RU2301260C2

RU2301260C2 - Viral vectors with condition-dependent replication and their using

Info

Publication number: RU2301260C2
Application number: RU2003111469/13A
Authority: RU
Inventors: Юнг-Ниен ЧАНГ (US); Юнг-Ниен ЧАНГ; Ксиаобин ЛУ (US); Ксиаобин ЛУ; Владимир СЛЕПУШКИН (US); Владимир СЛЕПУШКИН; Бетти КОУНД (US); Бетти КОУНД; Брайан ДЭВИС (US); Брайан ДЭВИС; Квиао Ю (US); Квиао Ю; Янпинг ЯНГ (US); Янпинг ЯНГ; Рэндалл МЕРЛИНГ (US); Рэндалл МЕРЛИНГ; Вей ХАН (US); Вей Хан; Ядзин НИ (US); Ядзин НИ
Original assignee: Вирэкссис Корпорейшн
Priority date: 2000-09-22
Filing date: 2001-09-21
Publication date: 2007-06-20
Also published as: JP2004524813A; IL154987A0; CZ2003784A3; WO2002024897A3; WO2002024897A2; NO20031293L; WO2002024897A9; CA2422544A1; NO20031293D0; NZ525283A; EP1356070A2; AU9307501A

Abstract

FIELD: genetic engineering.

SUBSTANCE: invention relates to vectors used in genetic engineering. Invention proposes a lentiviral vector with condition-dependent replication that comprises two nucleotide sequences. The first nucleotide sequence reduces probability for formation of lentiviral vector able for replication. The second nucleotide sequence inhibits replication of lentivirus of wild type, helper virus or helper vector but it doesn't inhibit replication of dependent vectors, or it encodes proteins showing the same properties. Also, invention discloses these nucleotide sequences, method for preparing such vectors and their using. Invention can be used in medicine in prophylaxis and therapeutic treatment of viral diseases, in particular, HIV infection.

EFFECT: valuable biological properties of vectors.

45 cl, 53 dwg, 12 ex

Description

Относящиеся к этому заявкиRelated applications

Данная заявка связана с патентной заявкой США с серийным номером 09/524006, зарегистрированной 13 марта 2000 г., которая включена здесь в качестве ссылки, как здесь полностью объяснено.This application is related to US patent application serial number 09/524006, registered March 13, 2000, which is incorporated herein by reference, as fully explained here.

Область техники, к которой относится изобретениеFIELD OF THE INVENTION

В настоящем изобретении предлагаются усовершенствованные векторы с зависимой от условий репликацией, способы их получения, способы их размножения, селективной упаковки, модификации и применение векторов с зависимой от условий репликацией и лентивирусных векторов. Важно, что векторы обладают пониженной способностью становиться компетентными по репликации и при применении обладают, таким образом, повышенной безопасностью. Предлагаются также специфические последовательности нуклеотидов и аминокислот, относящиеся к векторам, фармацевтические композиции и клетки-хозяева, включающие векторы, применение таких клеток-хозяев для скрининга лекарств и способы применения векторов для определения функции гена. Способы также включают профилактическое и терапевтическое лечение заболевания, особенно вирусной инфекции и, в частности, HIV инфекции. Изобретение также направлено на прямые и непрямые способы создания новых вакцин для лечения инфекционных заболеваний, рака и других заболеваний, имеющих отношение к генетике, и на способы диагностики. Другие способы и композиции изобретения включают применение векторов с зависимой от условий репликацией и лентивирусных векторов для генно-инженерной терапии и для других целей.The present invention provides improved conditions-dependent replication vectors, methods for their preparation, methods for their propagation, selective packaging, modification and use of conditions-dependent replication vectors and lentiviral vectors. It is important that vectors have a reduced ability to become competent in replication and, when used, have thus increased security. Specific nucleotide and amino acid sequences related to vectors, pharmaceutical compositions and host cells including vectors, the use of such host cells for screening drugs, and methods for using vectors to determine gene function are also provided. The methods also include the prophylactic and therapeutic treatment of the disease, especially a viral infection and, in particular, HIV infection. The invention is also directed to direct and indirect methods of creating new vaccines for the treatment of infectious diseases, cancer and other diseases related to genetics, and to diagnostic methods. Other methods and compositions of the invention include the use of conditionally dependent replication vectors and lentiviral vectors for genetic engineering therapy and other purposes.

Предпосылки изобретенияBACKGROUND OF THE INVENTION

Открытие того, что вирус иммунодефицита человека (HIV), лентивирус, является причиной синдрома приобретенного иммунодефицита (СПИДа), способствовало всплеску исследований механизмов, лежащих в основе инфекционного цикла вируса и патогенеза вирусного заболевания. Исследование данных механизмов обеспечило исследователей все возрастающим количеством мишеней для разработки противовирусных агентов, эффективных не только против HIV, но и против продуктов HIV, его генома, а также других вирусов. Данные противовирусные агенты, особенно те, которые направлены против HIV, могут быть разделены на группы в зависимости от способа их действия. Такие группы включают ингибиторы обратной транскриптазы, соединения, конкурирующие с вирусом за вход в клетки, вакцины, ингибиторы протеаз, а также недавно появившуюся группу, обозначаемую здесь как "генетические противовирусные агенты".The discovery that human immunodeficiency virus (HIV), lentivirus, is the cause of Acquired Immunodeficiency Syndrome (AIDS), has sparked a surge in research into the mechanisms underlying the viral infection cycle and the pathogenesis of viral disease. The study of these mechanisms provided researchers with an increasing number of targets for the development of antiviral agents that are effective not only against HIV, but also against HIV products, its genome, as well as other viruses. These antiviral agents, especially those directed against HIV, can be divided into groups depending on their mode of action. Such groups include reverse transcriptase inhibitors, compounds competing with the virus for entry into the cells, vaccines, protease inhibitors, as well as the recently appeared group, referred to herein as “genetic antiviral agents”.

Обычно каждый тип противовирусного агента имеет свои собственные преимущества и ограничения, и они должны быть оценены исходя из необходимости лечения при конкретной ситуации. Противовирусные агенты, такие как зидовудин (3'-азидо-3'-дезокситимидин, также известный как AZT), ингибиторы протеаз и тому подобное могут быть доставлены в клетки организма больного с относительной легкостью, и они интенсивно изучаются. Имея мишенью один конкретный фактор в инфекционном цикле вируса, такие агенты, как доказано, относительно малоэффективны против HIV. Это в первую очередь обусловлено тем фактом, что штаммы HIV быстро изменяются и становятся устойчивыми к агентам, имеющим единственный локус воздействия (Richman, AIDS Res. and Hum. Retrovir., 8, 1065-1071 (1992)). Соответственно, проблемы генетической вариабельности и быстрой мутации в геномах HIV вынуждают разрабатывать новые стратегии противовирусной терапии для лечения HIV инфекций. Среди данных стратегий привлекательными являются генетические противовирусные агенты, так как они работают на множестве различных внутриклеточных уровней.Typically, each type of antiviral agent has its own advantages and limitations, and they should be evaluated based on the need for treatment in a particular situation. Antiviral agents such as zidovudine (3'-azido-3'-deoxythymidine, also known as AZT), protease inhibitors and the like can be delivered to the patient’s body cells with relative ease, and they are intensively studied. Having targeted one specific factor in the infection cycle of the virus, such agents have been proven to be relatively ineffective against HIV. This is primarily due to the fact that HIV strains change rapidly and become resistant to agents having a single locus of exposure (Richman, AIDS Res. And Hum. Retrovir., 8, 1065-1071 (1992)). Accordingly, the problems of genetic variability and rapid mutation in the HIV genomes are forcing the development of new antiviral therapy strategies to treat HIV infections. Among these strategies, genetic antiviral agents are attractive, as they work at many different intracellular levels.

Генетические противовирусные агенты отличаются от других терапевтических агентов тем, что они переносятся в клетку-мишень как молекулярные элементы, где они защищают клетку от вирусной инфекции (Baltimore, Nature, 325, 395-396 (1988); и Dropulic' et al., Hum. Gene Ther., 5, 927-939 (1994)). Генетические противовирусные агенты могут представлять собой любую генетическую последовательность и включают, но не ограничиваются этим, антисмысловые молекулы, ловушки РНК, трансдоминантные мутанты, интерфероны, токсины, иммуногены и рибозимы. В частности, рибозимы являются генетическими противовирусными агентами, подобными антисмысловым, которые расщепляют РНК-мишени, включая РНК HIV, специфически зависимым от последовательности образом. Специфичность опосредованного рибозимами расщепления РНК-мишени предполагает возможность применения рибозимов в качестве терапевтических ингибиторов репликации вирусов, включая репликацию HIV. Различные типы рибозимов, такие как рибозимы в форме головки молотка и шпильки для волос, применяли в анти-HIV стратегии (см., например, патенты США № 5144019, 5180818 и 5272262 и патентные заявки PCT № WO 94/01549 и WO 93/23569). Как рибозимы в форме головки молотка, так и рибозимы в форме шпильки для волос могут быть сконструированы для разрушения любой РНК-мишени, которая содержит последовательность GUC (Haseloff et al., Nature, 334, 585-591 (1988); Uhlenbeck, Nature, 334, 585 (1987); Hampel et al., Nuc. Acids Res., 18, 299-304 (1990); и Symons, Ann. Rev. Biochem., 61, 641-671 (1992)). В общем виде рибозимы в форме головки молотка имеют два типа функциональных доменов, консервативный каталитический домен с двумя примыкающими гибридизационными доменами. Гибридизационные домены связываются с последовательностями, окружающими последовательность GUC, и каталитический домен расщепляет РНК-мишень с 3' конца от последовательности GUC (Uhlenbeck (1987), выше; Haseloff et al. (1988), выше; и Symons (1992), выше).Genetic antiviral agents differ from other therapeutic agents in that they are transferred to the target cell as molecular elements, where they protect the cell from viral infection (Baltimore, Nature, 325, 395-396 (1988); and Dropulic 'et al., Hum Gene Ther., 5, 927-939 (1994)). Genetic antiviral agents can be any genetic sequence and include, but are not limited to, antisense molecules, RNA traps, transdominant mutants, interferons, toxins, immunogens and ribozymes. In particular, ribozymes are antiviral genetic antiviral agents that cleave target RNAs, including HIV RNA, in a sequence-specific manner. The specificity of ribozyme-mediated cleavage of the target RNA suggests the possibility of using ribozymes as therapeutic inhibitors of viral replication, including HIV replication. Various types of ribozymes, such as hammer heads and hairpins, have been used in anti-HIV strategies (see, for example, US Pat. Nos. 5,144,019, 5,180,818 and 5,272,262 and PCT Patent Applications No. WO 94/01549 and WO 93/23569 ) Both ribozymes in the form of a hammer head and ribozymes in the form of hairpins can be designed to destroy any target RNA that contains the GUC sequence (Haseloff et al., Nature, 334, 585-591 (1988); Uhlenbeck, Nature, 334, 585 (1987); Hampel et al., Nuc. Acids Res., 18, 299-304 (1990); and Symons, Ann. Rev. Biochem., 61, 641-671 (1992)). In general, hammerhead-shaped ribozymes have two types of functional domains, a conservative catalytic domain with two adjacent hybridization domains. Hybridization domains bind to sequences surrounding the GUC sequence, and the catalytic domain cleaves the target RNA from the 3 'end of the GUC sequence (Uhlenbeck (1987), above; Haseloff et al. (1988), above; and Symons (1992), above) .

Ряд исследований подтвердил, что рибозимы могут быть, по меньшей мере, частично эффективными при ингибировании размножения HIV в клетках тканевых культур (смотри, например, Sarver et al., Science, 247, 1222-1225 (1990); Sarver et al., NIH Res., 5, 63-67 (1993a); Dropulic' et al., J. Virol., 66, 1432-1441 (1992); Dropulic' et al., Methods: Comp.Meth. Enzymol., 5, 43-49 (1993); Ojwang et al., PNAS, 89, 10802-10806 (1992); Yu et al., PNAS, 90, 6340-6344 (1993); и Weerasinghe et al., J. Virol., 65, 5531-5534 (1991)). В частности Sarver et al. ((1990), выше) показали, что рибозимы в форме головки молотка, предназначенные для расщепления в транскрибируемой области гена gag HIV, т.е. рибозимы против gag, могут специфически расщеплять РНК gag HIV in vitro. Более того, когда клеточные линии, экспрессирующие рибозимы против gag, инфицировали HIV-1, наблюдали от 50- до 100-кратное ингибирование репликации HIV. Сходно Weerasinghe et al. ((1991), выше) показали, что ретровирусные векторы, кодирующие рибозимы, предназначенные для расщепления в последовательности U5 РНК HIV-1, придают трансдуцированным клеткам устойчивость к HIV при последующем инфицировании HIV. Хотя различные клоны трансдуцированных клеток проявляли разные уровни устойчивости к инфицированию, что определялось с помощью промоторной системы, применяемой для управления экспрессией рибозимов, большинство клеточных линий, экспрессирующих рибозимы, становятся способными экспрессировать HIV после ограниченного времени культивирования.A number of studies have confirmed that ribozymes can be at least partially effective in inhibiting the growth of HIV in tissue culture cells (see, for example, Sarver et al., Science, 247, 1222-1225 (1990); Sarver et al., NIH Res., 5, 63-67 (1993a); Dropulic 'et al., J. Virol., 66, 1432-1441 (1992); Dropulic' et al., Methods: Comp. Matt. Enzymol., 5, 43 -49 (1993); Ojwang et al., PNAS, 89, 10802-10806 (1992); Yu et al., PNAS, 90, 6340-6344 (1993); and Weerasinghe et al., J. Virol., 65 5531-5534 (1991)). In particular, Sarver et al. ((1990), supra) showed that hammerhead-shaped ribozymes designed to cleave in the transcribed region of the HIV gag gene, i.e. anti-gag ribozymes, can specifically cleave HIV gag RNA in vitro. Moreover, when cell lines expressing anti-gag ribozymes infected with HIV-1, 50- to 100-fold inhibition of HIV replication was observed. Similarly, Weerasinghe et al. ((1991), supra) showed that retroviral vectors encoding ribozymes designed to cleave HIV-1 RNA in the U5 sequence confer HIV resistance to transduced cells upon subsequent HIV infection. Although different clones of the transduced cells showed different levels of resistance to infection, as determined by the promoter system used to control the expression of ribozymes, most cell lines expressing ribozymes become able to express HIV after a limited cultivation time.

Трансдукция клеток тканевых культур провирусом в ген nef (который не является необходимым для репликации вирусов в тканевой культуре), в который был введен рибозим, гибридизационные домены которого были специфичными для области U5 HIV, как показано, ингибирует репликацию вирусов в трансдуцированных клетках в 100 раз по сравнению с клетками, трансдуцированными провирусами дикого типа (смотри, например, Dropulic' et al. (1992) и (1993), выше). Сходно, рибозимы в форме шпильки для волос, как показано, ингибируют репликацию HIV в Т-клетках, трансдуцированных векторами, содержащими рибозимы в форме шпильки для волос U5, и инфицированных HIV (Ojwang et al. (1992), выше). Другие исследования показали, что векторы, содержащие рибозимы, экспрессирующиеся с промотора тРНК, также ингибируют различные штаммы HIV (Yu et al. (1993), выше).Transduction of tissue culture cells with a provirus into the nef gene (which is not necessary for virus replication in tissue culture), into which a ribozyme was introduced, the hybridization domains of which were specific for the HIV U5 region, as shown, inhibits virus replication in transduced cells by a factor of 100 compared to cells transduced with wild-type proviruses (see, for example, Dropulic 'et al. (1992) and (1993) above). Similarly, hairpin-shaped ribozymes have been shown to inhibit HIV replication in T cells transduced with vectors containing U5 hairpin-shaped ribozymes and infected with HIV (Ojwang et al. (1992), supra). Other studies have shown that vectors containing ribozymes expressed from the tRNA promoter also inhibit various strains of HIV (Yu et al. (1993), supra).

Доставка рибозимов или других генетических противовирусных агентов к клеточным мишеням HIV инфекции (например, к T-клеткам CD4+ и моноцитам/макрофагам) являлась существенным препятствием для эффективного генетического терапевтического лечения СПИДа. Современные подходы к направленной доставке к клеткам гемопоэтической системы (т.е. к первичным мишеням для HIV инфекции) требуют введение терапевтических генов в предшественник мультипотентных стволовых клеток, который в процессе дифференцировки дает ряд зрелых Т-клеток или, в противоположном варианте, превращается в сами зрелые Т-лимфоциты CD4+. Направленная доставка в стволовые клетки является, однако, проблематичной, так как клетки трудно культивировать и трансдуцировать in vitro. Направленная доставка в циркулирующие Т-лимфоциты также является проблематичной, так как данные клетки настолько широко распространены, что трудно охватить все клетки-мишени, применяя имеющиеся в настоящее время векторные системы доставки. Более того, макрофаги необходимо рассматривать как клеточные мишени, поскольку они представляют собой главный источник распространения вирусов к другим органам. Однако, так как макрофаги находятся на конечной стадии дифференцировки и, следовательно, не способны к клеточному делению, их нелегко трансдуцировать обычно применяемыми векторами.The delivery of ribozymes or other genetic antiviral agents to cellular targets of HIV infection (e.g., CD4 + T cells and monocytes / macrophages) has been a significant obstacle to the effective genetic therapeutic treatment of AIDS. Modern approaches to targeted delivery to the cells of the hematopoietic system (i.e., to primary targets for HIV infection) require the introduction of therapeutic genes into the precursor of multipotent stem cells, which in the process of differentiation produces a number of mature T cells or, in the opposite case, turns into mature T-lymphocytes CD4 +. Targeted stem cell delivery is, however, problematic since cells are difficult to cultivate and transduce in vitro. Targeted delivery to circulating T-lymphocytes is also problematic, since these cells are so widespread that it is difficult to reach all target cells using currently available vector delivery systems. Moreover, macrophages must be considered as cellular targets, since they represent the main source of the spread of viruses to other organs. However, since macrophages are at the final stage of differentiation and therefore not capable of cell division, they are not easily transduced by commonly used vectors.

Соответственно, преобладающий в настоящее время подход к лечению HIV основывается на применении вирусных векторов с дефектом репликации и упаковывающих (т.е. "хелперных") клеточных линий (смотри, например, Buchschacher, JAMA, 269(22), 2880-2886 (1993); Anderson, Science, 256, 808-813 (1992); Miller, Nature, 357, 455-460 (1992); Mulligan, Science, 260, 926-931 (1993); Friedmann, Science, 244, 1275-1281 (1989); и Cournoyer et al., Ann. Rev. Immunol., 11, 297-329 (1993)) для введения в клетки, восприимчивые к вирусной инфекции (такой как HIV инфекция), чужеродного гена, который специфически вмешивается в репликацию вирусов или который вызывает гибель инфицированной клетки (обобщено Buchschacher (1993), выше). Такие вирусные векторы с дефектом репликации содержат в дополнение к интересующему чужеродному гену цис-действующие последовательности, необходимые для репликации вирусов, но не содержат последовательности, которые кодируют важнейшие вирусные белки. Следовательно, такой вектор не способен завершить цикл репликации вируса и для его размножения применяется хелперная клеточная линия, которая содержит и конститутивно экспрессирует вирусные гены в своем геноме. После введения вирусного вектора с дефектом репликации в хелперную клеточную линию белки, требуемые для образования вирусной частицы, предоставляются в ней вектору и продуцируются векторные вирусные частицы, способные инфицировать клетки-мишени и экспрессировать в них ген, который вмешивается в репликацию вирусов или вызывает гибель инфицированной вирусом клетки.Accordingly, the currently prevailing approach to HIV treatment is based on the use of replication-defective viral vectors and packaging (ie “helper”) cell lines (see, for example, Buchschacher, JAMA, 269 (22), 2880-2886 (1993 ); Anderson, Science, 256, 808-813 (1992); Miller, Nature, 357, 455-460 (1992); Mulligan, Science, 260, 926-931 (1993); Friedmann, Science, 244, 1275-1281 (1989); and Cournoyer et al., Ann. Rev. Immunol., 11, 297-329 (1993)) for introducing into a cell susceptible to a viral infection (such as HIV infection) a foreign gene that specifically interferes with replication viruses or which causes the death of an infected person oh cell (summarized by Buchschacher (1993), supra). Such replication-defective viral vectors contain, in addition to the foreign gene of interest, the cis-active sequences necessary for virus replication, but do not contain sequences that encode the most important viral proteins. Therefore, such a vector is not able to complete the virus replication cycle and a helper cell line that contains and constitutively expresses viral genes in its genome is used to propagate it. After introducing a replication defective virus vector into the helper cell line, the proteins required for the formation of the virus particle are provided to the vector and the vector virus particles are produced that can infect target cells and express a gene in them that interferes with virus replication or causes the death of an infected virus cells.

Такие ретровирусные векторы с дефектом репликации включают аденовирусы и вирусы, ассоциированные с аденовирусами, а также те ретровирусные векторы, которые применяют в клинических испытаниях при генной терапии HIV, и, в частности, мышиный амфотропный ретровирусный вектор, известный как вирус мышиного лейкоза Молони (MuLV). Данные дефектные вирусные векторы применяли для трансдукции клеток CD4+ генетическими противовирусными агентами, такими как рибозимы против HIV, с различной степенью успешности (Sarver et al. (1990), выше; Weerasinghe et al. (1991), выше; Dropulic' et al. (1993), выше; Ojwang et al. (1992), выше; и Yu et al. (1993), выше). Однако применение данных векторов для генной терапии HIV существенно ограничено. Например, высокая частота трансдукции особенно важна для лечения HIV, когда вектор должен трансдуцировать либо редкие гемопоэтические стволовые клетки-предшественники CD34+, либо широко рассеянные клетки-мишени CD4+, большинство из которых в течение клинически "латентной" стадии заболевания уже инфицированы HIV. Векторы MuLV, однако, трудно получить с высоким титром, следовательно, результатом является редкая трансдукция. Более того, не получена длительная экспрессия трансдуцированной ДНК в стволовых клетках-предшественниках CD34+, в частности, после их дифференцировки в зрелые Т-лимфоциты. Кроме того, применение дефектных вирусных векторов требует стратегий переноса генов ex vivo (смотри, например, патент США No. 5399346), что может быть дорогостоящим и недоступным по цене для общей популяции.Such replication-defective retroviral vectors include adenoviruses and viruses associated with adenoviruses, as well as those retroviral vectors that are used in clinical trials of HIV gene therapy, and in particular the murine amphotropic retroviral vector known as Moloney murine leukemia virus (MuLV) . These defective viral vectors have been used to transduce CD4 + cells with genetic antiviral agents, such as anti-HIV ribozymes, with varying degrees of success (Sarver et al. (1990), supra; Weerasinghe et al. (1991), supra; Dropulic 'et al. ( 1993), supra; Ojwang et al. (1992), supra; and Yu et al. (1993), supra). However, the use of these vectors for HIV gene therapy is significantly limited. For example, a high frequency of transduction is especially important for HIV treatment, when the vector must transduce either rare hematopoietic CD34 + progenitor stem cells or widely scattered CD4 + target cells, most of which are already infected with HIV during the clinically “latent” stage of the disease. MuLV vectors, however, are difficult to obtain with a high titer, therefore, the result is rare transduction. Moreover, the long-term expression of transduced DNA was not obtained in CD34 + progenitor stem cells, in particular, after their differentiation into mature T-lymphocytes. In addition, the use of defective viral vectors requires ex vivo gene transfer strategies (see, for example, US Pat. No. 5,399,346), which can be expensive and not affordable for the general population.

Данные недостатки, связанные с применением доступных в настоящее время векторов для генного терапевтического лечения СПИДа, привели ученых к поиску новых вирусных векторов. Одним таким вектором является сам HIV. Векторы HIV применяли для исследований инфекционности (Page et al., J. Virol., 64, 5270-5276 (1990)) и для введения генов (таких как гены-самоубийцы) в клетки CD4+, особенно в клетки CD4+, инфицированные HIV (смотри, например, Buchschacher et al., Hum. Gener. Ther., 3, 391-397 (1992); Richardson et al., J. Virol., 67, 3997-4005 (1993); Carroll et al., J. Virol., 68, 6047-6051 (1994); и Parolin et al., J. Virol., 68, 3888-3895 (1994)). Стратегия данных исследований заключается в применении HIV-векторов для введения генов в Т-клетки CD4+ и моноциты.These shortcomings associated with the use of currently available vectors for the gene therapeutic treatment of AIDS have led scientists to search for new viral vectors. One such vector is HIV itself. HIV vectors have been used for infectivity studies (Page et al., J. Virol., 64, 5270-5276 (1990)) and for introducing genes (such as suicide genes) into CD4 + cells, especially HIV-infected CD4 + cells (see e.g. Buchschacher et al., Hum. Gener. Ther., 3, 391-397 (1992); Richardson et al., J. Virol., 67, 3997-4005 (1993); Carroll et al., J. Virol., 68, 6047-6051 (1994); and Parolin et al., J. Virol., 68, 3888-3895 (1994)). The strategy of these studies is to use HIV vectors to introduce genes into CD4 + T cells and monocytes.

В настоящий момент, однако, данные векторы являются крайне сложными. Более того, применение данных векторов сопровождается риском выработки HIV дикого типа в результате внутриклеточной рекомбинации. Совместная трансфекция/совместное инфицирование последовательностями дефектного вектора и хелперным вирусом, как обнаружено, ведет к рекомбинации между гомологичными областями вирусных геномов (Inoue et al., PNAS, 88, 2278-282 (1991)). Выявленная комплементация in vitro указывает на то, что сходный вектор с дефектной репликацией HIV может рекомбинировать in vivo, обостряя таким образом уже существующую HIV-инфекцию. Тот факт, что в ретровирусах упаковано два генома РНК в одном вирионе, привел исследователей к предположению о том, что ретровирусы несут две вирусных РНК для обхода любых генетических дефектов, вызываемых комплементацией и/или рекомбинацией (Inoue et al., (1991), выше).At the moment, however, these vectors are extremely complex. Moreover, the use of these vectors is associated with the risk of wild-type HIV production as a result of intracellular recombination. Co-transfection / co-infection with sequences of a defective vector and a helper virus has been found to lead to recombination between homologous regions of the viral genomes (Inoue et al., PNAS, 88, 2278-282 (1991)). Revealed complementation in vitro indicates that a similar vector with defective HIV replication can recombine in vivo, exacerbating an already existing HIV infection. The fact that two RNA genomes are packed in retroviruses in one virion has led researchers to suggest that retroviruses carry two viral RNAs to bypass any genetic defects caused by complementation and / or recombination (Inoue et al., (1991), supra )

В дополнение к риску внутриклеточной рекомбинации, в результате чего возникает HIV дикого типа, HIV-векторы имеют ассоциированный риск мутации in vivo, что увеличивает патогенность вирусного вектора. Это привело Sarver et al. (AIDS Res. and Hum. Retrovir., 9, 483-487 (1993b)) к предположению, касающемуся разработки второго поколения рекомбинантных HIV-векторов, которые компетентны в отношении репликации, но еще не патогенны. Такие векторы по сравнению с преимущественно используемыми нереплицирующимися векторами (т.е. векторами с дефицитом репликации) продолжают реплицироваться у больного, создавая таким образом постоянную конкуренцию HIV дикого типа. Однако до настоящего времени такие векторы не доступны.In addition to the risk of intracellular recombination, resulting in wild-type HIV, HIV vectors have an associated risk of in vivo mutation, which increases the pathogenicity of the viral vector. This led Sarver et al. (AIDS Res. And Hum. Retrovir., 9, 483-487 (1993b)) to the assumption regarding the development of a second generation of recombinant HIV vectors that are replication competent but not yet pathogenic. Such vectors, as compared to the predominantly used non-replicating vectors (i.e., replication deficient vectors), continue to replicate in the patient, thereby creating constant competition for wild-type HIV. However, to date, such vectors are not available.

В идеале наилучшая возможность лечения инфицированного индивидуума имеется в момент инокуляции, до того даже как вирус инфицирует хозяина. Однако это трудно достичь ввиду того, что многие индивидуумы не понимают, что они стали инфицированными HIV до клинической латентной фазы заболевания. Основываясь на этом, стадия, на которой противовирусное вмешательство максимально необходимо, представляет собой стадию клинически латентного периода. Терапия на данной стадии требует противостояния заражению, представленному большим числом уже инфицированных лимфоцитов CD4+, которые несут вирусные геномы. Это не обычное заражение, о чем свидетельствует тот факт, что к настоящему времени HIV остается неизлечимым и только в малой степени поддающимся лечению с помощью доступных к настоящему времени способов терапии. Эффективная вакцина не появляется и, хотя ингибиторы обратной транскриптазы и протеазы, как показано, предотвращают репликацию HIV в тканевой культуре, развитие устойчивости вируса in vivo ведет к несостоятельности лечения. Таким образом, терапия геном HIV может приносить небольшую пользу подавляющему большинству индивидуумов, инфицироанных HIV, которых к настоящему времени более 30 миллионов.Ideally, the best treatment option for an infected individual is at the time of inoculation, even before the virus infects the host. However, this is difficult to achieve due to the fact that many individuals do not understand that they became infected with HIV before the clinical latent phase of the disease. Based on this, the stage at which antiviral intervention is most necessary is the stage of a clinically latent period. Therapy at this stage requires confronting the infection represented by a large number of already infected CD4 + lymphocytes that carry the viral genomes. This is not a common infection, as evidenced by the fact that HIV has so far remained incurable and only to a small extent treatable with currently available treatment methods. An effective vaccine does not appear, and although reverse transcriptase and protease inhibitors have been shown to prevent HIV replication in tissue culture, the development of virus resistance in vivo leads to treatment failure. Thus, HIV gene therapy may be of little benefit to the vast majority of individuals infected with HIV, of which there are currently more than 30 million.

В свете представленного выше становится все более важным получение длительных и устойчивых иммунологических ответов на определенные патогены, особенно вирусы, в частности в связи, например, со СПИДом и раком. Рассматривались живые аттенуированные (LA) вакцины с применением компетентных в отношении репликации, но непатогенных вирусов (Daniel et al., Science, 258, 1938-1941 (1992); и Desrosiers, AIDS Res. & Human Retrovir., 10, 331-332 (1994)). Однако такие непатогенные вирусы, которые отличаются от соответствующих вирусов дикого типа делецией в одном или более генов, либо (i) не могут вызывать защитного иммунного ответа, потому что антиген не сохраняется (из-за того, что LA-вирус эффективно не реплицируется); или (ii) LA-вирус реплицируется, но имеет другой патогенный потенциал, что оценивается по способности LA-вируса вызывать заболевание в моделях молодых животных (Baba et al., Science, 267, 1823-1825 (1995)).In the light of the above, it is becoming increasingly important to obtain long-term and sustained immunological responses to certain pathogens, especially viruses, in particular in connection with, for example, AIDS and cancer. Live attenuated (LA) vaccines were considered using replication-competent but non-pathogenic viruses (Daniel et al., Science, 258, 1938-1941 (1992); and Desrosiers, AIDS Res. & Human Retrovir., 10, 331-332 (1994)). However, such non-pathogenic viruses that differ from the corresponding wild-type viruses by deletion in one or more genes, or (i) cannot elicit a protective immune response because the antigen is not preserved (due to the fact that the LA virus does not efficiently replicate); or (ii) the LA virus replicates, but has a different pathogenic potential, as measured by the ability of the LA virus to cause disease in young animal models (Baba et al., Science, 267, 1823-1825 (1995)).

По указанным выше причинам остается необходимость в альтернативных профилактических и терапевтических модальностях лечения вирусной инфекции, особенно в плане СПИДа и рака. В настоящем изобретении предлагаются такие альтернативные способы в результате предложения вектора с зависимой от условий репликацией. В изобретении также предлагаются такие дополнительные способы, в которых может применяться такой вектор. В изобретении дополнительно предлагаются хелперные векторные конструкты, которые дополняют вектор с зависимой от условий репликацией, для обеспечения его репликации и упаковки в виде вирусных частиц и вирионов. Такие хелперные векторы модифицированы так, что рекомбинация с вектором с зависимой от условий репликацией сведена к минимуму. Описаны различные осуществления конструктов таких хелперных векторов. Данные и другие цели и преимущества настоящего изобретения, также как дополнительные черты изобретения, будут ясны из представленного здесь описания изобретения.For the above reasons, there remains a need for alternative prophylactic and therapeutic modalities for treating viral infection, especially in terms of AIDS and cancer. The present invention provides such alternative methods by proposing a conditionally replicating vector. The invention also provides such additional methods in which such a vector can be applied. The invention further provides helper vector constructs that complement the conditionally replicated vector to allow for its replication and packaging in the form of viral particles and virions. Such helper vectors are modified so that recombination with a conditionally replicated vector is minimized. Various implementations of constructs of such helper vectors are described. These and other objects and advantages of the present invention, as well as additional features of the invention, will be apparent from the description of the invention presented herein.

Краткое изложение существа изобретенияSummary of the invention

В настоящем изобретении предлагаются усовершенствованные векторы с зависимой от условий репликацией, а также усовершенствованные композиции и способы получения и применения указанных векторов. Вектор с зависимой от условий репликацией характеризуется способностью к репликации только в клетке-хозяине, которая является пермиссивной для репликации вектора. Предлагаемые здесь усовершенствованные векторы характеризуются повышенной безопасностью, обладая пониженным риском восстановления репликативной компетенции. Векторы как таковые могут также обозначаться векторами с "пониженной рекомбинацией".The present invention provides improved conditions-dependent replication vectors, as well as improved compositions and methods for the preparation and use of these vectors. A conditionally replicated vector is characterized by the ability to replicate only in the host cell, which is permissive for replicating the vector. The advanced vectors offered here are characterized by increased security, with a reduced risk of restoring replicative competence. Vectors as such can also be denoted by vectors with "reduced recombination."

В одном аспекте изобретения усовершенствованный вектор с зависимой от условий репликацией включает, по меньшей мере, одну последовательность нуклеиновой кислоты, присутствие, транскрипция или трансляция которой придает вектору в клетке-хозяине, разрешающей репликацию, селективное преимущество над штаммом вируса дикого типа, соответствующим вирусу, от которого произошел вектор. Предпочтительно усовершенствованный вектор с зависимой от условий репликацией включает, по меньшей мере, одну последовательность нуклеиновой кислоты, которая придает вектору селективное преимущество в отношении репликации над любым другим конкурирующим геномом или элементом генома. Применяемый здесь термин элемент генома определяется как последовательность нуклеиновой кислоты в клетке-хозяине, которая не происходит ни от вектора, ни от любого вируса дикого типа и которая может конкурировать, вмешиваться или влиять на репликацию вектора в клетке-хозяине. Элемент генома не является также полным геномом, таким как геном клетки-хозяина или другого вектора или вируса. Селективное преимущество для репликации придается благодаря присутствию, транскрипции или трансляции указанной последовательности нуклеиновой кислоты.In one aspect of the invention, an improved conditionally replicated vector comprises at least one nucleic acid sequence, the presence, transcription or translation of which gives the vector in the replication-enabled host cell a selective advantage over the wild-type strain of the virus corresponding to which happened the vector. Preferably, an improved conditionally replicating vector includes at least one nucleic acid sequence that gives the vector a selective advantage over replication over any other competing genome or genome element. As used herein, the term “genome element” is defined as a nucleic acid sequence in a host cell that does not originate from a vector or from any wild-type virus and which can compete, interfere or affect the replication of the vector in the host cell. An element of the genome is also not a complete genome, such as the genome of a host cell or other vector or virus. A selective advantage for replication is given by the presence, transcription or translation of the indicated nucleic acid sequence.

В другом предпочтительном осуществлении вектор с зависимой от условий репликацией представляет собой ретровирус, особенно лентивирус, и включает, по меньшей мере, одну последовательность нуклеиновой кислоты, присутствие, транскрипция или трансляция которой придает клетке-хозяину, которая инфицирована вектором, селективное преимущество над клеткой, инфицированной штаммом вируса дикого типа, соответствующим вирусу, от которого произошел вектор. В противоположном варианте вектор не является полностью производным штамма дикого типа, а является химерным, содержащим компоненты, которые происходят более чем от одного вируса дикого типа. Более чем один вирус дикого типа может представлять собой различные (или гетерологичные) вирусы или различные штаммы или изоляты одного вируса. Предпочтительно указанная последовательность нуклеиновой кислоты может быть экспрессирована для обеспечения профилактического эффекта в указанной клетке-хозяине. Это ведет к клетке, которой придано преимущество в жизнеспособности, так как последовательность нуклеиновой кислоты не дает любому инфицирующему вирусу реплицироваться до уровней, которые вызывают гибель клетки.In another preferred embodiment, the conditionally dependent replication vector is a retrovirus, especially a lentivirus, and includes at least one nucleic acid sequence whose presence, transcription or translation gives the host cell that is infected with the vector a selective advantage over the cell infected a wild-type virus strain corresponding to the virus from which the vector originated. In the opposite embodiment, the vector is not fully derived from the wild-type strain, but is chimeric, containing components that are derived from more than one wild-type virus. More than one wild-type virus can be different (or heterologous) viruses or different strains or isolates of the same virus. Preferably, said nucleic acid sequence can be expressed to provide a prophylactic effect in said host cell. This leads to a cell that has been given an advantage in viability, since the nucleic acid sequence prevents any infectious virus from replicating to levels that cause cell death.

Другим предпочтительным осуществлением является усовершенствованный плазмидный вектор с зависимой от условий репликацией, включающий, по меньшей мере, одну последовательность нуклеиновой кислоты, которая придает вектору селективное репликативное преимущество над любой другой конкурирующей векторной или плазмидной молекулой. Например, такие векторы могут включать последовательность (такую как, например, рибозим или антисмысловую последовательность), способную расщеплять или разрушать или приводить к расщеплению или разрушению, что ведет к расщеплению конкурирующего вектора или плазмиды, когда они локализованы совместно с вектором. Если конкурирующий вектор и хелпер должны быть разрушены, то вектор изобретения сконструирован так, что содержит другие последовательности для придания ему полного селективного преимущества в репликации. Например, вектор изобретения может содержать антисмысловую последовательность, которая разрушает как конкурирующий вектор, так и хелпер, а вектор все еще будет иметь селективное преимущество в репликации, потому что он дополнительно содержит вторую первичную нуклеотидную последовательность (например, промотор, который продуцирует больше векторной РНК по сравнению с РНК конкурирующего вектора, число копий вектора в трансдуцированной клетке, большее, чем в конкурирующем геноме, или сигнал упаковки, который присутствует в векторе, но не в хелпере), что придает вектору с зависимой от условий репликацией полное селективное преимущество в репликации. Следовательно, по меньшей мере, первая нуклеотидная последовательность дополнительно обеспечивает полное селективное преимущество в репликации векторов изобретения в данном осуществлении, потому что две первичные нуклеотидные последовательности (т.е. первая первичная нуклеотидная последовательность, являющаяся мишенью конкурирующего вектора и/или хелпера, и вторая первичная нуклеотидная последовательность обеспечивает селективное преимущество в репликации) работают совместно для достижения эффекта полного селективного преимущества. Следовательно, синергические эффекты множественных первичных нуклеотидных последовательностей могут вести к полностью селективным условиям для вектора с зависимой от условий репликацией, где любая индивидуальная первичная нуклеотидная последовательность обеспечивает дискриминацию селекции по отношению к конкурирующему геному.Another preferred embodiment is an improved conditionally replicated plasmid vector, comprising at least one nucleic acid sequence that gives the vector a selective replicative advantage over any other competing vector or plasmid molecule. For example, such vectors may include a sequence (such as, for example, a ribozyme or antisense sequence) capable of cleaving or destroying or leading to cleavage or destruction, which leads to cleavage of the competing vector or plasmid when they are localized with the vector. If the competing vector and the helper must be destroyed, then the vector of the invention is designed to contain other sequences to give it a complete selective advantage in replication. For example, the vector of the invention may contain an antisense sequence that destroys both the competing vector and the helper, and the vector will still have a selective advantage in replication because it additionally contains a second primary nucleotide sequence (for example, a promoter that produces more vector RNA by compared to the RNA of a competing vector, the number of copies of the vector in the transduced cell is greater than in the competing genome, or a packaging signal that is present in the vector but not helper), which gives a vector dependent on the replication environment complete selective advantage replication. Therefore, at least the first nucleotide sequence further provides a complete selective advantage in replicating the vectors of the invention in this embodiment, because there are two primary nucleotide sequences (i.e., the first primary nucleotide sequence that is the target of a competing vector and / or helper, and the second primary the nucleotide sequence provides a selective advantage in replication) work together to achieve the full selective advantage effect Properties. Consequently, the synergistic effects of multiple primary nucleotide sequences can lead to completely selective conditions for a conditionally replicated vector, where any individual primary nucleotide sequence discriminates against the competing genome.

Расщепление или деструкция конкурирующего вектора или плазмиды снижает также возможность полноразмерной рекомбинации с вектором, который, таким образом, обладает свойством "пониженной рекомбинации". Вектор может быть защищен от расщепления путем индукции вырождения его последовательности для того, чтобы она не была мишенью рибозима или антисмысловой последовательности. Вектор может быть дополнительно защищен от расщепления путем конструирования вектора или геномной версии вектора для дифференциального отслеживания РНК, так что РНК геномного вектора существенно не расщепляется конкурирующим вектором или хелпером. В противоположном варианте может быть сходно и исключительно сконструирован хелпер путем, например, вставки элементов сплайсинга для внедрения хелпера в сплайсосому, при конструировании векторной геномной РНК для включения в нее первых последовательностей нуклеиновой кислоты, которые присутствуют только в не подвергнутой сплайсингу, но не в подвергнутой сплайсингу векторной РНК. Такие неограничивающие примеры усовершенствованных векторов особенно выгодны для применения при получении вирусного вектора или плазмидного вектора и клонирования или субклонирования последовательностей нуклеиновой кислоты в такие векторы, а также при их применении для мутагенеза, экспрессии индуцибельных генов и тому подобное.Cleavage or destruction of a competing vector or plasmid also reduces the possibility of full-size recombination with a vector, which, therefore, has the property of "reduced recombination". A vector can be protected from cleavage by inducing degeneration of its sequence so that it is not a target of the ribozyme or antisense sequence. The vector can be further protected against cleavage by constructing a vector or genomic version of the vector for differential RNA tracking, so that the RNA of the genomic vector is not substantially cleaved by a competing vector or helper. In the opposite embodiment, a helper can be similarly and exclusively constructed by, for example, inserting splicing elements to insert a helper into the spliceosome, when constructing a vector genomic RNA to include the first nucleic acid sequences that are present only in the un-spliced but not in the spliced vector RNA. Such non-limiting examples of improved vectors are particularly advantageous for use in the preparation of a viral vector or plasmid vector and the cloning or subcloning of nucleic acid sequences into such vectors, as well as their use for mutagenesis, expression of inducible genes and the like.

В настоящем изобретении предлагается также фармацевтическая композиция, включающая вектор изобретения с зависимой от условий репликацией и фармацевтически приемлемый носитель. Дополнительно предлагается клетка-хозяин, включающая вирусный вектор с зависимой от условий репликацией. Предлагается также вектор, где указанный вектор, если это ДНК, включает нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NOS: 2, 3, 4, 5, 6, 14, в которых, по меньшей мере, один нуклеотид мутирован, 15 и 16, и где указанный вектор, если это РНК, включает нуклеотидную последовательность, кодируемую нуклеотидной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NOS: 2, 3, 4, 5, 6, 14, в которых, по меньшей мере, один нуклеотид мутирован, 15 и 16, в виде выделенных и очищенных молекул нуклеиновой кислоты, как здесь указано. Сходно предлагается способ конструирования вектора с рибозимом, способ модификации вектора и способ размножения и селективной упаковки вектора с зависимой от условий репликацией без использования упаковывающей клеточной линии.The present invention also provides a pharmaceutical composition comprising a conditionally replicating vector of the invention and a pharmaceutically acceptable carrier. Additionally, a host cell is provided comprising a viral vector with conditionally dependent replication. A vector is also provided, wherein said vector, if it is DNA, comprises a nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOS: 2, 3, 4, 5, 6, 14, in which at least one nucleotide is mutated, 15 and 16, and where the specified vector, if it is RNA, includes a nucleotide sequence encoded by a nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOS: 2, 3, 4, 5, 6, 14, in which at least one the nucleotide is mutated, 15 and 16, in the form of isolated and purified nucleic acid molecules, as indicated here. Similarly, a method for constructing a vector with a ribozyme, a method for modifying a vector, and a method for propagating and selectively packing a vector with conditionally dependent replication without using a packaging cell line are proposed.

В еще одном аспекте настоящего изобретения предлагается способ терапевтического и профилактического лечения клетки-хозяина от вирусной инфекции. В особенно предпочтительных осуществлениях такое лечение эффективно у указанного хозяина в результате придания доминантного фенотипа, который ингибирует вирусную инфекцию, или в результате придания фенотипа, который ингибирует инфицирование другими вирусами. Предпочтительно другие ингибируемые вирусы включают широкий спектр вирусных штаммов. Такие способы могут дополнительно включать применение хелперных экспрессионных векторов, также обозначаемых как "хелперный вектор" или "хелперный векторный конструкт", цитотоксического лекарства, белков/факторов или ингибитора протеазы/обратной транскриптазы, что подходит. Способ может быть применен, например, для ингибирования репликации вируса, для лечения заболеваний (включая рак, генетические, инфекционные, сосудистые и другие заболевания), для проведения эффективного переноса генов ex vivo и in vivo, для возможности получения безопасных векторов, для определения функции гена или для экспрессии интересующего гена в клетке-хозяине.In yet another aspect, the present invention provides a method for the therapeutic and prophylactic treatment of a host cell for viral infection. In particularly preferred embodiments, such treatment is effective in said host by conferring a dominant phenotype that inhibits a viral infection, or by imposing a phenotype that inhibits infection by other viruses. Preferably, other inhibitory viruses include a wide variety of viral strains. Such methods may further include the use of helper expression vectors, also referred to as a "helper vector" or "helper vector construct," a cytotoxic drug, proteins / factors or a protease / reverse transcriptase inhibitor, which is suitable. The method can be used, for example, to inhibit virus replication, to treat diseases (including cancer, genetic, infectious, vascular and other diseases), to carry out effective ex vivo and in vivo gene transfer, to obtain safe vectors, to determine gene function or for expression of a gene of interest in a host cell.

В еще одном аспекте изобретения предлагается способ применения клетки-хозяина, включающей вектор изобретения с зависимой от условий репликацией, для определения взаимодействия между лекарством/фактором и белком. Такой способ дает возможность характеризовать белок и осуществлять скрининг лекарств, факторов или других белков на активность или физические взаимодействия в отношении данного белка, кодируемого вектором. Способ дополнительно позволяет идентифицировать и охарактеризовать белки, которые являются функционально близкими с данным белком, кодируемым вектором. Например, если кодируемый белок является транскрипционным фактором, его экспрессия вектором изобретения позволяет идентифицировать гены, регулируемые транскрипционным фактором.In yet another aspect of the invention, there is provided a method of using a host cell comprising a conditionally replicating vector of the invention to determine the interaction between a drug / factor and a protein. Such a method makes it possible to characterize a protein and to screen drugs, factors or other proteins for activity or physical interactions with respect to a given protein encoded by a vector. The method further allows the identification and characterization of proteins that are functionally close to the protein encoded by the vector. For example, if the encoded protein is a transcription factor, its expression by the vector of the invention allows the identification of genes regulated by the transcription factor.

В изобретении предлагаются также композиции и условия для хранения векторов при различных условиях перед их применением. Примеры таких условий включают хранение при -80°С, -20°С и 4°С в присутствии различных носителей.The invention also provides compositions and conditions for storing vectors under various conditions before use. Examples of such conditions include storage at -80 ° C, -20 ° C and 4 ° C in the presence of various carriers.

