were formed.
従って、人工皮膚中に皮膚付属器を形成させるには脂肪由来幹細胞、線維芽細胞、および皮膚ケラチノサイトを共に培養することが必須であることを発見した。 Accordingly, it has been discovered that culturing adipose-derived stem cells, fibroblasts, and skin keratinocytes together is essential for forming skin appendages in artificial skin.
実施例４
前述の実施例１〜実施例３、及び比較例１〜比較例３に示した脂肪由来幹細胞は前記調整例１で調製しているが、他の方法で調製した脂肪由来幹細胞についても同様の皮膚付属器形成能を有するかどうかについて検討した。
Example 4
The adipose-derived stem cells shown in the above-mentioned Examples 1 to 3 and Comparative Examples 1 to 3 are prepared in Preparation Example 1, but the same skin is also obtained for the adipose-derived stem cells prepared by other methods. We examined whether it has the ability to form appendages.
［脂肪由来幹細胞の調製］調製例２
上記調製例１の方法以外にも脂肪吸引液、または脂肪組織の酵素処理液から得られる成熟脂肪細胞を用いて幹細胞を得ることが出来、以下に方法を示した。４３歳、ＢＭＩ値２５ｋｇ／ｍ２の女性の腹部皮下脂肪の吸引手術により脂肪吸引液を得た。まず末梢血のコンタミネーションを最小化にするためエピネフリンを腹部皮下脂肪に投与し、その後に脂肪組織を２００ｃｃ吸引した。ＰＢＳバッファーを用いて吸引された組織を洗浄した後、０．０７５％コラゲナーゼ中にて３７℃、３０分間インキュベートした。ここに１０％ ＦＢＳを含むＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）を等量加えることによりコラゲナーゼ活性を中和した後、ポアサイズ１５０μｍのメッシュを用いてろ過後、１２００×ｇにて１０分間遠心した。遠心操作により最上部に浮遊した細胞をパスツールピペットで丁寧に採取し、ＰＢＳバッファーに再懸濁した。同様に再び遠心洗浄し、浮遊する細胞をパスツールピペットで採取した。こうして得た浮遊細胞を以下に示す天井培養に用いた。天井培養とは液中で浮遊するために通常の接着培養が困難である細胞を、培養液を満たしたフラスコに植え込むことにより天井面に付着させ培養する方法である。培養フラスコに新生仔牛血清を１０％添加したＦ１２培地を満たし、フラスコを立てたまま調製した浮遊細胞を入れ、栓をし、フラスコの底面を上にして３７℃、５％ＣＯ２存在下にて１０日間培養した。顕微鏡下にて細胞が天井面へ接着していることを確認した後、培地を除き、新生仔牛血清を１０％添加したＦ１２培地を加えフラスコの天地を静かに逆にして通常のフラスコ培養としてさらに７日間培養した。こうして得られた接着細胞は脂肪組織のみでなく骨組織、軟骨組織、筋肉組織へ分化する、つまり成体幹細胞であることを確認した（Ｖｏｎ Ｋｏｓｓａ ｓｔａｉｎ，Ａｌｃｉａｎ Ｂｌｕｅ ｓｔａｉｎ，Ｍｙｏｓｉｎ抗体染色、ＭｙｏＤ１抗体染色により確認）。
[Preparation of fat-derived stem cells] Preparation Example 2
In addition to the method of Preparation Example 1, stem cells can be obtained using mature adipocytes obtained from a liposuction solution or an enzyme-treated solution of adipose tissue. The method is described below. A lipoaspirate was obtained by aspiration surgery of a 43-year-old woman with a BMI value of 25 kg / m 2 in the abdominal subcutaneous fat. First, epinephrine was administered to the abdominal subcutaneous fat to minimize contamination of peripheral blood, and then 200 cc of adipose tissue was aspirated. The aspirated tissue was washed with PBS buffer and then incubated in 0.075% collagenase at 37 ° C. for 30 minutes. Collagenase activity was neutralized by adding an equal amount of Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) containing 10% FBS, followed by filtration using a mesh having a pore size of 150 μm, and centrifugation at 1200 × g for 10 minutes. did. Cells suspended at the top by centrifugation were carefully collected with a Pasteur pipette and resuspended in PBS buffer. Similarly, centrifugal washing was performed again, and floating cells were collected with a Pasteur pipette. The floating cells thus obtained were used for the ceiling culture shown below. Ceiling culture is a method in which cells that are difficult to perform normal adhesion culture because they float in the liquid are attached to the ceiling surface and cultured by being implanted in a flask filled with the culture liquid. Fill the culture flask with F12 medium supplemented with 10% of newborn calf serum, put the prepared floating cells with the flask upright, cap it, and place the flask on the bottom face up at 37 ° C in the presence of 5% CO 2 . Cultured for 10 days. After confirming that the cells adhere to the ceiling surface under the microscope, remove the medium, add F12 medium supplemented with 10% of newborn calf serum, and gently invert the top and bottom of the flask to further normal flask culture. Cultured for 7 days. The adherent cells thus obtained were confirmed to differentiate into not only adipose tissue but also bone tissue, cartilage tissue, and muscle tissue, that is, adult stem cells (Von Kossa stain, Alcian Blue stain, Myosin antibody staining, MyoD1 antibody staining). Confirmation).