Дополнительные осуществления настоящего изобретения включают общие лентивирусные векторы, модификации конструктов хелперных векторов, которые служат для уменьшения, сведения к минимуму или исключения рекомбинации вектора-хелпера с вектором с зависимой от условий репликацией для создания репликационно компетентного вектора или вируса (RCV). Следовательно, изобретение включает хелперные векторы, которые служат для получения векторов со "сниженной рекомбинацией". Хелперный вектор изобретения также предпочтительно увеличивает титр получаемого вектора с зависимой от условий репликацией до уровней, больших чем 10⁷ трансдуцирующих единиц на миллилитр. Другие осуществления включают концентрирование вектора с применением высокоскоростного (но не ультра) центрифугирования и хроматографических, ультрафильтрационных и диафильтрационных способов для концентрирования и очистки.Additional embodiments of the present invention include generic lentiviral vectors, modifications to helper vector constructs that are used to reduce, minimize, or eliminate recombination of a helper vector with a conditionally dependent replication vector to create a replication competent vector or virus (RCV). Therefore, the invention includes helper vectors that serve to produce vectors with "reduced recombination." The helper vector of the invention also preferably increases the titer of the resulting conditionally replicated vector to levels greater than 10 ⁷ transducing units per milliliter. Other implementations include concentration of the vector using high speed (but not ultra) centrifugation and chromatographic, ultrafiltration and diafiltration methods for concentration and purification.

Модификации хелперного вектора изобретения включают вставку рибозима, такого как анти-U5 рибозим, или антисмысловой последовательности, которая расщепляет или ведет к разрушению или инактивации вектора с зависимой от условий репликацией в случае, когда хелперный вектор и вектор с зависимой от условий репликацией совместно локализованы или совместно упакованы. В одном осуществлении хелперные компоненты полностью интегрированы в одном плазмидном конструкте для создания двухплазмидной функциональной векторной хелперной системы, которая эффективно продуцирует неконцентрированный супернатант векторов с титрами, большими чем 10⁷ трансдуцирующих единиц на мл (смотри фиг.3). В другом осуществлении нуклеотидная последовательность хелперного вектора является вырожденной для сведения к минимуму рекомбинации с вектором с зависимой от условий репликацией. В еще одном осуществлении хелперный вектор включает гетерологичные транс-активирующие элементы для применения при упаковке вектора с зависимой от условий репликацией. Примеры таких элементов включают, но не ограничиваются этим, белок оболочки вируса везикулярного стоматита VSV-G, белок оболочки RD114, белок оболочки вируса бешенства, белок оболочки вируса лейкоза человекообразных гиббонов (GALV) и химерные белки оболочки. Дополнительные модификации также включают гетерологичные элементы, чувствительные к rev (RREs), посттранскрипционные регуляторные элементы (PRE) или элементы конститутивного транспорта (CTEs).Modifications to the helper vector of the invention include the insertion of a ribozyme, such as an anti-U5 ribozyme, or an antisense sequence that cleaves or leads to the destruction or inactivation of a conditionally dependent replication vector when the helper vector and the conditionally dependent replication are jointly located or shared packaged. In one embodiment, helper components are fully integrated in one plasmid construct to create a two-plasmid functional vector helper system that efficiently produces an unconcentrated supernatant of vectors with titers greater than 10 ⁷ transducing units per ml (see FIG. 3). In another embodiment, the nucleotide sequence of the helper vector is degenerate to minimize recombination with the conditionally replicated vector. In yet another embodiment, the helper vector includes heterologous trans activating elements for use in packaging a conditionally replicating vector. Examples of such elements include, but are not limited to, vesicular stomatitis virus envelope protein VSV-G, RD114 envelope protein, rabies virus envelope protein, human gibbon leukemia envelope protein (GALV), and chimeric envelope proteins. Additional modifications also include rev-sensitive heterologous elements (RREs), post-transcriptional regulatory elements (PRE), or constitutive transport elements (CTEs).

В еще одном осуществлении конструкт хелперного вектора дополнительно включает донор сплайсинга, акцепторные сайты сплайсинга или сайты для вырожденных или гуманизированных нуклеотидных последовательностей. Например, сайты сплайсинга могут быть локализованы так, что сигнал упаковки и/или RRE может быть удален из транскрибируемых РНК в результате сплайсинга. Более того, сайты для вставки интронов в вектор или в хелперные конструкты предлагаются так, что димеризация, совместная локализация или рекомбинация между вектором с зависимой от условий репликацией и хелпером, или другим конкурирующим геномом или геномным элементом сводятся к минимуму. Вставка интронов может быть направлена на получение транспорта хелперной РНК в сплайсосомы и обратно из векторной РНК. Неожиданно оказалось, что некоторые конструкты хелперных векторов увеличивают титр вектора с зависимой от условий репликацией.In yet another embodiment, the helper vector construct further includes a splicing donor, acceptor splicing sites, or sites for degenerate or humanized nucleotide sequences. For example, splicing sites can be localized so that the packaging signal and / or RRE can be removed from the transcribed RNA as a result of splicing. Moreover, sites for inserting introns into a vector or in helper constructs are proposed such that dimerization, co-localization or recombination between a conditionally replicated vector and a helper or other competing genome or genomic element is minimized. The insertion of introns can be aimed at obtaining transport of helper RNA into spliceosomes and vice versa from vector RNA. Unexpectedly, some helper vector constructs increase the titer of a vector with conditionally dependent replication.

Краткое описание фигурBrief Description of the Figures

На фиг.1A-1K представлены схематические изображения конкретных векторов с зависимой от условий репликацией, охватываемых настоящим изобретением: pN1(cPT), pN1(cPTc)ASenvGFP(464), pN1(cPT)ASenvGFP(452), pN1(cPT2)ASenvGFP, pN1(cPT)cGFP, pN1GFP(cPT)T, pN1(cPT)GFPTAR, pN1GFP(cPT)VT, pN2GFP, pN2ASenvGFP(418) и pN2(spe)ASenvGFP. Разумеется, маркерный ген зеленого флуоресцентного белка (GFP) может быть удален перед использованием векторов для описанных здесь применений. Обозначения: N1, минимальный, ведущий свое начало от HIV-1 вектор без последовательностей gag/pol, но с упаковывающей последовательностью из gag, обозначаемой как gag' или gag", и кодоном терминации, помещенным на расстоянии приблизительно 40 пар оснований от ATG и последовательности gag; N2, вектор, берущий начало от HIV-1, способный экспрессировать последовательности gag/pol; AS, антисмысловая; ASenv, последовательность env, присутствующая в антисмысловой ориентации; gag, pol и env, кодирующая последовательность для белков, которые образуют сердцевину вируса, обратную транскриптазу и оболочку соответственно; tat, rev, rre и nef, дополнительные вирусные гены; cPTc, последовательность минимального центрального полипиримидинового тракта; cPT, центральный полипиримидиновый тракт, содержащий большую вставку из приблизительно 548 пар нуклеотидов; cPT2, центральный полипиримидиновый тракт, содержащий вставку из приблизительно 438 пар нуклеотидов (не включает последовательности gag в такой же степени, что и cPT); spe, нетранслируемые последовательности gag/pol; GFP, последовательность, кодирующая зеленый флуоресцентный белок.1A-1K are schematic views of specific conditionally replicated vectors covered by the present invention: pN1 (cPT), pN1 (cPTc) ASenvGFP (464), pN1 (cPT) ASenvGFP (452), pN1 (cPT2) ASenvGFP, pN1 (cPT) cGFP, pN1GFP (cPT) T, pN1 (cPT) GFPTAR, pN1GFP (cPT) VT, pN2GFP, pN2ASenvGFP (418) and pN2 (spe) ASenvGFP. Of course, the marker gene of green fluorescent protein (GFP) can be removed before using the vectors for the applications described here. Designations: N1, a minimal, originating from HIV-1 vector without gag / pol sequences, but with a packaging sequence from gag denoted as gag 'or gag ", and a termination codon placed at a distance of about 40 base pairs from the ATG and sequence gag; N2, a vector originating from HIV-1 capable of expressing gag / pol sequences; AS, antisense; ASenv, an env sequence present in the antisense orientation; gag, pol and env, a coding sequence for proteins that form the core of the virus, reverse t anscriptase and envelope, respectively; tat, rev, rre and nef, additional viral genes; cPTc, sequence of the minimum central polypyrimidine tract; cPT, central polypyrimidine tract containing a large insert of approximately 548 nucleotide pairs; cPT2, central polypyrimidine tract containing an insert of approximately 438 nucleotides (does not include gag sequences to the same extent as cPT); spe, untranslated gag / pol sequences; GFP, a sequence encoding a green fluorescent protein.

На фиг.2 показаны последовательности ДНК U5-РНК дикого типа HIV SEQ ID NO:l (A) и модифицированной U5-РНК crHIV SEQ ID NO:2 (B). Числа относятся к номерам оснований ниже старта транскрипции.Figure 2 shows the DNA sequences of wild-type HIV U5-RNA SEQ ID NO: l (A) and modified crHIV U5-RNA of SEQ ID NO: 2 (B). Numbers refer to base numbers below the start of transcription.

Фиг.3A-3E иллюстрирует влияния отношения хелперного вектора к вектору с зависимой от условий репликацией (cr) на титр образующихся cr-векторов. На фиг.3A показано, что молярное отношение 1:0,5 обеспечивает наибольший титр pNl(cPTc)GFP. На фиг.3B и 3C показано, что молярное отношение 1:0,75 обеспечивает наибольший титр pNl(cPT)GFP и pNl(cPT2)ASenvGFP соответственно; а фиг.3D и 3E показывают, что молярное отношение 1:1,5 обеспечивает наибольший титр pNlcGFP и pN2cGFP соответственно. Векторы показаны на фиг.1, за исключением pNl(cPT)GFP, в котором нет антисмысловой последовательности env, и pNlcGFP и pN2cGFP, в которых имеется вставка промотора цитомегаловируса (CMV) для экспрессии GFP. На фигурах показано, что для двухплазмидной системы были получены условия для получения титров, составляющих, по меньшей мере, 1,5×10⁷ трансдуцирующих единиц на мл.3A-3E illustrate the effects of the relation of helper vector to vector with conditionally dependent replication (cr) on the titer of the resulting cr vectors. FIG. 3A shows that a 1: 0.5 molar ratio provides the highest pNl (cPTc) GFP titer. Figures 3B and 3C show that a molar ratio of 1: 0.75 provides the highest titer pNl (cPT) of GFP and pNl (cPT2) of ASenvGFP, respectively; 3D and 3E show that a 1: 1.5 molar ratio provides the highest titer of pNlcGFP and pN2cGFP, respectively. The vectors are shown in FIG. 1, with the exception of pNl (cPT) GFP, in which there is no antisense sequence env, and pNlcGFP and pN2cGFP, in which there is an insert of the cytomegalovirus promoter (CMV) for GFP expression. The figures show that for a two-plasmid system, conditions were obtained for obtaining titers of at least 1.5 × 10 ⁷ transducing units per ml.

На фиг.4A и 4B показаны карты векторов с зависимой от условий репликацией на основе HIV-2: pS1cGFP и pS2cGFP. Обозначения pS1 и pS2 относятся к отсутствию или присутствию последовательностей gag/pol, как описано выше, для pNl и pN2. Обозначение с указывает на наличие промотора CMV для управления экспрессией GFP.Figures 4A and 4B show maps of conditionally replicated vector vectors based on HIV-2: pS1cGFP and pS2cGFP. The designations pS1 and pS2 refer to the absence or presence of gag / pol sequences, as described above, for pNl and pN2. The designation c indicates the presence of a CMV promoter for controlling the expression of GFP.

На фиг.5A и 5B проиллюстрировано влияние различных конструктов хелперного вектора на упаковку pSlcGFP и pS2cGFP. Влияние различных молярных отношений хелперного вектора и вектора с зависимой от условий репликацией проверяли наряду с влиянием различных RRE на хелперный вектор. Как показано, применение отношения 1:1 хелперного вектора к вектору с зависимой от условий репликацией было более эффективным в образовании функциональных векторных частиц по сравнению с другими тестированными отношениями.5A and 5B illustrate the effect of various helper vector constructs on pSlcGFP and pS2cGFP packaging. The effect of different molar ratios of the helper vector and the conditionally replicated vector was checked along with the effect of different RREs on the helper vector. As shown, the application of the 1: 1 ratio of a helper vector to a vector with conditionally dependent replication was more effective in the formation of functional vector particles in comparison with other tested ratios.

На фиг.6A-6G изображены структуры различных конструктов хелперного вектора: pVIRPAC-1, pVIRPAC-2, pVIRPAC-1.1Rz, pVIRPAC-1.2, VirPaс1.2Rz, pVIRPAC-l.2Rz2 и pVIRPAC 1.2RzIn, охватываемых настоящим изобретением. Rz относится к присутствию анти-U5 рибозима, а 1.1 и 1.2 относятся к хелперу, содержащему RRE, берущему начало от HIV-1 и HIV-2 соответственно.6A-6G depict structures of various helper vector constructs: pVIRPAC-1, pVIRPAC-2, pVIRPAC-1.1Rz, pVIRPAC-1.2, VirPac1.2Rz, pVIRPAC-l.2Rz2 and pVIRPAC 1.2RzIn covered by the present invention. Rz refers to the presence of anti-U5 ribozyme, and 1.1 and 1.2 relate to a helper containing RRE originating from HIV-1 and HIV-2, respectively.

На фиг.7 иллюстрируется влияние одного или более рибозимов на титры вирусного вектора. PN1(cPT)GFP упаковывали в клетках HeLa-tat в присутствии pvirPac1.2 (не содержащего рибозимы), pVirPac1.2RzIn (содержащего один рибозим и интрон), pVP1.2Rz (содержащего один рибозим) или pVP1.2Rz2 (содержащего два рибозима). Как показано на графике, присутствие одного рибозима (pVirPac1.2Rz) или рибозима и интрона, разработанного для влияния на клеточное перемещение хелперной РНК (pVirPac1.2RzIn), не оказывало существенного влияния на титр вектора. Анализ с помощью ПЦР образцов для титрования на совместную упаковку хелперных конструктов показал низкую совместную упаковку в присутствии рибозима по сравнению с высокой совместной упаковкой в отсутствие рибозима. Указатель "VirPac" может также обозначаться "VIRPAC" или "VP".7 illustrates the effect of one or more ribozymes on viral vector titers. PN1 (cPT) GFP was packaged in HeLa-tat cells in the presence of pvirPac1.2 (not containing ribozyme), pVirPac1.2RzIn (containing one ribozyme and intron), pVP1.2Rz (containing one ribozyme) or pVP1.2Rz2 (containing two ribozyme) . As shown in the graph, the presence of a single ribozyme (pVirPac1.2Rz) or a ribozyme and intron designed to influence the cellular movement of helper RNA (pVirPac1.2RzIn) did not significantly affect the titer of the vector. PCR analysis of samples for titration on co-packaging of helper constructs showed a low co-packaging in the presence of ribozyme compared with high co-packaging in the absence of ribozyme. The pointer "VirPac" may also be referred to as "VIRPAC" or "VP".

На фиг.8 иллюстрируется ингибирующее действие векторов из серий pNl и pN2 на репликацию HIV дикого типа в T-клетках. T-клетки сначала трансдуцировали вектором, а затем подвергали контрольному заражению вирусом дикого типа при кратности инфицирования 0,1 при 100% трансдуцированных клеток. Репликацию вируса оценивали с помощью теста ИФА поглощения антигена p24. pN2ASenvGFP показал сильное ингибирование репликации вируса дикого типа.Figure 8 illustrates the inhibitory effect of pNl and pN2 vectors on wild-type HIV replication in T cells. T cells were first transduced with the vector, and then they were challenged with wild-type virus at an infection rate of 0.1 at 100% transduced cells. Virus replication was assessed using an ELISA test for p24 antigen uptake. pN2ASenvGFP showed strong inhibition of wild-type virus replication.

На фиг.9A и 9B показано сильное ингибирование репликации HIV дикого типа векторами на основе pNl и pN2. На фиг.9A показано сильное ингибирование HIV дикого типа в T-клетках человека под действием pNlGFP(cPT)VT и pN2ASenvGFP по сравнению с контрольными опухолевыми клетками после инфицирования HIV дикого типа. На фиг.9B показаны сходные результаты на T-клетках с pN1(cPT)ASenvGFP и pN2ASenvGFP.9A and 9B show strong inhibition of wild-type HIV replication by pNl and pN2-based vectors. 9A shows strong inhibition of wild-type HIV in human T cells by pNlGFP (cPT) VT and pN2ASenvGFP compared to control tumor cells after wild-type HIV infection. 9B shows similar results on T cells with pN1 (cPT) ASenvGFP and pN2ASenvGFP.

На фиг.10A и 10B показаны векторы и их применение для отбора трансдуцированных клеток. На фиг.10A показана организация применяемых векторов, где pN1CMIG и pN1MCG содержат внутренний промотор CMV, в то время как pN1MIG и pN1MIG-W экспрессируют ген MGMT посредством промотора HIV-LTR. На фиг.10B показан график разрастания клеток SupT1, трансдуцированных указанными выше векторами и подвергнутыми селекции с помощью BG и BCNU, как описано ниже в примере 5.On figa and 10B shows the vectors and their use for the selection of transduced cells. 10A shows the organization of the vectors used, where pN1CMIG and pN1MCG contain the internal CMV promoter, while pN1MIG and pN1MIG-W express the MGMT gene through the HIV-LTR promoter. 10B shows a growth chart of SupT1 cells transduced with the above vectors and selected using BG and BCNU, as described below in Example 5.

На фиг.11, панели A-F, показана селекция трансдуцированных первичных клеток CD4+ с помощью BG и BCNU. Клетки CD4+, трансдуцированные pN2MIG, культивировали в присутствии 0, 0,5, 2, 5, 10 и 10 мкМ BG (показано на панелях A-F, соответственно), с указанными концентрациями BCNU. На панели F дополнительно показаны результаты разведения трансдуцированных клеток 1:5 с последующей обработкой 10 мкМ BG и указанными концентрациями BCNU. Исходный уровень 3% клеток GFP+ на панели F возрастал, по меньшей мере, в 32 раза до 97%, уровня, который ранее не наблюдали in vitro.11, panel A-F, shows the selection of transduced primary CD4 + cells using BG and BCNU. CD4 + cells transduced with pN2MIG were cultured in the presence of 0, 0.5, 2, 5, 10, and 10 μM BG (shown in panels A-F, respectively), with indicated BCNU concentrations. Panel F further shows the results of dilution of the transduced cells 1: 5, followed by treatment with 10 μM BG and the indicated concentrations of BCNU. The initial level of 3% of GFP + cells on panel F increased at least 32-fold to 97%, a level not previously observed in vitro.

На фиг.12 показаны эффекты рибозимов в предотвращении совместной упаковки хелперной РНК в препараты вектора. Содержащие вирус супернатанты экстрагировали с помощью «шумной экстракции» и подвергали перевариванию ДНКазой I с последующим количественным определением области gal-pol, найденной в хелперном конструкте, с помощью обратной транскрипции-ПЦР (ОТ-ПЦР). Как показано, присутствие одного или двух рибозимов в примененном хелперном конструкте (pVP1.2Rz или pVP1.2Rz2) значительно снижало количество совместно упакованного хелперного вектора по сравнению с хелпером без рибозима (pVP1.2).12 shows the effects of ribozymes in preventing co-packaging of helper RNA in vector preparations. Virus-containing supernatants were extracted using “noisy extraction” and digested with DNase I followed by quantification of the gal-pol region found in the helper construct using reverse transcription-PCR (RT-PCR). As shown, the presence of one or two ribozymes in the used helper construct (pVP1.2Rz or pVP1.2Rz2) significantly reduced the number of co-packed helper vector compared to a helper without ribozyme (pVP1.2).

На фиг.13A и 13B показана возможность очистки опухолевых клеток от стволовых клеток CD34+. На фиг.13A показано, что при MOI 10 pN1(cPT)ASenvGFP трансдуцировал 98.52% опухолевых клеток SupTl после одного раунда трансдукции. На фиг.13B показано, что при трансдукции клеток CD34+не наблюдалось значительной трансдукции после одного раунда трансдукции. Лишь после трех раундов наблюдалась значительная трансдукция. Обозначения: 1/2/A, например, относится к раунду 1 трансдукции при MOI 2 и присутствию вирусных вспомогательных белков в трансдуцируемом векторе, тогда как 3/50, например, относится к трем раундам трансдукции и MOI 50.On figa and 13B shows the ability to clean tumor cells from stem cells CD34 +. 13A shows that at an MOI of 10 pN1 (cPT), ASenvGFP transduced 98.52% of SupTl tumor cells after one round of transduction. FIG. 13B shows that, upon transduction of CD34 + cells, no significant transduction was observed after one round of transduction. Only after three rounds was significant transduction observed. Designations: 1/2 / A, for example, refers to round 1 transduction at MOI 2 and the presence of viral auxiliary proteins in the transduced vector, while 3/50, for example, refers to three rounds of transduction and MOI 50.

На фиг.14A показаны структуры VSV-G дикого типа, RD114 дикого типа и гибридных белков оболочки с указанными экстраклеточными, трансмембранными и цитоплазматическими доменами. На фиг.14B показаны титры векторов HIV-1, псевдотипированных в HT1080 различными белками оболочки (VSV-G дикого типа, вируса бешенства G, RD114 дикого типа и RD114E, гибридным конструктом VSV-G и RD114).On figa shows the structure of wild-type VSV-G, wild-type RD114 and hybrid membrane proteins with the indicated extracellular, transmembrane and cytoplasmic domains. 14B shows titers of HIV-1 vectors pseudotyped in HT1080 by various envelope proteins (wild type VSV-G, rabies virus G, wild type RD114 and RD114E, hybrid construct VSV-G and RD114).

На фиг.15A-15E представлены схематические изображения связанных с упаковкой конструктов, охватываемых настоящим изобретением: p(CGCRSRRE), p(TREtTApuro), p(BI-RevTat), p(EH-GP) и p(CMV-GP). На фиг.15F показана организация зависимых от rev конструктов VSV-G.15A-15E are schematic illustrations of packaging-related constructs covered by the present invention: p (CGCRSRRE), p (TREtTApuro), p (BI-RevTat), p (EH-GP) and p (CMV-GP). 15F shows the organization of rev-dependent VSV-G constructs.

На фиг.16 показан выход векторов pN1(cPT)GFP на клетку до и после концентрирования в клетках HeLa-tat. Можно видеть, что выход остается на уровне приблизительно 10¹⁰ при обоих условиях.On Fig shows the yield of pN1 (cPT) GFP vectors on the cell before and after concentration in HeLa-tat cells. You can see that the output remains at about 10 ¹⁰ under both conditions.

На фиг.17 показаны результаты применения системы Rev/RRE/CRS для контроля экспрессии VSV-G.17 shows the results of using the Rev / RRE / CRS system to control VSV-G expression.

На фиг.18 показано влияние буфера для хранения на извлечение вектора после хранения в течение 3-5 недель при различной температуре. Можно видеть, что присутствие 10% трегалозы или 10% глюкозы в D-PBS или HBS обеспечивает хороший выход вектора после хранения при -20 или при -80°С.On Fig shows the effect of the storage buffer on the extraction of the vector after storage for 3-5 weeks at different temperatures. It can be seen that the presence of 10% trehalose or 10% glucose in D-PBS or HBS provides a good vector yield after storage at -20 or at -80 ° C.

Описание предпочтительных осуществленийDescription of preferred embodiments

В настоящем изобретении предлагаются усовершенствованные векторы с зависимой от условий репликацией, лентивирусные векторы и их применение. В дополнение к способности к селективной репликации векторы содержат конкретные модификации для снижения вероятности рекомбинации, что ведет к тому, что векторы становятся репликационно компетентными. Включены способы ингибирования репликации штамма вируса дикого типа и способы генной доставки в клетки, включающие такие усовершенствованные векторы. Способ включает контактирование хозяина, который может быть инфицирован, имеет риск быть инфицированным или предпочтительно действительно инфицирован таким штаммом вируса дикого типа с усовершенствованным вектором, который размножается только в хозяине, который является пермиссивным для репликации вектора (т.е. непатогенного или не вызывающего болезнь вектора с зависимой от условий репликацией (cr)).The present invention provides improved conditions-dependent replication vectors, lentiviral vectors and their use. In addition to the ability to selectively replicate, vectors contain specific modifications to reduce the likelihood of recombination, which leads to the fact that the vectors become replication competent. Included are methods of inhibiting the replication of a strain of wild-type virus and methods for gene delivery to cells, including such advanced vectors. The method includes contacting a host that may be infected, has a risk of being infected, or preferably really infected, with a strain of the wild-type virus with an improved vector that propagates only in a host that is permissive for replication of the vector (i.e., a non-pathogenic or non-disease causing vector with conditional replication (cr)).

Как здесь дополнительно описывается, конкретная цель способа состоит в создании конкурентной инфекции у хозяина с помощью такого непатогенного вектора с зависимой от условий репликацией. Обычно вектор с зависимой от условий репликацией в соответствии с изобретением включает, по меньшей мере, одну последовательность нуклеиновой кислоты, которая придает селективное преимущество репликации и распространения вектору с зависимой от условий репликацией по сравнению с вирусом дикого типа, и/или, по меньшей мере, одну последовательность нуклеиновой кислоты, которая придает селективное преимущество размножения вирусных частиц в клетке-хозяине, содержащей вектор с зависимой от условий репликацией, по сравнению с клеткой-хозяином, содержащей вирус дикого типа.As further described herein, the specific objective of the method is to create a competitive infection in the host using such a non-pathogenic vector with conditionally dependent replication. Typically, a conditionally dependent replication vector in accordance with the invention includes at least one nucleic acid sequence that confers a selective advantage of replication and distribution to a conditionally replicated vector compared to a wild-type virus and / or at least one nucleic acid sequence that confers a selective advantage to the propagation of viral particles in a host cell containing a conditionally replicated vector compared with the host cell om containing wild-type virus.

В предпочтительном осуществлении изобретения вектор включает последовательность HIV и применяется для лечения HIV инфекции. Таким образом, вектор или клетка-хозяин, содержащая вектор, включает, по меньшей мере, одну последовательность нуклеиновой кислоты, которая (1) обеспечивает геном crHIV селективным преимуществом над геномом HIV дикого типа в отношении упаковки в вирионы-потомки (т.е. в клетках, в которых оба они являются резидентами), и/или (2) обеспечивает клетку-хозяин, продуцирующую вектор (вирус) с зависимой от условий репликацией, селективным преимуществом в отношении продукции вириона crHIV по сравнению с клеткой-хозяином, продуцирующей вирус дикого типа. Одним способом (которым изобретение не ограничивается) является придание геномам crHIV селективного преимущества в упаковке путем предложения их с одним или более рибозимов, способных расщеплять геном HIV дикого типа.In a preferred embodiment of the invention, the vector comprises an HIV sequence and is used to treat HIV infection. Thus, a vector or host cell containing a vector includes at least one nucleic acid sequence that (1) provides the crHIV gene with a selective advantage over the wild-type HIV genome in respect to packaging in offspring virions (i.e., in cells in which they are both resident) and / or (2) provides a host cell producing a vector (virus) with conditionally dependent replication, a selective advantage over the production of crHIV virion compared to a host cell producing wild type virus . One way (to which the invention is not limited) is to give the crHIV genomes a selective advantage in packaging by offering them with one or more ribozymes capable of cleaving the wild-type HIV gene.

В другом аспекте изобретения предлагаются векторы с пониженной способностью к рекомбинации с диким типом и хелперными конструктами, что ведет к получению репликационно компетентных векторов. Кроме того, предлагаются хелперные векторы, клетки и упаковывающие системы, которые также вносят вклад в снижение рекомбинации, для дальнейшего снижения количества событий продуктивной рекомбинации, чтобы не давать векторам больше условий для репликации.In another aspect of the invention, vectors with reduced recombination ability with wild type and helper constructs are provided, resulting in replication competent vectors. In addition, helper vectors, cells, and packaging systems are also provided that also contribute to a decrease in recombination, to further reduce the number of productive recombination events, so that the vectors are no longer subject to replication.

Вирус дикого типаWild type virus

В соответствии с изобретением "вирус" представляет собой инфекционный агент, который состоит из белка и нуклеиновой кислоты и который использует генетический аппарат клетки-хозяина для продукции вирусных продуктов, определяемых вирусной нуклеиновой кислотой. "Нуклеиновая кислота" обозначает полимер ДНК или РНК, который является одноцепочечным или двухцепочечным, линейным или кольцевым и необязательно содержит синтетические, неприродные или модифицированные нуклеотиды, которые способны включаться в полимеры ДНК или РНК. Полинуклеотидная ДНК предпочтительно состоит из последовательностей геномной или кДНК.According to the invention, a “virus” is an infectious agent that consists of a protein and a nucleic acid and which uses the genetic apparatus of the host cell to produce viral products determined by the viral nucleic acid. "Nucleic acid" means a polymer of DNA or RNA that is single-stranded or double-stranded, linear or ring and optionally contains synthetic, unnatural or modified nucleotides that are capable of being incorporated into polymers of DNA or RNA. Polynucleotide DNA preferably consists of genomic or cDNA sequences.

"Штамм вируса дикого типа" представляет собой штамм, который не включает какие-либо индуцированные человеком мутации, как здесь описано, т.е. любой вирус, который может быть выделен из природных источников. В противоположном варианте штаммом дикого типа является любой вирус, который культивировался в лаборатории, но до сих пор в отсутствие любого другого вируса способен продуцировать геномы или вирионы потомков, подобные тем, которые выделены из природных источников. Например, молекулярный клон pNL4-3 HIV-1, описанный в последующих примерах, представляет собой штамм дикого типа, который можно получить по AIDS Research and Reference Reagent Program Catalog через National Institutes of Health (смотри также Adachi et al., J. Virol., 59, 284-291 (1986)). pPSXB представляет собой молекулярный клон HIV-2, который был любезно предоставлен Dr Suresh Arya из National Institutes of Health, Bethesda, Maryland и описан в Arya et al. Human immunodeficiency virus type 2 lentivirus vectors for gene transfer: expression and potential for helper virus-free packaging. Hum Gene Ther. 1998 Jun 10;9(9):1371-80.A "wild-type virus strain" is a strain that does not include any human-induced mutations as described herein, i.e. any virus that can be isolated from natural sources. In the opposite embodiment, the wild-type strain is any virus that has been cultured in the laboratory, but so far, in the absence of any other virus, it is capable of producing genomes or virions of offspring similar to those isolated from natural sources. For example, the molecular clone pNL4-3 HIV-1 described in the following examples is a wild-type strain that can be obtained from the AIDS Research and Reference Reagent Program Catalog through the National Institutes of Health (see also Adachi et al., J. Virol. 59, 284-291 (1986)). pPSXB is a molecular clone of HIV-2, which was kindly provided by Dr Suresh Arya from National Institutes of Health, Bethesda, Maryland and described in Arya et al. Human immunodeficiency virus type 2 lentivirus vectors for gene transfer: expression and potential for helper virus-free packaging. Hum Gene Ther. 1998 Jun 10; 9 (9): 1371-80.

В целом, способ настоящего изобретения предпочтительно применяют для лечения вирусных заболеваний, которые являются результатом вирусной инфекции. Желательно, чтобы вирус (так же как вектор, как обсуждается ниже) представлял собой РНК-вирус, но также он может представлять собой ДНК-вирус. РНК-вирусы представляют собой разнообразную группу, которая инфицирует прокариот (например, бактериофаги), так же как многих эукариот, включая млекопитающих и, в частности, человека. Большинство РНК-вирусов обладает одноцепочечной РНК в качестве своего генетического материала, хотя, по меньшей мере, одно семейство имеет двухцепочечную РНК в качестве своего генетического материала. РНК-вирусы подразделены на три большие группы: вирусы с плюс-цепью (т.е. те, геном которых, переносимый вирусом, транслируется в белок и чья депротеинизированная нуклеиновая кислота существенна для инициации инфекции), вирусы с минус-цепью (т.е. те, геном которых, переносимый вирусом, комплементарен последовательности мессенджера и может наступать транскрипция, которая должна происходить с помощью ферментов, ассоциированных с вирионом, до трансляции) и двухцепочечные РНК-вирусы. Способ настоящего изобретения предпочтительно применяют для борьбы с вирусами с плюс-цепью, вирусами с минус-цепью и двухцепочечными РНК-вирусами.In general, the method of the present invention is preferably used to treat viral diseases that result from a viral infection. Preferably, the virus (like the vector as discussed below) is an RNA virus, but it can also be a DNA virus. RNA viruses are a diverse group that infects prokaryotes (e.g., bacteriophages), as well as many eukaryotes, including mammals and, in particular, humans. Most RNA viruses have single-stranded RNA as their genetic material, although at least one family has double-stranded RNA as their genetic material. RNA viruses are divided into three large groups: viruses with a plus chain (i.e., those whose genome carried by the virus is translated into a protein and whose deproteinized nucleic acid is essential for the initiation of infection), viruses with a negative chain (i.e. those whose genome, carried by the virus, is complementary to the messenger sequence and transcription can occur, which must take place using enzymes associated with the virion before translation) and double-stranded RNA viruses. The method of the present invention is preferably used to control viruses with a plus chain, viruses with a negative chain and double-stranded RNA viruses.

Применяемый здесь РНК-вирус охватывает Sindbis-подобные вирусы (например, Togaviridae, Bromovirus, Cucumovirus, Tobamovirus, Ilarvirus, Tobravirus и Potexvirus), Picornavirus-подобные вирусы (например, Picornaviridae, Caliciviridae, Comovirus, Nepovirus и Potyvirus), вирусы с минус-цепью (например, Paramyxoviridae, Rhabdoviridae, Orthomyxoviridae, Bunyaviridae и Arenaviridae), двухцепочечные вирусы (например, Reoviridae и Birnaviridae), Flavivirus-подобные вирусы (например, Flaviviridae и Pestivirus), Retrovirus-подобные вирусы (например, Retroviridae), Coronaviridae и другие группы вирусов, включая, но не ограничиваясь этим, Nodaviridae.The RNA virus used here encompasses Sindbis-like viruses (e.g. Togaviridae, Bromovirus, Cucumovirus, Tobamovirus, Ilarvirus, Tobravirus and Potexvirus), Picornavirus-like viruses (e.g. Picornaviridae, Caliciviridae, Comovirus, Nepovirus, and Potyvirus) chain (e.g., Paramyxoviridae, Rhabdoviridae, Orthomyxoviridae, Bunyaviridae, and Arenaviridae), double-stranded viruses (e.g., Reoviridae and Birnaviridae), Flavivirus-like viruses (e.g., Flaviviridae and Pestivirus), other viruses, Retrov, Retrov, Retrov viruses, groups of viruses, including but not limited to Nodaviridae.

Предпочтительный РНК-вирус в соответствии с изобретением представляет собой вирус семейства Flaviviridae, предпочтительно вирус рода Filovirus и особенно вирус Марбурга или Эбола. Предпочтительно вирус семейства Flaviviridae представляет собой вирус рода Flavivirus, такой как вирус желтой лихорадки, вирус Денге, вирус Западного Нила, вирус энцефалита Сант-Луиса, вирус японского энцефалита, вирус энцефалита долины Мюррей, вирус Роцио, вирус клещевого энцефалита и тому подобное.A preferred RNA virus according to the invention is a virus of the Flaviviridae family, preferably a virus of the genus Filovirus, and especially a Marburg or Ebola virus. Preferably, the Flaviviridae family virus is a Flavivirus virus, such as yellow fever virus, Dengue virus, West Nile virus, St. Louis encephalitis virus, Japanese encephalitis virus, Murray valley encephalitis virus, Rocio virus, tick-borne encephalitis virus and the like.

Также предпочтительным является вирус семейства Picornaviridae, предпочтительно вирус гепатита А (HAV), вирус гепатита B (HBV) или вирус гепатита не-А или не-В.Also preferred is the Picornaviridae family virus, preferably hepatitis A virus (HAV), hepatitis B virus (HBV) or hepatitis B virus non-A or non-B.

Другой предпочтительный РНК-вирус представляет собой вирус семейства Retroviridae (т.е. ретровирус), особенно вирус рода или подсемейства Oncovirinae, Spumavirinae, Spumavirus, Lentivirinae и Lentivirus. РНК-вирус подсемейства Oncovirinae является желательно Т-лимфотропным вирусом человека типа 1 или 2 (т.е. HTLV-1 или HTLV-2) или вирусом лейкоза коров (BLV), вирусом лейкосаркомы птиц (например, вирусом саркомы Рауса (RSV), вирусом миелобластоза птиц (AMV), вирусом эритробластоза птиц (AEV) и вирусом, ассоциированным с саркомой Рауса (RAV; от RAV-0 до RAV-50), вирусом типа С млекопитающих (например, вирусом мышиного лейкоза Молони (MuLV), вирусом мышиной саркомы Харвея (HaMSV), вирусом мышиного лейкоза Абельсона (A-MuLV), AKR-MuLV, вирусом лейкоза кошачьих (FeLV), вирусом саркомы обезьян, вирусом ретикулоэндотелиоза (REV), вирусом некроза селезенки (SNV)), вирусом типа В (например, вирусом опухоли молочной железы мышей (MMTV)) и вирусом типа D (например, вирусом обезьян Мейсона-Пфазера (MPMV) и вирусами "SAIDS"). РНК-вирус подсемейства Lentivirus представляет собой желательно вирус типа 1 или 2 иммунодефицита человека (т.е. HIV-1 или HIV-2, где HIV-1 ранее был назван как вирус 3, ассоциированный с лимфоаденопатией (HTLV-III), и вирус, связанный с синдромом приобретенного иммунодефицита (СПИДом) (ARV)), или другой вирус, относящийся к HIV-1 или HIV-2, который идентифицирован и связан со СПИДом и заболеванием, подобным СПИДу. Акроним "HIV (ВИЧ)" или термины "вирус СПИДа" или "вирус иммунодефицита человека" применяются здесь для обозначения таких вирусов HIV и вирусов, относящихся к или ассоциированных с HIV, в целом. Более того, РНК-вирус подсемейства Lentivirus предпочтительно представляет собой вирус Visna/maedi (например, такой, который инфицирует овец), вирус иммунодефицита кошачьих (FIV), лентивирус коров, вирус иммунодефицита обезьян (SIV), вирус инфекционной анемии лошадей (EIAV) и вирус артрита-энцефалита козлов (CAEV).Another preferred RNA virus is a virus of the Retroviridae family (i.e., a retrovirus), especially a virus of the genus or subfamily Oncovirinae, Spumavirinae, Spumavirus, Lentivirinae and Lentivirus. The Oncovirinae subfamily RNA virus is desirably a human T-lymphotropic virus of type 1 or 2 (i.e., HTLV-1 or HTLV-2) or bovine leukemia virus (BLV), avian leukosarcoma virus (e.g. Routh sarcoma virus (RSV), avian myeloblastosis virus (AMV), avian erythroblastosis virus (AEV) and Raus sarcoma virus (RAV; from RAV-0 to RAV-50), mammalian type C virus (e.g., Moloney mouse leukemia virus (MuLV), mouse virus Harvey’s sarcoma (HaMSV), Abelson’s mouse leukemia virus (A-MuLV), AKR-MuLV, feline leukemia virus (FeLV), monkey sarcoma virus, reticuloendotheliosis virus (REV), spleen necrosis virus (SNV), type B virus (for example, mouse breast tumor virus (MMTV)) and type D virus (for example, Mason-Phasper monkey virus (MPMV) and SAIDS viruses) The Lentivirus subfamily RNA virus is desirably a human immunodeficiency virus type 1 or 2 virus (ie HIV-1 or HIV-2, where HIV-1 was previously named as virus 3 associated with lymphadenopathy (HTLV-III), and acquired immunodeficiency syndrome (AIDS) (ARV) virus, or another HIV-1 or HIV-2 virus that has identified van and is associated with AIDS and a disease like AIDS. The acronym "HIV (HIV)" or the terms "AIDS virus" or "human immunodeficiency virus" are used herein to refer to such HIV viruses and viruses related to or associated with HIV in general. Moreover, the Lentivirus subfamily RNA virus is preferably Visna / maedi virus (e.g., one that infects sheep), feline immunodeficiency virus (FIV), bovine lentivirus, monkey immunodeficiency virus (SIV), equine infectious anemia virus (EIAV), and goat arthritis-encephalitis virus (CAEV).

Вирус в соответствии с изобретением также желательно является ДНК-вирусом. Предпочтительно ДНК-вирус представляет собой вирус Эпштейна-Барр, аденовирус, вирус простого герпеса, вирус папилломы, вирус коровьей оспы и тому подобное.The virus in accordance with the invention is also desirably a DNA virus. Preferably, the DNA virus is Epstein-Barr virus, adenovirus, herpes simplex virus, papilloma virus, vaccinia virus and the like.

Многие из данных вирусов классифицированы как патогены "уровня 4 биологической безопасности" (т.е. "группы риска 4" по классификации Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ)), для которых при всех лабораторных работах требуется максимум защитных приспособлений. Специалист в данной области техники, однако, близко знаком с этим и способен придерживаться мер предосторожности и безопасности, необходимых для данных вирусов.Many of these viruses are classified as pathogens of “level 4 biosafety” (ie, “risk group 4” according to the classification of the World Health Organization (WHO)), for which a maximum of protective devices is required for all laboratory work. A person skilled in the art, however, is closely familiar with this and is able to adhere to the precautions and safety necessary for these viruses.

"Клеткой-хозяином" может быть любая клетка и предпочтительно клетка эукариот. Желательно, чтобы клеткой-хозяином был лимфоцит (такой как Т-лимфоцит), или макрофаг (такой как моноцит/макрофаг), или предшественник любой из данных клеток, такой как гемопоэтическая стволовая клетка. Предпочтительно, чтобы клетки имели на клеточной поверхности гликопротеин CD4+, т.е. являлись CD4+. Желательно, однако, чтобы Т-лимфоцит CD4+, который инфицирован вирусом СПИДа, не был до этого активирован (т.е. предпочтительно, чтобы экспрессия nef еще не наступала, и даже более предпочтительно, чтобы экспрессия гена CD4 не регулировалась негативно, как будет далее обсуждаться ниже). Более того, клетка-хозяин предпочтительно представляет собой клетку, в которой отсутствует маркер CD4 и которая еще способна инфицироваться вирусом в соответствии с настоящим изобретением. Такая клетка включает, но не ограничивается этим, астроцит, фибробласт кожи, эпителиальную клетку кишечника, эндотелиальную клетку, эпителиальную клетку, дендритную клетку, клетки Лангерганса, моноцит, гематопоэтическую стволовую клетку, эмбриональную стволовую клетку, клетку, которая дает сперматогенный ряд или ооцит, стромальную клетку, мукозную клетку и тому подобное. Предпочтительно, чтобы клетка-хозяин представляла собой эукариотные, многоклеточные виды (например, в отличие от клетки одноклеточных дрожжей) и даже более предпочтительно, чтобы она представляла собой клетку млекопитающих, например, человека.A "host cell" can be any cell, and preferably a eukaryotic cell. It is desirable that the host cell be a lymphocyte (such as a T-lymphocyte), or a macrophage (such as a monocyte / macrophage), or a precursor to any of these cells, such as a hematopoietic stem cell. Preferably, the cells have CD4 + glycoprotein on the cell surface, i.e. were CD4 +. However, it is desirable that the CD4 + T-lymphocyte that is infected with the AIDS virus is not activated before (i.e., it is preferable that nef expression has not yet occurred, and even more preferably, the expression of the CD4 gene is not negatively regulated, as will be further discussed below). Moreover, the host cell is preferably a cell in which there is no CD4 marker and which is still able to become infected with the virus in accordance with the present invention. Such a cell includes, but is not limited to, astrocyte, skin fibroblast, intestinal epithelial cell, endothelial cell, epithelial cell, dendritic cell, Langerhans cells, monocyte, hematopoietic stem cell, embryonic stem cell, a cell that produces a spermatogenic stroma or oocyte a cell, a mucous cell, and the like. Preferably, the host cell is a eukaryotic, multicellular species (for example, unlike a unicellular yeast cell), and even more preferably, it is a mammalian cell, for example, a human.

Клетка может быть представлена как один организм, или может быть частью более крупного скопления клеток. Такое "более крупное скопление клеток" может включать, например, клеточную культуру (либо смешанную, либо чистую), ткань (например, эндотелиальную, эпителиальную, мукозную или другую ткань, включая ткани, содержащие указанные выше клетки с отсутствием CD 4), орган (например, сердце, легкое, печень, мышцу, желчный пузырь, мочевой пузырь, гонады, глаз и другие органы), систему органов (например, систему циркуляции, респираторную систему, систему желудочно-кишечного тракта, мочевую систему, нервную систему, систему наружных покровов или другую систему органов) или организм (например, птицы, млекопитающего или тому подобное). Предпочтительно, чтобы органы/ткани/клетки, являющиеся мишенями, представляли циркуляторную систему (например, включая, но не ограничиваясь этим, сердце, кровеносные сосуды и кровь, включая лейкоциты и эритроциты), респираторную систему (например, нос, глотку, гортань, трахею, бронхи, бронхиолы, легкие и тому подобное), систему желудочно-кишечного тракта (например, включая рот, глотку, пищевод, желудок, кишечник, слюнные железы, поджелудочную железу, печень, желчный пузырь и другие), мочевую систему (например, такую как почки, мочеточники, мочевой пузырь, уретру и тому подобное), нервную систему (например, включая, но не ограничиваясь этим, мозг и спинной мозг, специфические сенсорные органы, такие как глаз) и систему кожных покровов (например, кожу, эпидермис и клетки подкожной или кожной ткани). Даже более предпочтительно, чтобы клетки, являющиеся мишенями, были выбраны из группы, состоящей из сердца, кровеносного сосуда, легкого, печени, желчного пузыря, мочевого пузыря и клеток глаза. Клетки-мишени необязательно должны быть нормальными клетками и могут представлять собой клетки, пораженные болезнью. Такие клетки, пораженные болезнью, могут представлять собой, но не ограничиваться этим, опухолевые клетки, инфицированные клетки, генетически измененные клетки или клетки, находящиеся вблизи или в контакте с поврежденной тканью, такие как эндотелиальные клетки сосудов опухоли.A cell can be represented as a single organism, or it can be part of a larger collection of cells. Such a “larger cell pool” may include, for example, cell culture (either mixed or pure), tissue (eg, endothelial, epithelial, mucosal or other tissue, including tissues containing the above cells with no CD 4), organ ( e.g. heart, lung, liver, muscle, gall bladder, bladder, gonads, eyes and other organs), organ system (e.g., circulatory system, respiratory system, gastrointestinal system, urinary system, nervous system, external integument system or other system organs) or an organism (e.g., a bird, mammal, or the like). Preferably, the target organs / tissues / cells represent the circulatory system (e.g. including but not limited to the heart, blood vessels and blood, including white blood cells and red blood cells), the respiratory system (e.g. nose, pharynx, larynx, trachea , bronchi, bronchioles, lungs and the like), the gastrointestinal system (e.g., including the mouth, pharynx, esophagus, stomach, intestines, salivary glands, pancreas, liver, gall bladder and others), the urinary system (e.g. like kidneys, ureters, urine ovarian bladder, urethra and the like), the nervous system (for example, including, but not limited to, the brain and spinal cord, specific sensory organs such as the eye) and the skin system (for example, skin, epidermis and subcutaneous or skin tissue cells ) Even more preferably, the target cells are selected from the group consisting of the heart, blood vessel, lung, liver, gall bladder, bladder, and eye cells. The target cells do not have to be normal cells and can be cells affected by a disease. Such disease-affected cells may include, but are not limited to, tumor cells, infected cells, genetically modified cells, or cells in proximity to or in contact with damaged tissue, such as endothelial cells of tumor vessels.

ВекторVector

"Вектор" представляет собой молекулу нуклеиновой кислоты (обычно ДНК или РНК), которая служит для переноса переносимой последовательности нуклеиновой кислоты (т.е. ДНК или РНК) в клетку-хозяина. Три обычных типа векторов включают плазмиды, фаги и вирусы. Предпочтительно, чтобы вектор представлял собой вирус, который включает капсидные формы векторных нуклеиновых кислот, и вирусные частицы, в которые упакован вектор нуклеиновых кислот.A “vector” is a nucleic acid molecule (usually DNA or RNA) that serves to transfer a transferred nucleic acid sequence (ie, DNA or RNA) to a host cell. Three common types of vectors include plasmids, phages, and viruses. Preferably, the vector is a virus that includes the capsid forms of the vector nucleic acids and the viral particles into which the nucleic acid vector is packaged.

Желательно, чтобы вектор не представлял собой штамм вируса дикого типа, в виду того, что он включает индуцированные человеком мутации или модификации. Таким образом, вектор обычно получают от штамма вируса дикого типа путем генетических манипуляций (т.е. путем делеции) для охвата вируса с зависящей от условий репликацией, как будет далее здесь описано. Оптимально, чтобы вирусный вектор включал штамм вируса, который является тем же типом, что и вирус дикого типа, вызывающий инфекцию, подвергаемую лечению, который предпочтительно представляет собой один из указанных выше вирусов дикого типа. Соответственно, предпочтительно, чтобы вектор происходил от РНК-вируса, даже более предпочтительно, чтобы вектор происходил от ретровируса, и оптимально, чтобы вектор происходил от вируса иммунодефицита человека. Такой вектор, происходящий от вируса иммунодефицита человека, обозначается здесь обычно как вектор "crHIV".Preferably, the vector is not a strain of the wild-type virus, since it includes human-induced mutations or modifications. Thus, a vector is typically obtained from a wild-type strain of virus by genetic manipulation (i.e., by deletion) to encompass a conditionally replicating virus, as will be described hereinafter. Optimally, the viral vector includes a strain of the virus that is of the same type as the wild-type virus, causing the infection to be treated, which is preferably one of the above wild-type viruses. Accordingly, it is preferred that the vector is derived from an RNA virus, even more preferably that the vector is derived from a retrovirus, and it is optimal that the vector is derived from human immunodeficiency virus. Such a vector, derived from the human immunodeficiency virus, is usually referred to herein as the "crHIV" vector.

Вектор также предпочтительно является "химерным вектором", например сочетанием вирусного вектора с другими последовательностями, таким как, например, сочетание последовательностей HIV с одним или более другими вирусами (которые желательно происходят от штамма вирусов дикого типа для вхождения в состав вектора с зависимой от условий репликацией). В частности, последовательности HIV желательно могут быть соединены с последовательностями модифицированного (т.е. не дикого типа) штамма аденовируса, вируса, ассоциированного с аденовирусом, вируса из Alphaviridae, вируса из Flaviviridae, вируса из Hepadnaviridae, вируса из Papovaviridae, вируса из Parvoviridae, вируса из Herpesviridae, вируса из Poxviridae, вируса из Paramyxoviridae, вируса из Rhabdoviridae, вируса из Retroviridae, включая онко-ретровирусы, спума-ретровирусы и ленти-ретровирусы. Включаются также вирусы или вирусоподобные геномы, происходящие из или связанные с данными семействами вирусов.The vector is also preferably a “chimeric vector”, for example, a combination of a viral vector with other sequences, such as, for example, a combination of HIV sequences with one or more other viruses (which desirably derive from a strain of wild-type viruses to enter into a vector with conditionally dependent replication ) In particular, HIV sequences may desirably be linked to sequences of a modified (i.e., non-wild type) strain of adenovirus, virus associated with adenovirus, virus from Alphaviridae, virus from Flaviviridae, virus from Hepadnaviridae, virus from Papovaviridae, virus from Parvoviridae, a virus from Herpesviridae, a virus from Poxviridae, a virus from Paramyxoviridae, a virus from Rhabdoviridae, a virus from Retroviridae, including onco-retroviruses, spuma-retroviruses and lenti-retroviruses. Also included are viruses or virus-like genomes derived from or associated with these virus families.

Предпочтительным химерным вектором является такой, в котором векторные последовательности (т.е. либо последовательности, кодирующие белки, фрагменты, либо некодирующие последовательности), происходящие не от лентивируса, вставлены в лентивирусный вектор. Предпочтительно последовательности не-HIV вставляют в вектор, происходящий от HIV.A preferred chimeric vector is one in which vector sequences (i.e., either sequences encoding proteins, fragments, or non-coding sequences) derived from a non-lentivirus are inserted into the lentiviral vector. Preferably, non-HIV sequences are inserted into the HIV-derived vector.

Как здесь предусмотрено, вектор может включать либо ДНК, либо РНК. Например, либо ДНК, либо РНК-вектор может применяться для получения вируса. Сходно копия кДНК может быть создана из геномной РНК вируса. В противоположном варианте часть кДНК (или вирусной геномной ДНК) может быть транскрибирована in vitro для получения РНК. Данные способы хорошо известны специалистам в данной области техники и описаны также в последующих примерах.As provided herein, a vector may include either DNA or RNA. For example, either DNA or an RNA vector can be used to produce a virus. A similar copy of cDNA can be created from genomic RNA of the virus. Alternatively, a portion of the cDNA (or viral genomic DNA) can be transcribed in vitro to produce RNA. These methods are well known to those skilled in the art and are also described in the following examples.

"Вирус с зависимой от условий репликацией" представляет собой вирус с дефектом репликации, который обладает данным дефектом только при определенных условиях. В частности, вирус может завершать свой цикл репликации в пермиссирующей клетке-хозяине и не может завершать свой цикл репликации в запрещающей клетке-хозяине. "Клетка-хозяин" представляет собой клетку, способную инфицироваться или действительно инфицированную штаммом вируса дикого типа или псевдотипированным вектором. Такое инфицирование вирусом дикого типа может происходить либо перед, либо после инфицирования вирусом с зависимой от условий репликацией в соответствии с изобретением. В противоположном варианте "клеткой-хозяином" является такая клетка, которая кодирует генные продукты вируса дикого типа или хелпера, необходимые для репликации вируса. Таким образом, вектор с зависимой от условий репликацией в соответствии с изобретением представляет собой вирус (который предпочтительно является вирусом того же типа, что и вызывающий инфекцию, подвергаемую лечению), который реплицируется только при комплементации штаммом вируса дикого типа (или хелпером) или когда вирус дикого типа инфицирует клетки, содержащие геномы вектора с зависимой от условий репликацией.A condition-dependent replication virus is a virus with a replication defect that possesses this defect only under certain conditions. In particular, a virus can complete its replication cycle in a permissive host cell and cannot complete its replication cycle in a prohibiting host cell. A "host cell" is a cell capable of becoming infected or really infected with a wild-type strain of virus or a pseudotyped vector. Such wild-type virus infection can occur either before or after infection with a virus with conditional replication in accordance with the invention. Alternatively, a “host cell" is a cell that encodes the gene products of a wild-type virus or helper necessary for virus replication. Thus, the conditionally dependent replication vector of the invention is a virus (which is preferably the same type of virus as causing the infection being treated) that replicates only when complemented by a wild-type virus strain (or helper) or when the virus wild-type infects cells containing the genomes of a vector with conditionally dependent replication.

В предпочтительном осуществлении вектор включает РНК-вирус (например, вирус HIV с зависимой от условий репликацией), который вводится в форме ДНК. В данном предпочтительном осуществлении предлагается стратегия вектора HIV-1 с зависимой от условий репликацией, которая дает непатогенные векторные геномы crHIV-1 с селективным преимуществом над патогенными геномами HIV дикого типа. Конкретно, в клетках, содержащих геномы как HIV дикого типа, так и crHIV, РНК crHIV имеют селективное преимущество в отношении упаковки в вирионы, потому что они содержат, например, рибозимы, которые расщепляют РНК дикого типа, но не РНК crHIV. Такие непатогенные crHIVs способны переходить в неинфицированные клетки, которые восприимчивы к HIV-инфекции (например, клетки CD4+), в присутствии хелперного вируса дикого типа. Таким способом селективно упаковывающийся и распространяющийся crHIV вмешивается в репликацию HIV дикого типа.In a preferred embodiment, the vector comprises an RNA virus (e.g., conditionally replicating HIV virus) that is introduced in the form of DNA. This preferred embodiment provides an HIV-1 vector strategy with conditional replication that yields non-pathogenic crHIV-1 vector genomes with a selective advantage over wild-type pathogenic HIV genomes. Specifically, in cells containing both wild-type HIV and crHIV genomes, crHIV RNAs have a selective advantage with respect to packaging into virions because they contain, for example, ribozymes that cleave wild-type RNA, but not crHIV RNA. Such non-pathogenic crHIVs are able to pass into uninfected cells that are susceptible to HIV infection (e.g., CD4 + cells) in the presence of a wild-type helper virus. In this way, selectively packaged and spreading crHIV interferes with wild-type HIV replication.

Дополнительное предпочтительное осуществление представляет собой непатогенный вектор crHIV, который является непатогенным, потому что он не содержит никакого сочетания последовательностей вирусных вспомогательных белков (таких как, но не ограничиваясь этим, Vif, Vpu, Vpr или Nef или их сочетания, или фрагменты), которое может сделать вектор патогенным. В противоположном варианте последовательности могут присутствовать, но являться транскрипционно молчащими или нетранслируемыми. Необязательно вектор не содержит какого-либо сочетания последовательностей регуляторных белков (таких как, но не ограничиваясь этим, Tat или Rev или их фрагменты), которые должны сделать вектор патогенным. В противоположном варианте данные последовательности могут присутствовать, но являться транскрипционно молчащими или нетранслируемыми.A further preferred embodiment is the non-pathogenic vector crHIV, which is non-pathogenic because it does not contain any combination of viral accessory protein sequences (such as, but not limited to, Vif, Vpu, Vpr or Nef, or combinations or fragments thereof ) that may make the vector pathogenic. Alternatively, sequences may be present, but be transcriptionally silent or untranslated. Optionally, the vector does not contain any combination of sequences of regulatory proteins (such as, but not limited to, Tat or Rev, or fragments thereof), which should make the vector pathogenic. Alternatively, these sequences may be present, but be transcriptionally silent or untranslated.

Векторы, однако, предпочтительно содержат какое-либо сочетание последовательностей структурных белков (таких как, gag или его фрагмент), последовательностей ферментативных белков (таких как, pol или его фрагмент) и/или последовательностей белков оболочки (таких как, env или его фрагмент) в форме, способной либо активно транслироваться, либо в молчащей форме. Следовательно, вектор с зависимой от условий репликацией может быть способным к репликации, но не реплицироваться до уровней, которые являются патогенными для данного хозяина. Вместо этого вектор требует комплементации компонентом хелпера (таким как хелперный вектор), содержащим необходимые последовательности, происходящие от вируса дикого типа, для того чтобы реплицироваться до уровней, достаточных для индукции требуемого терапевтического, профилактического или биологического эффекта. Определение точного сочетания последовательностей белков или нуклеотидов, присутствующих в векторе и в хелпере, для обеспечения оптимального биологического эффекта включает только прямое применение простых процессов скрининга, включающих добавление в векторные или хелперные конструкты или изъятие из них различного сочетания последовательностей нуклеотидов, причем данные процессы являются рутинными для специалистов в данной области техники.The vectors, however, preferably contain any combination of sequences of structural proteins (such as gag or a fragment thereof), sequences of enzymatic proteins (such as pol or a fragment thereof) and / or sequences of envelope proteins (such as env or a fragment thereof) in a form capable of either actively broadcasting, or in silent form. Therefore, a conditionally replicated vector may be able to replicate, but not replicate to levels that are pathogenic for a given host. Instead, the vector requires complementation by a helper component (such as a helper vector) containing the necessary sequences derived from the wild-type virus in order to replicate to levels sufficient to induce the desired therapeutic, prophylactic or biological effect. Determining the exact combination of the protein or nucleotide sequences present in the vector and in the helper to ensure the optimal biological effect includes only the direct application of simple screening processes, including the addition of different combinations of nucleotide sequences to vector or helper constructs, and these processes are routine for specialists in this field of technology.

Более того, указанные выше последовательности нуклеотидов могут быть модифицированы или подвергнуты мутагенезу для того, чтобы модифицировать биологический эффект или, например, снизить возможность рекомбинации с хелперным конструктом. Хорошо известны в данной области техники многочисленные протоколы для модификации или мутагенеза векторных или хелперных конструктов для получения более оптимизированных конструктов (например, Current Protocols in Molecular Biology, Harcourt Brace and Jovanovich, 2000; Molecular Cloning, Sambrook et al, Cold Spring Harbor Press, 1989; и Soong et al Nature Genetics 25: 436-439, 2000, все включены здесь полностью).Moreover, the above nucleotide sequences can be modified or mutagenized in order to modify the biological effect or, for example, reduce the possibility of recombination with a helper construct. Numerous protocols are well known in the art for modifying or mutagenizing vector or helper constructs to produce more optimized constructs (e.g. Current Protocols in Molecular Biology, Harcourt Brace and Jovanovich, 2000; Molecular Cloning, Sambrook et al, Cold Spring Harbor Press, 1989 ; and Soong et al Nature Genetics 25: 436-439, 2000, all fully incorporated herein).

Подход, возможный с указанными выше векторами, отличается от применения живых аттенуированных (LA) вакцин, в которых используются компетентные в отношении репликации вирусы, которые не имеют вспомогательных белков (смотри Daniel et al., Science, 258, 1938-1941 (1992); и Desrosiers, AIDS Res. & Human Retrovir., 10, 331-332 (1994)), потому что с LA-вакцинами не делалось попыток восполнить недостатки, которые, например, препятствуют эффективной продукции эффективного иммунного ответа и при все еще сохраняющейся безопасности. Например, известно, что вакцины LA SIV с множественными делециями не могут вызывать эффективного иммунного ответа, в то время как вакцины LA SIV с одной делецией (Nef негативные) являются патогенными у неполовозрелых макак (Baba et al, 1995).The approach possible with the above vectors is different from the use of live attenuated (LA) vaccines that use replication-competent viruses that do not have auxiliary proteins (see Daniel et al., Science, 258, 1938-1941 (1992); and Desrosiers, AIDS Res. & Human Retrovir., 10, 331-332 (1994)) because LA vaccines have not been attempted to make up for deficiencies that, for example, impede the effective production of an effective immune response while still maintaining safety. For example, it is known that LA SIV vaccines with multiple deletions cannot elicit an effective immune response, while LA SIV vaccines with one deletion (Nef negative) are pathogenic in immature macaques (Baba et al, 1995).

Альтернативный подход к вакцине LA SIV, предлагаемый в настоящем изобретении, как описано выше, должен заключаться в использовании, по меньшей мере, двух векторов, где, по меньшей мере, один является вектором HIV с множественными делециями, а второй (хелперный) вектор экспрессирует все вспомогательные белки, за исключением Nef. Следовательно, многократно аттенуированный вектор HIV может реплицироваться зависимым от условий образом без провоцирования заболевания при комплементации Vif, Vpr и Vpu из хелперного вектора. Первый вектор может быть сконструирован как содержащий генетические противовирусные части, в результате чего может вмешиваться в репликацию и распространение HIV дикого типа. Альтернативно, такой первый вектор может быть использован для индукции эффективного иммунного ответа против вируса дикого типа. Специалистам в данной области техники должно быть ясно, что простой процесс скрининга должен позволить оценить какая(ие) фактическая(ие) комбинация(и) последовательностей, удаленных из первого вектора, но присутствующих в хелперном векторе, должны позволить первому вектору оптимально обеспечить терапевтический или профилактический ответ и все еще сохранять безопасность, будучи непатогенным.An alternative approach to the LA SIV vaccine proposed in the present invention, as described above, should be to use at least two vectors, where at least one is an HIV vector with multiple deletions, and the second (helper) vector expresses all auxiliary proteins, with the exception of Nef. Therefore, a multiply attenuated HIV vector can be replicated in a conditionally dependent manner without causing a disease when complementing Vif, Vpr, and Vpu from a helper vector. The first vector can be constructed as containing genetic antiviral parts, as a result of which it can interfere with the replication and spread of wild-type HIV. Alternatively, such a first vector can be used to induce an effective immune response against wild-type virus. It should be clear to those skilled in the art that a simple screening process should make it possible to evaluate which (s) actual combination (s) of sequences deleted from the first vector but present in the helper vector should allow the first vector to optimally provide therapeutic or preventive answer and still be safe while non-pathogenic.

При дополнительном предпочтительном осуществлении векторно-хелперной системы с зависимой от условий репликацией для экспрессии gag, pol, env, tat и rev будет применяться вектор HIV-1, а хелперный вектор, происходящий от HIV-2, будет применяться, например, для экспрессии Vif, Vpu, Vpr и необязательно Nef генов. Изобретение не ограничивается данным примером, потому что равно возможно любое сочетание указанных выше генов, помещенных в любое совместимое сочетание векторов, включая обратные HIV-1 и HIV-2, или химерные форматы HIV. Экспрессия Tat остовом HIV-1 должна трансактивировать как HIV-1, так и HIV-2 LTRs для комплементации одного другим для получения векторных частиц, которые содержат либо векторные геномы HIV-1, либо векторные геномы HIV-2. Однако две геномных РНК не должны эффективно димеризоваться, предотвращая таким образом совместную локализацию как векторного, так и хелперного геномов, которые иначе оба будут упакованы в одну вирионную частицу. Если они совместно упакованы в одну и ту же вирионную частицу, может наступить рекомбинация между векторным и хелперным геномом с получением репликационно компетентного вектора (RCV) в процессе обратной транскрипции после того, как частица инфицирует последующую клетку-мишень.In an additional preferred embodiment of the vector-dependent helper system with conditional replication, the HIV-1 vector will be used to express gag, pol, env, tat and rev, and the helper vector derived from HIV-2 will be used, for example, to express Vif, Vpu, Vpr, and optionally Nef genes. The invention is not limited to this example, because any combination of the above genes placed in any compatible combination of vectors, including reverse HIV-1 and HIV-2, or chimeric HIV formats, is equally possible. The expression of Tat backbone of HIV-1 should transactivate both HIV-1 and HIV-2 LTRs to complement one another to produce vector particles that contain either the HIV-1 vector genomes or the HIV-2 vector genomes. However, two genomic RNAs should not be effectively dimerized, thus preventing the joint localization of both the vector and helper genomes, which would otherwise be both packed into one virion particle. If they are packaged together in the same virion particle, recombination between the vector and helper genomes can occur to produce a replication competent vector (RCV) during reverse transcription after the particle infects the subsequent target cell.

Для дополнительного управления возможной продукцией совместно упакованных конструктов векторы могут дополнительно содержать одну или более последовательностей нуклеиновой кислоты, которые снижают риск любой рекомбинации. Например, первый вектор может содержать рибозимную (или антисмысловую/рибозимную) последовательность, специфичную в отношении расщепления хелперного вектора. Совместная локализация таких векторов в том же самом клеточном, субклеточном или внеклеточном месте должна приводить к расщеплению хелперного вектора для увеличения безопасности путем уничтожения димеризации или совместной локализации векторов, что ведет к возникновению неактивного генома после рекомбинации или по-другому предотвращает возникновение получения RCV. Данный подход может быть изменен путем включения рибозима в хелперный вектор вместо первого вектора или дополнительно усовершенствован путем включения рибозимов в оба вектора для обеспечения дополнительной безопасности.To further control the possible production of co-packaged constructs, the vectors may further comprise one or more nucleic acid sequences that reduce the risk of any recombination. For example, the first vector may contain a ribozyme (or antisense / ribozyme) sequence specific for cleavage of the helper vector. Co-localization of such vectors in the same cellular, subcellular or extracellular location should result in cleavage of the helper vector to increase safety by eliminating dimerization or co-localization of the vectors, which leads to the inactive genome after recombination or otherwise prevents the occurrence of RCV production. This approach can be modified by incorporating a ribozyme in a helper vector instead of the first vector, or further improved by incorporating ribozymes in both vectors for added security.

В противоположном варианте антисмысловые молекулы могут быть применены для замещения указанных выше рибозимов, так что образование гибридной двухцепочечной РНК будет быстро разрушаться клеточными эндонуклеазами. Дополнительное предпочтительное осуществление заключается в том, что антисмысловые последовательности должны превышать в длину РНК рибозима, используемую как мишень, на приблизительно 16 оснований.Alternatively, antisense molecules can be used to replace the above ribozymes, so that the formation of a hybrid double-stranded RNA will be rapidly destroyed by cellular endonucleases. A further preferred embodiment is that the antisense sequences must exceed the length of the ribozyme RNA used as a target by approximately 16 bases.

В модифицированном подходе хелперный вирус указанного выше примера может происходить от гетерологичного вируса (такого как любой из вирусов и семейств вирусов, описанных выше, но предпочтительно происходить от аденовируса, вируса, ассоциированного с аденовирусом, мышиного онкоретровируса или лентивируса, не относящегося к HIV), в результате чего белки могут экспрессироваться конститутивно. В противоположном варианте гетерологичный хелперный вектор может быть сконструирован для получения HIV-LTR для индуцируемой или ауторегулируемой экспрессии Tat с тем, чтобы трансактивировать экспрессию вектора HIV-1. Преимущество, обеспечиваемое гетерологичным вирусным хелперным вектором, состоит в ограниченной ассоциации между геномами первого и второго векторов, таким образом дополнительно снижая вероятность рекомбинации с возможным образованием RCV.In a modified approach, the helper virus of the above example can be derived from a heterologous virus (such as any of the viruses and virus families described above, but preferably from an adenovirus, an adenovirus associated virus, a mouse oncoretrovirus or a non-HIV lentivirus), as a result, proteins can be expressed constitutively. Alternatively, a heterologous helper vector can be designed to produce HIV-LTR for inducible or autoregulated expression of Tat in order to transactivate the expression of the HIV-1 vector. The advantage provided by the heterologous viral helper vector is the limited association between the genomes of the first and second vectors, thereby further reducing the likelihood of recombination with possible formation of RCV.

В другом осуществлении вектор содержит антисмысловую последовательность, которая присутствует в хелперном геноме или включена в хелперный геном. Неограничивающий пример можно рассмотреть с вектором pN1cptASgag, который аналогичен вектору pN1cptASenv за исключением того, что антисмысловая последовательность направлена на последовательность gag, присутствующую в хелперном векторе в дополнение к или вместо последовательности env, присутствующей в HIV дикого типа. Анти-gag антисмысловая последовательность расположена выше акцепторного сайта сплайсинга, который находится ниже последовательности RRE, присутствующей в векторе. Следовательно, последовательность gag будет упакована только в геномных, а не в подгеномных или сплайсингованных видах векторных РНК. Таким образом, хелперные геномы интронов, содержащих хелперы, такие как относящиеся к системе VIRPAC, должны быть предпочтительно направлены к сплайсосоме клетки, в то время как геномные векторные РНК, которые содержат анти-gag антисмысловую последовательность, должны предпочтительно обходить систему сплайсинга.In another implementation, the vector contains an antisense sequence that is present in the helper genome or included in the helper genome. A non-limiting example can be considered with the vector pN1cptASgag, which is similar to the vector pN1cptASenv except that the antisense sequence is directed to the gag sequence present in the helper vector in addition to or instead of the env sequence present in wild-type HIV. The anti-gag antisense sequence is located above the acceptor splicing site, which is located below the RRE sequence present in the vector. Therefore, the gag sequence will be packaged only in genomic and not in subgenomic or spliced types of vector RNA. Thus, helper genomes of introns containing helper cells, such as those belonging to the VIRPAC system, should preferably be directed to the cell spliceosome, while genomic vector RNAs that contain the anti-gag antisense sequence should preferably bypass the splicing system.

Различающиеся пути в клетке векторного и хелперного геномов должны приводить к минимальному влиянию на титр вектора, даже если векторный и хелперный геномы будут по «счастливой случайности» совместно локализованы, то гибридизация пар оснований векторного и хелперного геномов будет приводить к инактивации или разрушению таких частиц, содержащих векторный и хелперный геномы, и предотвращать рекомбинацию вектор-хелпер с образованием RCV. В противоположном осуществлении хелпер может быть сконструирован с наличием анти-U5 векторных антисмысловых последовательностей, направленных на U5 последовательности, находящиеся в векторе с зависимой от условий репликацией. Не выходя за пределы сущности данного аспекта изобретения, анти-U5 антисмысловые последовательности могут быть вставлены дистальнее хелперных кодирующих последовательностей, но перед сайтом терминации транскрипции. Однако если векторная и хелперная РНК будут по «счастливой случайности» совместно локализованы и будут подвергаться совместной упаковке и возможной рекомбинации, то антисмысловые последовательности будут разрушать или инактивировать такие совместно упакованные вирусные частицы и предотвращать рекомбинацию.Differing paths in the cell of the vector and helper genomes should lead to a minimal effect on the titer of the vector, even if the vector and helper genomes are “luckily” jointly localized, hybridization of the base pairs of the vector and helper genomes will lead to inactivation or destruction of such particles containing vector and helper genomes, and to prevent vector helper recombination with the formation of RCV. In the opposite embodiment, a helper can be constructed with anti-U5 vector antisense sequences directed to U5 sequences that are in a conditionally replicated vector. Without going beyond the gist of this aspect of the invention, anti-U5 antisense sequences can be inserted distal to the helper coding sequences, but in front of the transcription termination site. However, if vector and helper RNAs are “fortunate” together and localized and packaged and possibly recombined, antisense sequences will destroy or inactivate such co-packaged viral particles and prevent recombination.

В еще одном осуществлении хелпер может содержать последовательности-мишени для первой нуклеотидной последовательности, присутствующей в векторе. Нелимитирующим примером является вставка смыслового фрагмента env в хелпер из двух пар плазмид, содержащих вектор pN1cptSenv. Следовательно, если векторная и хелперная РНК будут совместно локализованы, смысловая последовательность env в хелпере будет образовывать пары оснований с антисмысловой последовательностью env в векторе с предотвращением рекомбинации. Представленные выше примеры не предназначены для ограничения изобретения только одним или двумя типами генетической противовирусной последовательности. Специалисту в данной области техники должно быть ясно, что множество генетических противовирусных последовательностей, также как родственных им последовательностей-мишеней, может быть вставлено в векторный и/или хелперный конструкты. В качестве дополнительного неограничивающего примера вектор pN1cptASgagASenv и хелпер, который содержит смысловую последовательность gag и последовательность фрагмента env, могут быть применены в сочетании друг с другом для увеличения безопасности путем снижения вероятности совместной упаковки и рекомбинации с образованием RCV.In yet another embodiment, the helper may comprise target sequences for the first nucleotide sequence present in the vector. A non-limiting example is the insertion of a sense fragment of env into a helper of two pairs of plasmids containing the vector pN1cptSenv. Therefore, if the vector and helper RNAs are jointly localized, the sense sequence env in the helper will form base pairs with the antisense sequence env in the vector to prevent recombination. The above examples are not intended to limit the invention to only one or two types of genetic antiviral sequences. One skilled in the art will appreciate that a plurality of genetic antiviral sequences, as well as their related target sequences, can be inserted into vector and / or helper constructs. As a further non-limiting example, the pN1cptASgagASenv vector and helper, which contains the gag sense sequence and the env fragment sequence, can be used in combination with each other to increase security by reducing the likelihood of co-packaging and recombination to form RCV.

В другом предпочтительном осуществлении при экспрессии векторного или хелперного компонентов компоненты экспрессируются временно. Одним способом создания вектора или хелпера, экспрессирующего свой геном или компоненты генома временно, является конструирование векторного или хелперного вектора с применением, например, негативного по интегразе гена Pol. Такие лентивирусные интегразные мутанты известны в данной области техники и, как показано, не являются инфекционными (Hirsch et al 1989 Nature 341: 573-574). Следовательно, векторный и/или хелперный геномы, которые получают из негативных по интегразе клеток-продуцентов, не будут интегрироваться, но могут экспрессироваться транзиторным образом с тем, чтобы регулировать уровень репликации вектора или хелпера. Еще одним способом транзиторной экспрессии либо вектора, либо хелпера является разрыв сайтов AAT в векторе LTRs. Данные сайты отвечают за активную интеграцию обратно транскрибируемой геномной векторной ДНК в хромосому клетки-хозяина.In another preferred embodiment, when expressing a vector or helper component, the components are expressed temporarily. One way to create a vector or helper expressing its genome or genome components temporarily is to construct a vector or helper vector using, for example, the integrase negative Pol gene. Such lentiviral integrase mutants are known in the art and are not shown to be infectious (Hirsch et al 1989 Nature 341: 573-574). Therefore, vector and / or helper genomes that are derived from integrase-negative producer cells will not integrate, but can be expressed transiently in order to regulate the level of replication of the vector or helper. Another way to transiently express either a vector or a helper is to break AAT sites in the LTRs vector. These sites are responsible for the active integration of the back transcribed genomic vector DNA into the chromosome of the host cell.

Дополнительным средством для достижения указанного выше является применение гибридного белка для упаковки функциональной молекулы интегразы в вирусные частицы. В данном осуществлении ни вектор с зависящей от условий репликацией, такой как лентивектор, ни хелперный вектор, не должны кодировать интегразу, но гибридный белок функциональной интегразы мог бы быть доступным за счет экспрессии другим плазмидным конструктом, таким как хелперный вектор, или копией, интегрированной в применяемую упаковывающую клетку, в процессе продукции или упаковки хелперного конструкта, обеспечивая таким образом функциональную активность интегразы при инфекции. В противоположном варианте белок-интеграза предлагается отдельно путем экспрессии хелперным конструктом, который его кодирует. В данном осуществлении изобретения вектор с зависящей от условий репликацией или лентивектор не должен кодировать интегразу. Гибридный белок может представлять собой, но не ограничиваться этим, гибридный белок vpr-интегразы, содержащий сайт расщепления протеазами в месте соединения между аминокислотными последовательностями vpr и интегразы.An additional means to achieve the above is the use of a hybrid protein for packaging a functional integrase molecule into viral particles. In this embodiment, neither a conditionally replicating vector, such as a lentivector, nor a helper vector, should encode integrase, but a functional integrase fusion protein could be accessible by expression with another plasmid construct, such as a helper vector, or a copy integrated into the packaging cell used, in the process of production or packaging of the helper construct, thus ensuring the functional activity of integrase in case of infection. In the opposite embodiment, integrase protein is proposed separately by expression with a helper construct that encodes it. In this embodiment of the invention, the conditionally replicating vector or lentivector does not need to code integrase. A fusion protein may be, but is not limited to, a vpr integrase fusion protein containing a protease cleavage site at the junction between the amino acid sequences of vpr and integrase.

Указанное выше описание двойной системы вектор-хелпер не должно ни в коей мере ограничивать изобретение двумя векторными или хелперными конструктами. Может быть использовано любое сочетание двух, трех или более векторов и/или хелперов для обеспечения компонентами, необходимыми для получения вектора. Разделение необходимых геномных элементов на большее количество векторных или хелперных компонентов будет создавать эффект повышенной безопасности, так как для множественных векторных и хелперных геномов будет труднее создавать RCV путем рекомбинации. Безопасность может быть дополнительно увеличена путем конструирования вектора(ов) и хелпера(ов), содержащих мало или не содержащих участков гомологии между ними, что является дополнительным предпочтительным осуществлением. Разделение необходимых геномных элементов на множественные компоненты может также дополнительно ограничить репликацию вектора с зависящей от условий репликацией, так как менее вероятно, чтобы более двух геномов по сравнению с только двумя геномами будет одновременно присутствовать в клетке-хозяине. Оптимальное количество требуемых вектора(ов) и хелпера(ов) может быть легко определено с помощью простого скрининга различных сочетаний и может варьироваться в зависимости от конкретной применяемой вирусной векторной системы.The above description of a binary vector helper system should in no way limit the invention to two vector or helper constructs. Any combination of two, three or more vectors and / or helpers can be used to provide the components necessary to obtain the vector. Dividing the required genomic elements into a larger number of vector or helper components will create an effect of increased security, since for multiple vector and helper genomes it will be more difficult to create RCV by recombination. Security can be further enhanced by constructing the vector (s) and helper (s) containing little or no homology between them, which is an additional preferred embodiment. Separation of the required genomic elements into multiple components can also further limit the replication of the vector depending on the conditions of replication, since it is less likely that more than two genomes, compared to only two genomes, will be present simultaneously in the host cell. The optimal number of required vector (s) and helper (s) can be easily determined using a simple screening of various combinations and can vary depending on the particular viral vector system used.

Одно простое и неограничивающее средство ограничения или удаления участков гомологии между вектором(ами) и хелпером(ами) заключается в простой вырожденности нуклеотидной последовательности при поддержании последовательности кодируемых аминокислот. Способы создания вырожденных последовательностей хорошо известны в данной области техники и являются рутинными. Один предпочтительный способ заключается в приближении последовательностей к человеческим, если их терапевтически применяют у человека. Применение кодонов у приматов сведено в таблицу и описывается в Wada et al. (Nucleic Acids Research vol. 18 Supplement: 2367-2411, 1990), которая включена здесь в полном изложении.One simple and non-limiting means of limiting or removing homology regions between the vector (s) and helper (s) is to simply degenerate the nucleotide sequence while maintaining the sequence of encoded amino acids. Methods for creating degenerate sequences are well known in the art and are routine. One preferred method is to approximate sequences to human sequences if they are therapeutically used in humans. The use of codons in primates is tabulated and described in Wada et al. (Nucleic Acids Research vol. 18 Supplement: 2367-2411, 1990), which is incorporated herein by reference in its entirety.

Вырожденность может также быть использована для защиты хелперного конструкта от действия агента, предназначенного для направления вектора в сторону упаковки с хелпером. Это может быть достигнуто просто с помощью вырожденности родственной последовательности-мишени, если какая-то найдена в хелперном конструкте. Дополнительно вырожденность как векторного, так и хелперного конструктов может быть предназначена для снижения рекомбинации с другими вирусными последовательностями, включая те из других последовательностей дикого типа, которые могут быть случайно найдены в векторной или хелперной последовательности в клетке. Например, применение векторной и хелперной пары в упаковывающей системе, основанной на HIV-1 и HIV-2, можно модифицировать так, что векторная и хелперная пара становится вырожденной также для эндогенного ретроэлемента. Таким образом, вырожденная нуклеотидная последовательность либо вектора, либо хелпера должна снижать совместную локализацию предполагаемых рекомбинантов и таким образом снижать риск создания репликационно компетентного вируса между векторным и хелперным геномами или между векторным или хелперным геномами и конкурирующим геномом, таким как эндогенный ретроэлемент.Degeneracy can also be used to protect the helper construct from the action of an agent designed to direct the vector towards the packaging with the helper. This can be achieved simply by degeneracy of the related target sequence, if any is found in the helper construct. Additionally, the degeneracy of both the vector and helper constructs can be designed to reduce recombination with other viral sequences, including those from other wild-type sequences that can be accidentally found in a vector or helper sequence in a cell. For example, the use of vector and helper pairs in a packaging system based on HIV-1 and HIV-2 can be modified so that vector and helper pairs become degenerate also for an endogenous retroelement. Thus, a degenerate nucleotide sequence of either a vector or a helper should reduce the joint localization of putative recombinants and thus reduce the risk of creating a replication competent virus between the vector and helper genomes or between the vector or helper genomes and a competing genome such as an endogenous retroelement.

В частности, геномы crHIV вводятся в инфицированные вирусом клетки или в неинфицированные клетки. Инфицированные клетки снабжают геном crHIV белками, требуемыми для инкапсидации и продукции потомства вирионов. Геномы crHIV вводят в неинфицированные клетки предпочтительно либо прямо путем трансдукции (например, это может быть сделано, например, с помощью опосредованной липосомами трансдукции ДНК crHIV или путем применения химерного вирусного вектора), либо путем инфицирования частицами crHIV, что является результатом трансфекции клеток, инфицированных HIV дикого типа. Неинфицированные клетки, содержащие усовершенствованный вектор crHIV изобретения, не продуцируют такое количество частиц crHIV, которое является патогенным для хозяина. Некоторые осуществления клеток с вектором crHIV, не суперинфицированных HIV дикого типа, будут продуцировать некоторое количество частиц crHIV, но на уровне, который не является патогенным для хозяина. Клетки, содержащие любой вектор изобретения, могут оставаться восприимчивыми к суперинфицированию вирусом дикого типа, который будет поставлять белки, требуемые для дополнительной продукции частиц crHIV. В этом смысле вектор с зависящей от условий репликацией в соответствии с изобретением в присутствии дополнительного суперинфицирования диким типом функционирует также как тип "вирусного вектора для доставки", например, могут происходить множественные циклы инфицирования crHIV (т.е. в присутствии сопутствующей инфекции HIV дикого типа). Такой вектор является источником вируса в течение более чем одного цикла репликации вируса и таким образом инфицирует другие клетки, или в течение множественных циклов репликации количество вирусов доводится до уровня, который должен вызывать биологический ответ, такой как иммунный ответ. Данное усовершенствование контрастирует с другими векторами, такими как те, которые применяют со стандартными упаковывающими клеточными линиями и которые дают только один цикл репликации или множественные циклы репликации, которые либо не достаточны для индукции соответствующего биологического ответа, либо являются патогенными для хозяина.In particular, crHIV genomes are introduced into virus-infected cells or into uninfected cells. Infected cells supply the crHIV gene with the proteins required for encapsidation and production of virion progeny. The crHIV genomes are introduced into uninfected cells, preferably either directly by transduction (for example, this can be done, for example, using liposome-mediated transduction of crHIV DNA or by using a chimeric viral vector), or by infection with crHIV particles, which results from transfection of cells infected with HIV wild type. Uninfected cells containing the improved crHIV vector of the invention do not produce as many crHIV particles that are pathogenic to the host. Some embodiments of cells with the crHIV vector that are not superinfected with wild-type HIV will produce a number of crHIV particles, but at a level that is not pathogenic to the host. Cells containing any vector of the invention may remain susceptible to superinfection with wild-type virus, which will supply the proteins required for additional production of crHIV particles. In this sense, the conditionally dependent replication vector of the invention, in the presence of additional wild-type superinfection, also functions as a “viral delivery vector” type, for example, multiple cycles of crHIV infection can occur (i.e. in the presence of a co-infection with wild-type HIV ) Such a vector is the source of the virus for more than one cycle of virus replication and thus infects other cells, or during multiple cycles of replication, the number of viruses is brought to the level that should cause a biological response, such as an immune response. This improvement contrasts with other vectors, such as those used with standard packaging cell lines and which give only one replication cycle or multiple replication cycles, which are either not sufficient to induce an appropriate biological response or are pathogenic for the host.

Если это желательно (например, для облегчения применения вектора in vitro), генные продукты вируса дикого типа могут параллельно поставляться клетке, инфицированной вектором с зависящей от условий репликацией. Генные продукты вируса дикого типа могут поставляться не только с помощью совместного инфицирования штаммом вируса дикого типа (или кДНК, или провирусом, или РНК-вирусом), но также путем предоставления их клетке в форме их генов, субклонированных в экспрессионном векторе, например в хелперном экспрессионном векторе ("хелпер" или "хелперный вектор"), который способен передавать клетке-хозяину транскрипцию или трансляцию последовательностей (регуляторных или структурных), или в альтернативном варианте генные продукты могут поставляться экзогенно, т.е. путем добавления белковых продуктов к клетке.If desired (for example, to facilitate the use of the vector in vitro), wild type virus gene products can be delivered in parallel to a cell infected with a conditionally replicated vector. Wild-type virus gene products can be delivered not only by co-infection with a wild-type strain of virus (or cDNA, or provirus, or RNA virus), but also by providing them with a cell in the form of their genes subcloned in an expression vector, for example, in an expression helper a vector ("helper" or "helper vector") that is capable of transmitting transcription or translation of sequences (regulatory or structural) to a host cell, or alternatively gene products may be delivered zogenic, i.e. by adding protein products to the cell.

Например, вектор crHIV может быть сконструирован так, чтобы он содержал все белки HIV дикого типа за исключением, например, последовательности, кодирующей Tat. Вместо применения хелперного экспрессионного конструкта, который экспрессирует Tat, в качестве хелпера может быть применен сам белок Tat. Преимущество использования белка вместо хелперного конструкта заключается в том, что не существует теоретической возможности создания вируса дикого типа, так как никаких последовательностей нуклеиновых кислот не присутствует для рекомбинации. Таким образом, crHIV может размножаться, используя белок Tat, а не хелперный конструкт нуклеиновой кислоты per se. Tat 1 или Tat 2 (соответствующие первому или первому и второму экзонам Tat соответственно) могут быть использованы в качестве хелпера. Способы получения и очистки таких белков хорошо известны в данной области техники.For example, the crHIV vector can be designed to contain all wild-type HIV proteins except, for example, the Tat coding sequence. Instead of using a helper expression construct that expresses Tat, Tat protein itself can be used as a helper. The advantage of using a protein instead of a helper construct is that there is no theoretical possibility of creating a wild-type virus, since no nucleic acid sequences are present for recombination. Thus, crHIV can be propagated using the Tat protein and not the nucleic acid helper construct per se. Tat 1 or Tat 2 (corresponding to the first or first and second exons of Tat, respectively) can be used as a helper. Methods for the preparation and purification of such proteins are well known in the art.

В одном предпочтительном осуществлении применяют химерный белок Tat. Tat вставляли в гибридный белок (например, Tat-VP16) и, как показано, он сохранял свою трансактивирующую активность на промоторе HIV-LTR. Для увеличения желаемого биологического эффекта могут быть созданы другие химерные белки Tat. Например, если желаемый биологический эффект состоит в увеличении иммунного ответа, то может быть сконструирован гибридный белок Tat-GM-CSF. Данный подход не ограничивается одним типом химерного белка и может быть желательным добавление, по меньшей мере, второго химерного (или нехимерного) белка Tat (например, Tat-IFN-alpha, Tat-TNF-alpha, Tat-IL-4, Tat-G-CSF, TNF-alpha, GM-CSF, IL-4, G-CSF, IFN-alpha в качестве примера, но охватывая только некоторые возможности). Специалист в данной области техники может, несомненно, с легкостью сконструировать и протестировать другие эквивалентные химерные белки и провести их скрининг на способность увеличивать иммунный ответ, предоставляя в то же время хелперную функцию для вектора. Другое предпочтительное осуществление заключается в конструировании гибридного белка Tat-Rev или гибридного белка Tat-Rev природного HIV, например Trev. Следовательно, представленное выше описание химерных белков Tat не ограничивается включением только цитокинов или клеточных белков, но в изобретении могут быть использованы также вирусные белки (продукция гомологичных или гетерологичных вирусных гибридных белков) в зависимости от желаемого биологического эффекта.In one preferred embodiment, a Tat chimeric protein is used. Tat was inserted into a fusion protein (e.g., Tat-VP16) and, as shown, it retained its transactivating activity on the HIV-LTR promoter. Other Tat chimeric proteins can be created to increase the desired biological effect. For example, if the desired biological effect is to increase the immune response, a Tat-GM-CSF fusion protein can be engineered. This approach is not limited to one type of chimeric protein, and it may be desirable to add at least a second chimeric (or non-chimeric) Tat protein (e.g., Tat-IFN-alpha, Tat-TNF-alpha, Tat-IL-4, Tat-G -CSF, TNF-alpha, GM-CSF, IL-4, G-CSF, IFN-alpha as an example, but covering only a few possibilities). One of skill in the art can, of course, easily design and test other equivalent chimeric proteins and screen them for their ability to increase the immune response, while providing a helper function for the vector. Another preferred embodiment is the construction of a Tat-Rev fusion protein or a natural HIV Tat-Rev fusion protein, for example Trev. Therefore, the above description of Tat chimeric proteins is not limited to the inclusion of only cytokines or cellular proteins, but viral proteins (production of homologous or heterologous viral fusion proteins) can also be used in the invention, depending on the desired biological effect.

В отношении "хелперного вектора" его экспрессия может быть специфичной или неспецифичной для клетки, и он может быть введен в клетку-хозяин вместе с вирусным вектором с зависящей от условий репликацией, как здесь указано, давая возможность постоянной репликации вирусному вектору с зависящей от условий репликацией.With respect to the helper vector, its expression may be specific or non-specific for the cell, and it may be introduced into the host cell along with the conditionally replicating viral vector, as indicated herein, allowing continuous replication of the conditionally dependent viral vector .

"Хелперные векторы" изобретения могут поставлять генные продукты, необходимые для репликации, с помощью либо единичного вектора, либо множественных векторов. Такие векторы предпочтительно применяют во временной трансфекционной системе. Альтернативно, генные продукты могут также быть интегрированы в геном клетки-хозяина или клеточной линии. В соответствии с изобретением единичный вектор или плазмида (которая может быть моно-, би- или мультицистронной в клетке-хозяине) являются предпочтительными из-за увеличенных векторных титров, возникающих благодаря увеличенной вероятности совместной трансфекции хелперного вектора и вектора с зависящей от условий репликацией в одной и той же клетке. Пониженная вероятность одновременной трансфекции более двух различных векторов в одной и той же клетке делает применение единичного хелперного вектора более желательным. Снижение количества векторов или плазмид, включенных в трансфекционную систему, является также целесообразным в плане цены, так как меньшее количество плазмид по сравнению с общепринятой трехплазмидной трансфекционной системой должно продуцироваться для упаковки ретровирусных конструктов.The "helper vectors" of the invention can supply the gene products needed for replication using either a single vector or multiple vectors. Such vectors are preferably used in a transient transfection system. Alternatively, the gene products may also be integrated into the genome of the host cell or cell line. In accordance with the invention, a single vector or plasmid (which may be mono-, bi- or multicistronic in the host cell) is preferred due to the increased vector titers resulting from the increased likelihood of co-transfection of the helper vector and the conditionally dependent replication vector in one and the same cage. The reduced likelihood of simultaneous transfection of more than two different vectors in the same cell makes the use of a single helper vector more desirable. Reducing the number of vectors or plasmids included in the transfection system is also reasonable in terms of price, since fewer plasmids compared to the conventional three-plasmid transfection system must be produced for packaging retroviral constructs.

Применяемый здесь термин "комплементация" обозначает негенное взаимодействие вирусных генных продуктов из различных источников в клетках. Конкретно, в случае смешанной инфекции комплементация включает увеличение выхода вирусов одного или обоих родительских геномов, в то время как генотипы родительских геномов остаются неизмененными. Комплементация может быть неаллельной (т.е. межгенной, при которой мутанты, дефектные в отношении различных функций, помогают друг другу при вирусной репликации путем снабжения функцией, которая является дефектной у другого вируса) или аллельной (т.е. внутригенной, при которой два родителя имеют дефекты в различных доменах мультимерного белка).The term “complementation” as used herein refers to the non-gene interaction of viral gene products from various sources in cells. Specifically, in the case of a mixed infection, complementation involves increasing the virus output of one or both of the parental genomes, while the genotypes of the parental genomes remain unchanged. Complementation can be non-allelic (i.e., intergenic, in which mutants defective in relation to different functions help each other in viral replication by providing a function that is defective in another virus) or allelic (i.e., intragenic, in which two parents have defects in different domains of the multimeric protein).