上述の調製例２で調製した脂肪由来幹細胞（細胞数：１．５×１０５ｃｅｌｌｓ）と皮膚細胞（線維芽細胞の細胞数：７．５×１０５ｃｅｌｌｓ、表皮ケラチノサイトの細胞数：７．５×１０５ｃｅｌｌｓ）の細胞比を１：１０、全細胞数合計を１６５００００ｃｅｌｌｓとしたほかは、実施例１と同様にして作成した人工皮膚を図７に示した。毛包、皮脂腺、汗腺といった皮膚付属器の形成が確認でき、皮膚組織切片長１０ｍｍあたりの毛包数は１０本以上であった。 6. Fat-derived stem cells (cell number: 1.5 × 10 5 cells) and skin cells (fibroblast cell number: 7.5 × 10 5 cells, epidermal keratinocyte cell number: 7 prepared in Preparation Example 2 above. FIG. 7 shows an artificial skin prepared in the same manner as in Example 1 except that the cell ratio of 5 × 10 5 cells was 1:10 and the total number of cells was 1650000 cells. Formation of skin appendages such as hair follicles, sebaceous glands and sweat glands was confirmed, and the number of hair follicles per 10 mm of skin tissue section length was 10 or more.
実施例５〜実施例８（育毛有効成分試験）
４３歳女性の頭部皮膚片（外科手術での余剰皮膚、１．０ｃｍ×３．０ｃｍの大きさ）を抗生物質含有のＰＢＳ（−）中にて洗浄した後、メスを用いて０．３ｃｍ幅の短冊状にカットした。これらの皮膚片は１０００Ｕ／ｍＬディスパーゼ中にて４℃、２４時間処理した。その後、ＤＭＥＭ培地に浸して軽く洗浄した後、ピンセットで表皮を真皮から剥離した。表皮は表皮角化細胞の培養に、真皮は線維芽細胞の培養に供した。
Example 5 to Example 8 (Hair-growth active ingredient test)
A 43-year-old female head skin piece (surgical skin surplus, 1.0 cm × 3.0 cm in size) was washed in PBS (−) containing antibiotics, and then 0.3 cm using a scalpel. Cut into strips of width. These skin pieces were treated in 1000 U / mL dispase at 4 ° C. for 24 hours. Then, after dipping in DMEM medium and washing lightly, the epidermis was peeled from the dermis with tweezers. The epidermis was used for the culture of epidermal keratinocytes, and the dermis was used for the culture of fibroblasts.
表皮角化細胞の調製法を以下に示した。表皮を０．１％トリプシン溶液１０ｍＬ中にて３７℃、３分間振とうすることにより表皮ケラチノサイトを溶液中に落とした。トリプシンインヒビターを２ｍｇ含有するＤＭＥＭ培地１０ｍＬを加え、遠心により細胞を回収後、ＫＧＭ培地を用いて細胞を播種した。インキュベータ内（３７℃、５％ＣＯ２）にて培養を開始し、培地交換は２日に１回行った。こうして培養した表皮ケラチノサイトは６０〜８０％コンフルエントで回収した。 A method for preparing epidermal keratinocytes was shown below. The epidermal keratinocytes were dropped into the solution by shaking the epidermis in 10 mL of 0.1% trypsin solution at 37 ° C. for 3 minutes. 10 mL of DMEM medium containing 2 mg of trypsin inhibitor was added, the cells were collected by centrifugation, and the cells were seeded using KGM medium. The culture was started in an incubator (37 ° C., 5% CO 2 ), and the medium was changed once every two days. The epidermal keratinocytes thus cultured were collected at 60-80% confluence.
線維芽細胞の調製法を以下に示した。真皮をメスを用いて１ｃｍ幅にカットし、この小片を培養シャーレに接着させた。ここに培地（１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ）を静かに加え、インキュベータ内（３７℃、５％ＣＯ２）にて培養を開始した。培地交換は週に２回行った。培養開始３日〜７日頃より皮膚片の周囲から細胞増殖が見られた。細胞は６０〜８０％コンフルエントで回収した。 The method for preparing fibroblasts is shown below. The dermis was cut to a width of 1 cm using a scalpel, and this small piece was adhered to a culture dish. Medium (DMEM containing 10% FBS) was gently added thereto, and culture was started in an incubator (37 ° C., 5% CO 2 ). The medium was changed twice a week. From about 3 to 7 days after the start of the culture, cell proliferation was observed around the skin piece. Cells were harvested at 60-80% confluence.