Желательно, чтобы типы клеток, которые могут быть трансфицированы (трансдуцированы) ДНК crHIV (т.е. с помощью липосом или применения гетерологичного вектора для получения химерного вектора, как описано выше), могли быть либо клетками, инфицированными HIV, либо неинфицированными клетками. Клетки, инфицированные HIV, могут быть активированными или неактивированными. Если они активированы, они будут немедленно транскрибировать РНК HIV дикого типа и РНК crHIV, приводя к селективной упаковке РНК crHIV в вирионы потомков. Если клетки, инфицированные HIV, неактивированы, ДНК crHIV будет находиться в них до тех пор, пока они не станут активированными (например, путем стимуляции митогенами, антигенами и тому подобное), опять приводя к селективной упаковке РНК crHIV в вирионы потомков. Как активированные, так и неактивированные неинфицированные клетки, которые трансфицированы ДНК crHIV, не будут продуцировать вирионы до тех пор, пока они не станут суперинфицированными HIV дикого типа и активированными путем стимуляции, опять приводящей к селективной упаковке РНК crHIV в вирионы потомков.It is desirable that the types of cells that can be transfected (transduced) with crHIV DNA (i.e. using liposomes or using a heterologous vector to produce a chimeric vector as described above) can be either HIV infected cells or uninfected cells. Cells infected with HIV may be activated or inactive. If activated, they will immediately transcribe wild-type HIV RNA and crHIV RNA, resulting in selective packaging of crHIV RNA in progeny virions. If HIV-infected cells are inactive, crHIV DNA will remain in them until they become activated (for example, by stimulation with mitogens, antigens and the like), again leading to selective packaging of crHIV RNA into progeny virions. Both activated and unactivated uninfected cells that are transfected with crHIV DNA will not produce virions until they become superinfected with wild-type HIV and activated by stimulation, again leading to selective packaging of crHIV RNA into progeny virions.

Одним вариантом клетки-хозяина, трансдуцированной вектором изобретения, является такой, при котором клетка содержит максимальное количество векторных копий, которые не являются существенно токсичными ни для клетки-хозяина, ни для организма-хозяина, содержащего клетку. Другим вариантом клетки-хозяина, трансдуцированной вектором, является такой, при котором клетка содержит, по меньшей мере, одну копию вектора, но предпочтительно содержит минимальное количество векторных копий, требуемых для индукции биологического эффекта. Количество копий в клетке может быть определено с помощью, например, TaqMan ПЦР, и приемлемое количество копий или диапазон количества копий, подходящие как для желаемого биологического эффекта, так и в плане отсутствия токсичности, может быть легко определено специалистом в данной области техники. Приемлемое количество копий будет варьироваться в зависимости от факторов, включая тип трансдуцируемой клетки, природу вектора (например, вирусное происхождение) и желаемый биологический эффект, но будет оставаться легко определимым путем обычного скрининга специалистом в данной области техники.One embodiment of a host cell transduced by the vector of the invention is one in which the cell contains a maximum number of vector copies that are not substantially toxic to either the host cell or the host organism containing the cell. Another embodiment of a vector transduced host cell is one in which the cell contains at least one copy of the vector, but preferably contains the minimum number of vector copies required to induce a biological effect. The number of copies in a cell can be determined using, for example, TaqMan PCR, and an acceptable number of copies or a range of copy numbers suitable for both the desired biological effect and the lack of toxicity can be easily determined by one skilled in the art. The acceptable number of copies will vary depending on factors, including the type of transduced cell, the nature of the vector (e.g., viral origin) and the desired biological effect, but will remain readily detectable by routine screening by a person skilled in the art.

Суперинфицирование клеток, содержащих геномы crHIV (например, в качестве результата трансфекции или инфекции), наступает, потому что геномы crHIV не кодируют вирусные белки, которые блокируют суперинфицирование (такие, как env и nef). Полученные вирионы crHIV могут инфицировать неинфицированные клетки, так как вирусные частицы содержат молекулу обратной транскриптазы, которую несут все частицы HIV, так что они могут создавать ДНК-провирус из их геномной РНК. Данный процесс называют обратной транскрипцией. Как только вирионы crHIV инфицируют неинфицированные клетки, они могут подвергаться обратной транскрипции и продуцировать провирус из своей геномной РНК. Таким образом, данные клетки являются эквивалентными тем неинфицированным клеткам, которые прямо трансдуцируются ДНК crHIV. Они не могут продуцировать частицы crHIV до тех пор, пока данные клетки не станут суперинфицированными HIV дикого типа и не будут активированными, тогда еще раз произойдет селективная упаковка РНК crHIV в вирионы потомков. Возможно, что частицы crHIV смогли также инфицировать некоторые клетки, которые уже инфицированы HIV (смотри, например, Yunoki et al., Arch. Virol., 116, 143-158 (1991); Winslow et al., Virol., 196, 849-854 (1993); Chen et al., Nuc. Acids Res., 20, 4581-4589 (1992); и Kim et al., AIDS Res. & Hum. Retrovir., 9, 875-882 (1993)). Однако для того, чтобы это наступило, данные инфицированные HIV клетки не должны экспрессировать белки, которые негативно регулируют экспрессию CD4, потому что это будет препятствовать вирионам crHIV инфицировать данные клетки. Активированные клетки, инфицированные HIV, обычно негативно регулируют экспрессию CD4. Соответственно, клетки, инфицированные HIV, которые являются неактивированными, потенциально восприимчивы к суперинфицированию crHIV и, таким образом, могут быть другим источником продукции частиц crHIV. В отношении предпочтительного вектора crHIV изобретения вектор включает последовательности, требуемые для транскрипции РНК, связывания праймеров тРНК, димеризации и упаковки, и либо не имеет последовательностей, кодирующих белки, которые блокируют суперинфицирование HIV дикого типа (например, белки nef или env), или включают такие последовательности, но они либо не транскрибируются, либо не транслируются в функционирующий белок, так что их экспрессия считается "молчащей". Даже более предпочтительно, чтобы вектор не имел области или последовательностей, кодирующих область HIV дикого типа, начиная от последовательности, кодирующей gag, до и включая ген nef. Оптимально, однако, чтобы вектор действительно включал rev-чувствительный элемент (RRE), который клонирован в вектор в область делеции или какую-либо другую подходящую область. Такой предпочтительный вектор HIV, как говорят, "лишен области или последовательностей, кодирующих область", в виду того, что данный вектор может быть введен в своем РНК варианте или, альтернативно, в виде ДНК, как описано ранее.Superinfection of cells containing the crHIV genomes (for example, as a result of transfection or infection) occurs because the crHIV genomes do not encode viral proteins that block superinfection (such as env and nef). The resulting crHIV virions can infect uninfected cells, since the viral particles contain a reverse transcriptase molecule that all HIV particles carry, so that they can create a DNA provirus from their genomic RNA. This process is called reverse transcription. Once crHIV virions infect uninfected cells, they can undergo reverse transcription and produce provirus from their genomic RNA. Thus, these cells are equivalent to those uninfected cells that are directly transduced by crHIV DNA. They cannot produce crHIV particles until these cells become superinfected with wild-type HIV and are activated, then selective packing of crHIV RNA into progeny virions will again occur. It is possible that crHIV particles were also able to infect some cells that are already infected with HIV (see, for example, Yunoki et al., Arch. Virol., 116, 143-158 (1991); Winslow et al., Virol., 196, 849 -854 (1993); Chen et al., Nuc. Acids Res., 20, 4581-4589 (1992); and Kim et al., AIDS Res. & Hum. Retrovir., 9, 875-882 (1993)) . However, in order for this to occur, these HIV-infected cells must not express proteins that negatively regulate the expression of CD4, because this will prevent the crHIV virions from infecting these cells. Activated HIV-infected cells typically upregulate CD4 expression. Accordingly, HIV-infected cells that are inactive are potentially susceptible to superinfection of crHIV and thus may be another source of production of crHIV particles. With respect to the preferred crHIV vector of the invention, the vector includes the sequences required for RNA transcription, binding of tRNA primers, dimerization and packaging, and either does not have sequences that encode proteins that block wild-type HIV superinfection (e.g., nef or env proteins), or include sequences, but they are either not transcribed or not translated into a functioning protein, so that their expression is considered “silent”. Even more preferably, the vector does not have a region or sequences encoding a wild-type HIV region, ranging from a sequence encoding a gag to and including a nef gene. It is optimal, however, for the vector to actually include a rev-sensitive element (RRE) that is cloned into the vector in the deletion region or some other suitable region. Such a preferred HIV vector is said to be “lacking a region or sequences encoding a region” since this vector can be introduced in its RNA variant or, alternatively, as DNA, as described previously.

В соответствии с изобретением для того, чтобы достичь успешной комплементации в системе, которая использует хелперный вектор в сочетании с вектором с зависящей от условий репликацией, любой вирусный компонент, необходимый для вирусной упаковки, но не экспрессируемый вектором с зависящей от условий репликацией, должен быть поставлен хелперным вектором. Таким образом, настолько долго, насколько два или более различных вектора вместе обладают полным дополнением необходимых вирусных компонентов, композиция индивидуальных векторов является предметом для многих перестановок. Каждая из данных перестановок охватывается настоящим изобретением. В качестве примера гены gag и pol, необходимые для успешной упаковки и репликации, могут оба быть включенными либо в хелперный вектор, либо в вектор с зависящей от условий репликацией, или два гена могут индивидуально присутствовать в одном из каждых векторов. Более того, один хелперный векторный конструкт может включать последовательности как gag/pol, так и env, включая гетерологичные последовательности env, под контролем одного ряда транскрипционных регуляторных элементов, включая промотор, или под контролем отдельных промоторных элементов. Например, LTR может быть использован для экспрессии генных продуктов в векторах изобретения. Применение различных промоторов, включая индуцибельные промоторы, дает возможность дифференциальной регуляции, например, последовательностей gag/pol и env. Таким образом, последовательность env, особенно гетерологичная последовательность env, такая как последовательность оболочки VSV-G, может экспрессироваться на более высоком уровне.In accordance with the invention, in order to achieve successful complementation in a system that uses a helper vector in combination with a conditionally dependent replication vector, any viral component necessary for viral packaging but not expressed by a conditionally dependent replication vector must be delivered helper vector. Thus, as long as two or more different vectors together possess the complete complement of the necessary viral components, the composition of individual vectors is the subject of many permutations. Each of these permutations is covered by the present invention. As an example, the gag and pol genes necessary for successful packaging and replication can both be included in either a helper vector or a conditionally replicated vector, or two genes can be individually present in one of each vectors. Moreover, one helper vector construct can include both gag / pol and env sequences, including heterologous env sequences, under the control of one of a number of transcriptional regulatory elements, including a promoter, or under the control of individual promoter elements. For example, LTR can be used to express gene products in the vectors of the invention. The use of various promoters, including inducible promoters, enables differential regulation of, for example, gag / pol and env sequences. Thus, the env sequence, especially the heterologous env sequence, such as the VSV-G envelope sequence, can be expressed at a higher level.

Векторное конструирование хорошо известно специалистам в данной области техники. Данные способы могут быть использованы для конструирования как вектора с зависящей от условий репликацией, так и хелперного вектора. Таким образом, применяемый здесь термин "вектор" может относиться к обоим типам векторов. Дополнительно термин вектор охватывает любой лентивирусный вектор, не обязательно являющийся вектором с зависящей от условий репликацией. Такие векторы могут также относиться к общим лентивирусным векторам. В предпочтительных осуществлениях изобретения, однако, вектор представляет собой лентивирусный вектор с зависящей от условий репликацией. Например, и как описано в примере 1, манифестированная ДНК РНК-вируса, такого как HIV, расщепляется при применении рестриктазных ферментов для удаления последовательностей, кодирующих HIV, начиная от области, кодирующей gag, до U3 области, следующей за геном nef, включительно. Клонирующую кассету, включающую полилинкер, содержащий множественные сайты рестрикции, вставляют в область делеции перед лигированием для обеспечения удобных сайтов рестрикции для клонирования в векторе. Фрагмент ДНК, содержащий RRE, субклонируют в один из данных сайтов. Полученный вектор продуцирует укороченный транскрипт gag и не продуцирует белок Gag дикого типа или любые другие белки HIV дикого типа. Более того, не является необходимым, чтобы вектор экспрессировал даже укороченный белок gag, в виду того что последовательность инициации трансляции gag может быть подвергнута мутации для предотвращения его трансляции.Vector design is well known to specialists in this field of technology. These methods can be used to construct both a conditionally replicated vector and a helper vector. Thus, the term “vector” as used herein can refer to both types of vectors. Additionally, the term vector encompasses any lentiviral vector, which is not necessarily a conditionally replicating vector. Such vectors may also refer to common lentiviral vectors. In preferred embodiments of the invention, however, the vector is a lentiviral vector with conditional replication. For example, and as described in Example 1, the manifested DNA of an RNA virus, such as HIV, is cleaved using restriction enzymes to remove sequences encoding HIV, starting from the gag coding region to the U3 region following the nef gene, inclusive. A cloning cassette comprising a polylinker containing multiple restriction sites is inserted into the deletion region before ligation to provide convenient restriction sites for vector cloning. A DNA fragment containing RRE is subcloned into one of these sites. The resulting vector produces a shortened gag transcript and does not produce wild-type Gag protein or any other wild-type HIV proteins. Moreover, it is not necessary that the vector express even a truncated gag protein, since the gag translation initiation sequence can be mutated to prevent its translation.

С применением того же самого подхода последовательности crHIV могут быть соединены с другими последовательностями, такими как последовательности вируса или другого вектора, с получением химерного вектора, как описано выше. Например, последовательности crHIV могут быть соединены с таковыми вируса лихорадки Синдбиса, AAV, аденовируса или амфотропного ретровируса, упоминая некоторые из них. Дополнительные вирусные последовательности, которые могут быть применены, включают последовательности вируса герпеса, поксвируса и других описанных здесь вирусов, включая любой вирус, который может быть использован для обеспечения доставки последовательностей crHIV. Такой химерный вектор может быть введен в клетку либо с применением механизма соединения вирусов для входа в клетку (например, путем опосредуемого рецепторами эндоцитоза для аденовируса), либо с помощью других способов, например с помощью липосом.Using the same approach, crHIV sequences can be linked to other sequences, such as a virus or other vector, to produce a chimeric vector as described above. For example, crHIV sequences may be linked to those of Sindbis fever virus, AAV, adenovirus, or amphotropic retrovirus, some of which are mentioned. Additional viral sequences that can be used include those of the herpes virus, poxvirus, and other viruses described herein, including any virus that can be used to ensure delivery of crHIV sequences. Such a chimeric vector can be introduced into the cell either using the mechanism of connecting viruses to enter the cell (for example, by receptor-mediated endocytosis for adenovirus), or using other methods, for example, using liposomes.

Предпочтительно в соответствии с изобретением вектор (т.е. вирус с зависящей от условий репликацией, который предпочтительно является вектором crHIV) включает, по меньшей мере, одну последовательность нуклеиновой кислоты, наличие (т.е. присутствие, транскрипция или трансляция) которой придает селективное преимущество. Существует два типа таких последовательностей нуклеиновой кислоты, предназначенных для включения в вектор: (1) последовательность нуклеиновой кислоты, наличие которой дает оптимальное селективное преимущество для вирусной репликации и распространения вектору, включающему такую последовательность, над штаммом вируса дикого типа (т.е. предпочтительно штаммом дикого типа, из которого происходит вектор и который не включает последовательность), и (2) последовательность нуклеиновой кислоты, наличие которой дает оптимальное селективное преимущество клеткам, инфицированным вектором, включающим последовательность, по сравнению с клетками, инфицированными или неинфицированными штаммом вируса дикого типа (т.е. предпочтительно штаммом дикого типа, из которого происходит вектор (и также, например, хелперный экспрессионный вектор, который стимулирует репликацию и/или функцию вектора в неинфицированной клетке-хозяине), который не включает последовательность, с помощью, например, стимуляции выживания клеток, содействия продукции и/или размножению векторных частиц, стимуляции получения crHIV-векторных вирионов из клеток, продуцирующих вектор crHIV, индукции апоптоза, облегчения продукции белков или стимуляции иммунологической функции или ее направленности, так чтобы достичь желаемого профилактического, терапевтического или биологического выхода. Каждая из данных последовательностей или множественность из каждой из данных последовательностей, т.е. последовательность, которая одна или в сочетании с другим(ими) фактором(ами) стимулирует размножение вектора и/или стимулирует конкретную функцию клетки-хозяина, так чтобы возникал благоприятный профилактический, терапевтический и/или биологический эффект, может быть включена в вектор либо в отсутствие, либо в присутствии другой последовательности, т.е. вектор может включать, "по меньшей мере, одну последовательность нуклеиновой кислоты" и, "по меньшей мере, одну дополнительную последовательность нуклеиновой кислоты".Preferably, in accordance with the invention, a vector (i.e., a conditionally replicating virus, which is preferably a crHIV vector) comprises at least one nucleic acid sequence whose presence (i.e., the presence, transcription or translation) gives selective advantage. There are two types of such nucleic acid sequences to be included in a vector: (1) a nucleic acid sequence which provides an optimal selective advantage for viral replication and propagation to a vector including such a sequence over a strain of wild-type virus (i.e., preferably a strain wild type, from which the vector originates and which does not include the sequence), and (2) the nucleic acid sequence, the presence of which gives the optimal selective property of cells infected with a vector comprising a sequence as compared to cells infected or uninfected with a strain of wild-type virus (i.e. preferably a wild-type strain from which the vector originates (and also, for example, a helper expression vector that stimulates replication and / or a function of a vector in an uninfected host cell) that does not include a sequence, using, for example, stimulating cell survival, promoting the production and / or reproduction of vector particles, stimulating Acquiring crHIV-vector virions from cells producing the vector crHIV, induction of apoptosis, facilitating protein production or promoting immunological function or its orientation, so as to achieve the desired prophylactic, therapeutic or biological release. Each of these sequences or the multiplicity of each of these sequences, i.e. a sequence that alone or in combination with other factor (s) stimulates the reproduction of the vector and / or stimulates the specific function of the host cell, so that a favorable prophylactic, therapeutic and / or biological effect occurs, can be included in the vector either in the absence of or in the presence of another sequence, i.e. the vector may include “at least one nucleic acid sequence” and “at least one additional nucleic acid sequence”.

Третий тип последовательности нуклеиновой кислоты представляет собой такой, который придает клетке-хозяину фенотип, который снижает, сводит к минимуму или предотвращает вирусную инфекцию. Такие последовательности нуклеиновой кислоты включают те, которые кодируют генный продукт, который, когда экспрессируется, защищает клетку-хозяин от вирусной инфекции. Например, индивидуумы, гомозиготные по аллелю Δ32 белка CCR5, были защищены от инфицирования HIV-1 из-за отсутствия главного со-рецептора для входа HIV-1 в клетки, экспрессирующие на своей поверхности усеченный белок CCR5. Исследования гетерозиготных индивидуумов показали, что аллель Δ32 имеет трансдоминантный эффект на экспрессию СCR5 дикого типа на клеточной поверхности. Это может быть обусловлено способностью аллеля Δ32 димеризоваться с белком дикого типа и предотвращать его корректную экспрессию на клеточной поверхности.A third type of nucleic acid sequence is one that gives the host cell a phenotype that reduces, minimizes, or prevents viral infection. Such nucleic acid sequences include those that encode a gene product that, when expressed, protects the host cell from viral infection. For example, individuals homozygous for the Δ32 allele of CCR5 protein were protected against HIV-1 infection due to the lack of a major co-receptor for HIV-1 to enter cells expressing truncated CCR5 protein on its surface. Studies of heterozygous individuals have shown that the Δ32 allele has a transdominant effect on the expression of wild-type CRCR5 on the cell surface. This may be due to the ability of the Δ32 allele to dimerize with the wild-type protein and prevent its correct expression on the cell surface.

Аллель Δ32 имеет делецию 32 нуклеотидов, что вызывает мутацию со сдвигом рамки считывания, ведущую к синтезу укороченного белка CCR5. Так как укорочение вызывает появление 31 аминокислот на С-конце аллеля Δ32, которые не присутствуют в белке дикого типа и могут вызвать нежелательный иммунный ответ при присутствии на клеточной поверхности, настоящее изобретение включает экспрессию укороченного мутантного белка CCR5Δ32 (CCR5Δ32T), у которого отсутствует потенциально антигенная последовательность из 31 аминокислоты. Данный белок должен сохранять свою способность создавать трансдоминантный эффект для обеспечения клеткам защиты против инфицирования HIV. Последовательность, кодирующая CCR5Δ32T, легко создается путем введения стоп-кодона непосредственно после последней аминокислоты, общей как для CCR5 дикого типа, так и для CCR5Δ32 (после тирозина в положении 184).The Δ32 allele has a 32 nucleotide deletion that causes a frameshift mutation leading to the synthesis of a truncated CCR5 protein. Since shortening causes the appearance of 31 amino acids at the C-terminus of the Δ32 allele, which are not present in the wild-type protein and can cause an undesirable immune response when present on the cell surface, the present invention includes the expression of a truncated mutant protein CCR5Δ32 (CCR5Δ32T), which lacks potentially antigenic a sequence of 31 amino acids. This protein must retain its ability to create a transdominant effect to provide cells with protection against HIV infection. The sequence encoding CCR5Δ32T is easily created by introducing a stop codon immediately after the last amino acid common to both wild-type CCR5 and CCR5Δ32 (after tyrosine at position 184).

В дополнительном осуществлении другой третий тип последовательности нуклеиновой кислоты представляет собой такой, который дополнительно усиливает приданный фенотип, который снижает, сводит к минимуму или предотвращает вирусную инфекцию. Такая последовательность нуклеиновой кислоты может кодировать генетический противовирусный агент, который, например, направлен на клеточный ген. Например, вектор может экспрессировать указанный выше мутантный белок CCR5Δ32T и дополнительно экспрессировать антисмысловые молекулы или молекулы рибозима с промотора U1 и содержащиеся в U1 snРНК (описано в патенте США 5814500), например, направленные на молекулу CCR5 дикого типа. Антисмысловая область, которая направлена против CCR5 дикого типа, должна быть вырожденной в ограниченной последовательности вектора CCR5Δ32T, таким образом, чтобы создать трансдоминантную мутантную РНК, устойчивую к действию антисмысловой последовательности против CCR5 или рибозимным молекулам, но все еще транслируемой в правильную аминокислотную последовательность для получения функционального белка CCR5Δ32T.In a further embodiment, another third type of nucleic acid sequence is one that further enhances a given phenotype that reduces, minimizes, or prevents viral infection. Such a nucleic acid sequence can encode a genetic antiviral agent that, for example, targets a cell gene. For example, a vector can express the above mutant CCR5Δ32T protein and optionally express antisense or ribozyme molecules from the U1 promoter and snRNAs contained in U1 (described in US Pat. No. 5,814,500), for example, directed to a wild-type CCR5 molecule. The antisense region that is directed against wild-type CCR5 must be degenerate in the limited sequence of the CCR5Δ32T vector, so as to create a transdominant mutant RNA that is resistant to the antisense sequence against CCR5 or ribozyme molecules, but still translates into the correct amino acid sequence to obtain a functional protein CCR5Δ32T.

Представленный выше способ одновременной экспрессии рибозима или антисмысловой последовательности, направленных против генного продукта, и вырождения гена в сайтах-мишенях для удержания рибозима или связывания или расщепления антисмысловой последовательности не ограничен CCR5 или даже молекулой, которая может свести к минимуму репликацию вируса. Другой неограничивающий пример для терапевтического применения заключается в направленности против онкогенного белка, такого как гибридный белок Bcr-Abl, который является этиологическим агентом хронического миелогенного лейкоза. Векторный конструкт, содержащий ген Abl или Bcr или оба, может экспрессировать данные гены одновременно с экспрессией антисмысловой последовательности или рибозима, которые направлены на любой сайт по всей длине транскрипта Bcr-Abl. Следовательно, ненормальный гибридный транскрипт Bcr-Abl должен быть разрушен, в то время как природный Bcr или Abl или оба должны экспрессироваться для уменьшения ненормального дефекта. Таким образом, гены Bcr или Abl должны иметь селективное преимущество для амплификации над генами дикого типа или гибридным геном Bcr-Abl. Предпочтительный вектор должен экспрессировать конструкт Bcr и/или Abl с их природных промоторов, в то время как рибозимы или антисмысловая последовательность против Bcr-Abl должны экспрессироваться с промотора U1 и содержащихся в U1 последовательностей snРНК.The above method of simultaneously expressing a ribozyme or antisense sequence directed against a gene product and degenerating the gene at target sites to retain the ribozyme or binding or cleaving the antisense sequence is not limited to CCR5 or even a molecule that can minimize virus replication. Another non-limiting example for therapeutic use is directed against an oncogenic protein, such as the Bcr-Abl fusion protein, which is the etiological agent of chronic myelogenous leukemia. A vector construct containing the Abl or Bcr gene, or both, can express these genes simultaneously with the expression of an antisense sequence or ribozyme that are directed to any site along the entire length of the Bcr-Abl transcript. Therefore, the abnormal Bcr-Abl hybrid transcript must be destroyed, while the native Bcr or Abl or both must be expressed to reduce the abnormal defect. Thus, Bcr or Abl genes should have a selective advantage for amplification over wild-type genes or a hybrid Bcr-Abl gene. A preferred vector is to express the Bcr and / or Abl construct from their natural promoters, while ribozymes or the antisense sequence against Bcr-Abl should be expressed from the U1 promoter and the snRNA sequences contained in U1.

Представленный выше пример Bcr-Abl не ограничивает изобретение направленностью против онкогенов, и специалисту в данной области техники должно быть очевидно, что данный подход может быть использован для терапевтического или профилактического замещения любого экспрессируемого ненормального гена, нежелательного гена или даже интересующего(их) желательного(ых) гена(ов). Ген-мишень может быть гомологичным или гетерологичным по отношению к модифицированному гену, который устойчив к эффектам генной противовирусной молекулы. Другие заболевания, на которые может быть направлен данный способ, должны быть ясны для специалиста в данной области медицинской и клинической техники. Например, молекулярные мишени для лечения заболеваний крови с помощью раскрытых здесь способов изобретения описаны в "The molecular basis of blood diseases"(Stamatoyannopoulos, Majerus, Perlmutter & Varmus, 3rd Ed., Philadelphia: WB Sauders Co., авторские права 1987, 1994 и 2001, все из которых включены здесь в качестве ссылки).The above example of Bcr-Abl does not limit the invention to anti-oncogenes, and it will be apparent to one skilled in the art that this approach can be used to therapeutic or prophylactic substitution of any expressed abnormal gene, an unwanted gene, or even the desired one (s) of interest ) gene (s). The target gene may be homologous or heterologous to a modified gene that is resistant to the effects of the gene antiviral molecule. Other diseases to which this method may be directed should be clear to a person skilled in the art of medical and clinical technology. For example, molecular targets for treating blood diseases using the methods of the invention disclosed herein are described in "The molecular basis of blood diseases" (Stamatoyannopoulos, Majerus, Perlmutter & Varmus, 3rd Ed., Philadelphia: WB Sauders Co., copyright 1987, 1994 and 2001, all of which are incorporated herein by reference).

Изобретение не должно быть ограничено клиническим применением. Может быть использован подход для определения функции интересующей генной последовательности. Например, интересующая генная последовательность, модифицированная в интересующем домене, может быть одновременно экспрессирована с антисмысловой последовательностью или рибозимом, которые ингибируют или нарушают экспрессию любой немодифицированной генной последовательности, будучи направленными против соответствующей немодифицированной области. Таким образом, интересующая модифицированная генная последовательность должна иметь селективное преимущество для амплифицированной экспрессии над немодифицированной генной последовательностью, позволяя определить функцию модифицированной генной последовательности или кодируемого ею генного продукта с помощью способов тестирования, известных в данной области техники.The invention should not be limited to clinical use. An approach can be used to determine the function of the gene sequence of interest. For example, a gene sequence of interest, modified in the domain of interest, can be simultaneously expressed with an antisense sequence or ribozyme that inhibit or disrupt the expression of any unmodified gene sequence, directed against the corresponding unmodified region. Thus, the modified gene sequence of interest should have a selective advantage for amplified expression over the unmodified gene sequence, allowing the function of the modified gene sequence or the encoded gene product to be determined using testing methods known in the art.

"Нуклеиновая кислота" представляет собой описанное ранее. "Последовательность нуклеиновой кислоты", в частности, включает любой ген или кодирующую последовательность (т.е. ДНК или РНК) потенциально любого размера (т.е., конечно, ограниченного любыми упаковывающими ограничениями, навязанными вектором), наличие которой придает селективное преимущество, как здесь определяется далее. "Ген" представляет собой любую последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую белок, или возникающую молекулу мРНК (не взирая на то, будет ли последовательность транскрибироваться и/или транслироваться). В то время как ген включает кодирующие последовательности, а также некодирующие последовательности (например, регуляторные последовательности), "кодирующая последовательность" не включает никакую некодирующую ДНК."Nucleic acid" is as previously described. A "nucleic acid sequence", in particular, includes any gene or coding sequence (i.e., DNA or RNA) of potentially any size (i.e., of course, limited by any packaging restrictions imposed by the vector), the presence of which gives a selective advantage, as defined hereinafter. A "gene" is any nucleic acid sequence encoding a protein or an emerging mRNA molecule (regardless of whether the sequence is transcribed and / or translated). While a gene includes coding sequences as well as non-coding sequences (eg, regulatory sequences), a “coding sequence” does not include any non-coding DNA.

1. Последовательность нуклеиновой кислоты, наличие которой придает вектору, включающему такую последовательность, в клетке-хозяине селективное преимущество над штаммом вируса дикого типа, или конкурирующая геномная последовательность, которая должна вмешиваться или влиять на амплификацию вектора.1. The nucleic acid sequence, the presence of which gives a vector comprising such a sequence, in the host cell, a selective advantage over the strain of the wild-type virus, or a competing genomic sequence that should interfere or affect the amplification of the vector.

Последовательность нуклеиновой кислоты, которая придает селективное преимущество вектору в клетке-хозяине над штаммом вируса дикого типа, предпочтительно является любой последовательностью, которая позволяет вирусным частицам размножаться из вектора, будучи селективно продуцируемыми или упакованными по сравнению с вирусными частицами, полученными размножением вируса дикого типа. Такие последовательности включают, но не ограничиваются этим, последовательность, которая ведет к увеличению количества векторных геномов, продуцируемых внутриклеточно, по сравнению с геномами дикого типа, и противовирусную последовательность нуклеиновой кислоты. Такие последовательности также включают, но не ограничиваются этим, последовательность, которая ведет к увеличению количества, свойства или состояния векторных геномов, продуцируемых внутриклеточно по сравнению с геномами дикого типа, которые не происходят от родственного вируса дикого типа.A nucleic acid sequence that confers a selective advantage to a vector in a host cell over a wild-type virus strain is preferably any sequence that allows viral particles to multiply from a vector by being selectively produced or packaged compared to virus particles obtained by propagating wild-type virus. Such sequences include, but are not limited to, a sequence that leads to an increase in the number of vector genomes produced intracellularly compared to wild-type genomes, and an antiviral nucleic acid sequence. Such sequences also include, but are not limited to, a sequence that leads to an increase in the number, property or condition of vector genomes produced intracellularly compared to wild-type genomes that are not derived from the related wild-type virus.

Первая категория последовательностей нуклеиновой кислоты, которая придает селективное преимущество в клетке-хозяине вектору, содержащему последовательность, над штаммом вируса дикого типа, представляет собой последовательности, такие как промоторные. "Промотор" представляет собой последовательность, которая направляет связывание РНК-полимеразы и в результате этого стимулирует синтез РНК и которая может включать один или более энхансеров. "Энхансеры" представляют собой цис-действующие элементы, которые стимулируют или ингибируют транскрипцию примыкающих генов. Энхансер, который тормозит транскрипцию, также обозначают как "сайленсер". Сайленсер может также быть "изоляционным" элементом, как это найдено в сайтах гиперчувствительности к ДНКазе эритроидного изоляционного элемента цыплят. Энхансеры отличаются от сайтов ДНК, взаимодействующих с ДНК-связывающими белками, специфически узнающими последовательность ДНК, найденными только в промоторе (которые также называют "промоторными элементами"), тем, что энхансеры могут функционировать в любой ориентации и на расстоянии до нескольких тысяч пар нуклеотидов (т.п.н.) от положения даже ниже транскрибируемой области.The first category of nucleic acid sequences, which confers a selective advantage in the host cell to a vector containing the sequence over a wild-type strain of virus, are sequences such as promoter. A "promoter" is a sequence that directs the binding of RNA polymerase and, as a result, stimulates RNA synthesis and which may include one or more enhancers. "Enhancers" are cis-acting elements that stimulate or inhibit transcription of adjacent genes. An enhancer that inhibits transcription is also referred to as silencer. A silencer can also be an “insulating” element, as found in chickens erythrocytic DNAase hypersensitivity sites. Enhancers differ from DNA sites that interact with DNA-binding proteins that specifically recognize the DNA sequence found only in the promoter (also called “promoter elements”) in that enhancers can function in any orientation and up to several thousand pairs of nucleotides ( kb) from a position even below the transcribed region.

Соответственно и предпочтительно промотор (например, длинный концевой повтор (LTR)) вектора HIV с зависящей от условий репликацией модифицирован так, что вектор становится более чувствительным к определенным цитокинам, чем штамм HIV дикого типа. Например, имеется модифицированный промотор HIV, который проявляет увеличенную транскрипционную активность в присутствии интерлейкина-2. Включение данного промотора в вектор и включение вектора в клетки, инфицированные HIV дикого типа, предпочтительно ведет к увеличенной продукции и упаковке вирионов-потомков векторного генома по сравнению с геномом HIV дикого типа. Сходным образом для стимуляции селективной упаковки вирионов, кодируемых вектором, могут быть применены другие цитокины и/или хемокины (например, включая, но не ограничиваясь этим, интерферон-альфа, фактор некроза опухолей альфа, RANTES и тому подобное). Положение элементов, которые делают HIV-LTR чувствительным к цитокинам, не в коей мере не ограничивают объем изобретения такими осуществлениями. Любая нуклеотидная последовательность может быть включена в HIV-LTR для модификации чувствительности данного промотора. Перечень факторов, которые связываются с сайтами ДНК, которые могут быть вставлены в HIV-LTR, можно найти на сайте http://transfac.gb.de/TRANSFAC/lists/browse.html доступном на 8 сентября 2000 г., который включен здесь в качестве ссылки в полном изложении. Перечень ДНК-связывающих факторов для Homo sapiens (http://transfac.gbf.de/TRANSFAC/lists/factor/species/humanHomosapiens.html) доступен на 8 сентября 2000 г., который сходно включен здесь в качестве ссылки.Accordingly and preferably, the promoter (e.g., long terminal repeat (LTR)) of the conditionally replicated HIV vector is modified so that the vector becomes more sensitive to certain cytokines than the wild-type strain of HIV. For example, there is a modified HIV promoter that exhibits increased transcriptional activity in the presence of interleukin-2. The inclusion of this promoter in the vector and the inclusion of the vector in cells infected with wild-type HIV preferably leads to increased production and packaging of offspring virions of the vector genome compared to the wild-type HIV genome. Similarly, other cytokines and / or chemokines (e.g., including, but not limited to, interferon alpha, tumor necrosis factor alpha, RANTES and the like) can be used to stimulate selective packaging of virions encoded by the vector. The position of the elements that make HIV-LTR sensitive to cytokines, in no way limit the scope of the invention to such implementations. Any nucleotide sequence can be included in HIV-LTR to modify the sensitivity of this promoter. A list of factors that bind to DNA sites that can be inserted into HIV-LTR can be found at http://transfac.gb.de/TRANSFAC/lists/browse.html, available September 8, 2000, which is included here. by reference in its entirety. A list of DNA-binding factors for Homo sapiens (http://transfac.gbf.de/TRANSFAC/lists/factor/species/humanHomosapiens.html) is available as of September 8, 2000, which is similarly incorporated herein by reference.

Сходно сайленсеры или изоляторы могут быть также включены в промоторную или энхансерную области природного или модифицированного ретровирусного LTR, такого как HIV-LTR, так, чтобы четко регулировать экспрессию с данного промотора. В определенных случаях вставка элементов в HIV-LTR может придать вектору селективно невыгодное положение в отношении инфицирования вирусом дикого типа. Однако применение данного типа вектора может не создавать конкуренции с вирусом дикого типа за упаковку вирионов-потомков, но лучше экспрессировать последовательность интересующей нуклеиновой кислоты (или "гена полезной нагрузки"), которая, например, ингибирует репликацию HIV без конкуренции. В данном случае первая последовательность нуклеиновой кислоты не дает вектору селективного преимущества, но должна в минимальном количестве, например, ингибировать рекомбинацию между вектором и хелпером в процессе продукции вектора.Similarly, silencers or isolators may also be included in the promoter or enhancer region of a natural or modified retroviral LTR, such as HIV-LTR, so as to clearly regulate expression from a given promoter. In certain instances, insertion of elements into HIV-LTR may confer a vector selectively disadvantageous to infection with wild-type virus. However, the use of this type of vector may not compete with the wild-type virus for packaging offspring virions, but it is better to express the sequence of the nucleic acid of interest (or the “payload gene”), which, for example, inhibits HIV replication without competition. In this case, the first nucleic acid sequence does not give the vector a selective advantage, but should in a minimal amount, for example, inhibit the recombination between the vector and the helper during the production of the vector.

Вторая категория последовательности нуклеиновой кислоты, которая придает селективное преимущество вектору, содержащему последовательность, над штаммом вируса дикого типа, включает в качестве предпочтительной последовательности нуклеиновой кислоты противовирусную последовательность нуклеиновой кислоты. "Противовирусные агенты" классифицируются по типу своего действия, например ингибиторы обратной транскриптазы, конкуренты с вирусом за вход в клетки, вакцины, ингибиторы протеаз и генетические противовирусные агенты. "Генетические противовирусные агенты" представляют собой молекулы ДНК или РНК, которые переносятся в клетки и влияют на свои внутриклеточные мишени либо прямо (т.е. в том виде, в котором введены внутрь клетки), либо после своего превращения либо в РНК, либо в белок (обобщено Dropulic et al. (1994), выше). Генетическая противовирусная последовательность также является предпочтительной последовательностью нуклеиновой кислоты. Генетические противовирусные агенты включают, но не ограничиваются этим, антисмысловые молекулы, ловушки РНК, трансдоминантные мутанты, токсины, агенты, модифицирующие и модулирующие сплайсинг РНК и белка, EGS (сами или в прямой связи с элементами M1, U1, PRE или CTE), иммуногены, РНКi (смотри Zamore et al. Cell 101:25-33, 2000), нуклеотидные последовательности или молекулы, которые модифицируют или модулируют сплайсинг, конститутивные элементы транспорта (CTE), факторы ядерного импорта и экспорта, факторы интеграции ДНК, элементы, стабилизирующие или дестабилизирующие РНК, посттранскрипционные регуляторные элементы (PRE), белки, которые вмешиваются в репликацию вирусов, интерфероны, токсины, иммуногены (определяемые любым геном, связанным с иммунной системой), антитела (цельные антитела, одноцепочечные антитела или молекулы, представляющие лиганды), рибозимы или любой другой элемент, который любым образом влияет на репликацию вектора или вируса дикого типа, и рибозимы. Желательно, чтобы генетический противовирусный агент представлял собой антисмысловую молекулу, трансдоминантный мутант, иммуноген и рибозим. Соответственно, предпочтительная последовательность нуклеиновой кислоты, которая придает селективное преимущество вектору над штаммом вируса дикого типа, является таковой генетического противовирусного агента, выбранного из группы, состоящей из антисмысловой молекулы, иммуногена и рибозима.A second category of nucleic acid sequence that confers a selective advantage to a vector containing the sequence over a wild-type strain of virus includes, as a preferred nucleic acid sequence, an antiviral nucleic acid sequence. "Antiviral agents" are classified according to their type of action, for example, reverse transcriptase inhibitors, competitors with the virus for entry into cells, vaccines, protease inhibitors and genetic antiviral agents. “Genetic antiviral agents” are DNA or RNA molecules that are carried into cells and affect their intracellular targets either directly (i.e., as introduced into the cell), or after being converted to either RNA or protein (summarized by Dropulic et al. (1994), supra). A genetic antiviral sequence is also a preferred nucleic acid sequence. Genetic antiviral agents include, but are not limited to, antisense molecules, RNA traps, transdominant mutants, toxins, RNA and protein modifying and modulating splicing agents, EGS (alone or in direct association with elements M1, U1, PRE or CTE), immunogens , RNAi (see Zamore et al. Cell 101: 25-33, 2000), nucleotide sequences or molecules that modify or modulate splicing, constitutive transport elements (CTE), nuclear import and export factors, DNA integration factors, stabilizing or destabilizer downstream RNAs, post-transcriptional regulatory elements (PREs), proteins that interfere with viral replication, interferons, toxins, immunogens (defined by any gene associated with the immune system), antibodies (whole antibodies, single chain antibodies or molecules representing ligands), ribozymes, or any other element that in any way affects the replication of a vector or wild-type virus, and ribozymes. Preferably, the genetic antiviral agent is an antisense molecule, a transdominant mutant, an immunogen, and a ribozyme. Accordingly, a preferred nucleic acid sequence that confers a selective advantage to a vector over a wild-type strain of virus is that of a genetic antiviral agent selected from the group consisting of an antisense molecule, an immunogen, and a ribozyme.

Генетические противовирусные агенты, применяемые в настоящем изобретении, ограничиваются только нацеливанием на вирусную последовательность, особенно когда они не помещены в вирусные векторы с зависящей от условий репликацией. В качестве неограничивающего примера генетическая противовирусная последовательность может быть помещена в лентивирусный вектор так, что агент направлен на вирусные или невирусные мишени, например клеточные, бактериальные или паразитарные мишени. В данном случае лентивирусный вектор содержит интересующий ген, оперативно связанный с модифицированным или немодифицированным HIV-LTR (для экспрессии неподвергнутой или подвергнутой сплайсингу РНК), и дополнительно содержит генетический противовирусный агент или последовательность, которая присоединена к промоторной последовательности, которая оперативно не связана с HIV-LTR. Предпочтительная последовательность представляет собой антисмысловую последовательность или рибозимы, которые представляют собой химеры с snРНК, предпочтительно U1, U2, U3, U4, U5 или U6 snРНК.The genetic antiviral agents used in the present invention are limited only by targeting the viral sequence, especially when they are not placed in viral vectors with conditionally replicating. By way of non-limiting example, a genetic antiviral sequence can be inserted into a lentiviral vector such that the agent is directed to viral or non-viral targets, for example, cellular, bacterial or parasitic targets. In this case, the lentiviral vector contains the gene of interest that is operably linked to modified or unmodified HIV-LTR (for expression of unexposed or spliced RNA), and further comprises a genetic antiviral agent or sequence that is linked to a promoter sequence that is not operably linked to HIV- LTR A preferred sequence is an antisense sequence or ribozymes that are snRNA chimeras, preferably U1, U2, U3, U4, U5 or U6 snRNA.

Также генетический противовирусный агент не ограничивается одной или однотипной последовательностью, присутствующей либо в векторной, либо в хелперной последовательности. Два или более агентов могут одновременно присутствовать в векторном или хелперном конструкте, либо локализованных дистально, либо предпочтительно соединенных в виде тандема. Предпочтительно два или более различных генетических противовирусных агентов соединяют в виде тандема. Дополнительное осуществление генетических противовирусных агентов для применения в изобретении представляет собой любое, при котором соединяют два различных типа генетических противовирусных агентов.Also, the genetic antiviral agent is not limited to one or the same type of sequence present either in a vector or in a helper sequence. Two or more agents can simultaneously be present in a vector or helper construct, either localized distally, or preferably connected in tandem. Preferably, two or more different genetic antiviral agents are combined in tandem. A further embodiment of the genetic antiviral agents for use in the invention is any one in which two different types of genetic antiviral agents are combined.

"Антисмысловая молекула" представляет собой молекулу, которая является "зеркальным отражением" на основе правил пар нуклеотидов и наличия "неоднозначности" пар нуклеотидов, короткого участка гена, экспрессию которого надо блокировать. Антисмысловая молекула, направленная против HIV, гибридизуется с РНК HIV дикого типа, создавая возможность ее предпочтительной деградации под действием клеточных нуклеаз. Антисмысловые молекулы предпочтительно являются олигонуклеотидами ДНК, желательно от приблизительно 20 до приблизительно 200 пар нуклеотидов в длину, предпочтительно от приблизительно 20 до приблизительно 50 пар нуклеотидов в длину и оптимально менее 25 пар нуклеотидов в длину. С РНК crHIV может быть экспрессирована антисмысловая молекула, которая предпочтительно связывается с геномной РНК дикого типа, придавая в результате этого РНК crHIV селективное преимущество для упаковки вирионов-потомков.An "antisense molecule" is a molecule that is a "mirror image" based on the rules of nucleotide pairs and the presence of "ambiguity" of nucleotide pairs, a short portion of the gene whose expression must be blocked. The antisense molecule directed against HIV hybridizes with wild-type HIV RNA, creating the possibility of its preferred degradation under the influence of cell nucleases. Antisense molecules are preferably DNA oligonucleotides, preferably from about 20 to about 200 nucleotide pairs in length, preferably from about 20 to about 50 nucleotide pairs in length and optimally less than 25 nucleotide pairs in length. An antisense molecule can be expressed with crHIV RNA, which preferably binds to wild-type genomic RNA, thereby giving the crHIV RNA a selective advantage in packaging offspring virions.

Антисмысловые молекулы, экспрессируемые в векторах в виде РНК, предпочтительно составляют, по меньшей мере, от 20 нуклеотидов до любого размера в длину, но предпочтительно до 2000 нуклеотидов в длину, более предпочтительно от приблизительно 50 до 500 нуклеотидов в длину. Такие антисмысловые молекулы предпочтительно связываются с геномной РНК дикого типа, а не с векторной РНК, придавая вектору селективное преимущество над вирусом дикого типа. Предпочтительной областью для создания антисмысловой молекулы в векторе, происходящем от HIV, например, является область из области оболочки (env), областей белков Tat или Rev, областей вспомогательных генов (Vif, Nef, Vpr, Vpu), областей Gag, которые находятся 3'("правее") по отношению к сайту рестрикции Nsi I на pNL4-3, и областей Pol, которые не содержат область 545 нуклеотидов в Pol, как описано ниже.Antisense molecules expressed in vectors as RNAs are preferably at least 20 nucleotides to any size in length, but preferably up to 2000 nucleotides in length, more preferably from about 50 to 500 nucleotides in length. Such antisense molecules preferably bind to wild-type genomic RNA rather than vector RNA, giving the vector a selective advantage over wild-type virus. The preferred region for creating an antisense molecule in an HIV-derived vector, for example, is a region from the envelope region (env), regions of Tat or Rev proteins, regions of auxiliary genes (Vif, Nef, Vpr, Vpu), Gag regions that are 3 ' (“to the right”) with respect to the Nsi I restriction site on pNL4-3, and Pol regions that do not contain a region of 545 nucleotides in Pol, as described below.

"Иммуноген" относится к любому относящемуся к иммунной системе гену и кодируемому им генному продукту. Хотя исторически термин "иммуноген" применялся в отношении адъюванта, применяемого для вакцинации, термины "иммуно-" и "-ген" применяются здесь для обозначения относящегося к иммунной системе гена и кодируемого им генного продукта. Например, иммуноген может кодировать одноцепочечное антитело (scAb), направленное против структурного белка вируса, или он может кодировать антитело, которое секретируется клеткой во внеклеточную среду. Иммуноген переносится в виде нуклеиновой кислоты и экспрессируется внутриклеточно. Сходно иммуноген также может кодировать любой антиген, белок клеточной поверхности (включая ограниченные определенным классом) или индикаторно-подобное антитело, который облегчает селекцию вектора и/или клетки-хозяина. В предпочтительном векторе последовательность нуклеиновой кислоты включает последовательность, кодирующую scAb, которое связывается с белком Rev HIV дикого типа. Это предпочтительно предотвращает созревание белка Rev в результате его удержания в эндоплазматическом ретикулуме. Конкретно, белки Rev, сами или в сочетании с другими клеточными факторами, экспортируют несплайсированную и раздельно сплайсированную РНК HIV из ядра в цитоплазму с помощью связывания с RRE (высоко структурированной цис-действующей последовательностью РНК-мишени для Rev, обозначаемой Rev-чувствительным элементом) и затем олигомеризуются вокруг РНК HIV. РНК HIV, которые комплексируются с Rev, экспортируются в цитоплазму и обходят клеточный механизм сплайсинга. Таким образом, если Rev дикого типа не связывается с RRE дикого типа, то РНК HIV дикого типа не экспортируются в цитоплазму и не инкапсидируются в вирионы-потомки."Immunogen" refers to any gene related to the immune system and the gene product encoded by it. Although historically the term "immunogen" has been used to refer to the adjuvant used for vaccination, the terms "immuno" and "-gene" are used here to refer to the gene system and the gene product encoded by it. For example, an immunogen can encode a single chain antibody (scAb) directed against a structural protein of the virus, or it can encode an antibody that is secreted by the cell into the extracellular medium. The immunogen is transferred as a nucleic acid and is expressed intracellularly. Similarly, an immunogen can also encode any antigen, cell surface protein (including those limited to a specific class) or an indicator-like antibody that facilitates the selection of a vector and / or host cell. In a preferred vector, the nucleic acid sequence includes a sequence encoding a scAb that binds to wild-type HIV Rev protein. This preferably prevents the maturation of the protein Rev as a result of its retention in the endoplasmic reticulum. Specifically, Rev proteins, alone or in combination with other cellular factors, export unspliced and separately spliced HIV RNA from the nucleus to the cytoplasm by binding to RRE (the highly structured cis-acting sequence of the RNA target for Rev designated by the Rev-sensitive element) and then oligomerized around HIV RNA. HIV RNAs that complex with Rev are exported to the cytoplasm and bypass the cellular splicing mechanism. Thus, if wild-type Rev does not bind to wild-type RREs, then wild-type HIV RNAs are not exported to the cytoplasm and are not encapsulated in descendant virions.

Оптимально, чтобы вектор, содержащий последовательность нуклеиновой кислоты scAb, дополнительно содержал модифицированную последовательность RRE и кодировал мутантный белок Rev, который узнает модифицированный RRE, но не RRE дикого типа. Соответственно, в клетках, содержащих HIV дикого типа и вектор, включающий последовательность нуклеиновой кислоты scAb, вектор предпочтительно упаковывается в вирионы. Сходная стратегия предпочтительно применяется, когда белки матрикса или нуклеокапсида HIV дикого типа (т.е. или любой белок, вовлеченный во взаимодействия белок/РНК, который влияет на инкапсидацию вирусной РНК) являются мишенями scAb.Optimally, the vector containing the scAb nucleic acid sequence further comprises a modified RRE sequence and encodes a mutant Rev protein that recognizes a modified RRE but not a wild-type RRE. Accordingly, in cells containing wild-type HIV and a vector comprising a scAb nucleic acid sequence, the vector is preferably packaged in virions. A similar strategy is preferably applied when wild-type HIV matrix or nucleocapsid proteins (i.e., or any protein involved in protein / RNA interactions that affects viral RNA encapsidation) are targets of scAb.

"Рибозим" представляет собой антисмысловую молекулу с каталитической активностью, т.е. вместо связывания РНК и ингибирования трансляции рибозимы связывают РНК и вызывают сайт-специфическое расщепление связанной молекулы РНК. В целом существуют четыре группы рибозимов: вмешивающаяся последовательность группы I Tetrahymena, EGS (внешняя руководящая последовательность) и рибозимы в форме головки молотка и шпильки для волос. Однако существуют также дополнительные каталитические мотивы в других молекулах РНК, например РНК вируса гепатита дельта и рибосомальных РНК в митохондриях грибов."Ribozyme" is an antisense molecule with catalytic activity, i.e. instead of binding to RNA and inhibiting translation, ribozymes bind RNA and cause site-specific cleavage of the bound RNA molecule. In general, there are four groups of ribozymes: the interfering sequence of group I Tetrahymena, EGS (external guide sequence) and ribozymes in the form of a hammer head and hairpin. However, there are also additional catalytic motifs in other RNA molecules, such as hepatitis delta RNA and ribosomal RNA in fungal mitochondria.

Предпочтительным рибозимом является рибозим, в котором каталитический домен расщепляет 3'-нуклеотидную последовательность NUH, где N может быть любым нуклеотидом (т.е. G, A, U или C) и H может быть либо A, C или U. Однако в виду того, что последовательность, которая расщепляется наиболее эффективно такими рибозимами, представляет собой сайт GUC, предпочтительно, чтобы последовательность NUH включала сайт GUC.A preferred ribozyme is a ribozyme in which the catalytic domain cleaves the 3'-nucleotide sequence of NUH, where N can be any nucleotide (ie G, A, U or C) and H can be either A, C or U. However, in view of of the fact that the sequence that is cleaved most efficiently by such ribozymes is a GUC site, it is preferred that the NUH sequence includes a GUC site.

Желательно, чтобы такой рибозим расщеплял в области штамма вируса дикого типа или его транскриптов, но не расщеплял в области вектора или его транскриптов. Рибозим расщепляет вирус или его транскрипты, в том смысле, что такой вирус или вектор может представлять собой либо РНК, либо ДНК, как описано ранее. Под расщеплением "в области" подразумевается расщепление в области-мишени, т.е. предпочтительно в области вируса, которая необходима для размножения вируса. Желательно, чтобы вектор был модифицирован так, чтобы данная конкретная область, являющаяся мишенью (т.е. если она вообще присутствует в векторе), не расщеплялась рибозимом. Необязательно рибозим может расщеплять вектор, если расщепление не происходит в области, требуемой для размножения вирусных, например crHIV, частиц.It is desirable that such a ribozyme cleaves in the region of the wild-type virus strain or its transcripts, but does not cleave in the region of the vector or its transcripts. Ribozyme cleaves the virus or its transcripts, in the sense that such a virus or vector can be either RNA or DNA, as described previously. By "in the region" cleavage is meant a cleavage in the target region, i.e. preferably in the area of the virus, which is necessary for the reproduction of the virus. It is desirable that the vector be modified so that this particular target region (i.e., if it is present at all in the vector) is not cleaved by the ribozyme. Optionally, the ribozyme can cleave the vector if cleavage does not occur in the region required for the propagation of viral, for example crHIV, particles.

Оптимально, чтобы рибозим кодировался последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO:3 (т.е. CACACAACACTGATGAGGCCGAAAGGCCGAAACGGGCACA) и SEQ ID NO:4 (т.е. ATCTCTAGTCTGATGAGGCCGAAAGGCCGAAACCAGAGTC). В то время как SEQ ID NO:3 включает рибозим, который направляют к сайту +115 (т.е. в терминах количества нуклеотидов ниже старта транскрипции) области U5 HIV дикого типа, SEQ ID NO:4 включает рибозим, который направляют к сайту +133 области U5 HIV дикого типа.Optimally, the ribozyme is encoded by a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 3 (i.e., CACACAACACTGATGAGGCCGAAAGGCCGAAACGGGCACA) and SEQ ID NO: 4 (i.e., ATCTCTAGTCTGATGAGGCCGAAAGGCCGAAACCAGAGTC). While SEQ ID NO: 3 includes a ribozyme that directs to the +115 site (i.e., in terms of the number of nucleotides below the start of transcription) of the wild type HIV U5 region, SEQ ID NO: 4 includes a ribozyme that directs to the + 133 U5 regions of wild-type HIV.

Такой рибозим способен расщеплять геном HIV дикого типа (или его транскрипты), но не векторный геном (или его транскрипты), в виду того, что последовательности вектора U5 модифицированы с помощью сайт-специфического мутагенеза in vitro, как это известно в данной области техники и описано в примере 1. В частности, последовательности вектора предпочтительно модифицируют так, что вектор включает последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO:2 (т.е. GTGTGCCCACCTGTTGTGTGACTCTGGCAGCTAGAGAAC), SEQ ID NO:5 (т.е. GTGTGCCCGCCTGTTGTGTGACTCTGGTAACTAGAGATC), SEQ ID NO:6 (т.е., GTGTGCCCGTCTGTTGTGTGACTCTGGCAAC TAGAGATC), SEQ ID NO:14, в которой, по меньшей мере, один N мутирован, SEQ ID NO:15 и SEQ ID NO:16. В форме РНК вектор предпочтительно включает последовательность, кодируемую последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:14, в которой, по меньшей мере, один N мутирован, SEQ ID NO: 15 и SEQ ID NO: 16. В отличие от этого HIV дикого типа включает последовательность US, кодируемую последовательностью SEQ ID NO:1 (т.е. GTGTGCCCGTCTGTTGTGTGACTCTGGTAACTAGAGATC). Модификации в целом и сравнение с последовательностью U5 дикого типа (в форме ДНК) представлены на Фиг.2.Such a ribozyme is capable of cleaving the wild-type HIV genome (or its transcripts), but not the vector genome (or its transcripts), since the sequences of the U5 vector are modified using site-specific mutagenesis in vitro, as is known in the art and described in Example 1. In particular, the sequences of the vector are preferably modified so that the vector includes a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 2 (ie GTGTGCCCACCTGTTGTGTGACTCTGGCAGCTAGAGAAC), SEQ ID NO: 5 (ie GTGTGCCCGCCTGTTGTGTGACTCTGTA) , SEQ ID NO: 6 (i.e., GTGTGCCCGTCTGTTGTGTGACTCTGGCAAC TAGAGATC), SEQ ID NO: 14, in which at least one N is mutated, SEQ ID NO: 15 and SEQ ID NO: 16. In the form of RNA, the vector preferably includes a sequence encoded by a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 14, in which at least one N is mutated, SEQ ID NO: 15 and SEQ ID NO: 16. In contrast, wild-type HIV includes the US sequence encoded by the sequence SEQ ID NO: 1 (i.e., GTGTGCCCGTCTGTTGTGTGACTCTGGTAACTAGAGATC). Modifications in general and comparison with the wild-type U5 sequence (in the form of DNA) are presented in FIG. 2.

Более того, могут быть применены другие рибозимы, направленные на другие области вирусного генома, и особенно генома HIV, либо по одиночке, либо в сочетании. Например, рибозим может расщеплять другие последовательности РНК, необходимые для репликации вирусов, например в последовательностях обратной транскриптазы, протеазы, или трансактиваторного белка, в последовательности Rev или в других необходимых последовательностях, таких как описанные. Предпочтительно, чтобы вектор включал множество рибозимов, например, направленных на множественные сайты. В таких случаях аналогичные последовательности в векторе модифицируют с помощью сайт-направленного мутагенеза или некоторых других способов, таких как известные в данной области техники, для получения вектора, который устойчив к такому расщеплению рибозимами.Moreover, other ribozymes can be used that target other regions of the viral genome, and especially the HIV genome, either singly or in combination. For example, a ribozyme can cleave other RNA sequences necessary for viral replication, for example, in reverse transcriptase, protease, or transactivation protein sequences, in a Rev sequence, or in other necessary sequences, such as those described. Preferably, the vector includes many ribozymes, for example, directed to multiple sites. In such cases, similar sequences in the vector are modified using site-directed mutagenesis or some other methods, such as those known in the art, to obtain a vector that is resistant to such ribozyme cleavage.

Когда вектор представляет собой вирус иммунодефицита человека, предпочтительно, чтобы вектор был лишен гена tat и его 5' сайта сплайсинга и на его месте содержал тройную кассету анти-Tat рибозимов, где каталитический домен каждого рибозима тройной кассеты рибозимов расщепляет молекулу нуклеиновой кислоты вируса дикого типа иммунодефицита человека по различным сайтам, в частности по различным сайтам внутри tat. Предпочтительно, чтобы каталитический домен каждого рибозима расщеплял нуклеотидную последовательность в области молекулы нуклеиновой кислоты вируса дикого типа иммунодефицита человека, для которой не существует рибозим-чувствительной копии в самом векторе.When the vector is a human immunodeficiency virus, it is preferable that the vector be devoid of the tat gene and its 5 ′ splicing site and in its place contains a triple anti-Tat ribozyme cassette, where the catalytic domain of each ribozyme of the triple ribozyme cassette cleaves the nucleic acid molecule of the wild-type immunodeficiency virus person on various sites, in particular on various sites within tat. Preferably, the catalytic domain of each ribozyme cleaves the nucleotide sequence in the region of the nucleic acid molecule of the human immunodeficiency virus of the wild type for which there is no ribozyme-sensitive copy in the vector itself.

Дополнительное осуществление рибозима в качестве генетического противовирусного агента доступно в рибозимах, которые направлены на последовательности не только со спариванием нуклеотидов по Уотсону-Крику, но и с образованием неоднозначного спаривания нуклеотидов G-U. Предшествующие исследования показали, что неоднозначное спаривание нуклеотидов G-U в двуспиральной РНК имеет сходные черты с образованием пар нуклеотидов по Уотсону-Крику. Принимая во внимание высокую скорость мутаций даже в высококонсервативных областях HIV, приводящую к образованию различных штаммов HIV, возможность создания рибозима, который направлен на многие штаммы, является существенным преимуществом настоящего изобретения. Например, высококонсервативная область-мишень в гене tat, которая может быть использована в качестве последовательности-мишени для рибозимов настоящего изобретения, содержит либо "G", либо "A" в 40 хорошо изученных штаммах HIV-1. Таким образом, рибозим, направленный на данную область, может быть создан как содержащий "U" вместо "C" в подходящей направляющей последовательности для обеспечения образования пар с остатком либо "G", либо "A". Это можно сравнить с применением "С" в направляющей последовательности, которое должно снижать способность рибозима поражать штаммы HIV-1, содержащие в соответствующем положении "А". Данный подход с применением "U" везде, где имеется вариация G, A в положении, узнаваемом рибозимом, существенно увеличивает применимость рибозимов изобретения.The additional implementation of the ribozyme as a genetic antiviral agent is available in ribozymes, which are aimed at sequences not only with Watson-Crick nucleotide pairing, but also with the formation of ambiguous G-U nucleotide pairing. Previous studies have shown that the ambiguous pairing of G-U nucleotides in double-stranded RNA has similar features with the formation of nucleotide pairs according to Watson-Crick. Given the high mutation rate, even in highly conserved regions of HIV, leading to the formation of various strains of HIV, the possibility of creating a ribozyme that targets many strains is a significant advantage of the present invention. For example, a highly conserved target region in the tat gene, which can be used as a target sequence for the ribozymes of the present invention, contains either “G” or “A” in 40 well-studied strains of HIV-1. Thus, a ribozyme directed to a given region can be created as containing “U” instead of “C” in a suitable guide sequence to ensure the formation of pairs with the remainder of either “G” or “A”. This can be compared with the use of "C" in the guide sequence, which should reduce the ability of the ribozyme to infect HIV-1 strains containing the corresponding "A" position. This approach using "U" wherever there is a variation of G, A in a position recognized by the ribozyme significantly increases the applicability of the ribozymes of the invention.

Дополнительное осуществление для применения раскрытого изобретения заключается в использовании кассеты рибозимов (которая содержит более одного рибозима, связанных в тандем), вырожденной так, что она не представляет собой прямо повторенную последовательность в векторе. Присутствие вырожденных последовательностей предотвращает делецию повторов последовательностей, как наблюдается в ретровирусных векторах и других нуклеиновых кислотах. Следовательно, во время множественных циклов репликации может произойти делеция кассеты рибозимов, состоящей из тандемно-организованных прямых повторов последовательностей. Вырожденные последовательности рибозимов могут быть использованы для преодоления данной проблемы, потому что последовательности в каталитическом домене молекулы рибозимов в форме головки молотка, например, могут быть замещены другими нуклеотидами на основе принципа образования неоднозначных пар нуклеотидов без существенной потери активности. Ранее был осуществлен мутагенез рибозимов в форме головки молотка и определены сайты, которые могут быть вырожденными (Ruffner DE, Stormo GD, Uhlenbeck OC. Sequence requirements of the hammerhead RNA self-cleavage reaction. Biochemistry. 1990, Nov 27; 29(47):10695-702). Другой подход к снижению вероятности делеций заключается в направлении индивидуальных рибозимов кассеты к различным сайтам-мишеням РНК-мишени. Таким образом, кассета не будет иметь в наличии прямых повторов последовательностей.An additional implementation for the application of the disclosed invention is to use a ribozyme cassette (which contains more than one ribozyme linked in tandem) degenerated so that it is not a directly repeated sequence in a vector. The presence of degenerate sequences prevents deletion of sequence repeats, as observed in retroviral vectors and other nucleic acids. Therefore, during multiple replication cycles, a deletion of the ribozyme cassette consisting of tandem-organized direct repeats of sequences can occur. Degenerate ribozyme sequences can be used to overcome this problem because sequences in the catalytic domain of a hammerhead-shaped ribozyme molecule, for example, can be replaced by other nucleotides based on the principle of the formation of ambiguous nucleotide pairs without significant loss of activity. Previously, hammerhead-shaped ribozymes were mutagenized and sites that could be degenerate were identified (Ruffner DE, Stormo GD, Uhlenbeck OC. Sequence requirements of the hammerhead RNA self-cleavage reaction. Biochemistry. 1990, Nov 27; 29 (47): 10695-702). Another approach to reducing the likelihood of deletions is to direct the individual ribozymes of the cassette to different target sites of the target RNA. Thus, the cassette will not have available direct repetition of sequences.

"Трансдоминантная" или "доминантная негативная" последовательность нуклеиновой кислоты дает свой кодируемый фенотип даже в присутствии последовательности дикого типа. Одним примером является обсуждение укороченного белка CCR5 (смотри выше). Другие примеры включают любую мутантную ретровирусную или лентивирусную последовательность, которая дает трансдоминантный фенотип. Примеры включают гены rev и gag.A “transdominant” or “dominant negative” nucleic acid sequence gives its encoded phenotype even in the presence of a wild-type sequence. One example is the discussion of the truncated CCR5 protein (see above). Other examples include any mutant retroviral or lentiviral sequence that gives a transdominant phenotype. Examples include the rev and gag genes.

Одним примером применения для обеспечения селективного преимущества, а также ингибирования инфицирующего вируса дикого типа является применение трансдоминантных последовательностей gag, которые, как показано, ингибируют репликацию HIV-1, возможно, путем создания препятствия для сборки капсида. Таким образом, такую последовательность предпочтительно применяют в сочетании с ретровирусным вектором не на основе HIV-1 для обеспечения его репликации и упаковки без торможения трансдоминантной последовательности. Например, ретровирусный вектор, содержащий гены gag HIV-2 и pol, может включать трансдоминантную последовательность gag HIV-1. Такой вектор может быть реплицирован и упакован в результате комплементации подходящим хелперным векторным конструктом HIV-2. Но после развертывания в клетке, подвергнутой инфицированию HIV-1, трансдоминантная последовательность gag способна экспрессироваться при инфицировании HIV-1, блокируя мобилизацию вируса HIV-1. Ретровирусный вектор, кодирующий гены gag и pol HIV-2, является, однако, все еще доступным для инкапсидации и мобилизации вектора.One example of application to provide selective advantage as well as inhibition of wild-type infectious virus is the use of transdominant gag sequences that are shown to inhibit HIV-1 replication, possibly by creating an obstacle to capsid assembly. Thus, such a sequence is preferably used in combination with a non-HIV-1 based retroviral vector to ensure its replication and packaging without inhibition of the transdominant sequence. For example, a retroviral vector containing HIV-2 and pol gag genes may include the transdominant HIV-1 gag sequence. Such a vector can be replicated and packaged as a result of complementation with a suitable HIV-2 helper vector construct. But after being deployed in a cell exposed to HIV-1 infection, the transdominant gag sequence is able to be expressed upon HIV-1 infection, blocking the mobilization of HIV-1 virus. The retroviral vector encoding the gag and pol genes of HIV-2 is, however, still available for encapsidation and mobilization of the vector.

2. Последовательность нуклеиновой кислоты, наличие которой придает селективное преимущество клеткам, инфицированным или неинфицированным вектором, включающим последовательность, по сравнению с клетками, инфицированными штаммом вируса дикого типа.2. The nucleic acid sequence, the presence of which gives a selective advantage to cells infected or uninfected with a vector comprising a sequence compared to cells infected with a strain of wild-type virus.

Последовательность нуклеиновой кислоты, которая придает селективное преимущество клетке, содержащей вектор, включающий последовательность, по сравнению с клеткой, содержащей или не содержащей штамм вируса дикого типа (т.е. у которой отсутствует последовательность), предпочтительно представляет собой любую последовательность, которая позволяет клетке, содержащей вектор, способствовать выживанию и размножению вирусных частиц (т.е. вирусных частиц crHIV) по сравнению с клеткой, содержащей вирус дикого типа, или с клеткой, у которой отсутствует последовательность нуклеиновой кислоты. Такие последовательности включают, но не ограничиваются этим, любую последовательность, которая позволяет клетке или вектору, содержащемуся в клетке, избежать разрушения, последовательности, которые стимулируют выживание клетки, последовательности, которые индуцируют апоптоз, последовательности, которые облегчают продукцию белков, или последовательности, которые стимулируют иммунную функцию или ее направленность.A nucleic acid sequence that confers a selective advantage to a cell containing a vector comprising a sequence compared to a cell containing or not containing a wild-type strain of virus (i.e., which lacks a sequence) is preferably any sequence that allows the cell to containing a vector, contribute to the survival and propagation of viral particles (i.e., crHIV virus particles) compared to a cell containing a wild-type virus, or to a cell that lacks a nucleic acid sequence. Such sequences include, but are not limited to, any sequence that allows the cell or vector contained in the cell to avoid destruction, sequences that stimulate cell survival, sequences that induce apoptosis, sequences that facilitate the production of proteins, or sequences that stimulate immune function or its focus.

Например, предпочтительно, чтобы такая последовательность нуклеиновой кислоты, содержащаяся в векторе, кодировала гены множественной устойчивости к лекарствам (смотри, например, Ueda et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 141, 956-962 (1986); Ueda et al., J. Biol. Chem., 262, 505-508 (1987); и Ueda et al., PNAS, 84, 3004-3008 (1987)). В присутствии добавленного цитотоксического лекарства (например, как применяется при химиотерапии рака) это позволяет клетке, содержащей вектор, выжить, в то время как клетка, которая содержит вирус дикого типа, такой как HIV, не способна выжить. Такие цитотоксические лекарства включают, но не ограничиваются этим, актиномицин D, сульфат винбластина, сульфат винкристина, BCNU (с или без улучшения с помощью BG), дауномицин, адриамицин, VP-16 и AMSA.For example, it is preferred that such a nucleic acid sequence contained in a vector encodes multiple drug resistance genes (see, for example, Ueda et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 141, 956-962 (1986); Ueda et al ., J. Biol. Chem., 262, 505-508 (1987); and Ueda et al., PNAS, 84, 3004-3008 (1987)). In the presence of an added cytotoxic drug (for example, as used in cancer chemotherapy), this allows the cell containing the vector to survive, while the cell that contains the wild-type virus, such as HIV, is unable to survive. Such cytotoxic drugs include, but are not limited to, actinomycin D, vinblastine sulfate, vincristine sulfate, BCNU (with or without improvement with BG), daunomycin, adriamycin, VP-16, and AMSA.

Другим примером такой последовательности нуклеиновой кислоты является любой вариант последовательности O⁶-метилгуанин-ДНК-метилтрансферазы (MGMT). MGMT может использоваться для защиты гематопоэтических предшественников от токсичности алкилирующих агентов. MGMT дикого типа ингибируется O⁶-бензилгуанином (BG), который усиливает токсичность алкилирующего агента. Варианты MGMT, которые устойчивы к опосредуемой BG инактивации и способны защищать против алкилирующих агентов, могут быть предоставлены любому типу клеток с помощью настоящего изобретения. Примером такого варианта является G156A MGMT.Another example of such a nucleic acid sequence is any variant of the O ⁶ methylguanine DNA methyl transferase (MGMT) sequence. MGMT can be used to protect hematopoietic precursors from the toxicity of alkylating agents. Wild-type MGMT is inhibited by O ⁶ -benzylguanine (BG), which enhances the toxicity of the alkylating agent. MGMT variants that are resistant to BG mediated inactivation and are capable of protecting against alkylating agents can be provided to any type of cell using the present invention. An example of such an option is the G156A MGMT.

Например, гематопоэтические клетки-предшественники, трансдуцированные таким вариантом настоящего изобретения, могут быть отобраны при введении BG и агента, метилирующего или хлорэтилирующего O⁶-гуанин. Примеры таких метилирующих агентов для применения в изобретении включают, но не ограничиваются этим, клинически пригодные темозоломид, нитрозомочевину, тетразины, триазины, дакабазин, темозоломид, стрептозотоцин, прокарбазин. Примеры хлорэтилирующих агентов включают, но не ограничиваются этим, BCNU (1,3-бис(2-хлорэтил)-1-нитрозомочевину), CCNU (3-циклогексил-1-хлорэтил-нитрозомочевину), ACNU (1-(4-амино-2-метил-5-пиримидинил)метил-3-(2-хлор)-3-нитрозомочевину) и MeCCNU (1-(2-хлорэтил)-3-(4-метилциклогексил)-1-нитрозомочевину. Предпочтительным алкилирующим агентом является BCNU.For example, hematopoietic progenitor cells transduced with such an embodiment of the present invention can be selected by administration of BG and an agent that methylates or chloethylates O ⁶ -guanine. Examples of such methylating agents for use in the invention include, but are not limited to, clinically suitable temozolomide, nitrosourea, tetrazines, triazines, dacabazine, temozolomide, streptozotocin, procarbazine. Examples of chloroethylating agents include, but are not limited to, BCNU (1,3-bis (2-chloroethyl) -1-nitrosourea), CCNU (3-cyclohexyl-1-chloroethyl-nitrosourea), ACNU (1- (4-amino 2-methyl-5-pyrimidinyl) methyl-3- (2-chloro) -3-nitrosourea) and MeCCNU (1- (2-chloroethyl) -3- (4-methylcyclohexyl) -1-nitrosourea. A preferred alkylating agent is BCNU .

BCNU, как показано, формирует постоянное повреждение путем ковалентной межцепочечной сшивки ДНК в клетках, как в стадии покоя, так и в цикле пролиферации. Данные повреждения являются цитотоксическими для клеток в процессе репликации ДНК. MGMT является первичным механизмом репарации ДНК после повреждений под действием BCNU. В результате передачи его токсичности клеткам в стадии покоя отбор вариантов MGMT, доставляемых лентивирусными векторами изобретения, может также позволить отбирать тотипотентные гемопоэтические стволовые клетки (HSCs), которые находятся преимущественно в стадии G₀ клеточного цикла, но которые циклируют периодически для получения большего количества стволовых клеток и клеток-предшественников крови. Стволовые клетки обычно устойчивы к ретровирусной трансдукции, но могут быть трансдуцированы ретровирусными векторами, если они находятся не только в стадии G₀ цикла. Подобно онкоретровирусам, лентивирусные векторы изобретения могут быть использованы для трансдукции гематопоэтических стволовых клеток, включая пригодные для тестирования гемопоэтические ELTC-IC и NOD-SCID или SCID-hu клетки с воспроизводимой популяцией. Однако в отличие от онкоретровирусов состав цитокинов, требуемый для трансдукции стволовых клеток без их дифференцировки, более сходен с лентивирусными векторами, так как лентивирусы (например, HIV) могут инфицировать клетки, которые активно не делятся в момент инфицирования. Селекция HSC невозможна с помощью других стратегий, которые заключаются в отборе циклирующих гематопоэтических предшественников. Таким образом, селекция, опосредуемая вариантами MGMT и лентивирусными векторами изобретения, может увеличить присутствие трансдуцированных тотипотентных HSCs в отсутствие необходимости длительного введения лекарства для селекции.BCNU, as shown, forms permanent damage by covalent interchain DNA cross-linking in cells, both at rest and in the proliferation cycle. These lesions are cytotoxic to cells during DNA replication. MGMT is the primary mechanism for DNA repair after damage by BCNU. As a result of the transfer of its toxicity to dormant cells, the selection of MGMT variants delivered by the lentiviral vectors of the invention may also allow the selection of totipotent hematopoietic stem cells (HSCs), which are predominantly in the G ₀ stage of the cell cycle, but which cycle periodically to obtain more stem cells and blood precursor cells. Stem cells are usually resistant to retroviral transduction, but can be transduced with retroviral vectors if they are not only in the G ₀ cycle stage. Like oncoretroviruses, the lentiviral vectors of the invention can be used for transduction of hematopoietic stem cells, including testable hematopoietic ELTC-IC and NOD-SCID or SCID-hu cells with a reproducible population. However, unlike oncoretroviruses, the cytokine composition required for stem cell transduction without differentiation is more similar to lentiviral vectors, since lentiviruses (e.g. HIV) can infect cells that do not actively divide at the time of infection. HSC selection is not possible with other strategies, which are the selection of cycling hematopoietic precursors. Thus, selection mediated by MGMT variants and lentiviral vectors of the invention can increase the presence of transduced totipotent HSCs in the absence of the need for long-term administration of a selection drug.

Представленное выше обсуждение может быть обобщено в контексте гематопоэтических клеток in vitro и ex vivo, а также in vivo. Таким образом, в дополнение к трансдукции вариантами MGMT клеток in vivo гематопоэтические клетки субъекта могут быть трансдуцированы ex vivo с последующим лекарственным лечением либо ex vivo, либо in vivo. Такие клетки, обработанные ex vivo, могут быть затем инфузированы субъекту, необязательно в качестве частичной замены популяции клеток костного мозга трансдуцированными клетками.The discussion above can be generalized in the context of hematopoietic cells in vitro and ex vivo, as well as in vivo. Thus, in addition to transduction with in vivo variants of MGMT cells, hematopoietic cells of a subject can be transduced ex vivo followed by drug treatment either ex vivo or in vivo. Such ex vivo treated cells can then be infused with a subject, optionally as a partial replacement for a population of bone marrow cells with transduced cells.

Перед осуществлением описанного выше может быть также использован алкилирующий агент BCNU для снижения в целом инфицированных HIV клеток CD4+ у HIV-позитивных субъектов. Как установлено выше, BCNU (после истощения эндогенной MGMT) дает цитотоксические повреждения как в клетках в стадии покоя, так и в пролиферирующих клетках. Такие повреждения образуются даже без принудительного истощения MGMT, если доза лекарства превышает уровень функционального белка AGT. Повторное системное введение BCNU вызывает кумулятивную миелосупрессию и панцитопению. Среди лимфоидных клеток клетки CD4+, очевидно, являются особенно чувствительными к BCNU. Таким образом, у субъектов, инфицированных ретровирусом, таких как субъекты, инфицированные HIV, введение BCNU, включая введение в малых дозах, для избежания миелосупрессии, если это желательно, будет снижать суммарную популяцию клеток CD4+ и таким образом снижать нагрузку вирусом. За данным подходом может следовать инфузия гематопоэтических клеток-предшественников, как обсуждалось выше.Prior to the implementation of the above, BCNU alkylating agent can also be used to reduce generally HIV-infected CD4 + cells in HIV-positive subjects. As stated above, BCNU (after depletion of endogenous MGMT) produces cytotoxic damage in both resting cells and proliferating cells. Such damage occurs even without the forced depletion of MGMT if the dose of the drug exceeds the level of functional protein AGT. Repeated systemic administration of BCNU causes cumulative myelosuppression and pancytopenia. Among lymphoid cells, CD4 + cells are obviously particularly sensitive to BCNU. Thus, in subjects infected with a retrovirus, such as subjects infected with HIV, the administration of BCNU, including administration in small doses, to avoid myelosuppression, if desired, will reduce the total population of CD4 + cells and thus reduce the load of the virus. This approach may be followed by infusion of hematopoietic progenitor cells, as discussed above.

Так как BCNU может действовать "скрытым" способом путем образования цитотоксических повреждений даже в клетках в стадии покоя, данный подход имеет дополнительное преимущество в снижении потребности повторных обработок. Конечно, данный подход можно сочетать с применением BG для потенцирования эффектов BCNU. В противоположном варианте подход может быть применен в сочетании с введением вариантов MGMT с векторами изобретения для обеспечения защиты трансдуцированных клеток CD4+. Данное последнее средство может быть либо независимым, либо применяться в сочетании с обработкой гематопоэтических клеток, как обсуждалось выше. Следовательно, предпочтительное осуществление изобретения заключается в экспрессии мутантной MGMT (второй последовательности нуклеиновой кислоты) в векторе, который содержит анти-HIV антисмысловую последовательность или рибозим (первую последовательность нуклеиновой кислоты), так, чтобы вектор обеспечивал селективное преимущество над клетками, инфицированными HIV дикого типа, и селективное преимущество над вирусом HIV дикого типа, соответственно. Дополнительное предпочтительное осуществление изобретения заключается в том, что вектор экспрессирует ген MGMT (или вторую последовательность нуклеиновой кислоты) вне промотора HIV-LTR в виде сплайсированной мРНК.Since BCNU can act in a “covert” way by generating cytotoxic damage even in dormant cells, this approach has the added benefit of reducing the need for re-treatments. Of course, this approach can be combined with the use of BG to potentiate the effects of BCNU. Alternatively, the approach may be used in conjunction with the introduction of MGMT variants with the vectors of the invention to protect transduced CD4 + cells. This latter agent can be either independent, or used in combination with the treatment of hematopoietic cells, as discussed above. Therefore, a preferred embodiment of the invention is the expression of a mutant MGMT (second nucleic acid sequence) in a vector that contains an anti-HIV antisense sequence or ribozyme (first nucleic acid sequence), so that the vector provides a selective advantage over wild-type HIV infected cells, and a selective advantage over wild-type HIV virus, respectively. A further preferred embodiment of the invention is that the vector expresses the MGMT gene (or the second nucleic acid sequence) outside the HIV-LTR promoter as spliced mRNA.

Наконец, хотя векторы экспрессируют анти-HIV рибозимы или антисмысловые последовательности, изобретение этим не ограничивается, так как специалист в данной области техники может легко вставить любую ингибиторную нуклеотидную последовательность в вектор для конкретного терапевтического, профилактического или биологического эффекта. Предпочтительный способ экспрессии ингибиторной последовательности заключается во включении ее в U1 snРНК/промоторную кассету, как описано Dietz (патент США 5814500).Finally, although vectors express anti-HIV ribozymes or antisense sequences, the invention is not limited to this, as one skilled in the art can easily insert any inhibitory nucleotide sequence into a vector for a specific therapeutic, prophylactic or biological effect. A preferred method for expressing an inhibitory sequence is to incorporate it into a U1 snRNA / promoter cassette, as described by Dietz (US Pat. No. 5,851,400).

В противоположном варианте такая последовательность нуклеиновой кислоты желательно включает последовательность, выбранную из группы, состоящей из последовательности (или последовательности, которая кодирует) мутантной (т.е. мутанта) протеазы и последовательности (или последовательности, которая кодирует) мутантной (т.е. мутанта) обратной транскриптазы. Предпочтительно, чтобы мутантную обратную транскриптазу конструировали так, чтобы она была устойчива к нуклеозидным и ненуклеозидным ингибиторам обратной транскриптазы, а мутантную протеазу конструировали так, чтобы она была устойчива к обычно применяемым ингибиторам протеаз.Alternatively, such a nucleic acid sequence desirably comprises a sequence selected from the group consisting of a sequence (or sequence that encodes) a mutant (i.e. mutant) protease and a sequence (or sequence that encodes) a mutant (i.e. mutant ) reverse transcriptase. Preferably, the mutant reverse transcriptase is designed to be resistant to nucleoside and non-nucleoside reverse transcriptase inhibitors, and the mutant protease is designed to be resistant to commonly used protease inhibitors.

Введение данных ингибиторов протеазы или обратной транскриптазы хозяину в сочетании с вектором применяется для отбора на клетки, продуцирующие вектор в противоположность клеткам, продуцирующим вирус дикого типа. Сходно данный подход модифицируется для применения с любым лекарством, которое ингибирует репликацию вируса так, что вирус может быть подвергнут мутации для избежания ингибирования. Соответственно, для лечения HIV селективная последовательность нуклеиновой кислоты, включенная в вектор, предпочтительно включает мутантные последовательности HIV. Оптимально, однако, чтобы данные последовательности не предотвращали суперинфицирование HIV дикого типа.The administration of these protease or reverse transcriptase inhibitors to the host in combination with the vector is used to select for cells producing the vector as opposed to cells producing the wild-type virus. Similarly, this approach is modified for use with any drug that inhibits virus replication so that the virus can be mutated to avoid inhibition. Accordingly, for the treatment of HIV, the selective nucleic acid sequence included in the vector preferably includes mutated HIV sequences. It is optimal, however, that these sequences do not prevent the superinfection of wild-type HIV.

Предпочтительно, чтобы вектор представлял собой один из указанных выше и, в частности, усовершенствованные векторы с зависящей от условий репликацией, изображенные на фиг.1А-1К. Конечно, при применении в способах изобретения последовательности, кодирующие GFP, могут быть удалены или замещены другими последовательностями. Последовательности, кодирующие GFP, присутствуют в данных примерах осуществлений векторов в качестве маркера или индикатора присутствия вектора или экспрессии гена из вектора.Preferably, the vector is one of the above and, in particular, improved conditionally replicating vectors depicted in FIGS. 1A-1K. Of course, when used in the methods of the invention, sequences encoding GFPs may be deleted or replaced with other sequences. GFP coding sequences are present in these exemplary embodiments of the vectors as a marker or indicator of the presence of a vector or expression of a gene from a vector.

Предпочтительные векторы изобретения могут содержать различные элементы, описанные в настоящем раскрытии. В частности, в лентивирусных векторах может отсутствовать ген tat и содержаться, по меньшей мере, одна антисмысловая последовательность. Дополнительно векторы могут содержать последовательность, такую как центральный полипиримидиновый тракт HIV или содержащий его более крупный фрагмент нуклеиновой кислоты.Preferred vectors of the invention may contain various elements described in the present disclosure. In particular, lentiviral vectors may lack the tat gene and contain at least one antisense sequence. Additionally, the vectors may contain a sequence, such as a central HIV polypyrimidine tract or a larger nucleic acid fragment containing it.

Оптимально, чтобы вектор был совместим с клеткой, в которую его вводят, например, был способен осуществлять экспрессию в клетке последовательностей нуклеиновой кислоты, кодируемых вектором. Желательно, чтобы вектор включал ориджин репликации, функционирующий в клетке. Когда последовательность нуклеиновой кислоты переносится в форме своей кодирующей последовательности ДНК (например, в отличие от формы полного гена, включающего свой собственный промотор), оптимально, чтобы вектор также содержал промотор, который способен индуцировать экспрессию кодирующей последовательности и который оперативно связан с кодирующей последовательностью. Кодирующая последовательность является "оперативно связанной" с промотором (например, когда как кодирующая последовательность, так и промотор совместно составляют природный или рекомбинантный ген), когда промотор способен направлять транскрипцию кодирующей последовательности.Optimally, the vector is compatible with the cell into which it is introduced, for example, is capable of expressing nucleic acid sequences encoded by the vector in the cell. Preferably, the vector includes an origin of replication that functions in the cell. When a nucleic acid sequence is transferred in the form of its coding DNA sequence (for example, in contrast to the form of a complete gene including its own promoter), it is optimal that the vector also contains a promoter that is capable of inducing expression of the coding sequence and which is operably linked to the coding sequence. The coding sequence is “operably linked” to the promoter (for example, when both the coding sequence and the promoter together comprise a natural or recombinant gene) when the promoter is capable of directing transcription of the coding sequence.

В рекомбинантном векторе настоящего изобретения предпочтительно все присущие сигналы транскрипции (например, сигналы инициации и терминации), трансляции (например, вход рибосом или сайт связывания или тому подобное), сигналы процессинга (например, донорские и акцепторные сайты сплайсинга, если это необходимо, и сигналы полиаденилирования), транслокации, сборки, сайтов интеграции, входа рибонуклеиновых комплексов, стабильности и элементов транслокации в цис- или транс-положениях организованы в векторе корректно, так что любой ген или кодирующая последовательность транскрибируется присущим ей образом (и/или транслируется, если это желательно) в клетках, в которые введен вектор. Манипуляции с такими сигналами для уверенности в их соответствующей экспрессии в клетках-хозяевах хорошо известны и находятся в компетенции специалистов в данной области техники.In the recombinant vector of the present invention, preferably all inherent transcription signals (e.g., initiation and termination signals), translation (e.g., ribosome entry or binding site or the like), processing signals (e.g., donor and acceptor splicing sites, if necessary, and signals polyadenylation), translocation, assembly, integration sites, entry of ribonuclein complexes, stability and translocation elements in cis or trans positions are organized in the vector correctly, so any gene or code The nascent sequence is transcribed in its own way (and / or translated, if desired) in the cells into which the vector is introduced. Manipulations with such signals to ensure their appropriate expression in host cells are well known and are within the competence of specialists in this field of technology.

Предпочтительно, чтобы вектор содержал последовательность Pol, которая увеличивает эффективность стабильной трансдукции, определяемой как интегрированные копии вектора в геноме клетки-хозяина. Последовательность, ранее идентифицированная Zennou et al. (Cell 101:173-185 (2000)) как центральное крыло ДНК (фрагмент из 178 пар нуклеотидов в положениях от 4793 до 4971 в pLAI3, соответствующий положениям от 4757 до 4935 в pNL4-3), как указывалось, увеличивает эффективность трансдукции, но было найдено, что она неэффективна в отношении значительного увеличения эффективности стабильной трансдукции. Настоящее изобретение включает раскрытие того, что в то время как данный небольшой фрагмент не достаточен для увеличения эффективности стабильной трансдукции, более крупный фрагмент из 545 пар нуклеотидов (положения от 4551 до 5096 в pNL4-3) или содержащие его еще более крупные фрагменты, как описано в патенте США 5885806, способны увеличивать стабильную трансдукцию, являясь частью настоящего изобретения. Увеличение эффективности стабильной трансдукции было определено с помощью экспрессии GFP и анализа FACS, а также Taqman-анализа интегрированных копий векторного генома.Preferably, the vector contains a Pol sequence that increases the efficiency of stable transduction, defined as integrated copies of the vector in the genome of the host cell. The sequence previously identified by Zennou et al. (Cell 101: 173-185 (2000)) as the central wing of DNA (a fragment of 178 nucleotides at positions from 4793 to 4971 in pLAI3, corresponding to positions from 4757 to 4935 in pNL4-3), as indicated, increases the efficiency of transduction, but it was found to be ineffective with respect to a significant increase in the efficiency of stable transduction. The present invention includes the disclosure that while this small fragment is not sufficient to increase the stability of stable transduction, a larger fragment of 545 nucleotides (positions 4551 to 5096 in pNL4-3) or even larger fragments containing it, as described in US patent 5885806, are able to increase stable transduction, as part of the present invention. The increase in the efficiency of stable transduction was determined using GFP expression and FACS analysis, as well as Taqman analysis of integrated copies of the vector genome.

Дополнительные средства для увеличения эффективности трансдукции описаны в параллельно поданной патентной заявке США с серийным номером (еще будет присвоен), зарегистрированной 31 августа 2000 г., под номером выданного патентным поверенным документа № 397272000400, которая включена здесь в качестве ссылки в полном изложении.Additional means for increasing transduction efficiency are described in a parallel US patent application with a serial number (still to be assigned), registered August 31, 2000, under Patent Attorney Document No. 397272000400, which is incorporated herein by reference in its entirety.

Вирусные векторы, применяемые в настоящем изобретении, могут также приводить к образованию "псевдотипа", когда совместное инфицирование клетки различными вирусами дает вирионы-потомки, содержащие геном одного вируса и имеющие внешний слой капсида, содержащий один или более белков оболочки от другого вируса. Данный феномен был применен для упаковки интересующих вирусных векторов в "псевдотипные" вирионы с помощью совместной трансфекции или совместного инфицирования упаковывающей клетки, как интересующим вирусным вектором, так и генетическим материалом, кодирующим, по меньшей мере, один белок оболочки другого вируса или молекулу клеточной поверхности. Смотри патент США 5512421. Такие смешанные вирусы могут быть нейтрализованы с помощью антисывороток против одного или более используемых гетерологичных белков оболочки. Одним вирусом, обычно применяемым при образовании псевдотипа, является вирус везикулярного стоматита (VSV), который представляет собой рабдовирус. Применение псевдотипирования расширяет диапазон клеток-хозяев для вируса путем включения элементов механизма вирусного входа от применяемого гетерологичного вируса. Псевдотипирование вирусных векторов и VSV для применения в настоящем изобретении дает вирусные частицы, содержащие нуклеиновую кислоту вирусного вектора, инкапсулированную в нуклеокапсид, который окружен мембраной, содержащей белок G VSV. Нуклеокапсид предпочтительно содержит белки, обычно ассоциированные с вирусным вектором. Окружающая мембрана, содержащая белок G VSV, образует часть вирусной частицы при выходе ее из клетки, применяемую для упаковки вирусного вектора. Примеры упаковывающих клеток описываются в патенте США 5739018. В предпочтительном осуществлении изобретения вирусная частица происходит от HIV и псевдотипирована с белком G VSV. Псевдотипированные вирусные частицы, содержащие белок G VSV, могут инфицировать разнообразный набор клеточных типов с большей эффективностью, чем амфотропные вирусные векторы. Диапазон клеток-хозяев включает виды как млекопитающих, так и немлекопитающих, такие как человек, грызуны, рыбы, амфибии и насекомые.The viral vectors used in the present invention can also lead to the formation of a “pseudotype” when co-infection of a cell with different viruses produces offspring virions containing the genome of one virus and having an outer capsid layer containing one or more shell proteins from another virus. This phenomenon has been used to package viral vectors of interest into "pseudotypic" virions by co-transfection or co-infection of a packaging cell with both the viral vector of interest and the genetic material encoding at least one envelope protein of another virus or cell surface molecule. See US Pat. No. 5,512,421. Such mixed viruses can be neutralized with antisera against one or more used heterologous envelope proteins. One virus commonly used in pseudo-type formation is vesicular stomatitis virus (VSV), which is a rhabdovirus. The use of pseudotyping extends the range of host cells for the virus by incorporating elements of the viral entry mechanism from the heterologous virus used. Pseudotyping of viral vectors and VSV for use in the present invention provides viral particles containing the nucleic acid of a viral vector encapsulated in a nucleocapsid that is surrounded by a membrane containing VSV G protein. The nucleocapsid preferably contains proteins typically associated with a viral vector. The surrounding membrane containing protein G VSV forms part of the viral particle when it leaves the cell, used to package the viral vector. Examples of packaging cells are described in US Pat. No. 5,739,018. In a preferred embodiment of the invention, the viral particle is derived from HIV and is pseudotyped with VSV protein G. Pseudotyped viral particles containing VSV G protein can infect a diverse set of cell types with greater efficiency than amphotropic viral vectors. The range of host cells includes species of both mammals and non-mammals, such as humans, rodents, fish, amphibians and insects.