こうして得られた表皮ケラチノサイトと線維芽細胞を上述の調製例２で得られた脂肪由来幹細胞と混合して、細胞懸濁コラーゲン・ゲル混合溶液を調製した。細胞懸濁コラーゲン・ゲル混合溶液の調製は、細胞数、細胞比を表２の実施例５〜実施例８に記載した通りとしたほかは、実施例１と同様とした。このようにして調製した細胞混合液に何も添加しないで（実施例５）、或いは細胞混合液に既に育毛効果の知られているタンパクであるｅｐｈｒｉｎ−Ａ３（実施例６）、ｓｈｈ（実施例７）、ＥＧＦ（実施例８）を、それぞれ表２に示す量加えてヌードマウスの皮膚切除部位に播種し、育毛促進効果が得られるか検討した。ヌードマウスへの細胞播種、形成した人工皮膚における皮膚付属器有無の確認については実施例１と同様にして行った。 The epidermal keratinocytes and fibroblasts thus obtained were mixed with the fat-derived stem cells obtained in Preparation Example 2 to prepare a cell suspension collagen / gel mixed solution. The cell suspension collagen / gel mixed solution was prepared in the same manner as in Example 1 except that the number of cells and the cell ratio were as described in Examples 5 to 8 in Table 2. Nothing is added to the cell mixture prepared in this way (Example 5), or ephrin-A3 (Example 6), shh (Example), which is a protein already known to have a hair-growth effect in the cell mixture. 7) and EGF (Example 8) were added in the amounts shown in Table 2, respectively, and seeded at the skin excision site of nude mice to examine whether a hair growth promoting effect was obtained. Cell seeding in nude mice and confirmation of the presence or absence of skin appendages in the formed artificial skin were carried out in the same manner as in Example 1.
各タンパク質を添加して培養した場合と、無添加の場合とで、毛包などの皮膚付属器の分化の程度を比較した。その結果、各タンパク質のいずれを添加した場合にも、無添加の場合と比較して毛包が形成され、組織において毛が生えたことが肉眼でも明らかであり、育毛効果も確認できた。中でもｅｐｈｒｉｎ−Ａ３を加えた場合（実施例６：図９）と無添加の場合（実施例５：図８）との間の毛包数の増加および育毛効果は、他のタンパク質の場合と比べて顕著であった。つまり評価した本人に適した育毛有効成分はｅｐｈｒｉｎ−Ａ３であることが分かった。 The degree of differentiation of skin appendages such as hair follicles was compared between when each protein was added and cultured, and when no protein was added. As a result, it was clear to the naked eye that hair follicles were formed when any of the respective proteins was added, compared with the case where no protein was added, and the hair grew in the tissue, and the hair growth effect could be confirmed. Among them, the increase in the number of hair follicles and the hair growth effect between the case where ephrin-A3 was added (Example 6: FIG. 9) and the case where no ephrin-A3 was added (Example 5: FIG. 8) were compared with the case of other proteins. It was remarkable. That is, it was found that ephrin-A3 is a hair growth active ingredient suitable for the evaluated individual.
このことから、本発明人工皮膚は育毛剤および育毛有効成分の試験に使用することができることが明らかとなった。すなわち、育毛試験をしたい本人の皮膚細胞から調製した人工皮膚を試験に用いることができるため、本人に合った育毛剤や育毛有効成分を選択することが可能となる。従って、従来の動物試験による育毛評価よりも個人に合った育毛評価が出来る。 From this, it became clear that the artificial skin of the present invention can be used for the test of a hair restorer and a hair restorer active ingredient. That is, since artificial skin prepared from the skin cells of the person who wants to perform a hair growth test can be used for the test, it becomes possible to select a hair growth agent and a hair growth active ingredient suitable for the person. Therefore, hair growth evaluation suitable for an individual can be performed rather than hair growth evaluation by a conventional animal test.
Ａ チャンバー
１ 蓋
２ 注入口
A Chamber 1 Lid 2 Inlet
Claims (8)
脂肪由来幹細胞の細胞数と、表皮ケラチノサイトおよび線維芽細胞の数を合計した皮膚細胞の細胞数との比が５０：１〜１：１０００である、
皮膚付属器形成能を有する培養細胞塊。 Including adipose-derived stem cells, epidermal keratinocytes, and fibroblasts suspended in collagen gel,
The ratio of the number of cells of adipose-derived stem cells and the number of skin cells obtained by adding the number of epidermal keratinocytes and fibroblasts is 50: 1 to 1: 1000,
A cultured cell mass having the ability to form skin appendages.
Priority Applications (1)
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