Предпочтительно, чтобы вектор также включал некое средство, с помощью которого вектор или содержащую его субклонированную последовательность идентифицировали и отбирали. Идентификация и/или отбор вектора осуществляется с применением множества подходов известных специалистам в данной области техники. Например, векторы, содержащие конкретные гены или кодирующие последовательности, предпочтительно идентифицируют с помощью гибридизации, в присутствии или в отсутствие так называемых "маркеров" функций генов, кодируемых маркерными генами, присутствующими в векторах, и/или при экспрессии конкретных последовательностей. При первом подходе присутствие конкретной последовательности в векторе определяется с помощью гибридизации (например, с помощью гибридизации ДНК-ДНК) с применением зондов, включающих последовательности, которые являются гомологичными соответствующей последовательности. При втором подходе рекомбинантную систему вектор/хозяин идентифицируют и отбирают на основе присутствия или отсутствия определенных функций маркерных генов, таких как устойчивость к антибиотикам, активность тимидинкиназы и тому подобное, обусловленных определенными генами, кодирующими данные функции, присутствующими в векторе. При третьем подходе векторы идентифицируют с помощью тестирования конкретного продукта гена, кодируемого вектором. Такие тесты основаны на физических, иммунологических или функциональных свойствах продукта гена.Preferably, the vector also includes some means by which the vector or its subcloned sequence is identified and selected. Identification and / or selection of the vector is carried out using a variety of approaches known to specialists in this field of technology. For example, vectors containing specific genes or coding sequences are preferably identified by hybridization, in the presence or absence of so-called “markers”, of the functions of genes encoded by marker genes present in the vectors and / or in the expression of specific sequences. In the first approach, the presence of a particular sequence in a vector is determined by hybridization (for example, by DNA-DNA hybridization) using probes that include sequences that are homologous to the corresponding sequence. In the second approach, the recombinant vector / host system is identified and selected based on the presence or absence of certain functions of marker genes, such as antibiotic resistance, thymidine kinase activity and the like, due to certain genes encoding these functions present in the vector. In a third approach, vectors are identified by testing a particular gene product encoded by the vector. Such tests are based on the physical, immunological, or functional properties of a gene product.

Соответственно, в настоящем изобретении также предлагается вектор, который, если это ДНК, включает нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NOS: 2, 4, 5, 6, 15 и 16, и который, если это РНК, включает нуклеотидную последовательность, кодируемую нуклеотидной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NOS: 4, 5, 6.Accordingly, the present invention also provides a vector which, if it is DNA, comprises a nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOS: 2, 4, 5, 6, 15 and 16, and which, if it is RNA, includes a nucleotide a sequence encoded by a nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOS: 4, 5, 6.

В настоящем изобретении дополнительно предлагается способ конструирования вектора, который происходит от вируса дикого типа иммунодефицита человека и который способен реплицироваться только в клетке-хозяине, которая является пермиссивной для репликации указанного вектора, с рибозимом. Рибозим, который включают в вектор или который кодируется вектором, расщепляет нуклеиновую кислоту вируса дикого типа иммунодефицита человека, но не самого вектора и его транскриптов, если они есть. Способ включает получение вектора, который происходит от вируса дикого типа иммунодефицита человека и который способен реплицироваться только в клетке-хозяине, которая является пермиссивной для репликации указанного вектора, и включение в вектор последовательности нуклеиновой кислоты, которая включает или кодирует рибозим, каталитический домен которого расщепляет нуклеиновую кислоту вируса дикого типа иммунодефицита человека, но не самого вектора и его транскриптов, если они есть. В таком способе нуклеотидная последовательность, включающая или кодирующая последовательность U5 вируса дикого типа иммунодефицита человека, может быть удалена из вектора и замещена нуклеотидной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NOS: 2, 5, 6, 14, в которой, по меньшей мере, один N мутирован, 15 и 16, если вектор представляет собой ДНК, и нуклеотидной последовательностью, кодируемой нуклеотидной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NOS: 2, 5, 6, 14, в которой, по меньшей мере, один N мутирован, 15 и 16, если вектор представляет собой РНК. Предпочтительно, чтобы вектор реплицировался в клетке-хозяине, пермиссивной для репликации указанного вектора, более одного раза.The present invention further provides a method for constructing a vector that is derived from the wild-type human immunodeficiency virus and which is able to replicate only in a host cell that is permissive for replication of the specified vector with a ribozyme. Ribozyme, which is included in the vector or which is encoded by the vector, cleaves the nucleic acid of the wild-type human immunodeficiency virus, but not the vector itself and its transcripts, if any. The method includes obtaining a vector that originates from the wild-type human immunodeficiency virus and which is able to replicate only in the host cell, which is permissive for replication of the specified vector, and the inclusion in the vector of a nucleic acid sequence that includes or encodes a ribozyme whose catalytic domain cleaves the nucleic the acid of wild-type human immunodeficiency virus, but not the vector itself and its transcripts, if any. In such a method, a nucleotide sequence comprising or encoding a U5 sequence of a wild type human immunodeficiency virus can be removed from the vector and replaced by a nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOS: 2, 5, 6, 14, in which at least at least one N is mutated, 15 and 16, if the vector is DNA, and a nucleotide sequence encoded by a nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOS: 2, 5, 6, 14, in which at least one N is mutated, 15 and 16 if the vector Representing RNA. Preferably, the vector is replicated in the host cell permissive for replication of the specified vector, more than once.

В настоящем изобретении также предлагается способ модификации вектора. Способ включает получение вектора и введение в вектор нуклеотидной последовательности, выбранной из группы, состоящей из последовательностей ДНК SEQ ID NOS: 2, 3, 4, 5, 6, 14, в которой, по меньшей мере, один N мутирован, 15 и 16, если вектор представляет собой ДНК, и нуклеотидной последовательности, кодируемой нуклеотидной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NOS: 2, 4, 5, 6, 15 и 16, если вектор представляет собой РНК.The present invention also provides a method for modifying a vector. The method includes obtaining a vector and introducing into the vector a nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOS DNA sequences: 2, 3, 4, 5, 6, 14, in which at least one N is mutated, 15 and 16, if the vector is DNA, and a nucleotide sequence encoded by a nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOS: 2, 4, 5, 6, 15 and 16, if the vector is RNA.

В настоящем изобретении дополнительно предлагается способ размножения и селективной упаковки вектора с зависящей от условий репликацией без применения упаковывающей клеточной линии. Способ включает контактирование вектора с зависящей от условий репликацией с клеткой, способной быть инфицированной другим вектором, который является вектором того же самого типа, что и вектор с зависящей от условий репликацией, и который отличается от вектора с зависящей от условий репликацией сохранением репликационной компетенции вектора дикого типа; последующее контактирование клетки с другим вектором и затем культивирование клетки в условиях, приводящих к размножению вектора с зависящей от условий репликацией. Хелперный вектор, обсуждаемый выше и более подробно описываемый ниже, является одним из таких дополнительных векторов.The present invention further provides a method for propagating and selectively packaging a conditionally replicated vector without the use of a packaging cell line. The method comprises contacting a conditionally dependent replication vector with a cell capable of being infected with another vector that is the same type of vector as the conditionally dependent replication vector, and which is different from a conditionally replicating vector by maintaining the replication competence of the wild vector type; subsequent contacting of the cell with another vector and then culturing the cell under conditions leading to the reproduction of the vector, depending on the conditions. The helper vector discussed above and described in more detail below is one such additional vector.

Предлагается также молекула выделенной и очищенной нуклеиновой кислоты, выбранная из группы, состоящей из молекулы ДНК, включающей нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NOS: 2, 5, 6, 14, в которой, по меньшей мере, один N мутирован, 15 и 16, и молекулы РНК, включающей нуклеотидную последовательность, кодируемую нуклеотидной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NOS: 2, 6, 15 и 16.Also provided is an isolated and purified nucleic acid molecule selected from the group consisting of a DNA molecule comprising a nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOS: 2, 5, 6, 14, in which at least one N is mutated , 15 and 16, and an RNA molecule comprising a nucleotide sequence encoded by a nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOS: 2, 6, 15 and 16.

Способ примененияMode of application

Описанные выше векторы предпочтительно вводят в клетку-хозяин для профилактического или терапевтического лечения вирусной инфекции, для облегчения поддержания вектора, а также по другим причинам. Соответственно, в настоящем изобретении предлагается клетка-хозяин, включающая вектор согласно изобретению. Выделение клеток-хозяев и/или поддержание таких клеток или ведущих от них начало линий клеток в культуре стало обычным делом, в котором хорошо разбирается специалист в данной области техники.The vectors described above are preferably introduced into a host cell for the prophylactic or therapeutic treatment of a viral infection, to facilitate vector maintenance, and for other reasons. Accordingly, the present invention provides a host cell comprising the vector of the invention. Isolation of host cells and / or maintenance of such cells or leading from them the beginning of cell lines in culture has become commonplace, which is well understood by a person skilled in the art.

В частности, вирусный вектор с зависимой от условий репликацией или предпочтительно лентивирусный вектор, как описано выше, предпочтительно применяют для профилактического или терапевтического лечения вирусной инфекции, предпочтительно такой, где инфекция обусловлена вирусом дикого типа, предпочтительно РНК-вирусом дикого типа, еще более предпочтительно ретровирусом дикого типа и оптимально ВИЧ дикого типа.In particular, a conditionally replicating viral vector, or preferably a lentiviral vector, as described above, is preferably used for prophylactic or therapeutic treatment of a viral infection, preferably one where the infection is due to a wild-type virus, preferably a wild-type RNA virus, even more preferably a retrovirus wild type and optimally wild type HIV.

Способ включает контактирование клетки-хозяина, восприимчивой к инфицированию вирусом дикого типа, с вектором с зависимой от условий репликацией, способным реплицироваться только в клетке-хозяине, допускающей репликацию вектора, наличие, транскрипция или трансляция которого ингибирует репликацию штамма вируса дикого типа в клетке-хозяине. Желательно, чтобы вектор реплицировался более одного раза и включал, по меньшей мере, одну последовательность нуклеиновой кислоты, обладание (т.е. наличие, транскрипция или трансляция) которой придает селективное преимущество вектору в клетке-хозяине по сравнению со штаммом вируса дикого типа, который оптимально является штаммом, от которого происходит вектор.The method includes contacting a host cell susceptible to wild-type virus infection with a conditionally dependent vector capable of replicating only in a host cell capable of replicating the vector, the presence, transcription or translation of which inhibits the replication of a wild-type virus strain in the host cell . Preferably, the vector is replicated more than once and includes at least one nucleic acid sequence, the possession (i.e. presence, transcription or translation) of which gives a selective advantage to the vector in the host cell over the wild-type strain of the virus, which optimally is the strain from which the vector originates.

Согласно данному способу последовательность нуклеиновой кислоты предпочтительно включает нуклеотидную последовательность, которая включает или кодирует генетический противовирусный агент, который неблагоприятно влияет на репликацию и/или экспрессию вируса, отличного от указанного вектора. Желательно, чтобы генетический противовирусный агент был выбран из группы, состоящей из антисмысловой молекулы, рибозима и иммуногена. Оптимально, чтобы генетический противовирусный агент был рибозимом, каталитический домен которого предпочтительно расщепляет 3' нуклеотидную последовательность NUH (т.е. в особенности последовательность GUC). Необязательно рибозим кодируется, по меньшей мере частично, последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO:3 и SEQ ID NO:4. Желательно, чтобы рибозим вызывал расщепление в области штамма вируса дикого типа или его транскриптов, но не вызывал расщепление в области вектора или его транскриптов. Предпочтительно, чтобы это происходило благодаря тому, что штамм вируса дикого типа включает последовательность, кодируемую SEQ ID NO:1, тогда как вектор, если он представлен ДНК, включает нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NOS:2, 5, 6, 14, в которых, по меньшей мере, один N мутирован, 15 и 16, и, если он представлен РНК, включает нуклеотидную последовательность, кодированную нуклеотидной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NOS:2, 5, 6, 14, в которых, по меньшей мере, один N мутирован, 15 и 16.According to this method, the nucleic acid sequence preferably includes a nucleotide sequence that includes or encodes a genetic antiviral agent that adversely affects the replication and / or expression of a virus other than the specified vector. Preferably, the genetic antiviral agent is selected from the group consisting of an antisense molecule, a ribozyme and an immunogen. Optimally, the genetic antiviral agent should be a ribozyme whose catalytic domain preferably cleaves the 3 'nucleotide sequence of the NUH (i.e., especially the GUC sequence). Optionally, the ribozyme is encoded, at least in part, by a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4. It is desirable that the ribozyme causes cleavage in the region of the wild-type virus strain or its transcripts, but does not cause cleavage in the region of the vector or its transcripts. Preferably, this is due to the fact that the wild-type strain of the virus includes the sequence encoded by SEQ ID NO: 1, while the vector, if represented by DNA, includes a nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOS: 2, 5, 6, 14, in which at least one N is mutated, 15 and 16, and if it is RNA, includes a nucleotide sequence encoded by a nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOS: 2, 5, 6, 14, in which at least one N is mutated, 15 and 16.

Способ также желательно осуществлять, когда вектор включает, по меньшей мере, одну последовательность нуклеиновой кислоты, обладание (т.е. наличие, транскрипция или трансляция) которой придает селективное преимущество инфицированной вектором клетке-хозяину по сравнению с клеткой, инфицированной штаммом вируса дикого типа, который оптимально является штаммом вируса, от которого берет начало вектор. В этом отношении вектор может включать, по меньшей мере, одну последовательность нуклеиновой кислоты, которая придает селективное преимущество клетке-хозяину, инфицированной вирусом, и, по меньшей мере, последовательность нуклеиновой кислоты, которая придает селективное преимущество вектору по сравнению со штаммом вируса дикого типа, соответствующего вирусу, от которого берет начало вектор.It is also desirable to carry out the method when the vector comprises at least one nucleic acid sequence, the possession (i.e. presence, transcription or translation) of which confers a selective advantage to the host cell infected with the vector compared with the cell infected with the wild-type strain of virus, which is optimally the strain of the virus from which the vector originates. In this regard, the vector may include at least one nucleic acid sequence that confers a selective advantage to the host cell infected with the virus, and at least a nucleic acid sequence that confers the selective advantage of the vector over the wild-type strain, corresponding to the virus from which the vector originates.

Соответственно, предпочтительно реализуют способ, в котором последовательность нуклеиновой кислоты включает нуклеотидную последовательность, кодирующую ген устойчивости ко многим лекарствам. В противоположном варианте реализуют способ, в котором последовательность нуклеиновой кислоты включает нуклеотидную последовательность, кодирующую мутированную (мутантную) протеазу, и нуклеотидную последовательность, кодирующую мутированную (мутантную) обратную транскриптазу, в случае, когда подлежащая профилактическому или терапевтическому лечению вирусная инфекция обусловлена ретровирусом.Accordingly, a method is preferably implemented in which the nucleic acid sequence comprises a nucleotide sequence encoding a multi-drug resistance gene. Alternatively, a method is implemented in which the nucleic acid sequence comprises a nucleotide sequence encoding a mutated (mutant) protease and a nucleotide sequence encoding a mutated (mutant) reverse transcriptase when the viral infection to be prevented or therapeutic is caused by a retrovirus.

Способ предпочтительно дополнительно включает введение в клетку-хозяина агента, выбранного из группы, состоящей из цитотоксичного лекарства, ингибитора протеазы и ингибитора обратной транскриптазы (т.е. в дополнение к введению вектора).The method preferably further includes introducing into the host cell an agent selected from the group consisting of a cytotoxic drug, a protease inhibitor, and a reverse transcriptase inhibitor (i.e., in addition to introducing the vector).

Соответственно, вектор может быть применен в соответствии с описанным выше способом не только для терапевтического лечения вирусной инфекции, но и для защиты потенциальной клетки-хозяина от вирусной инфекции, т.е. способом профилактического лечения вирусной инфекции или «вакцинации» против интересующего вируса, такого как РНК-вирус, в особенности ретровирус, такой как HIV (ВИЧ). Способ в значительной мере ингибирует репликацию штамма вируса дикого типа перед тем, как клетка-хозяин входит в контакт с штаммом вируса дикого типа. В этом контексте вектор может включать или кодировать белки, которые блокируют суперинфекцию вирусом дикого типа. Способ включает контактирование клетки-хозяина с вектором с зависимой от условий репликацией, как описано выше, и «вектором, экспрессирующим хелпер», т.е. геномом вируса, стимулирующим репликацию «вектора» в неинфицированном хозяине. Вектор с зависимой от условий репликацией имеет селективное преимущество при упаковке и/или размножении. Более того, вектор, например, может содержать последовательность, которая повышает выживаемость клетки, стимулирует образование вируса, индуцирует апоптоз, облегчает образование белка и/или стимулирует иммунную функцию и/или определяет направленное воздействие. Конструкт «вектора, экспрессирующего хелпер» представляет собой любой экспрессионный вектор, который комплементирует неспособность «вектора» к репликации. Такие экспрессирующие хелпер векторы являются обычными и могут быть легко сконструированы специалистами в данной области техники. Экспрессирующий хелпер вектор может быть либо упакован в вирионы, подобно вектору, либо может быть экспрессирован без необходимости упаковки. Поскольку «вектор» обладает селективным преимуществом при упаковке и/или размножении, данная система обеспечивает средства безопасности для достижения значительной репликации вируса без возможных патогенных эффектов, которые мог бы потенциально вызвать живой аттенуированный вирус. Кроме того, вектор может быть смешан с неспецифическими адъювантами для повышения иммуногенности. Такие адъюванты известны специалистам в данной области техники и включают, но не ограничиваются этим, полный или неполный адъювант Фрейнда, эмульсии, составленные из компонентов стенки бактериальной или микобактериальной клетки, и тому подобное.Accordingly, the vector can be used in accordance with the method described above not only for the therapeutic treatment of a viral infection, but also for protecting a potential host cell from a viral infection, i.e. a method for prophylactically treating a viral infection or “vaccinating” against a virus of interest, such as an RNA virus, in particular a retrovirus such as HIV (HIV). The method substantially inhibits the replication of the wild-type virus strain before the host cell comes into contact with the wild-type virus strain. In this context, the vector may include or encode proteins that block wild-type virus superinfection. The method includes contacting the host cell with a conditionally replicated vector as described above and a “helper expressing vector”, i.e. virus genome that stimulates the replication of the "vector" in an uninfected host. A conditionally dependent replication vector has a selective advantage in packaging and / or propagation. Moreover, the vector, for example, may contain a sequence that increases cell survival, stimulates the formation of the virus, induces apoptosis, facilitates the formation of protein and / or stimulates the immune function and / or determines the directional effect. The construct of a helper expressing vector is any expression vector that complements the inability of the vector to replicate. Such helper-expressing vectors are conventional and can be easily constructed by those skilled in the art. An expression helper vector can either be packaged in virions, like a vector, or can be expressed without the need for packaging. Since the “vector” has a selective advantage in packaging and / or reproduction, this system provides security tools to achieve significant virus replication without possible pathogenic effects that could potentially cause a live attenuated virus. In addition, the vector may be mixed with non-specific adjuvants to enhance immunogenicity. Such adjuvants are known to those skilled in the art and include, but are not limited to, Freund's complete or incomplete adjuvant, emulsions composed of wall components of a bacterial or mycobacterial cell, and the like.

Векторы с зависимой от условий репликацией или предпочтительно лентивирусные векторы изобретения могут быть, например, также применены для иммунотерапии при лечении вирусной инфекции или для лечения онкогенных заболеваний. Дендритные клетки или их предшественники (например, гематопоэтические клетки CD34+ или моноциты крови, но не ограничиваясь данными клеточными типами), а также другие презентирующие антиген клетки могут быть трансдуцированы вектором, который экспрессирует белки ВИЧ или белковую последовательность, которая содержит главные эпитопы, благодаря которым хозяин формирует иммунный ответ против чужеродного агента, такого как вирус. Такие белковые эпитопы для ВИЧ описаны в "HIV molecular immunology database", 1998, National Institutes of Allergy and Infection Diseases, Maryland & Los Alamos National Laboratory, New Mexico, которая включена здесь во всей своей полноте. Предпочтительным осуществлением для эпитопа белка ВИЧ является интегрированная или композитная последовательность ЦТЛ (или ее фрагмент), представленная ниже в примере 14. Другие эпитопы, которые могли бы быть экспрессированы сходным образом, берут начало от других вирусов, бактерий грибков, паразитов, опухолевых клеток и генетически модифицированных клеток. В одной белковой последовательности может быть объединено более одного эпитопа таким образом, что неиммуногенные сайты исключаются для создания вектора с повышенной безопасностью, поскольку кодирующие белок последовательности являются строго прерывистыми. Предпочтительное осуществление прерывистой последовательности представляет собой вырожденную прерывистую последовательность (при наличии или в отсутствие подходящих линкерных аминокислотных последовательностей для стабилизации белковой структуры, если это необходимо), кодирующую иммунологически значимые эпитопы. Применение вырожденных последовательностей снижает риск рекомбинации. Другим предпочтительным осуществлением является экспрессия описанной белковой последовательности (или ее фрагмента) с помощью подвергнутого сплайсингу месенджера, управляемого ретровирусным LTR, таким как HIV-LTR.The conditionally dependent replication vectors, or preferably the lentiviral vectors of the invention, can for example also be used for immunotherapy in the treatment of viral infection or for the treatment of oncogenic diseases. Dendritic cells or their precursors (for example, CD34 + hematopoietic cells or blood monocytes, but not limited to these cell types), as well as other presenting antigen cells, can be transduced with a vector that expresses HIV proteins or a protein sequence that contains the main epitopes that make the host forms an immune response against a foreign agent such as a virus. Such protein epitopes for HIV are described in the "HIV molecular immunology database", 1998, National Institutes of Allergy and Infection Diseases, Maryland & Los Alamos National Laboratory, New Mexico, which is incorporated herein in its entirety. A preferred embodiment for an HIV protein epitope is the integrated or composite CTL sequence (or fragment thereof) shown in Example 14 below. Other epitopes that could be similarly expressed are derived from other viruses, fungal bacteria, parasites, tumor cells, and genetically modified cells. More than one epitope can be combined in one protein sequence in such a way that non-immunogenic sites are excluded to create a vector with increased safety, since protein coding sequences are strictly discontinuous. A preferred implementation of the discontinuous sequence is a degenerate discontinuous sequence (in the presence or absence of suitable linker amino acid sequences to stabilize the protein structure, if necessary) encoding immunologically significant epitopes. The use of degenerate sequences reduces the risk of recombination. Another preferred embodiment is the expression of the described protein sequence (or fragment thereof) using a spliced messenger controlled by a retroviral LTR, such as HIV-LTR.

В связи с применением ретровирусных векторов для лечения инфекции и заболевания человека вызывает озабоченность возможность возникновения способного к репликации вируса (RCV). Одним из основных путей возникновения RCV, по-видимому, является гомологичная рекомбинация между хелперным вектором и вектором с зависимой от условий репликацией. Таким образом, в настоящем изобретении предлагается модификация конструкта хелперного вектора для сведения к минимуму или исключения возможности гомологичной рекомбинации. Настоящим изобретением рассматривается любая модификация, которая служит для снижения вероятности димеризации, совместной упаковки и/или рекомбинации хелперного вектора и вектора с зависимой от условий репликацией.The use of retroviral vectors for the treatment of infections and human diseases is a matter of concern for the possibility of the emergence of a replicable virus (RCV). One of the main pathways for RCV, apparently, is homologous recombination between a helper vector and a conditionally replicated vector. Thus, the present invention provides a modification of the helper vector construct to minimize or eliminate the possibility of homologous recombination. The present invention contemplates any modification that serves to reduce the likelihood of dimerization, co-packaging and / or recombination of a helper vector and a conditionally dependent replication vector.

Осуществлением настоящего изобретения является вставка одного или более антивекторных рибозимов или антисмысловой последовательности (не обязательно в форме кассеты, определяемой как, по меньшей мере, две такие последовательности, соединенные последовательно, в отношении рибозимов, и определенной как, по меньшей мере, две последовательности, соединенные последовательно и направленные против прерывистых областей векторной нуклеиновой кислоты-мишени, в отношении антисмысловых последовательностей) в 3'-конец кодирующих последовательностей хелперного гена, но со стороны 5' от сайта терминации транскрипции. Хотя неспецифическая упаковка хелперных геномов в вектор может происходить, такая упаковка, по-видимому, зависит от вектора. Следовательно, может быть применен ряд подходов для снижения упаковки хелперного вектора в векторные частицы, которая в противном варианте могла бы быть первой стадией возможного возникновения RCV.An embodiment of the present invention is the insertion of one or more anti-vector ribozymes or an antisense sequence (not necessarily in the form of a cassette, defined as at least two such sequences connected in series with respect to the ribozymes, and defined as at least two sequences connected sequentially and directed against discontinuous regions of a vector target nucleic acid, with respect to antisense sequences) at the 3'-end of the coding sequences of the helper gene, but from the 5 ′ side of the transcription termination site. Although non-specific packaging of helper genomes into a vector may occur, such packaging appears to be dependent on the vector. Therefore, a number of approaches can be applied to reduce the packaging of the helper vector into vector particles, which otherwise could be the first stage of the possible occurrence of RCV.

Предпочтительный хелперный конструкт включает антивекторный рибозим или антисмысловую молекулу на 3' конце последовательности, кодирующей структурный белок, или последовательности, кодирующей (гомологичную или гетерологичную) оболочку. Более предпочтительный хелперный конструкт включает антивекторный рибозим или антисмысловую молекулу на 3' конце последовательности, кодирующей структурный белок, и последовательности, кодирующей оболочку. Если последовательность нуклеиновой кислоты является антисмысловой молекулой, то она может действовать внутриклеточно, разрушая совместно локализованные двухцепочечные вектор-хелперные молекулы посредством нуклеаз клетки. Если хелпер упакован с векторной РНК в вирусные частицы, то такие молекулы не способны подвергаться полной обратной транскрипции для образования RCV.A preferred helper construct includes an anti-vector ribozyme or antisense molecule at the 3 'end of a sequence encoding a structural protein, or a sequence encoding a (homologous or heterologous) envelope. A more preferred helper construct includes an anti-vector ribozyme or antisense molecule at the 3 'end of a sequence encoding a structural protein and a sequence encoding a coat. If the nucleic acid sequence is an antisense molecule, then it can act intracellularly, destroying co-localized double-stranded vector helper molecules via cell nucleases. If the helper is packaged with vector RNA into viral particles, then such molecules are not able to undergo complete reverse transcription to form RCV.

В другом предпочтительном осуществлении в хелперный конструкт помещают последовательности, которые стимулируют дифференцированное перемещение или локализацию хелперной нуклеиновой кислоты в стороне от вектора. Неограничивающим примером является включение в хелперные конструкты гетерологичных интронных и поли-A последовательностей так, как это показано на фиг.6. Данные последовательности должны облегчать дифференцированное перемещение векторной и хелперной нуклеиновых кислот в различные участки клетки или внутриклеточных структур. Предпочтительно, чтобы титр образованного вектора менялся не более чем в 100 раз, более предпочтительно - не более чем в 10 раз, и наиболее предпочтительно - не зависел от такой модификации хелпера.In another preferred embodiment, sequences are inserted into the helper construct that stimulate differentiated movement or localization of the helper nucleic acid away from the vector. A non-limiting example is the inclusion of heterologous intron and poly-A sequences in helper constructs as shown in FIG. 6. These sequences should facilitate the differentiated movement of vector and helper nucleic acids to different parts of the cell or intracellular structures. Preferably, the titer of the formed vector changes no more than 100 times, more preferably no more than 10 times, and most preferably does not depend on such a helper modification.

На фиг.7 показано, что присутствие одного рибозима (pVirPac1.2Rz) или рибозима и интрона, созданного для оказания влияния на перемещение в клетке хелперной РНК (pVirPac1.2RzIn), не оказывало существенного влияния на титр вектора. На фиг.12 показано, что анализ с помощью ПЦР образцов для титрования совместной упаковки хелперных конструктов показал сниженную совместную упаковку в присутствии рибозима по сравнению с высокой совместной упаковкой в отсутствие рибозима. Наличие двух рибозимов полностью предотвращало совместную упаковку хелперного вектора в векторные вирусные частицы. Таким образом, изобретение включает эффективные средства применения системы упаковки двух плазмид как для получения высоких титров вектора, так и для усовершенствования безопасности таких векторов путем снижения или исключения совместной упаковки хелперного вектора.Figure 7 shows that the presence of a single ribozyme (pVirPac1.2Rz) or a ribozyme and intron designed to influence helper RNA movement (pVirPac1.2RzIn) in the cell did not significantly affect the titer of the vector. 12 shows that PCR analysis of samples for titration of co-packaging of helper constructs showed reduced co-packaging in the presence of ribozyme compared to high co-packaging in the absence of ribozyme. The presence of two ribozymes completely prevented the joint packaging of the helper vector into vector viral particles. Thus, the invention includes effective means of using a packaging system for two plasmids both for obtaining high titers of a vector and for improving the safety of such vectors by reducing or eliminating co-packaging of a helper vector.

Результаты позволяют предполагать, что упаковка хелпера в вирионы не является случайной и зависит от вектора. В альтернативном предпочтительном осуществлении для предотвращения совместной упаковки хелперных нуклеиновых кислот с таковыми вектора применяют вырождение хелперного конструкта в областях, важных для ассоциации хелперной и векторной последовательностей. Данный подход может быть дополнительно модифицирован полным вырождением хелперной последовательности для предотвращения совместной упаковки хелперной и векторной последовательностей.The results suggest that the packaging of the helper in virions is not random and depends on the vector. In an alternative preferred embodiment, to prevent co-packaging of helper nucleic acids with those of the vector, helper construct degeneracy is used in areas important for the association of helper and vector sequences. This approach can be further modified by the complete degeneration of the helper sequence to prevent co-packaging of the helper and vector sequences.

Например, нуклеотидная последовательность хелперного вектора может быть вырожденной частично или полностью. В то время как такое вырождение значительно снижает или снимает вероятность гомологичного спаривания и рекомбинации хелперного вектора и вектора с зависимой от условий репликацией, оно не влияет на способность хелперного вектора кодировать белковые продукты, необходимые для репликации и упаковки вируса. Данное вырождение может быть направлено на любой возможный ген и открытую рамку считывания (ОРС), которая является гомологичной для хелпера и векторов с зависимой от условий репликацией, или более селективно направлено на конкретные гены или ОРС внутри хелперного вектора. Следует отметить, что полное вырождение не является необходимым для снижения вероятности гомологичной рекомбинации, поскольку отсутствие гомологии последовательности из более 18 нуклеотидов в длину должно быть достаточным. Таким образом, вырождение до уровней, которые не превышают 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7 или 6 нуклеотидов, идентичных в последовательностях, будет подавлять или предотвращать рекомбинацию. Последовательности могут быть вырождены с применением кодонов, которые обладают преимущественной экспрессией у человека или в конкретном типе клеток, если это желательно. For example, the nucleotide sequence of a helper vector may be partially or completely degenerate. While such degeneration significantly reduces or eliminates the likelihood of homologous pairing and recombination of the helper vector and the conditionally dependent replication vector, it does not affect the ability of the helper vector to encode protein products necessary for virus replication and packaging. This degeneracy can be directed to any possible gene and open reading frame (OPC), which is homologous to helper and conditionally dependent replication vectors, or more selectively directed to specific genes or OPC within the helper vector. It should be noted that complete degeneration is not necessary to reduce the likelihood of homologous recombination, since the absence of sequence homology of more than 18 nucleotides in length should be sufficient. Thus, degeneration to levels that do not exceed 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, or 6 nucleotides that are identical in sequence will inhibit or prevent recombination. Sequences can be degenerated using codons that are predominantly expressed in humans or in a particular type of cell, if desired.

Например, нуклеотидная последовательность, кодирующая gag, rev и/или tat, может быть вырождена полностью или частично. Другие примеры включают дегенерацию первых 42 нуклеотидов последовательности gag, первых 208 нуклеотидов последовательности rev, последних 183 нуклеотидов последовательности tat и последних 545 нуклеотидов последовательности Pol. Примерами хелперных векторов с таким вырождением являются pVirPac1.2, pVirPac1.2Rz, pVirPac1.2Rz2 и pVirPac1.2RzIn или их производные. Разумеется, нуклеотидная последовательность, кодирующая любой другой продукт вирусного гена, также может быть вырождена согласно изобретению, что тем самым снижает, сводит к минимуму или исключает вероятность гомологичной рекомбинации.For example, the nucleotide sequence encoding gag, rev and / or tat may be degenerated in whole or in part. Other examples include the degeneration of the first 42 nucleotides of the gag sequence, the first 208 nucleotides of the rev sequence, the last 183 nucleotides of the tat sequence, and the last 545 nucleotides of the Pol sequence. Examples of helper vectors with this degeneration are pVirPac1.2, pVirPac1.2Rz, pVirPac1.2Rz2 and pVirPac1.2RzIn or their derivatives. Of course, the nucleotide sequence encoding any other product of the viral gene can also be degenerated according to the invention, thereby reducing, minimizing or eliminating the possibility of homologous recombination.

Альтернативным осуществлением настоящего изобретения является включение в хелперный вектор элемента, который направлен на вектор с зависимой от условий репликацией и вызывает его разрушение в случае совместной локализации, совместной упаковки или иного совместного спаривания двух векторов. Рибозим является примером такого элемента. В изобретении рассматривается любой рибозим, который селективно поражает вектор с зависимой от условий репликацией. Могут быть также применены множественные рибозимы, такие как описанные здесь кассеты из двух или трех рибозимов. Например, рибозим может поражать область U5 (например, область U5 HIV-1, HIV-2 или другого ретровируса, применяемого в векторе с зависимой от условий репликацией) вектора с зависимой от условий репликацией. Расщепление вектора с зависимой от условий репликацией предотвращает событие рекомбинации с вектором с зависимой от условий репликацией с образованием RCV, которое может произойти, если два вектора были упакованы совместно. Примерами хелперных векторов, содержащих рибозим, являются pVIRPAC1.1Rz и pVIRPAC1.2Rz2, как показано на фигуре 6.An alternative implementation of the present invention is the inclusion in the helper vector of an element that is directed to a vector with conditionally dependent replication and causes its destruction in the case of joint localization, joint packaging or other joint pairing of two vectors. Ribozyme is an example of such an element. The invention contemplates any ribozyme that selectively infects a conditionally replicating vector. Multiple ribozymes may also be used, such as the cassettes of two or three ribozymes described herein. For example, a ribozyme can affect the U5 region (for example, the U5 region of HIV-1, HIV-2, or another retrovirus used in a conditionally replicated vector) of a conditionally replicated vector. The splitting of the conditionally dependent replication vector prevents the event of recombination with the conditionally dependent replication vector to form RCV, which can occur if the two vectors are packed together. Examples of helper vectors containing ribozyme are pVIRPAC1.1Rz and pVIRPAC1.2Rz2, as shown in FIG. 6.

Еще одним осуществлением настоящего изобретения является замена гетерологичного RRE, включая любой ретровирусный RRE, но предпочтительно другой лентивирусный RRE, в хелперном векторе, такая как замена RRE HIV-1, CTE или PRE на RRE HIV-2. Данный подход вносит вклад в снижение, сведение к минимуму или снятию возможности гомологичной рекомбинации на основе того, что разные RRE имеют разные последовательности. Дополнительным преимуществом такой замены согласно изобретению является удивительное и неожиданное повышение образования вектора с зависимой от условий репликацией, равное пятикратному повышению. Вне связи с теорией возможно, что различные RRE в хелперном векторе и векторе с зависимой от условий репликацией связываются с одним или более различными факторами клетки, количество которых может быть ограниченным. В результате применение разных RRE может снижать конкуренцию между двумя векторами за ограниченные клеточные факторы. Примерами хелперных векторов, содержащих элемент RRE HIV-2 для упаковки ретровирусного вектора на основе HIV-1, являются pVIRPAC-1.2 и pVIRPAC-1.2Rz2, как показано на фиг.6.Another embodiment of the present invention is the replacement of a heterologous RRE, including any retroviral RRE, but preferably another lentiviral RRE, in a helper vector, such as replacing HIV-1, CTE or PRE with HIV-2 RRE. This approach contributes to reducing, minimizing, or eliminating the possibility of homologous recombination based on the fact that different RREs have different sequences. An additional advantage of such a replacement according to the invention is a surprising and unexpected increase in the formation of a vector with conditional replication equal to a five-fold increase. Out of touch with theory, it is possible that different RREs in a helper vector and a conditionally replicated vector bind to one or more different cell factors, the number of which may be limited. As a result, the use of different RREs can reduce competition between two vectors for limited cellular factors. Examples of helper vectors containing an HIV-2 RRE element for packaging an HIV-1 based retroviral vector are pVIRPAC-1.2 and pVIRPAC-1.2Rz2, as shown in FIG. 6.

Еще одним осуществлением является включение в хелперный вектор нуклеотидной последовательности, кодирующей гетерологичный белок env, такой как VSV-G из вируса везикулярного стоматита, белок G бешенства, GaLV, гликопротеин E1/2 альфавируса или RD114 - белок env эндогенного вируса кошачьих. Это обеспечивает упаковку вектора с зависимой от условий репликацией в частицы с гетерологичными белками env. Более того, в белок оболочки необязательно может быть вставлен лиганд для стимуляции клетки-мишени во время трансдукции, если это желательно. Поскольку модификация белков оболочки может нарушать их связываюшую способность, предпочтительным осуществлением является экспрессия модифицированного лиганда, содержащего гибридный белок оболочки, с немодифицированным псевдотипированным белком оболочки во время образования. Таким образом, оба типа белков оболочки должны находиться на поверхности клетки, один из которых предназначен для стимуляции клетки-мишени, а другой - для опосредования связывания и вхождения. Предпочтительным псевдотипированным лентивирусным вектором, который также экспрессирует гибридный рецептор для стимуляции клеток, является белок оболочки VSV-G и гибридный белок оболочки VSV-G. Более предпочтительным гибридным белком оболочки является гибридный белок оболочки VSV-G/RD114 (смотри фиг.14A и 14B). Другие предпочтительные белки (или их фрагменты) для создания гибридов с VSV-G включают notch, дельта, лиганд FLT-3, TPO, лиганд Kit, лиганд, который связывается с CD3, лиганд, который связывается с CD28, и лиганд, который связывается с GM-CSF.Another embodiment is the incorporation into a helper vector of a nucleotide sequence encoding a heterologous env protein, such as vesicular stomatitis virus VSV-G, rabies protein G, GaLV, alphavirus E1 / 2 glycoprotein or RD114, an endogenous feline env protein. This provides packaging of the vector with conditionally dependent replication into particles with heterologous env proteins. Moreover, a ligand can optionally be inserted into the envelope protein to stimulate the target cell during transduction, if desired. Since the modification of envelope proteins may impair their binding ability, the preferred embodiment is the expression of a modified ligand containing a hybrid envelope protein with an unmodified pseudotyped envelope protein during formation. Thus, both types of membrane proteins must be on the surface of the cell, one of which is intended to stimulate the target cell, and the other to mediate binding and entry. A preferred pseudotyped lentiviral vector that also expresses a hybrid receptor for cell stimulation is VSV-G coat protein and VSV-G coat hybrid protein. A more preferred hybrid coat protein is the VSV-G / RD114 hybrid coat protein (see FIGS. 14A and 14B). Other preferred proteins (or fragments thereof) for creating VSV-G hybrids include notch, delta, FLT-3 ligand, TPO, Kit ligand, ligand that binds to CD3, ligand that binds to CD28, and ligand that binds to GM-CSF.

Последовательность, кодирующая гетерологичный белок env, может быть необязательно оперативно связана со вторым индуцибельным промотором для обеспечения более обильной поставки белка env для упаковки вируса. Данный подход может дополнительно увеличивать продукцию вируса, в особенности в условиях, при которых продукция белка env является лимитирующим фактором. Последовательность, кодирующая гетерологичный белок env, может находиться либо в том же хелперном векторе, в котором находятся последовательности, кодирующие другие дополняющие вирусные белки, или в отдельном векторе. Она необязательно может быть также интегрирована в продуцирующую клетку-хозяин или клеточную линию.The sequence encoding the heterologous env protein may optionally be operably linked to a second inducible promoter to provide a more abundant supply of env protein for packaging the virus. This approach can further increase the production of the virus, especially under conditions in which the production of env protein is a limiting factor. The sequence encoding the heterologous env protein can be either in the same helper vector as the sequences encoding other complementary viral proteins, or in a separate vector. It can optionally also be integrated into a producing host cell or cell line.

Дополнительным осуществлением настоящего изобретения является селективное позиционирование донорных и акцепторных сайтов сплайсинга в хелперном векторе, в результате чего селективное удаление за счет сплайсинга некоторых компонентов вируса обеспечивает сведение к минимуму или исключение возможности гомологичной рекомбинации с вектором с зависимой от условий репликацией. Например, сайты сплайсинга могли бы быть расположены так, чтобы в результате событий сплайсинга обеспечивалась делеция RRE и/или сигналов упаковки или димеризации. Следовательно, контекст того, какие нуклеиновые кислоты будут экспрессироваться, может контролироваться помещением в вектор сайтов сплайсинга. Например, сайты сплайсинга можно было бы расположить дистально по отношению к рибозимной или антисмысловой последовательности так, чтобы, например, рибозимы или антисмысловая последовательность включались в не подвергнутые сплайсингу, но не в подвергнутые сплайсингу РНК. В противоположном варианте рибозимы или антисмысловую последовательность можно было бы поместить ниже сайта сплайсинга, если бы целью являлась экспрессия молекулы рибозимов или антисмысловой последовательности со всех молекул мРНК, а не их конкретного подтипа.An additional embodiment of the present invention is the selective positioning of splicing donor and acceptor sites in a helper vector, as a result of which the selective removal of some components of the virus by splicing minimizes or eliminates the possibility of homologous recombination with a conditionally replicated vector. For example, splicing sites could be located so that splicing events result in a deletion of RRE and / or packaging or dimerization signals. Therefore, the context of which nucleic acids will be expressed can be controlled by placement of splicing sites in the vector. For example, splicing sites could be positioned distally with respect to the ribozyme or antisense sequence so that, for example, ribozymes or antisense sequence are included in non-spliced but not spliced RNAs. Alternatively, a ribozyme or antisense sequence could be placed below the splicing site if the goal was to express a ribozyme molecule or antisense sequence from all mRNA molecules, rather than their specific subtype.

Когда вектор применяют согласно описанному выше способу для профилактического лечения вирусной инфекции, вектор может кодировать антиген белка, который не кодируется вирусом дикого типа, такой как мутантный вирусный белок или невирусный белок. Соответственно, кодируемый вектором антиген может иметь, например, бактериальное происхождение или может происходить от раковых клеток. Более того, вирусный вектор с зависимой от условий репликацией или предпочтительно лентивирусный вектор может также кодировать ген MHC для правильной презентации антигена иммунной системе хозяина. Таким образом, такие векторы могут быть применены для облегчения продолжительного иммунологического ответа против широкого спектра потенциальных патогенов и/или эндогенных белков (например, специфичного для опухоли антигена), которые селективно экспрессируются в ненормальных клетках.When a vector is used according to the method described above for the prophylactic treatment of a viral infection, the vector can encode a protein antigen that is not encoded by a wild-type virus, such as a mutant viral protein or a non-viral protein. Accordingly, the antigen encoded by the vector can be, for example, of bacterial origin or can be derived from cancer cells. Moreover, a conditionally replicating viral vector, or preferably a lentiviral vector, can also encode the MHC gene for proper presentation of the antigen to the host immune system. Thus, such vectors can be used to facilitate a sustained immunological response against a wide range of potential pathogens and / or endogenous proteins (e.g., tumor specific antigen) that are selectively expressed in abnormal cells.

Приведенный выше пример не ограничивает применение изобретения предоставлением антигена дендритным клеткам для иммунотерапии. Напротив, в изобретении предлагаются средства и способы для доставки и экспрессии любого интересующего гена в любом желаемом типе клеток. Более того, изобретение также обеспечивает доставку и экспрессию многих генов посредством одного вектора. Множество генов может быть экспрессировано при применении любой подходящей стратегии генной экспрессии. Неограничивающим примером является применение внутреннего сайта вхождения в рибосому (IRES), который может быть помещен дистально по отношению к первому гену, который подлежит экспрессии. Предпочтительным примером является экспрессия интересующего гена с применением последовательности IRES, расположенной дистально по отношению к варианту гена MGMT. В более предпочтительном осуществлении вектор экспрессирует интересующий ген и соединенный с IRES интересующий ген с немодифицированного или модифицированного промотора HIV-LTR, исключаемого из подвергнутого сплайсингу мессенджера. Следующий предпочтительный вектор экспрессирует два интересующих гена с немодифицированного или модифицированного промотора HIV-LTR, такого, что если он модифицирован, то модификация касается последовательностей, которые связываются с транскрипционными факторами. Разумеется, в дополнение к LTR HIV могут быть применены любые немодифицированные или модифицированные лентивирусные LTR.The above example does not limit the use of the invention to the provision of antigen to dendritic cells for immunotherapy. On the contrary, the invention provides means and methods for the delivery and expression of any gene of interest in any desired cell type. Moreover, the invention also provides the delivery and expression of many genes through a single vector. Many genes can be expressed using any suitable gene expression strategy. A non-limiting example is the use of an internal ribosome entry site (IRES), which can be placed distal to the first gene to be expressed. A preferred example is the expression of a gene of interest using an IRES sequence distal to the MGMT gene variant. In a more preferred embodiment, the vector expresses the gene of interest and the IRES coupled gene of interest from the unmodified or modified HIV-LTR promoter excluded from the spliced messenger. The following preferred vector expresses two genes of interest from an unmodified or modified HIV-LTR promoter, such that if it is modified, the modification refers to sequences that bind to transcription factors. Of course, in addition to HIV LTR, any unmodified or modified lentiviral LTR can be used.

Другим неограничивающим примером является экспрессия интересующего гена с HIV-LTR с применением сайтов сплайсинга, берущих начало от HIV. Например, один интересующий ген мог бы экспрессироваться с акцепторного сайта сплайсинга Nef, а второй интересующий ген мог бы экспрессироваться с акцепторного сайта сплайсинга Tat. В данном варианте два гена могли бы экспрессироваться без необходимости в наличии элемента IRES. Мог бы быть применен любой сайт сплайсинга, включая таковые генов Tat, Rev, Vif, Vpr, Vpu, Nef и Env. Белок Env экспрессируется с подвергнутого однократному сплайсингу мессенджера, и поэтому для экспрессии интересующего гена через данный сайт сплайсинга может иметься потребность в Rev, если необходима значительная экспрессия интересующего гена. Более того, если это желательно, экспрессия с HIV-LTR может быть сделана зависимой от Tat и Rev.Another non-limiting example is the expression of a gene of interest with HIV-LTR using splicing sites originating from HIV. For example, one gene of interest could be expressed from a Nef splice acceptor site, and a second gene of interest could be expressed from a Tat splice acceptor site. In this embodiment, two genes could be expressed without the need for an IRES element. Any splicing site could be used, including those of the Tat, Rev, Vif, Vpr, Vpu, Nef, and Env genes. Env protein is expressed from a single-spliced messenger, and therefore, expression of a gene of interest through this splicing site may require Rev if significant expression of the gene of interest is required. Moreover, if desired, expression with HIV-LTR can be made dependent on Tat and Rev.

Более того, может быть создан экспрессионный вектор «хелпер-вирус» (также обозначаемый здесь как «хелпер») для экспрессии лишь в специфичных типах клеток (например, стволовых клетках, профессиональных антиген-презентирующих клетках и опухолевых клетках) путем добавления или удаления специфического генетического элемента/фактора (либо в векторе, либо в экспрессионном конструкте хелпер-вирус), что обеспечивает специфичную в отношении клетки репликацию и распространение вектора. Таким образом, вектор продолжает распространяться благодаря комплементации хелпер-вирусным конструктом, но это распространение является специфичным для клеток и зависит от того, добавлен ли в вектор или в хелпер-вирусный экспрессионный конструкт или удален из них определенный генетический элемент/фактор. Это можно применять отдельно или в сочетании с другими упомянутыми выше стратегиями.Moreover, a helper-virus expression vector (also referred to as a “helper”) can be created for expression only in specific cell types (eg, stem cells, professional antigen-presenting cells and tumor cells) by adding or removing a specific genetic element / factor (either in the vector or in the helper-virus expression construct), which provides cell-specific replication and distribution of the vector. Thus, the vector continues to spread due to complementation by the helper-viral construct, but this spread is cell specific and depends on whether a specific genetic element / factor has been added to or removed from the helper-viral expression construct. This can be used alone or in combination with the other strategies mentioned above.

Например, может быть создан вектор HIV с зависимой от условий репликацией для специфичной репликации в макрофагах, а не в T-клетках. Вектор, который создавал бы дефектный по Tat HIV (вектор кодирует другие белки HIV, но они не экспрессируются из-за отсутствия транскрипционного трансактиватора Tat), может кодировать рибозим, который расщепляет HIV дикого типа, но не РНК HIV с зависимой от условий репликацией. Экспрессионный вектор хелпера для данного вектора может кодировать ген tat, экспрессируемый со специфичного для макрофагов промотора. Таким образом, crHIV должен был бы реплицироваться в зависимости от условий только в клетках-макрофагах и в то же время был бы неспособен реплицироваться в T-клетках или клетках других типов.For example, an HIV vector with conditionally dependent replication can be created for specific replication in macrophages and not in T cells. A vector that would create Tat defective HIV (the vector encodes other HIV proteins, but they are not expressed due to the lack of a transcriptional transactivator Tat), can encode a ribozyme that cleaves wild-type HIV, but not HIV-dependent RNA with conditional replication. A helper expression vector for a given vector can encode a tat gene expressed from macrophage-specific promoter. Thus, crHIV would have to replicate depending on conditions only in macrophage cells and at the same time would be unable to replicate in T cells or other types of cells.

В противоположном варианте ген tat может быть оперативно соединен со специфичным для опухоли промотором; так что crHIV мог бы затем реплицироваться только в опухолевых клетках CD4, но не в нормальных клетках CD4. Генетический элемент/фактор может быть также модификацией промоторной последовательности вектора, так что он экспрессируется только в специфичных типах клеток, но не в других типах клеток вместе с «хелпер-вирусным» экспрессионным конструктом.Alternatively, the tat gene can be operably linked to a tumor-specific promoter; so that crHIV could then replicate only in CD4 tumor cells, but not in normal CD4 cells. A genetic element / factor can also be a modification of the promoter sequence of a vector, so that it is expressed only in specific types of cells, but not in other types of cells together with a helper-viral expression construct.

В другом осуществлении белки оболочки хелперного экспрессионного конструкта или векторного конструкта (если такие конструкты были разработаны для включения белков оболочки) могут быть модифицированы таким образом, что вектор-вирион будет специфично инфицировать определенные типы клеток (например, опухолевые клетки), не будучи способным инфицировать другие типы клеток (например, нормальные клетки). В еще одном осуществлении аденовирус, лишенный одного или нескольких ключевых для репликации факторов, мог бы быть дополнен применением хелперного конструкта, который обеспечивает снабжение такими факторами, связанными со специфичным для опухоли промотором. Таким образом, факторы, комплементирующие репликацию аденовируса, должны были бы экспрессироваться только в опухолевых клетках, тем самым обеспечивая вирусную репликацию в опухолевых клетках (с экспрессией белков, необходимых для гибели клеток), но не в нормальных клетках.In another embodiment, envelope proteins of a helper expression construct or vector construct (if such constructs were designed to incorporate envelope proteins) can be modified so that the virion vector will specifically infect certain types of cells (e.g., tumor cells) without being able to infect other cell types (e.g. normal cells). In yet another embodiment, an adenovirus lacking one or more key factors for replication could be complemented by the use of a helper construct that provides such factors associated with the tumor-specific promoter. Thus, factors complementing the replication of adenovirus should be expressed only in tumor cells, thereby ensuring viral replication in tumor cells (with the expression of proteins necessary for cell death), but not in normal cells.

В другом осуществлении вектор мог бы экспрессировать ген негативной селекции для вызова гибели клеток с помощью агента, алкилирующего O⁶-гуанин, такого как, но не ограничиваясь этим, BCNU (или функциональный аналог BCNU) в качестве лекарства для негативной селекции. Лентивирусный вектор, экспрессирующий антисмысловую последовательность или рибозим, направленные на ген MGMT, может быть доставлен к нормальной клетке. Позже в желаемый момент клетки можно обработать BCNU или его аналогом ex vivo или in vivo для индукции гибели трансдуцированных вектором клеток. В предпочтительном осуществлении нормальные клетки профилактически трансдуцируют экспрессионным вектором с антисмысловой последовательностью MGMT и затем вызывают гибель, когда клетки становятся ненормальными. Примером данного последнего подхода является возможность индукции гибели клеток обработкой клеток BCNU или его функциональным аналогом после превращения клеток в раковые. Другим предпочтительным осуществлением является экспрессия антисмысловой последовательности против MGMT или рибозимной молекулы c промотора U1 и содержащейся в snRNA U1. Еще более предпочтительным осуществлением является трансдукция анти-MDMT лентивирусного вектора в популяцию гематопоэтических клеток, таких как лимфоциты, стволовые клетки и дендритные клетки.In another embodiment, the vector could express a negative selection gene to induce cell death with an O ⁶ -guanine alkylating agent, such as, but not limited to, BCNU (or a functional analogue of BCNU) as a negative selection drug. A lentiviral vector expressing an antisense sequence or ribozyme directed to the MGMT gene can be delivered to a normal cell. Later, at the desired moment, the cells can be treated with BCNU or its analogue ex vivo or in vivo to induce the death of cells transduced by the vector. In a preferred embodiment, normal cells are prophylactically transduced with an MGMT antisense expression vector and then cause death when the cells become abnormal. An example of this latter approach is the possibility of inducing cell death by treating BCNU cells or a functional analogue thereof after the transformation of cells into cancer cells. Another preferred embodiment is the expression of an antisense sequence against MGMT or a ribozyme molecule from the U1 promoter and contained in snRNA U1. An even more preferred embodiment is the transduction of an anti-MDMT lentiviral vector into a population of hematopoietic cells such as lymphocytes, stem cells and dendritic cells.

В другом предпочтительном осуществлении нормальными клетками являются гематопоэтические клетки, предпочтительно T клетки, которые трансдуцируют вектором перед трансплантацией аллогенному хозяину. Гибель таких клеток может быть вызвана обработкой BCNU или его функциональным аналогом, если клетки становятся вредными для хозяина (например, происходит реакция трансплантат против хозяина). В еще одном осуществлении тот же самый лентивирусный вектор, экспрессирующий антисмысловую последовательность против MGMT или рибозим, мог бы быть применен для удаления нежелательных клеток из смешанных клеточных популяций. Неограничивающим примером является случай зараженного опухолевыми клетками костного мозга, готового к трансплантации. Было показано, что опухолевые клетки очень эффективно трансдуцируются при относительно низких MOI при одном раунде трансдукции (смотри фиг.13A). Напротив, нормальные клетки, в особенности, но не ограничиваясь этим, гематопоэтические стволовые клетки CD34+, труднее эффективно трансдуцировать, и для высокой эффективности требуется много раундов трансдукции (смотри фиг.13B). Следовательно, привлекательная стратегия очистки заключается в трансдукции зараженного костного мозга вектором, содержащим антисмысловую последовательность против MGMT, с применением MOI, который бы эффективно трансдуцировал загрязняющие опухолевые клетки, но не нормальные клетки. Данный пример не ограничивает объем изобретения применением ex vivo или связанными исключительно с раком применениями. Другие применения включают избирательную доставку гена in vivo, в особенности, но не ограничиваясь этим, для лечения рака мозга и любых других заболеваний, при которых дифференцированная между больными и нормальными клетками эффективность трансдукции может быть использована для направленного воздействия в соответствии с настоящим изобретением.In another preferred embodiment, the normal cells are hematopoietic cells, preferably T cells, which are transduced with the vector prior to transplantation to the allogeneic host. The death of such cells can be caused by treatment with BCNU or its functional analogue if the cells become harmful to the host (for example, a graft versus host reaction occurs). In yet another embodiment, the same lentiviral vector expressing an anti-MGMT antisense sequence or ribozyme could be used to remove unwanted cells from mixed cell populations. A non-limiting example is the case of a bone marrow infected tumor cell ready for transplantation. Tumor cells have been shown to transduce very efficiently at relatively low MOIs in one round of transduction (see figa). In contrast, normal cells, in particular, but not limited to, CD34 + hematopoietic stem cells, are more difficult to transduce efficiently, and many rounds of transduction are required for high efficiency (see Fig. 13B). Therefore, an attractive purification strategy is to transduce the infected bone marrow with a vector containing an anti-MGMT antisense sequence using an MOI that would efficiently transduce contaminating tumor cells, but not normal cells. This example does not limit the scope of the invention to ex vivo use or exclusively to cancer related applications. Other applications include selective in vivo gene delivery, in particular, but not limited to the treatment of brain cancer and any other diseases in which the transduction efficiency differentiated between diseased and normal cells can be used for targeted exposure in accordance with the present invention.

Таким образом, в настоящем изобретении также предлагается способ лечения рака и, в частности, Т-клеточного лейкоза. «Лечение рака» согласно изобретению включает введение хозяину дополнительно модифицированного вектора, как изложено здесь, с целью индукции терапевтического действия. Такое действие может быть оценено, например, с помощью отслеживания задержки опухолевого роста и/или регрессии опухоли. «Опухолевый рост» включает увеличение размера и/или количества опухолей. «Регрессия опухоли» включает снижение массы опухоли.Thus, the present invention also provides a method for treating cancer, and in particular T-cell leukemia. A “cancer treatment” according to the invention includes administering to the host an additionally modified vector, as set forth herein, in order to induce a therapeutic effect. Such an effect can be evaluated, for example, by tracking tumor growth retardation and / or tumor regression. “Tumor growth” includes an increase in the size and / or number of tumors. “Tumor regression” includes a reduction in tumor mass.

«Рак» согласно изобретению включает раки, которые характеризуются ненормальной клеточной пролиферацией и отсутствием контактного ингибирования, которые могут быть подтверждены образованием опухоли. Термин охватывает рак, локализованный в опухолях, а также рак, не локализованный в опухолях, такой как, например, раковые клетки, распространяющиеся из опухоли локально путем инвазии или системно путем метастазирования. Теоретически любой тип рака может быть объектом лечения согласно изобретению. Предпочтительно, однако, чтобы рак имел вирусное происхождение."Cancer" according to the invention includes cancers that are characterized by abnormal cell proliferation and lack of contact inhibition, which can be confirmed by the formation of a tumor. The term includes cancer localized in tumors, as well as cancer not localized in tumors, such as, for example, cancer cells spreading from a tumor locally by invasion or systemically by metastasis. Theoretically, any type of cancer can be treated according to the invention. Preferably, however, the cancer is of viral origin.

Наконец, описанные выше векторы могут быть непосредственно применены для генной терапии in vivo. Современные стратегии генной терапии ущербны из-за того, что они не могут опосредовать доставку гена к большому проценту клеток; лишь определенный процент клеток подвергается инфицированию. Это особенно важно в противоопухолевых стратегиях, когда трансдукция гена всей опухолевой популяции является решающей. Путем добавления «вектора» вместе с «хелпером» непосредственно трансдуцированные клетки будут продуцировать вирусные частицы, которые могут инфицировать соседние клетки и, таким образом, способны к высокой и, возможно, полной эффективности трансдукции. В одном осуществлении данного изобретения ретровирус человека (которым мог бы быть HIV или ретротранспозонный элемент) мог бы доставляться в ткань (или клетки in vitro) с помощью «хелперного» конструкта. Клетки, непосредственно содержащие вектор и хелпер, будут продуцировать вирус и будут зависимо от условий упаковывать вектор в вирионы. Данные вирионы будут способны опосредовать высокую эффективность трансдукции соседних клеток (поскольку межклеточные контакты являются наиболее эффективным путем трансдукции клеток). Непосредственно трансдуцированные клетки могут погибать или не погибать, в зависимости от того, приводит ли сочетание вектор/хелпер к цитолитической инфекции. В случае ретротранспозона может не иметься необходимости в содержании в хелпере структурных белков, поскольку нормальные или опухолевые клетки могут содержать белок/фактор, необходимый для инкапсуляции в вирионы. В данном случае хелпер может быть, но не ограничиваясь этим, лишь трансактиваторным белком, который активирует транскрипцию факторов, необходимых для инкапсулирования ретротранспозона. В случае HIV для инкапсулирования генома HIV в вирионы потомства для инфицирования/трансдукции клеток могут, но не обязательно, требоваться другие факторы.Finally, the vectors described above can be directly used for in vivo gene therapy. Current gene therapy strategies are flawed because they cannot mediate gene delivery to a large percentage of cells; only a certain percentage of cells are infected. This is especially important in antitumor strategies, when gene transduction of the entire tumor population is crucial. By adding a "vector" together with a "helper", directly transduced cells will produce viral particles that can infect neighboring cells and are thus capable of high and possibly complete transduction efficiency. In one embodiment of the invention, a human retrovirus (which could be HIV or a retrotransposon element) could be delivered to tissue (or cells in vitro) using a helper construct. Cells directly containing the vector and helper will produce the virus and, depending on the conditions, will pack the vector into virions. These virions will be able to mediate the high efficiency of transduction of neighboring cells (since intercellular contacts are the most effective way of cell transduction). Directly transduced cells may or may not die, depending on whether the vector / helper combination leads to a cytolytic infection. In the case of a retrotransposon, it may not be necessary to contain structural proteins in the helper, since normal or tumor cells may contain the protein / factor necessary for encapsulation in virions. In this case, a helper can be, but not limited to, only a transactivating protein that activates the transcription of factors necessary for the encapsulation of a retrotransposon. In the case of HIV, other factors may, but not necessarily, be required to encapsulate the HIV genome in progeny virions for infection / cell transduction.

Описанные выше векторы могут быть применены для биологической и химической защиты в военных целях. Например, вектор с зависимой от условий репликацией может быть введен индивидууму, недавно инфицированному высоко патогенным вирусом, или бактерией, или химическим агентом (например, токсином). Вектор должен препятствовать репликации патогенного вируса, как описано ранее. Однако вектор с зависимой от условий репликацией может быть также применен в целях бактериальной и химической защиты совместно с хелперным экспрессионным вектором («хелпером»).The vectors described above can be used for biological and chemical protection for military purposes. For example, a conditionally replicated vector can be administered to an individual recently infected with a highly pathogenic virus, or a bacterium, or a chemical agent (e.g., a toxin). The vector should inhibit the replication of the pathogenic virus, as described previously. However, a conditionally replicated vector can also be used for bacterial and chemical protection in conjunction with a helper expression vector (“helper”).

Например, вектор с зависимой от условий репликацией может секретировать антибактериальные или противотоксинные антитела после обеспечения «хелпером» его экспрессии и размножения. «Хелпер» может, но не обязательно, управляться индуцибельным промотором, который обеспечивает его экспрессию при активации бактерией, цитокином (в ответ на бактериальную инфекцию), антибиотиком (как в случае индуцируемых тетрациклином промоторных систем (Paulus et al., J. Virol., 70, 62-67 (1996)) или химическим агентом (например, самим токсином). Таким образом, вектор с зависимой от условий репликацией будет не только селективно размножаться с помощью «хелпера» в ответ на вторжение патогена или токсина (в результате активации хелпера), но и секретировать противопатогенные или противотоксинные антитела для торможения патологических эффектов опухолевого антигена, патогена или химического агента (например, токсина). Таким образом, любой белок, фактор или генетический элемент, который может быть транскрибирован в мРНК и/или белок, может быть вставлен в вектор с зависимой от условий репликацией для торможения патогенного действия - совместно с «хелпером», который способствует его селективному размножению и экспрессии (селективному благодаря тому, что продукты хелпера экспрессируются в зависимости от условий (например, но не ограничиваясь этим, (a) индуцибельная промоторная система - фактор опухолевых клеток активирует продукцию хелперного фактора, чувствительной к токсину последовательности, которая экспрессирует хелперный фактор, или цитокинчувствительный промотор индуцирует продукцию хелперного фактора, (b) хелперные РНК/белок/фактор селективно стабилизируются в одних, но не в других клетках) и (c) непрямая индукция гена третьей стороны, который влияет на хелперный вирусный белок через его продукцию, сопровождение, направление, структуру или другую биологическую функцию). Такие стратегии могут быть применены у трансгенных растений и животных для их защиты от патогенов. Сходным образом такие стратегии могут быть применены в трансгенных системах для получения ценных гетерологичных белков/факторов.For example, a conditionally replicated vector can secrete antibacterial or antitoxin antibodies after the helper has provided for its expression and propagation. A helper may, but not necessarily, be driven by an inducible promoter that provides expression when activated by a bacterium, a cytokine (in response to a bacterial infection), an antibiotic (as is the case with tetracycline-induced promoter systems (Paulus et al., J. Virol., 70, 62-67 (1996)) or by a chemical agent (for example, the toxin itself). Thus, a vector with conditionally dependent replication will not only selectively propagate using a “helper” in response to the invasion of a pathogen or toxin (as a result of helper activation ), but also to secret n rotivopathogenic or antitoxin antibodies to inhibit the pathological effects of a tumor antigen, pathogen or chemical agent (eg, toxin) .Thus, any protein, factor or genetic element that can be transcribed into mRNA and / or protein can be inserted into a dependent vector from replication conditions to inhibit pathogenic effects - together with a “helper”, which contributes to its selective propagation and expression (selective due to the fact that helper products are expressed depending conditions (for example, but not limited to, (a) an inducible promoter system - a tumor cell factor activates the production of a helper factor, a toxin-sensitive sequence that expresses a helper factor, or a cytokine-sensitive promoter induces the production of a helper factor, (b) helper RNA / protein / factor selectively stabilize in one, but not in other cells) and (c) indirect induction of a third-party gene that affects the helper viral protein through its production, maintenance, e.g. Leniye, structure or another biological function). Such strategies can be applied in transgenic plants and animals to protect them from pathogens. Similarly, such strategies can be applied in transgenic systems to produce valuable heterologous proteins / factors.

В другом осуществлении способа согласно настоящему изобретению может быть создана клеточная линия для скрининга лекарства/фактора для определения, например, того, какая часть белка/фактора является важной для конкретной функции. Может быть создан вектор для экспрессии интересующего мутированного белка в данной клеточной линии. РНК, кодирующую мутированный белок, однако, делают устойчивой к рибозиму путем, например, вставки молчащих точечных мутаций. В то же время экспрессия белка дикого типа в клеточной линии ингибируется. Для экспрессии мутантного тестируемого белка могут быть также сконструированы векторы, которые экспрессируют рибозим против интересующего белка. Когда вектор трансдуцируют в клетки, большая часть природной РНК, кодирующей нормальный белок, расщепляется, тогда как мутантный тестируемый белок экспрессируется. Данный способ может быть применен с использованием недавно разработанных способов доставки и селекции в качестве быстрого и действенного способа определения того, как функционирует данный белок и как данный фактор/лекарство взаимодействует с белком.In another embodiment of the method of the present invention, a cell line for screening a drug / factor can be created to determine, for example, which portion of the protein / factor is important for a particular function. A vector can be created to express the mutated protein of interest in a given cell line. RNA encoding a mutated protein, however, is made resistant to ribozyme by, for example, insertion of silent point mutations. At the same time, expression of wild-type protein in the cell line is inhibited. To express the mutant test protein, vectors can also be constructed that express the ribozyme against the protein of interest. When the vector is transduced into cells, most of the natural RNA encoding the normal protein is cleaved, while the mutant test protein is expressed. This method can be applied using recently developed delivery and selection methods as a quick and effective way to determine how a given protein functions and how a given factor / drug interacts with a protein.

В еще одном осуществлении для введения вектора для лечения врожденных заболеваний крови больного подвергают лейкаферезу для извлечения из крови достаточного количества лейкоцитов. После лейкафереза выделяют желаемые клетки, трансдуцируют вектором и размножают в культуре до желаемого количества клеток. Во время размножения желаемого типа клеток ex vivo больному вводят антитела, направленные против белка клеточной поверхности клеток желаемого типа, с целью разрушения данных клеток в период времени, совпадающий с размножением достаточного количества клеток желаемого типа. Трансдуцированные клетки затем обратно вводят больному для компенсации вызванной антителом in vivo утраты клеток.In yet another embodiment, for the administration of a vector for the treatment of congenital blood diseases, a patient is subjected to leukapheresis to extract a sufficient number of white blood cells from the blood. After leukapheresis, the desired cells are isolated, transduced with the vector and propagated in culture to the desired number of cells. During the propagation of the desired cell type ex vivo, the patient is given antibodies directed against the cell surface protein of the desired cell type in order to destroy these cells in a period of time coinciding with the multiplication of a sufficient number of cells of the desired type. The transduced cells are then reintroduced to the patient to compensate for in vivo antibody-induced cell loss.

Предпочтительным средством реализации указанного выше является выделение T-клеток CD4+ из лейкаферезного материала с последующей трансдукцией клеток вектором HIV, который содержит антисмысловую или рибозимную последовательность против HIV, для размножения ex vivo. Во время размножения клеток ex vivo эндогенные T-клетки CD4+ больного разрушают введением, например, антитимоцитного глобулина (ATG) (Pasteur Merieux Serums et Vaccins, Lyon, Франция, распространяемого SangStat Medical Corporation, Menlo Park, CA, США) или Atgam (Upjohn Company, Kalamazoo, MI, США), однако могло бы быть применено любое снижающее количество клеток антитело после подходящего скрининга, который должен быть очевиден для специалиста в данной области техники. После размножения трансдуцированные T-клетки CD4+ затем обратно вводят больному. В предпочтительном осуществлении CD4-негативные клетки, полученные во время выделения CD4-позитивных клеток, сохраняют, замораживают и размораживают для введения в момент введения назад больному трансдуцированных CD4-позитивных клеток.A preferred means of implementing the above is the isolation of CD4 + T cells from leukapheresis material, followed by transduction of the cells with an HIV vector that contains an antisense or ribozyme sequence against HIV for ex vivo propagation. During cell expansion ex vivo, endogenous CD4 + T cells of a patient are disrupted by administration of, for example, antithymocytic globulin (ATG) (Pasteur Merieux Serums et Vaccins, Lyon, France, distributed by SangStat Medical Corporation, Menlo Park, CA, USA) or Atgam (Upjohn Company , Kalamazoo, MI, USA), however, any cell-reducing antibody could be used after suitable screening, which should be apparent to one skilled in the art. After propagation, the transduced CD4 + T cells are then reintroduced into the patient. In a preferred embodiment, the CD4-negative cells obtained during the isolation of CD4-positive cells are stored, frozen and thawed for administration at the time the transduced CD4-positive cells are introduced back to the patient.

Приведенный выше пример не ограничивает объем изобретения ни ATG, ни T-клетками CD4+. Любой тип клеток может быть направленно поражен путем применения антитела, которое связывается с белком клеточной поверхности указанной клетки и является цитоцидным. Антитело могло бы быть введено экзогенно больному, или в организм мог бы быть введен второй вектор, секретирующий антитело. Данный вектор мог бы продуцировать антитело конститутивно (на протяжении жизни клетки), временно (например, но не ограничиваясь этим, с вектором, лишенным интегразы) или индуцибельно (например, но не ограничиваясь этим, с индуцируемой тетрациклином промоторной системой).The above example does not limit the scope of the invention to either ATG or CD4 + T cells. Any type of cell can be directionally affected by the use of an antibody that binds to the cell surface protein of the cell and is cytocidal. The antibody could be administered exogenously to the patient, or a second vector secreting the antibody could be introduced into the body. This vector could produce an antibody constitutively (throughout the life of the cell), temporarily (for example, but not limited to, with a vector lacking integrase) or inducibly (for example, but not limited to, with a tetracycline-induced promoter system).

Существует также множество применений способа и векторов настоящего изобретения in vitro. Например, векторы можно применять для выяснения некоторых нюансов репликации вирусов и рибозимной функции. Сходным образом, содержащие рибозим векторы можно применять в качестве средств диагностики, например, для оценки мутаций, имеющихся в больных клетках, или для проверки генетического дрейфа. Векторы могут быть также применены для определения или подтверждения функции гена в зависимости от того, была ли эта функция известна ранее, является известной или лишь предполагается или допускается. Данное вышеизложенное обсуждение никоим образом не является исчерпывающим в отношении применения настоящего изобретения.There are also many in vitro applications of the method and vectors of the present invention. For example, vectors can be used to elucidate some of the nuances of virus replication and ribozyme function. Similarly, ribozyme-containing vectors can be used as diagnostic tools, for example, to evaluate mutations present in diseased cells, or to test for genetic drift. Vectors can also be used to determine or confirm the function of a gene, depending on whether this function was previously known, is known, or is only assumed or allowed. The foregoing discussion is by no means exhaustive with respect to the application of the present invention.

Преимущества изобретенияAdvantages of the Invention

Преимущества применения стратегии crHIV для генетического терапевтического лечения СПИД и других заболеваний являются значительными. Например, становится решенной проблема направления вектора к клеткам, инфицированным HIV. После трансфекции crHIVs in vivo в инфицированные клетки CD4+ crHIV упаковываются в вирионы потомства с использованием эндогенных белков оболочки инфекционного HIV. Таким образом, РНК crHIV переносится внутри вирионов потомства и инфицирует типы клеток, в норме инфицируемые данным конкретным штаммом HIV, с образованием непатогенных вирионов. Это включает затруднение с направленным лечением клеток, таких как микроглия мозга, которые являются главным резервуаром для инфекции HIV (ВИЧ) в центральной нервной системе. По-видимому, с векторами crHIV, которые инфицируют неинфицированные клетки CD4+, связана слабая токсичность, поскольку вирусные белки не кодируются векторами crHIV. Более того, за счет конкуренции вектора crHIV с HIV дикого типа образуются непатогенные частицы, что приводит к снижению вирусного заражения. Снижение заражения патогенным HIV-1 не только повышает время выживания инфицированных индивидуумов, но и снижает скорость заражения неинфицированных индивидуумов, поскольку частицы crHIV также могут распространяться системно (т.е. как и инфекционный HIV). Сниженное заражение патогенным HIV-1 крови может быть особенно важным для беременных инфицированных HIV (ВИЧ) индивидуумов, поскольку образование crHIV также может снижать передачу HIV-1 от инфицированных матерей их плодам in utero.The benefits of using the crHIV strategy for the genetic therapeutic treatment of AIDS and other diseases are significant. For example, the problem of directing the vector to cells infected with HIV becomes resolved. Following in vivo transfection of crHIVs into infected cells, CD4 + crHIV are packaged into offspring virions using endogenous HIV envelope envelope proteins. Thus, crHIV RNA is carried within the offspring virions and infects cell types normally infected with this particular HIV strain to form non-pathogenic virions. This includes the difficulty with targeted treatment of cells, such as brain microglia, which are the main reservoir for HIV infection in the central nervous system. Mild toxicity appears to be associated with crHIV vectors that infect uninfected CD4 + cells, since viral proteins are not encoded by crHIV vectors. Moreover, due to the competition of the crHIV vector with wild-type HIV, non-pathogenic particles are formed, which leads to a reduction in viral infection. Reducing infection with pathogenic HIV-1 not only increases the survival time of infected individuals, but also reduces the rate of infection of uninfected individuals, since crHIV particles can also spread systemically (i.e., like infectious HIV). Reduced infection with pathogenic HIV-1 blood can be especially important for pregnant HIV-infected individuals (HIV), since the formation of crHIV can also reduce the transmission of HIV-1 from infected mothers to their fetuses in utero.

Смесь плазмидная ДНК/липид, которая может быть применена для введения вектора crHIV в клетку-хозяин, должна быть стабильной и дешевой для получения в обход дорогих стратегий ex vivo. Разумеется, способу изобретения присуща врожденная гибкость, поскольку он мог бы быть также применен для доставки гена ex vivo, если это было бы желательно. Независимо от этого доступность опосредуемого липосомами подхода открывает возможность лечения всей популяции - того, что нереально с современными стратегиями генной терапии. Могут быть также созданы векторы crHIV, которые содержат несколько рибозимов, которые могут быть изготовлены против разных мишеней в геноме HIV. Это снижает возможность мутации и ускользания инфекционного HIV из-под действия рибозимов против HIV. Более того, стратегия вирусов, способных к зависимой от условий репликации, может быть применена для лечения других вирусных инфекций, в особенности таких, при которых оборот вируса является высоким.A plasmid DNA / lipid mixture that can be used to introduce the crHIV vector into a host cell must be stable and cheap to bypass expensive ex vivo strategies. Of course, the method of the invention has inherent flexibility, since it could also be used to deliver ex vivo gene, if desired. Regardless, the availability of a liposome-mediated approach opens up the possibility of treating the entire population - something that is unrealistic with modern gene therapy strategies. CrHIV vectors can also be created that contain several ribozymes that can be made against different targets in the HIV genome. This reduces the possibility of mutation and escape of infectious HIV from the action of ribozymes against HIV. Moreover, a virus strategy capable of conditionally dependent replication can be used to treat other viral infections, especially those in which the turnover of the virus is high.

Особенно полезной особенностью векторов crHIV является то, что их можно применять для экспрессии генетических противовирусных агентов, например рибозима, действующих посттранскрипционно. Так, инфекция векторами crHIV неинфицированных клеток сопровождается низкой токсичностью из-за слабой экспрессии с промотора длинного концевого повтора (LTR) HIV в отсутствие белка Tat. Высокий уровень экспрессии crHIV и его последующей противовирусной активности имеют место только тогда, когда белок Tat обеспечивается комплементацией HIV дикого типа. Таким образом, векторы crHIV предназначены не для зашиты клеток от инфекции HIV, а для снижения общей нагрузки вирусом HIV дикого типа за счет селективной аккумуляции непатогенных частиц crHIV.A particularly useful feature of the crHIV vectors is that they can be used to express genetic antiviral agents, for example, ribozyme, acting post-transcriptionally. Thus, infection with the crHIV vectors of uninfected cells is accompanied by low toxicity due to poor expression from the HIV Long Term Repeat (LTR) promoter in the absence of Tat protein. A high level of expression of crHIV and its subsequent antiviral activity occurs only when Tat protein is provided by complementation of wild-type HIV. Thus, crHIV vectors are not intended to protect cells from HIV infection, but to reduce the total load of wild-type HIV virus due to the selective accumulation of non-pathogenic crHIV particles.

Не желая быть связанными какой-либо конкретной теорией, касающейся действия или функционирования изобретения, заявители полагают, что, как это подтверждено в следующих примерах, рибозимы могут быть применены для придания геномам crHIV селективного преимущества за счет двух полезных свойств: (1) они обладают высокой степенью специфичности, и (2) они обладают относительной эффективностью, которая зависит от их способности к совместной локализации с РНК-мишенями (Cech, Science, 236, 1532-1539 (1987)). Специфичность рибозимов подтверждается их специфичной гибридизацией с комплементарными последовательностями-мишенями, содержащими сайт XUY. Рибозимы относительно эффективны, поскольку они расщепляют РНК-мишени с высокой эффективностью лишь тогда, когда они эффективно локализуются совместно с РНК-мишенями. При смешанной инфекции HIV/crHIV должна иметь место совместная локализация содержащей рибозим РНК crHIV и РНК HIV дикого типа, поскольку геномы РНК HIV димеризуются перед упаковкой в вирионы потомства. Расщепление негеномных форм РНК HIV дикого типа, необходимое для продукции вирусных белков, по-видимому, происходит менее эффективно по сравнению с геномными РНК HIV дикого типа, поскольку негеномные РНК HIV не димеризуются. В описанных здесь экспериментах было обнаружено, что сообщаемое РНК crHIV селективное преимущество обусловлено селективной упаковкой crHIVs в вирусные частицы. Данные результаты позволяют предполагать, что наиболее эффективное расщепление происходит внутриклеточно во время димеризации, что приводит к селективному разрушению РНК HIV дикого типа нуклеазами хозяина. Это обеспечивает преимущественную упаковку РНК crHIV в вирусные частицы.Not wanting to be bound by any particular theory regarding the action or functioning of the invention, the applicants believe that, as confirmed in the following examples, ribozymes can be used to give the crHIV genomes a selective advantage due to two useful properties: (1) they have high degree of specificity, and (2) they have relative efficiency, which depends on their ability to co-localize with RNA targets (Cech, Science, 236, 1532-1539 (1987)). The specificity of ribozymes is confirmed by their specific hybridization with complementary target sequences containing the XUY site. Ribozymes are relatively effective because they cleave RNA targets with high efficiency only when they are effectively localized together with RNA targets. In mixed HIV / crHIV infections, co-localization of the ribozyme-containing crHIV RNA and wild-type HIV RNA must take place, since the HIV RNA genomes dimerize before being packaged into progeny virions. The cleavage of non-genomic forms of wild-type HIV RNA, necessary for the production of viral proteins, appears to be less efficient compared to wild-type HIV genomic RNAs, since non-genomic HIV RNAs do not dimerize. In the experiments described herein, it was found that the reported selective advantage of crHIV RNA is due to the selective packaging of crHIVs into viral particles. These results suggest that the most effective cleavage occurs intracellularly during dimerization, which leads to the selective destruction of wild-type HIV RNA by host nucleases. This provides preferential packaging of crHIV RNA in viral particles.

Применение векторов crHIV для терапии HIV (ВИЧ) может включать не только геномную селекцию crHIV, но и клеточную селекцию клеток, продуцирующих частицы crHIV. В противном случае клетки, продуцирующие HIV дикого типа, продуцировали бы частицы HIV дикого типа с селективным преимуществом по сравнению с клетками, продуцирующими частицы crHIV, и быстро становились бы преобладающими. Селективное преимущество может быть сообщено экспрессирующим crHIV клеткам путем вставки в геномы crHIV гена (например, гена устойчивости ко многим лекарствам), который придает экспрессирующим crHIV клеткам (в присутствии лекарства) преимущество в выживании по сравнению с клетками, экспрессирующими HIV дикого типа. В данных условиях клетки, экспрессирующие HIV дикого типа, постепенно гибнут, но все еще продуцируют некоторое количество HIV дикого типа, а клетки, экспрессирующие crHIV, которые селективно продуцируют crHIV, выживают. Инфицирование клеток, содержащих crHIV, остающимся HIV дикого типа должно приводить к дополнительной продукции вирусных частиц, содержащих crHIV. Таким образом, вирусный геномный сдвиг может приводить к кумулятивному инфицированию клеток CD4+геномами crHIV, что тем самым смещает вирусный баланс у хозяина от патогенного HIV дикого типа к непатогенным геномам crHIV. Такая стратегия может приводить к удалению HIV дикого типа, поскольку баланс между геномами HIV селективно смещается от HIV дикого типа в сторону crHIV. Вирусная репликация постепенно прекращается, поскольку crHIV может реплицироваться только в присутствии геномов хелперного HIV дикого типа. Следовательно, при таких взаимно ограничивающих условиях возможно создание векторов crHIV, которые не только снижают уровень вирусного заражения HIV дикого типа, но и удаляют вирус из инфицированного HIV хозяина.The use of crHIV vectors for the treatment of HIV (HIV) can include not only genomic selection of crHIV, but also cell selection of cells producing crHIV particles. Otherwise, cells producing wild-type HIV would produce wild-type HIV particles with a selective advantage over cells producing crHIV particles and would quickly become dominant. A selective advantage can be conferred on crHIV-expressing cells by inserting into the genome a crHIV gene (e.g., a multi-drug resistance gene) that gives crHIV-expressing cells (in the presence of the drug) an advantage in survival compared to cells expressing wild-type HIV. Under these conditions, wild-type HIV expressing cells die, but still produce some wild-type HIV, and crHIV expressing cells that selectively produce crHIV survive. Infection of cells containing crHIV with remaining wild-type HIV should result in additional production of viral particles containing crHIV. Thus, a viral genomic shift can lead to cumulative infection of CD4 + cells with crHIV genomes, thereby shifting the viral balance in the host from pathogenic wild-type HIV to non-pathogenic crHIV genomes. Such a strategy can lead to the removal of wild-type HIV, since the balance between the HIV genomes selectively shifts from wild-type HIV towards crHIV. Viral replication is phasing out because crHIV can only replicate in the presence of wild-type helper HIV genomes. Therefore, under such mutually limiting conditions, it is possible to create crHIV vectors that not only reduce the level of viral infection of wild-type HIV, but also remove the virus from the HIV-infected host.

Средства полученияMeans of obtaining

Вектор может быть получен с помощью процесса комплементации либо путем применения временной трансфекции геномов вектора и хелпера в клеточную линию, предпочтительно, но не ограничиваясь этим, в хорошо известную клеточную линию 293T; или путем применения клеточной линии для упаковки. Предпочтительно клетку временно трансфицируют при высокой эффективности трансфекции с применением реагента трансфекции, предпочтительно фосфата кальция, электропорации или липидного реагента трансфекции. После того как трансфекция произошла, вектор собирают из супернатанта, предпочтительно, но не ранее чем через 12 часов после трансфекции и не более чем через 7 дней после трансфекции. Вектор может быть необязательно по желанию сконцентрирован высокоскоростным центрифугированием без осаждения или ультрацентрифугированием. Предпочтительными условиями центрифугирования являются приблизительно 5000-12000g, более предпочтительно приблизительно 10000g. Более предпочтительными условиями являются центрифугирование в течение ночи при 4°С.The vector can be obtained using the complementation process or by applying transient transfection of the vector and helper genomes into a cell line, preferably, but not limited to, the well-known 293T cell line; or by using a cell line for packaging. Preferably, the cell is transiently transfected with high transfection efficiency using a transfection reagent, preferably calcium phosphate, electroporation or a lipid transfection reagent. After transfection has occurred, the vector is harvested from the supernatant, preferably, but not earlier than 12 hours after transfection and not more than 7 days after transfection. The vector may optionally be concentrated by high speed centrifugation without precipitation or ultracentrifugation as desired. Preferred centrifugation conditions are approximately 5000-12000g, more preferably approximately 10000g. More preferred conditions are centrifugation overnight at 4 ° C.

Способы очистки вектораVector cleaning methods

Способ 1Method 1

1. Осветление вирусного супернатанта1. Clarification of the viral supernatant

2. Концентрирование ультрафильтрацией2. Concentration by ultrafiltration

3. Диафильтрация с обработкой или без обработки бензоназой3. Diafiltration with or without treatment with benzonase

4. Ионообменная хроматография4. Ion exchange chromatography

5. Хроматография с исключением по размеру или диафильтрация5. Size exclusion chromatography or diafiltration

6. Необязательно концентрирование ультрафильтрацией6. Optional concentration by ultrafiltration

Способ 2Method 2

2. Ионообменная хроматография2. Ion exchange chromatography

3. Диафильтрация или хроматография с исключением по размеру3. Diafiltration or size exclusion chromatography

4. Необязательная обработка бензоназой4. Optional benzonase treatment

Для указанной выше процедуры могут быть применены различные смолы, включая Poros 50HQ от Perseptive Biosystems. Для ультрафильтрации или диафильтрации могут быть применены картриджи из полых волокон, включая картриджи (серия UFP-750) от A/G Technologies.Various resins can be used for the above procedure, including Poros 50HQ from Perseptive Biosystems. For ultrafiltration or diafiltration, hollow fiber cartridges can be used, including cartridges (UFP-750 series) from A / G Technologies.

Средства введенияMeans of Introduction

Согласно изобретению вектор вводят в клетку-хозяин, нуждающуюся в генной терапии вирусной инфекции, как описано ранее. Средства введения включают контактирование хозяина, способного быть инфицированным, с вирусным вектором согласно изобретению. Предпочтительно, чтобы такое контактирование включало любые средства, с помощью которых вектор вводится в клетку-хозяин; способ не зависит от любого конкретного средства введения и не нуждается в таком толковании. Средства введения хорошо известны специалистам в данной области техники и также проиллюстрированы здесь.According to the invention, the vector is introduced into a host cell in need of gene therapy for viral infection, as described previously. Means of administration include contacting a host capable of being infected with the viral vector of the invention. Preferably, such contacting includes any means by which the vector is introduced into the host cell; the method does not depend on any particular means of administration and does not need such an interpretation. Means of administration are well known to those skilled in the art and are also illustrated here.

Соответственно, введение может быть осуществлено, например, либо in vitro (например, в способе генной терапии типа ex vivo), либо in vivo, которое включает применение электропорации, трансформации, трансдукции, конъюгации или трехродительского спаривания, трансфекции, инфицирования, слияния мембран с катионными липидами, высокоскоростной бомбардировки покрытыми ДНК микроснарядами, инкубации с преципитатом фосфат кальция-ДНК, прямой микроинъекции в одиночную клетку и тому подобного. Другие способы также доступны и известны специалистам в данной области техники.Accordingly, the introduction can be carried out, for example, either in vitro (for example, in an ex vivo type gene therapy method) or in vivo, which includes the use of electroporation, transformation, transduction, conjugation or three parents mating, transfection, infection, fusion of membranes with cationic lipids, high-speed bombardment of DNA-coated microprojectiles, incubation with precipitate of calcium phosphate-DNA, direct microinjection into a single cell, and the like. Other methods are also available and known to those skilled in the art.

Предпочтительно, однако, чтобы векторы или рибозимы вводились с помощью катионных липидов, например липосом. Такие липосомы имеются в продаже (например, Lipofectin™, Lipofectamine™ и тому подобное, предоставляемые Life Technologies, Gibco BRL, Gaithersburg, Md). Более того, в настоящем изобретении могут быть использованы липосомы с повышенной переносящей способностью и/или сниженной токсичностью in vivo (например, как рассмотрено в обзоре в патентной заявке PCT no. WO 95/21259). Для введения липосом можно следовать рекомендациям, указанным в патентной заявке PCT no. WO 93/23569. В целом при таком введении состав захватывается большей частью лимфоцитов в течение 8 ч при 37°С с обнаружением более 50% введенной дозы в селезенке через час после внутривенного введения. Сходным образом другие средства доставки включают гидрогели и полимеры с контролируемым высвобождением.Preferably, however, the vectors or ribozymes are introduced using cationic lipids, for example liposomes. Such liposomes are commercially available (e.g., Lipofectin ™, Lipofectamine ™ and the like, provided by Life Technologies, Gibco BRL, Gaithersburg, Md). Moreover, liposomes with increased transference ability and / or reduced toxicity in vivo can be used in the present invention (for example, as discussed in review in PCT patent application no. WO 95/21259). For the administration of liposomes, the recommendations indicated in PCT patent application no. WO 93/23569. In general, with such an introduction, the composition is captured by most of the lymphocytes for 8 hours at 37 ° C with the detection of more than 50% of the administered dose in the spleen one hour after intravenous administration. Similarly, other delivery vehicles include hydrogels and controlled release polymers.

Форма вектора, вводимого в клетку-хозяин, может варьировать в зависимости частично от того, подлежит ли вектор введению in vitro или in vivo. Например, нуклеиновая кислота может быть сомкнута в кольцо, разрезана или линеризована в зависимости от того, подлежит ли вектор внегеномному поддержанию (т.е. в виде автономно реплицируемого вектора), интеграции в виде провируса или профага, временной трансфекции, временной инфекции, как при применении вирусов с дефектной репликацией или с зависимой от условий репликацией, или стабильному включению в геном хозяина посредством событий двойной или одиночной рекомбинации кроссинговера.The shape of the vector introduced into the host cell may vary in part depending on whether the vector is to be introduced in vitro or in vivo. For example, a nucleic acid can be closed in a ring, cut or linearized depending on whether the vector is subject to extragenomic support (i.e., as an autonomously replicable vector), integration in the form of a provirus or prophage, temporary transfection, temporary infection, as in the use of viruses with defective replication or conditionally dependent replication, or stable incorporation into the host genome through double or single crossingover recombination events.

Перед введением хозяину вектор настоящего изобретения может быть составлен в различные композиции для применения в способах терапевтического и профилактического лечения. В частности, вектор может быть выполнен в виде фармацевтической композиции путем сочетания с подходящими фармацевтически приемлемыми носителями или разбавителями и может быть составлен для того, чтобы быть приемлемым для применений у человека или в ветеринарии.Prior to administration to a host, the vector of the present invention can be formulated into various compositions for use in therapeutic and prophylactic treatment methods. In particular, the vector may be formulated as a pharmaceutical composition by combination with suitable pharmaceutically acceptable carriers or diluents, and may be formulated in order to be suitable for human or veterinary use.

Так, композиция для применения в способе настоящего изобретения может включать один или более упомянутых выше векторов, предпочтительно в сочетании с фармацевтически приемлемым носителем. Фармацевтически приемлемые носители хорошо известны специалистам в данной области техники, так же как и подходящие способы введения. Выбор носителя должен определяться отчасти конкретным вектором, а также конкретным способом, применяемым для введения композиции. Специалист в данной области техники также должен понимать, что доступны разные пути введения композиции, и, хотя для введения могут быть применены более одного пути, определенный путь может обеспечить более быструю и более эффективную реакцию по сравнению с другим путем. Соответственно, существует множество подходящих составов композиции настоящего изобретения.Thus, a composition for use in the method of the present invention may include one or more of the above vectors, preferably in combination with a pharmaceutically acceptable carrier. Pharmaceutically acceptable carriers are well known to those skilled in the art, as well as suitable routes of administration. The choice of carrier must be determined in part by the specific vector, as well as by the specific method used to administer the composition. One of ordinary skill in the art should also understand that different routes of administration of the composition are available, and although more than one route can be used for administration, a particular route can provide a faster and more effective reaction compared to the other route. Accordingly, there are many suitable formulations of the composition of the present invention.

Композиция, составленная из вектора настоящего изобретения, отдельно или в сочетании с другими противовирусными соединениями, может быть выполнена в виде состава, пригодного для парентерального введения, предпочтительно внутрибрюшинного введения. Такая композиция может включать водные и неводные изотоничные стерильные растворы для инъекции, которые могут содержать антиоксиданты, буферы, бактериостатики и растворы, которые придают композиции изотоничность с кровью подлежащего лечению реципиента, и водные или неводные стерильные суспензии, которые могут включать суспендирующие агенты, солюбилизаторы, загустители, стабилизаторы и консерванты. Композиции могут быть представлены в форме единицы дозы или множества доз в запаянных контейнерах, таких как ампулы или флаконы, и могут храниться в лиофилизованной форме, для которой требуется лишь добавление стерильного жидкого носителя, например воды для инъекций, непосредственно перед применением. Приготовленные для немедленного применения растворы и суспензии для инъекций могут быть получены из стерильных порошков, гранул и таблеток, как описано здесь.A composition composed of a vector of the present invention, alone or in combination with other antiviral compounds, can be made in the form of a composition suitable for parenteral administration, preferably intraperitoneal administration. Such a composition may include aqueous and non-aqueous isotonic sterile injectable solutions, which may contain antioxidants, buffers, bacteriostats and solutions that make the composition isotonic with the blood of the recipient to be treated, and aqueous or non-aqueous sterile suspensions, which may include suspending agents, solubilizers, thickeners , stabilizers and preservatives. The compositions may be presented in unit dosage form or in multiple doses in sealed containers, such as ampoules or vials, and may be stored in lyophilized form, which only requires the addition of a sterile liquid carrier, such as water for injection, immediately before use. Formulations and suspensions for injection prepared for immediate use may be prepared from sterile powders, granules and tablets, as described herein.

Вектор может храниться в любом подходящем растворе, буфере или в лиофилизованной форме, если это желательно. Предпочтительным буфером для хранения является забуференный фосфатом солевой раствор Дульбекко; забуференный фосфатом солевой раствор Дульбекко, смешанный с 1-50% раствором трегалозы в воде (1:1), предпочтительно 10% раствором трегалозы в воде (1:1), так что конечная концентрация трегалозы равна 5%; забуференный фосфатом солевой раствор Дульбекко, смешанный с 1-50% раствором глюкозы в воде (1:1), предпочтительно 10% раствором глюкозы в воде (1:1), так что конечная концентрация глюкозы равна 5%; солевой раствор, забуференный 20 мМ HEPES, смешанный с 1-50% раствором трегалозы в воде (1:1), предпочтительно 10% раствором трегалозы в воде (1:1), так что конечная концентрация трегалозы равна 5%; забуференный фосфатом солевой раствор Дульбекко, смешанный с 1-50% раствором маннита в воде (1:1), предпочтительно 5% раствором маннита в воде (1:1), так что конечная концентрация маннита равна 2,5%.The vector may be stored in any suitable solution, buffer, or in lyophilized form, if desired. A preferred storage buffer is Dulbecco's phosphate buffered saline; Dulbecco's phosphate buffered saline mixed with a 1-50% solution of trehalose in water (1: 1), preferably a 10% solution of trehalose in water (1: 1), so that the final concentration of trehalose is 5%; Dulbecco's phosphate buffered saline mixed with 1-50% glucose in water (1: 1), preferably 10% glucose in water (1: 1), so that the final glucose concentration is 5%; saline buffered with 20 mM HEPES mixed with a 1-50% solution of trehalose in water (1: 1), preferably a 10% solution of trehalose in water (1: 1), so that the final concentration of trehalose is 5%; Dulbecco's phosphate buffered saline mixed with a 1-50% solution of mannitol in water (1: 1), preferably a 5% solution of mannitol in water (1: 1), so that the final concentration of mannitol is 2.5%.

Композиция, пригодная для перорального введения, может состоять из жидких растворов, таких как эффективное количество соединения, растворенного в разбавителях, таких как вода, солевой раствор или фруктовый сок; капсул, пакетиков или таблеток, каждый из которых содержит заранее определенное количество активного ингредиента в виде твердого вещества или гранул; растворов или суспензий в водной жидкости и эмульсий масла в воде или эмульсий воды в масле. Таблетированные формы могут включать одно или более из лактозы, маннита, кукурузного крахмала, картофельного крахмала, микрокристаллической целлюлозы, камеди, желатина, коллоидного диоксида кремния, кроскармеллозы натрия, талька, стеарата магния, стеариновой кислоты и других наполнителей, красителей, разбавителей, забуферивающих агентов, увлажняющих агентов, консервантов, корригентов и фармакологически совместимых носителей.A composition suitable for oral administration may consist of liquid solutions, such as an effective amount of a compound dissolved in diluents, such as water, saline or fruit juice; capsules, sachets or tablets, each of which contains a predetermined amount of the active ingredient in the form of a solid or granules; solutions or suspensions in an aqueous liquid; and oil-in-water emulsions or water-in-oil emulsions. Tableted forms may include one or more of lactose, mannitol, corn starch, potato starch, microcrystalline cellulose, gum, gelatin, colloidal silicon dioxide, croscarmellose sodium, talc, magnesium stearate, stearic acid and other excipients, colorants, diluents, zabufer moisturizing agents, preservatives, flavoring agents and pharmacologically compatible carriers.

Может быть также изготовлена аэрозольная композиция, пригодная для введения посредством ингаляции. Аэрозольная композиция может быть помещена в приемлемый сжатый движущий газ, такой как дихлордифторметан, пропан, азот и тому подобное.An aerosol composition suitable for administration by inhalation may also be made. The aerosol composition may be placed in a suitable compressed propellant gas such as dichlorodifluoromethane, propane, nitrogen, and the like.

Сходным образом композиция, пригодная для перорального введения, может включать форму лепешек, которые могут включать активный ингредиент в сластях, обычно из сахарозы и камеди или трагаканта; пастилок, включающих активный ингредиент в инертной основе, такой как желатин, или глицерин, или сахароза и камедь; и полосканий для рта, включающих активный ингредиент в подходящем жидком носителе; а также в виде кремов, эмульсий, гелей и тому подобного, содержащих в дополнение к активному ингредиенту такие носители, которые известны в данной области техники.Similarly, a composition suitable for oral administration may include the form of lozenges, which may include the active ingredient in sweets, usually sucrose and gum or tragacanth; lozenges comprising the active ingredient in an inert basis, such as gelatin, or glycerin, or sucrose and gum; and mouthwashes comprising the active ingredient in a suitable liquid carrier; as well as in the form of creams, emulsions, gels and the like, containing, in addition to the active ingredient, such carriers as are known in the art.

Композиции, пригодные для местного нанесения, могут находиться в форме кремов, мазей или лосьонов.Formulations suitable for topical application may be in the form of creams, ointments or lotions.

Композиция для ректального введения может быть представлена в форме суппозитория с подходящей основой, например маслом какао или салицилатом. Композиция, подходящая для влагалищного введения, может быть представлена в виде пессария, тампона, крема, геля, пасты, пены или спрея, содержащих в дополнение к активному ингредиенту такие носители, которые, как известно в данной области техники, являются подходящими. Сходным образом активный ингредиент может быть объединен со смазывающим агентом в качестве покрытия презерватива.The composition for rectal administration may be presented in the form of a suppository with a suitable base, for example cocoa butter or salicylate. A composition suitable for vaginal administration may be presented as a pessary, tampon, cream, gel, paste, foam or spray containing, in addition to the active ingredient, carriers which are known in the art are suitable. Similarly, the active ingredient may be combined with a lubricant as a condom coating.

Доза, вводимая животному, в особенности человеку, в контексте настоящего изобретения должна быть достаточной для оказания терапевтического действия у инфицированного индивидуума в рамках разумного периода времени. Доза должна определяться эффективностью конкретного вектора, применяемого для лечения, тяжести заболевания, а также массой тела и возрастом инфицированного индивидуума. Размер дозы должен также определяться наличием каких-либо побочных эффектов, которые могут сопровождать применение конкретного используемого вектора. Всегда желательно при любой возможности сводить нежелательные побочные эффекты к минимуму.The dose administered to an animal, especially a human, in the context of the present invention should be sufficient to provide a therapeutic effect in an infected individual within a reasonable period of time. The dose should be determined by the effectiveness of the particular vector used for treatment, the severity of the disease, as well as the body weight and age of the infected individual. The size of the dose should also be determined by the presence of any side effects that may accompany the use of the particular vector used. It is always advisable to minimize unwanted side effects whenever possible.

Доза может находиться в виде единицы лекарственной формы, такой как таблетка или капсула. Применяемый здесь термин «единица лекарственной формы» относится к физически дискретным единицам, подходящим в качестве единиц доз для субъектов, являющихся человеком и животным, причем каждая единица содержит предварительно определенное количество вектора, одного или в сочетании с другими противовирусными агентами, рассчитанное в виде количества, достаточного для получения желаемого эффекта, в сочетании с фармакологически приемлемым разбавителем, носителем или наполнителем. Характерные особенности единиц лекарственных форм настоящего изобретения зависят от конкретного применяемого соединения или соединений и эффекта, который должен быть достигнут, а также от фармакодинамики каждого соединения у хозяина. Вводимая доза должна быть «эффективным против вируса количеством» или количеством, необходимым для достижения «эффективного уровня» у отдельного больного.The dose may be in unit dosage form, such as a tablet or capsule. As used herein, the term “dosage unit” refers to physically discrete units suitable as dose units for human and animal subjects, each unit containing a predetermined amount of a vector, alone or in combination with other antiviral agents, calculated as the amount sufficient to obtain the desired effect, in combination with a pharmacologically acceptable diluent, carrier or excipient. The characteristic features of the dosage units of the present invention depend on the particular compound or compounds used and the effect to be achieved, as well as the pharmacodynamics of each compound in the host. The dose administered must be an “effective amount against the virus” or the amount necessary to achieve an “effective level” in an individual patient.

Так как «эффективный уровень» применяют в качестве предпочтительного предела дозирования, действительная доза и схема могут варьировать в зависимости от межиндивидуальных особенностей фармакокинетики, распределения лекарства и метаболизма. «Эффективный уровень» может быть определен, например, как желательный уровень в крови или ткани больного, который соответствует концентрации одного или более вектора(векторов) согласно изобретению, которая ингибирует вирус, такой как HIV, в тесте прогноза клинической противовирусной активности химических соединений. «Эффективный уровень» для соединений настоящего изобретения может также варьировать, когда композиции настоящего изобретения применяют в сочетании с зидовудином или другими известными противовирусными соединениями или их сочетаниями.Since the “effective level” is used as the preferred dosage limit, the actual dose and regimen may vary depending on the interindividual characteristics of the pharmacokinetics, drug distribution and metabolism. An “effective level” can be defined, for example, as the desired level in a patient’s blood or tissue that corresponds to the concentration of one or more of the vector (s) of the invention that inhibits a virus, such as HIV, in a test for predicting the clinical antiviral activity of chemical compounds. The "effective level" for the compounds of the present invention may also vary when the compositions of the present invention are used in combination with zidovudine or other known antiviral compounds or combinations thereof.

Специалист в данной области техники может легко определить подходящую дозу, схему и способ введения для применяемого конкретного состава композиции для достижения желаемого «эффективного уровня» у отдельного больного. Специалист в данной области техники также может легко определить и использовать подходящий индикатор «эффективного уровня» соединений настоящего изобретения с помощью прямого (например, аналитического химического анализа) или непрямого (например, с суррогатными индикаторами вирусной инфекции, такими как p24 или обратная транскриптаза для лечения СПИДа или подобного СПИДу заболевания) анализа подходящих образцов больного (например, крови и/или ткани).One of ordinary skill in the art can easily determine the appropriate dose, schedule, and route of administration for the particular composition used to achieve the desired “effective level” in an individual patient. One of skill in the art can also easily identify and use a suitable indicator of the “effective level” of the compounds of the present invention using direct (eg, analytical chemical analysis) or indirect (eg, surrogate indicators of viral infection, such as p24 or reverse transcriptase for the treatment of AIDS or an AIDS-like disease) analyzing suitable patient samples (e.g., blood and / or tissue).

Затем в отношении определения эффективного уровня у больного для лечения СПИДа или подобного СПИДу заболевания, в частности, существуют подходящие животные модели, и они широко применяются для оценки эффективности in vivo различных протоколов генной терапии против HIV (Sarver et al. (1993b), см. выше). Данные модели включают мышей, обезьян и кошек. Даже хотя данные животные по своей природе не восприимчивы к инфекции HIV, химерные мышиные модели (например, SCID, bg/nu/xid, NOD/SCID, SCID-hu, иммунокомпетентные SCID-hu, BALB/c с удаленным костным мозгом), воссозданные с мононуклеарными клетками периферической крови человека (PBMCs), лимфатическими узлами, фетальной печенью/тимусом или другими тканями, могут быть инфицированы вектором или HIV и применены в качестве моделей патогенеза HIV и генной терапии. Сходным образом может быть применена модель вирус иммунодефицита обезьян (SIV)/обезьяна, так же как и модель вирус иммунодефицита кошачьих (FIV)/кошка.Then, with regard to determining the patient’s effective level for treating AIDS or an AIDS-like disease, in particular, suitable animal models exist and are widely used to evaluate the in vivo efficacy of various anti-HIV gene therapy protocols (Sarver et al. (1993b), see above). These models include mice, monkeys, and cats. Even though these animals are inherently not susceptible to HIV infection, chimeric mouse models (e.g., SCID, bg / nu / xid, NOD / SCID, SCID-hu, immunocompetent SCID-hu, BALB / c with bone marrow removed) recreated with human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs), lymph nodes, fetal liver / thymus, or other tissues, can be infected with a vector or HIV and used as models of HIV pathogenesis and gene therapy. Similarly, the monkey immunodeficiency virus (SIV) / monkey model can be used, as well as the feline immunodeficiency virus (FIV) / cat model.

Данные модели могут быть также использованы для определения безопасности вектора с целью подтверждения возможности применения векторной системы в клинических испытаниях. Важным применением является использование данных животных моделей для исследований биологического распределения. Трансдуцированные клетки, предпочтительно человека, но не ограничиваясь этим, содержащие вектор, вводят животному-модели, не являющемуся человеком, и безопасность вектора определяют по отсутствию генетического материала вектора в ткани животного. Отсутствие генетического материала вектора в ткани животного должно означать, что вектор не реплицируется автономно в отсутствие хелпера или вируса дикого типа и, таким образом, должен рассматриваться как безопасный для клинического применения у человека. Присутствие вектора в отсутствие хелперного вируса или хелперного вектора может рассматриваться как угроза безопасности, если не ожидается, что вектор будет реплицироваться автономно. Однако в том случае, когда ожидается, что векторы будут реплицироваться автономно, необходимо установить другие критерии безопасности, например отсутствие репликации в определенных тканях или уровень репликации у животного. Присутствие или отсутствие вектора может быть определено с помощью ПЦР или FASC-анализом, если тестируемый вектор экспрессирует маркерный ген, который может быть визуализован с помощью FASC, но не ограничивается такими способами определения.These models can also be used to determine the safety of the vector in order to confirm the possibility of using the vector system in clinical trials. An important application is the use of animal models for biological distribution studies. Transduced cells, preferably human, but not limited to containing a vector, are introduced to a non-human model animal, and the safety of the vector is determined by the absence of the genetic material of the vector in the animal tissue. The absence of the genetic material of the vector in animal tissue should mean that the vector does not replicate autonomously in the absence of a helper or wild-type virus and, therefore, should be considered safe for clinical use in humans. The presence of a vector in the absence of a helper virus or helper vector can be considered a security risk if the vector is not expected to replicate autonomously. However, in the case where it is expected that the vectors will replicate autonomously, it is necessary to establish other safety criteria, for example, the absence of replication in certain tissues or the level of replication in the animal. The presence or absence of a vector can be determined by PCR or FASC analysis if the test vector expresses a marker gene that can be visualized using FASC, but is not limited to such determination methods.

Обычно предпочтительно количество вектора, достаточное для достижения концентрации в ткани вводимого рибозима (или вектора), от приблизительно 5 мкг/кг до приблизительно 300 мг/кг массы тела в день, особенно от приблизительно 10 мкг/кг до приблизительно 200 мг/кг массы тела в день. В определенных применениях, например местном, глазном или вагинальном применениях, предпочтительны множественные дневные дозы. Более того, количество доз должно варьироваться в зависимости от средств доставки и конкретного вводимого вектора.Typically, an amount of the vector sufficient to achieve a tissue concentration of the administered ribozyme (or vector) is preferably from about 5 μg / kg to about 300 mg / kg body weight per day, especially from about 10 μg / kg to about 200 mg / kg body weight in a day. In certain applications, for example local, ophthalmic or vaginal applications, multiple daily doses are preferred. Moreover, the number of doses should vary depending on the delivery vehicles and the particular vector being administered.

При лечении некоторых индивидуумов, инфицированных вирусом, может быть желательным применение режима «мега-дозировки», при которой вводится большая доза вектора, дается время, чтобы соединение подействовало, и затем индивидууму вводится подходящий реагент для инактивации активного(ных) соединения(ний). В способе настоящего изобретения лечение (т.е. репликацию вектора, конкурирующую с таковой вируса, от которого лечат) необходимо ограничить. Другими словами, как только уровень, например, HIV снижается, уровень вектора, зависимого от HIV с целью продукции вирионов, должен также снижаться.In the treatment of some individuals infected with the virus, it may be desirable to use a “mega-dosage” regimen in which a large dose of the vector is administered, time is given for the compound to work, and then a suitable reagent is introduced to the individual to inactivate the active compound (s). In the method of the present invention, treatment (i.e., vector replication competing with that of the virus being treated) must be limited. In other words, as soon as the level of, for example, HIV decreases, the level of the HIV dependent vector for the production of virions should also decrease.

Фармацевтическая композиция может содержать также другие фармацевтические компоненты в сочетании с вектором в соответствии с изобретением при применении для терапевтического лечения СПИДа. Данные другие фармацевтические компоненты могут быть применены в их традиционном виде (т.е. в качестве агентов для лечения HIV инфекции), так же как более предпочтительно в способе отбора вирусов crHIV in vivo. Такой отбор, как здесь описано, должен стимулировать распространение HIV с зависимой от условий репликацией и позволять HIV с зависимой от условий репликацией более эффективно конкурировать с HIV дикого типа, что будет неизбежно ограничивать патогенность HIV дикого типа. В частности, предполагается применение антиретровирусного агента, такого как предпочтительно зидовудин. Дополнительные репрезентативные примеры данных дополнительных фармацевтических агентов, которые могут быть применены в дополнение к описанным ранее, включают противовирусные соединения, иммуномодуляторы, иммуностимуляторы, антибиотики и другие агенты и режимы терапии (включающие те, которые известны как альтернативная медицина), которые могут применяться для лечения СПИДа. Противовирусные компоненты включают, но не ограничиваются этим, ddI, ddC, ганцикловир, фторированные дидезоксинуклеотиды, ненуклеозидные аналоги соединений, такие как невирапин (Shih et al., PNAS, 88, 9878-9882 (1991)), производные TIBO, такие как R82913 (White et al., Antiviral Research, 16, 257-266 (1991)) и BI-RJ-70 (Shih et al., Am. J. Med., 90 (Suppl. 4A), 8S-17S (1991)). Иммуномодуляторы и иммуностимуляторы включают, но не ограничиваются этим, различные интерлейкины, CD4, цитокины, препараты антител, трансфузии крови и клеточные трансфузии. Антибиотики включают, но не ограничиваются этим, противогрибковые агенты, антибактериальные агенты и агенты против Pneumocystis carinii.The pharmaceutical composition may also contain other pharmaceutical components in combination with the vector in accordance with the invention when used for the therapeutic treatment of AIDS. These other pharmaceutical components can be used in their traditional form (i.e., as agents for treating HIV infection), as well as more preferably in an in vivo method for selecting crHIV viruses. Such a selection, as described herein, should stimulate the spread of HIV with conditionally dependent replication and allow HIV with conditional replication to more effectively compete with wild-type HIV, which will inevitably limit the pathogenicity of wild-type HIV. In particular, it is contemplated to use an antiretroviral agent, such as preferably zidovudine. Additional representative examples of these additional pharmaceutical agents that can be used in addition to those previously described include antiviral compounds, immunomodulators, immunostimulants, antibiotics, and other agents and treatment regimens (including those known as alternative medicine) that can be used to treat AIDS. . Antiviral components include, but are not limited to, ddI, ddC, ganciclovir, fluorinated dideoxynucleotides, non-nucleoside analogs of compounds such as nevirapine (Shih et al., PNAS, 88, 9878-9882 (1991)), TIBO derivatives such as R82913 ( White et al., Antiviral Research, 16, 257-266 (1991)) and BI-RJ-70 (Shih et al., Am. J. Med., 90 (Suppl. 4A), 8S-17S (1991)) . Immunomodulators and immunostimulants include, but are not limited to, various interleukins, CD4, cytokines, antibody preparations, blood transfusions, and cell transfusions. Antibiotics include, but are not limited to, antifungal agents, antibacterial agents, and anti-Pneumocystis carinii agents.

Введение ингибирующего вирусы соединения с другими противоретровирусными агентами и особенно с известными ингибиторами ОТ, такими как ddC, зидовудин, ddI, ddA, или с другими ингибиторами, которые действуют против других белков HIV, такими как агенты против TAT, должно обычно ингибировать большинство или все репликативные стадии жизненного цикла вируса. Дозировки ddC и зидовудина, применяемые у больных СПИДом или заболеванием, ассоциированным со СПИДом (ARC), опубликованы. Статический для вируса диапазон ddC находится обычно между 0,05 мкМ и 1,0 мкМ. Диапазон в приблизительно 0,005-0,25 мг/кг массы тела является статическим для вирусов у большинства больных. Диапазоны доз для перорального введения являются несколько более широкими, например от 0,001 до 0,25 мг/кг, при приеме в виде одной или более доз с интервалами в 2, 4, 6, 8 и 12 и т.д. час. Предпочтительно, чтобы дозу ddC в 0,01 мг/кг массы тела давали каждые 8 ч. При приеме в виде комбинированной терапии другое противовирусное соединение, например, может быть дано в то же самое время, что и вектор в соответствии с изобретением, или дозирование может по желанию разнесено. Вектор также может сочетаться в композиции. Дозы каждого могут быть меньшими при применении в комбинации, чем когда каждый агент применяют по отдельности.The administration of a virus-inhibiting compound with other antiretroviral agents and especially with known RT inhibitors such as ddC, zidovudine, ddI, ddA, or with other inhibitors that act against other HIV proteins, such as anti-TAT agents, should usually inhibit most or all of the replicative stages of the life cycle of the virus. Dosages of ddC and zidovudine used in patients with AIDS or AIDS-related illness (ARC) have been published. The virus-static ddC range is usually between 0.05 μM and 1.0 μM. A range of approximately 0.005-0.25 mg / kg body weight is static for viruses in most patients. Dosage ranges for oral administration are somewhat wider, for example from 0.001 to 0.25 mg / kg, when taken as one or more doses at intervals of 2, 4, 6, 8 and 12, etc. hour. Preferably, a dose of ddC of 0.01 mg / kg body weight is given every 8 hours. When taken as a combination therapy, another antiviral compound, for example, can be given at the same time as the vector of the invention, or dosing may be spaced at will. Vector can also be combined in composition. Doses of each may be lower when used in combination than when each agent is used separately.

ПримерыExamples

Соединения и способы настоящего изобретения далее описываются в контексте следующих примеров. Данные примеры служат для дополнительной иллюстрации настоящего изобретения и не предназначены для ограничения объема изобретения.The compounds and methods of the present invention are further described in the context of the following examples. These examples serve to further illustrate the present invention and are not intended to limit the scope of the invention.

Пример 1Example 1

В данном примере описывается конструкция векторов, способных к зависимой от условий репликации, в соответствии с изобретением. В частности, в данном примере описывается конструкция векторов с зависимой от условий репликацией на основе HIV (ВИЧ), т.е. векторы crHIV.This example describes the construction of vectors capable of conditionally dependent replication in accordance with the invention. In particular, this example describes the construction of condition-dependent replication vectors based on HIV (HIV), i.e. vectors crHIV.

Одним из наиболее выраженных аспектов патогенеза ВИЧ-1 является образование генетических вариантов вируса. Быстрое образование вариантов ВИЧ in vivo указывает на то, что вирус можно рассматривать в рамках Дарвиновской генетической модели (смотри, например, Coffin, Curr. Top.Microbiol. Immunol., 176, 143-164 (1992); и Coffin, Science, 267, 483-489 (1995)). Варианты возникают в результате неточности работы молекулы обратной транскриптазы HIV-1, которая создает мутации в новых провирусах при транскрипции вирусной геномной РНК. Таким образом, в условиях in vivo при отсутствии существенных ограничений и многочисленных циклах репликации имеют место значительные генетические изменения с образованием многих вариантов вируса. При этом, однако, все еще преобладает HIV дикого типа, поскольку при таких неограничивающих условиях он обладает наибольшим селективным преимуществом. Однако в присутствии ингибитора, например зидовудина, будет отбираться вариант вируса, обладающий большим селективным преимуществом по сравнению со штаммом дикого типа, и вследствие этого он будет преобладать (Coffin (1992) и (1995), выше). На этой основе в настоящем изобретении предлагается стратегия вирусного вектора с зависимой от условий репликацией, которая дает непатогенные геномы HIV-1 с селективным преимуществом по сравнению с патогенным HIV-1 дикого типа.One of the most prominent aspects of the pathogenesis of HIV-1 is the formation of genetic variants of the virus. Rapid in vivo generation of HIV variants indicates that the virus can be considered within the Darwin genetic model (see, for example, Coffin, Curr. Top. Microbiol. Immunol., 176, 143-164 (1992); and Coffin, Science, 267 483-489 (1995)). Variants result from the inaccuracy of the HIV-1 reverse transcriptase molecule, which creates mutations in new proviruses during transcription of viral genomic RNA. Thus, in vivo conditions in the absence of significant restrictions and numerous replication cycles, significant genetic changes occur with the formation of many variants of the virus. However, wild-type HIV still prevails, since under such non-limiting conditions it has the greatest selective advantage. However, in the presence of an inhibitor, such as zidovudine, a variant of the virus will be selected that has a large selective advantage over the wild-type strain, and as a result, it will prevail (Coffin (1992) and (1995) above). On this basis, the present invention provides a viral vector strategy with conditionally dependent replication that yields non-pathogenic HIV-1 genomes with a selective advantage over wild-type pathogenic HIV-1.

Данные непатогенные векторы HIV (crHIV) с зависимой от условий репликацией представляют собой дефектные HIV, которые подвергаются репликации и упаковке только в клетках, инфицированных HIV дикого типа. Геномы crHIV конкурируют с патогенным HIV дикого типа и снижают вызываемое им заражение. Эффект снижения заражения HIV дикого типа у инфицированного хозяина должен вести к повышению вероятности сохранения жизни. Это должно также снижать способность инфицированных хозяев передавать HIV дикого типа неинфицированным индивидуумам. Для успешной конкуренции crHIV с HIV-1 дикого типа, по-видимому, важны два фактора: (1) селективное преимущество геномов crHIV по сравнению с геномами HIV дикого типа, и (2) селективное преимущество клеток, экспрессирующих crHIV, по сравнению с клетками, экспрессируюшими HIV дикого типа, (т.е. селективное преимущество в отношении продукции вирионов crHIV из клеток, экспрессирующих crHIV, по сравнению с клетками, экспрессируюшими HIV дикого типа).These non-pathogenic HIV vectors (crHIV) with conditionally dependent replication are defective HIV that replicate and pack only in cells infected with wild-type HIV. The crHIV genomes compete with wild-type pathogenic HIV and reduce the infection it causes. The effect of reducing wild-type HIV infection in an infected host should increase the likelihood of life being saved. It should also reduce the ability of infected hosts to transmit wild-type HIV to uninfected individuals. Two factors are apparently important for the successful competition of crHIV with wild-type HIV-1: (1) the selective advantage of crHIV genomes compared to wild-type HIV genomes, and (2) the selective advantage of crHIV expressing cells compared to cells expressing wild-type HIV, (i.e., a selective advantage with respect to the production of crHIV virions from cells expressing crHIV compared to cells expressing wild-type HIV).

Векторы crHIV реплицируются в зависимости от условий благодаря тому, что они содержат последовательности, необходимые для экспрессии, димеризации и упаковки РНК, но не экспрессируют функциональные (т.е. дикого типа) белки HIV-1. Селективное преимущество было придано векторам crHIV путем вставки рибозимной кассеты, которая вызывает расщепление в области U5 генома HIV дикого типа, но не U5 РНК crHIV.The crHIV vectors are replicated depending on the conditions due to the fact that they contain the sequences necessary for the expression, dimerization and packaging of RNA, but do not express functional (i.e. wild-type) HIV-1 proteins. A selective advantage was given to the crHIV vectors by inserting a ribozyme cassette that cleaves in the U5 region of the wild-type HIV genome, but not the U5 crHIV RNA.

Имеющиеся в векторах рибозимы не расщепляют РНК crHIV, поскольку область U5 РНК crHIV была модифицирована консервативной заменой оснований (замены оснований, имеющиеся в других штаммах HIV) для предотвращения эффективного связывания и расщепления рибозимами по данным сайтам. Более того, crHIVs являются непатогенными, поскольку они не кодируют белки, которые, как полагают, ответственны за гибель клеток CD4+. Когда инфицированные HIV клетки (предварительно трансфицированные вектором crHIV) активируются, клетки становятся способными комплементировать недостатки генома crHIV, что приводит к образованию вирионного потомства crHIV.The ribozymes present in the vectors do not cleave crHIV RNA, since the crHIV RNA region U5 was modified by a conservative base change (base replacements found in other HIV strains) to prevent effective binding and cleavage of ribozymes at these sites. Moreover, crHIVs are non-pathogenic because they do not encode proteins that are believed to be responsible for the death of CD4 + cells. When HIV-infected cells (previously transfected with the crHIV vector) are activated, cells become able to complement the deficiencies of the crHIV genome, resulting in the formation of virion progeny crHIV.

В целом, геномы crHIV конструировали из полноразмерного инфекционного клона HIV, pNL4-3 (Adachi et al. (1986), см. выше). Все реакции клонирования и манипуляции с ДНК, РНК и белками производили с применением способов, хорошо известных специалистам в данной области техники и которые были описаны, например, в Maniatis et al., Molecular cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed. (Cold Spring Harbor Laboratory, NY (1982)). Ферменты и реагенты, применяемые в данных реакциях, были получены от торговых поставщиков (например, New England Biolabs, Inc., Beverly, Mass.; Clontech, Palo Alto, Calif. и Boehringer Mannheim, Inc., Indianapolis, Ind.) и применялись в соответствии с рекомендациями производителей. Кроме того, поддержание и размножение векторов осуществляли с применением широко известных способов, описанных ранее (например, Dropulic' et al. (1992), см. выше, и Dropulic' et al. (1993), см. выше).In general, crHIV genomes were constructed from a full-length HIV infectious clone, pNL4-3 (Adachi et al. (1986), supra). All cloning reactions and manipulations with DNA, RNA and proteins were performed using methods well known to those skilled in the art and described, for example, in Maniatis et al., Molecular cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed. (Cold Spring Harbor Laboratory, NY (1982)). The enzymes and reagents used in these reactions were obtained from commercial suppliers (e.g., New England Biolabs, Inc., Beverly, Mass .; Clontech, Palo Alto, Calif. And Boehringer Mannheim, Inc., Indianapolis, Ind.) And used in accordance with the recommendations of the manufacturers. In addition, the maintenance and propagation of vectors was carried out using widely known methods described previously (for example, Dropulic 'et al. (1992), see above, and Dropulic' et al. (1993), see above).

PNL4-3 расщепляли с помощью ферментов Pst I (который разрезает в области gag, в положении приблизительно +1000 от старта транскрипции) и Xho I (который разрезает в области nef, в положении приблизительно +8400 от старта транскрипции) и вставляли полилинкер, содержащий подходящие сайты рестрикции. Фрагмент размером 0,86 т.п.н. от Bgl II до Bam HI, содержащий rev-чувствительный элемент (RRE), клонировали в имеющийся в полилинкере Bam HI-сайт. Данные манипуляции привели к делеции в геноме HIV дикого типа, включающей фрагмент от кодирующей gag области до области кодирующей U3 (т.е., таким образом, с делецией и гена nef). Хотя вектор способен продуцировать укороченный транскрипт gag, вектор не продуцирует полноразмерный функциональный белок Gag. Однако поскольку функции Gag дикого типа не являются необходимыми согласно изобретению, последовательности gag могут быть подвержены мутациям для предотвращения трансляции белка Gag.PNL4-3 was digested with the enzymes Pst I (which cuts in the gag region, at a position of approximately +1000 from the start of transcription) and Xho I (which cuts in the nef region, at a position of approximately +8400 from the start of transcription), and a polylinker containing suitable restriction sites. A fragment of 0.86 kbp Bgl II to Bam HI containing a rev-sensitive element (RRE) was cloned into the Bam HI site in the polylinker. These manipulations resulted in a deletion in the wild-type HIV genome, including a fragment from the gag coding region to the U3 coding region (i.e., thus with the deletion and the nef gene). Although the vector is capable of producing a shortened gag transcript, the vector does not produce the full-length functional Gag protein. However, since wild-type Gag functions are not necessary according to the invention, gag sequences may be mutated to prevent translation of the Gag protein.

Рибозимную кассету, содержащую либо один, либо множество рибозимов, как описано здесь, вставляли в Sal I-сайт ниже Bam HI сайта. Для этого синтезировали комплементарные дезоксиолигонуклеотиды, кодирующие последовательности рибозимов, отжигали и затем клонировали в Sal I-сайт. Рибозимы, примененные для конструирования векторов crHIV, являлись рибозимами в форме головки молотка. Данные рибозимы содержали каталитический домен, состоявший из 22 пар оснований, и два домена гибридизации, каждый из которых включал 9 пар оснований. Рибозимы были направлены либо к сайту +115, либо к сайту +133 (т.е. соответственно количеству пар оснований ниже старта транскрипции) последовательности U5 РНК. Домены гибридизации и каталитический домен (подчеркнут) рибозимов, направленных к сайту +115 и сайту +133, были следующими:A ribozyme cassette containing either one or multiple ribozymes, as described herein, was inserted into the Sal I site below the Bam HI site. For this, complementary deoxy oligonucleotides encoding ribozyme sequences were synthesized, annealed, and then cloned into the Sal I site. The ribozymes used to construct the crHIV vectors were hammerhead ribozymes. These ribozymes contained a catalytic domain consisting of 22 base pairs, and two hybridization domains, each of which included 9 base pairs. Ribozymes were directed either to the +115 site or to the +133 site (i.e., corresponding to the number of base pairs below the start of transcription) of the U5 RNA sequence. The hybridization domains and the catalytic domain (underlined) of the ribozymes directed to the +115 site and the +133 site were as follows:

CACACAACACTGATGAGGCCGAAAGGCCGAAACGGGCACA ("рибозим +115") SEQ ID NO:3CACACAACACTGATGAGGCCGAAAGGCCGAAACGGGCACA ("ribozyme +115") SEQ ID NO: 3

ATCTCTAGTCTGATGAGGCCGAAAGGCCGAAACCAGAGTC ("рибозим +133") SEQ ID NO:4ATCTCTAGTCTGATGAGGCCGAAAGGCCGAAACCAGAGTC ("ribozyme +133") SEQ ID NO: 4

Рибозимная кассета была составлена из одного, двух или трех рибозима(ов), расположенных в виде тандема. Векторы, содержащие либо один, либо три рибозима, могут быть легко сконструированы и направлены на один и тот же сайт РНК U5 HIV в положении +115. Векторы, содержащие сдвоенные рибозимы, могут быть легко сконструированы и направлены либо на тот же сайт в положении +115, либо на другие сайты в положениях +115 и +133 РНК U5 HIV.Ribozyme cassette was composed of one, two or three ribozyme (s) arranged in tandem. Vectors containing either one or three ribozymes can be easily constructed and directed to the same HIV U5 RNA site at position +115. Vectors containing double ribozymes can be easily constructed and directed either to the same site at position +115, or to other sites at positions +115 and +133 of HIV U5 RNA.

Для завершения конструирования векторов векторам crHIV придавали устойчивость к расщеплению рибозимами (т.е. при их манифестации в форме РНК) путем мутации сайта, узнаваемого рибозимами в форме головки молотка, находящегося в области U5 генома crHIV. Для этого для введения модифицированных сайтов в вектор применяли двухцепочечный олигонуклеотид (т.е.To complete the construction of vectors, crHIV vectors were rendered resistant to ribozyme cleavage (i.e., when they appear in RNA form) by mutating a site recognized by ribozymes in the form of a hammer head located in the U5 region of the crHIV genome. For this, a double-stranded oligonucleotide (i.e.

AAGCTTGCCTTGAGTGCTCAAAGTAGTGTGTGCCCACCTGTTGTGTGACTCTGGCAGAAGCTTGCCTTGAGTGCTCAAAGTAGTGTGTGCCCACCTGTTGTGTGACTCTGGCAG

CTAGAGATCCCACAGACCCTTTTAGTCAGTGTGGAAAATCTCTAGCAGTGGCGCC SEQ ID NO:13), содержащий замены оснований, описанные на фиг.2 SEQ ID NO:2. В частности, были введены замены оснований в сайты гибридизации и расщепления рибозимов в пары оснований 115 и 133. Конкретно, как показано на фиг.2, были введены мутации в пары оснований 113, 114, 132, 134 и 142. Данные сайты могут быть модифицированы для введения любой мутации (т.е. GTGTGCCCNNCTGTTGTGTGACTCTGGNANCTAGAGANC, где N может быть любым мутантным нуклеотидом SEQ ID NO:14). Предпочтительно, однако, чтобы последовательности мутировали таким образом, чтобы A заменял G в положении +113 (т.е. как в последовательности GTGTGCCCATCTGTTGTGTGACTCTGGTAACTAGAGATC SEQ ID NO:15), U (т.е. T в контексте последовательности ДНК) был заменен на C в сайте +114 SEQ ID NO:5, U (т.е. T в контексте последовательности ДНК) был заменен на C в сайте +132 SEQ ID NO:6, A был заменен на G в сайте +134 (т.е. так, что последовательность включает GTGTGCCCGTCTGTTGTGTGACTCTGGTAGCTAGAGATC SEQ ID NO: 16) и U (т.е. T в контексте последовательности ДНК) был заменен на A в сайте +142, причем данные мутации могут быть осуществлены изолированно или в сочетании. В частности, в отсутствие других мутаций U5 замена U (т.е. T в контексте последовательности ДНК) на C в сайте +114 SEQ ID NO:5 и/или сайте +132 SEQ ID NO:6 в РНК US crHIV предотвращает ее расщепление рибозимами (Uhlenbeck (1987), см. выше). Введенные замены оснований имеются в различных других штаммах HIV (Myers et al., HIV Sequence Database, Los Alamos Nat. Lab. (1994)), что указывает на то, что данные замены не снижают репликативной способности генома HIV.CTAGAGATCCCACAGACCCTTTTAGTCAGTGTGGAAAATCTCTAGCAGTGGCGCC SEQ ID NO: 13) containing the base substitutions described in FIG. 2 of SEQ ID NO: 2. In particular, base replacements were introduced at the hybridization and cleavage sites of ribozymes into base pairs 115 and 133. Specifically, as shown in FIG. 2, mutations were introduced into base pairs 113, 114, 132, 134 and 142. These sites can be modified to introduce any mutation (i.e., GTGTGCCCNNCTGTTGTGTGACTCTGGNANCTAGAGANC, where N may be any mutant nucleotide SEQ ID NO: 14). Preferably, however, the sequences are mutated such that A replaces G at position +113 (i.e., as in the sequence GTGTGCCCATCTGTTGTGTGACTCTGGTAACTAGAGATC SEQ ID NO: 15), U (i.e., T in the context of the DNA sequence) is replaced by C at site +114 SEQ ID NO: 5, U (i.e., T in the context of the DNA sequence) was replaced with C at site +132 SEQ ID NO: 6, A was replaced with G at site +134 (i.e. so that the sequence includes GTGTGCCCGTCTGTTGTGTGACTCTGGTAGCTAGAGATC SEQ ID NO: 16) and U (i.e., T in the context of the DNA sequence) was replaced by A at +142, and these mutations can be carried out by isolating ovanno or in combination. In particular, in the absence of other U5 mutations, replacing U (i.e., T in the context of a DNA sequence) with C at the +114 SEQ ID NO: 5 site and / or the +132 SEQ ID NO: 6 site in US crHIV RNA prevents its cleavage ribozymes (Uhlenbeck (1987), see above). The base substitutions introduced are found in various other HIV strains (Myers et al., HIV Sequence Database, Los Alamos Nat. Lab. (1994)), which indicates that these substitutions do not reduce the replicative ability of the HIV genome.

Представленный здесь способ может быть применен для конструирования других векторов с зависимой от условий репликацией, например, составленных из различных вирусных геномов (например, различных РНК-вирусов) или составленных из различных генетических противовирусных агентов. Более того, вектор с зависимой от условий репликацией может быть дополнительно модифицирован для придания клетке-хозяину, в которую введен вектор, селективного преимущества по сравнению с клеткой-хозяином, содержащей вирус дикого типа. Например, такой вектор может быть модифицирован для дополнительного кодирования устойчивости ко многим лекарствам или мутантной протеазы или обратной транскриптазы.The method presented here can be used to construct other vectors with conditional replication, for example, composed of various viral genomes (eg, various RNA viruses) or composed of various genetic antiviral agents. Moreover, a conditionally replicated vector can be further modified to give the host cell into which the vector is introduced a selective advantage over the host cell containing the wild-type virus. For example, such a vector can be modified to further encode many drug resistance or a mutant protease or reverse transcriptase.

Данные способы, конечно, могут быть также применены для конструирования описанных здесь различных конструктов хелперных векторов.These methods, of course, can also be used to construct the various helper vector constructs described herein.

Пример 2Example 2

В данном примере описана устойчивость к рибозимному расщеплению векторов с зависимой от условий репликацией и, в частности, векторов crHIV.This example describes resistance to ribozyme cleavage of vectors with conditionally dependent replication and, in particular, crHIV vectors.

Для подтверждения устойчивости к рибозимному расщеплению векторов crHIV проводили транскрипцию in vitro. Для этого рибозимные последовательности клонировали в Xho I-сайт pBluescript KSII (Stratagene, La Jolla, Calif.). Bgl II-фрагмент размером 0,21 тысячи пар нуклеотидов (т.п.н.), содержащий мутированную область U5 crHIV, был сходным образом вырезан из вектора crHIV и вставлен в Bam I-сайт pBluescript KSII. Полученные модифицированные векторы pBluescript KSII линеризовали с помощью Bss HII перед транскрипцией in vitro. Сходную плазмиду, экспрессирующую РНК U5 HIV-дикого типа (описанную в Myers et al. (1994), см выше), применяли в качестве контроля. Ее линеризовали с помощью Eco RI перед транскрипцией in vitro.In vitro transcription was performed to confirm resistance to ribozyme cleavage of the crHIV vectors. For this, ribozyme sequences were cloned into the Xho I site of pBluescript KSII (Stratagene, La Jolla, Calif.). The Bgl II fragment of 0.21 thousand nucleotide pairs (kbp) containing the mutated U5 crHIV region was similarly excised from the crHIV vector and inserted into the BB I site of pBluescript KSII. The resulting modified pBluescript KSII vectors were linearized with Bss HII before in vitro transcription. A similar plasmid expressing HIV-wild-type U5 RNA (described in Myers et al. (1994), see above) was used as a control. It was linearized with Eco RI before in vitro transcription.

Радиоактивно меченную РНК U5 HIV и рибозимную РНК получали с помощью транскрипции in vitro векторов, как описано ранее (Dropulic' et al. (1992), см. выше). Радиоактивно меченные транскрипты инкубировали совместно (при молярном отношении мишени к рибозиму 1:2) в буфере 1X для транскрипции, содержащем 40 мМ трис-HCl, pH 7,5, 6 мМ MgCl₂, 2 мМ спермидин и 10 мМ NaCl. Образцы нагревали до 65°С и затем охлаждали до 37°С в течение 5 мин перед добавления останавливающего буфера, содержащего 95% формамид, 20 мМ ЭДТА, 0,05% бромфеноловый синий и 0,05% Xylene Cyanol FF. Затем продукты разделяли с помощью электрофореза в полиакриламидном геле в денатурирующих условиях (PAGE) и определяли авторадиографией.Radioactively labeled HIV U5 RNA and ribozyme RNA were obtained by in vitro transcription of vectors as previously described (Dropulic 'et al. (1992), see above). Radiolabeled transcripts were incubated together (at a 1: 2 molar ratio of target to ribozyme) in 1X transcription buffer containing 40 mM Tris-HCl, pH 7.5, 6 mM MgCl ₂ , 2 mM spermidine and 10 mM NaCl. Samples were heated to 65 ° C and then cooled to 37 ° C for 5 min before the addition of stopping buffer containing 95% formamide, 20 mM EDTA, 0.05% bromophenol blue and 0.05% Xylene Cyanol FF. Then the products were separated by polyacrylamide gel electrophoresis under denaturing conditions (PAGE) and determined by autoradiography.

Когда РНК U5 HIV дикого типа инкубировали с транскриптом, содержащим единственный рибозим к сайту +115, расщепление легко наблюдалось. Такое расщепление давало продукты P1 и P2. Расщепление также наблюдалось при инкубации РНК HIV дикого типа с РНК, содержащими сдвоенные рибозимы, направленные либо на тот же сайт, либо на другие сайты. Когда содержащий рибозим транскрипт, направленный на два различных сайта, инкубировали с РНК HIV дикого типа, образовывались продукты P1, P2 и P3. P3 возникал в результате расщепления по сайту +133.When wild-type U5 HIV RNA was incubated with a transcript containing a single ribozyme to the +115 site, cleavage was easily observed. This cleavage gave products P1 and P2. Cleavage was also observed during incubation of wild-type HIV RNA with RNA containing double ribozymes directed either to the same site or to other sites. When a ribozyme-containing transcript directed to two different sites was incubated with wild-type HIV RNA, products P1, P2 and P3 were formed. P3 arose as a result of cleavage at the site +133.

Напротив, когда инкубировали модифицированную РНК, содержащую U5 crHIV, с либо одним рибозимом, направленным на сайт +115, либо сдвоенным рибозимом, направленным либо на сайт +115, либо на сайт +133, продукты расщепления не обнаруживались. Таким образом, данные результаты подтверждают, что РНК U5 crHIV устойчивы к расщеплению рибозимами, тогда как РНК U5 HIV дикого типа расщепляются анти-US рибозимами. Более того, результаты подтверждают, что подход настоящего изобретения может быть применен для придания векторам с зависимой от условий репликацией (включая векторы, отличные от векторов HIV) селективного преимущества в репликации при введении в клетку-хозяин по сравнению со штаммом вируса дикого типа.In contrast, when a modified RNA containing U5 crHIV was incubated with either one ribozyme directed to the +115 site or a double ribozyme directed either to the +115 site or +133, no cleavage products were detected. Thus, these results confirm that U5 crHIV RNAs are resistant to ribozyme cleavage, while wild-type HIV U5 RNAs are cleaved by anti-US ribozymes. Moreover, the results confirm that the approach of the present invention can be used to give conditionally dependent replication vectors (including vectors other than HIV vectors) a selective replication advantage when introduced into a host cell compared to a wild-type strain of virus.

Пример 3Example 3

В данном примере кратко описаны ключевые стадии получения конструктов хелперных векторов изобретения. Если это специально не указано, последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие различные ретровирусные элементы, получали из общедоступных источников. На всех описанных стадиях требовалось секвенирование полной кодирующей области для всех белков для выявления ошибок и при необходимости прямой коррекции.This example briefly describes the key steps for the preparation of helper vector constructs of the invention. Unless specifically indicated, nucleic acid sequences encoding various retroviral elements were obtained from publicly available sources. At all stages described, sequencing of the complete coding region for all proteins was required to detect errors and, if necessary, direct correction.

Для вырождения последовательности tat и обеспечения ее атаки анти-tat рибозимами плазмиду pTAT подвергали мутагенезу с помощью набора QuickChange от Stratagene для включения сайтов-мишеней для кассеты рибозимов против tat. Затем мутированную последовательность tat клонировали в экспрессионный вектор на основе плазмиды pMG от InvitroGen. Последовательность tat соединяли с IRES по первому ATG с применением NcoI-сайта. Вектор дополнительно модифицировали для включения гена резистентности к ампициллину и старта репликации SV40.To degenerate the tat sequence and ensure that it is attacked with anti-tat ribozymes, the pTAT plasmid was mutagenized using the Stratagene QuickChange kit to include target sites for the anti-tat ribozyme cassette. The mutated tat sequence was then cloned into the pMG plasmid expression vector from InvitroGen. The tat sequence was connected to the IRES at the first ATG using the NcoI site. The vector was further modified to include the ampicillin resistance gene and start SV40 replication.

Последовательности, содержащие элементы rev и RRE HIV-1, были получены вырезанием третьего экзона rev вместе с RRE из pNL4-3 и клонированием в плазмиду pLITMUS38. Последовательность Rev до нуклеотида 208, которая включает второй экзон и часть третьего экзона до BamHI-сайта, была собрана из 3 синтетических нуклеотидов с применением ETR и ПЦР. Продукт ПЦР клонировали в pUC18 и затем субклонировали в pLIT/RRErev3. Две части rev соединяли с помощью набора QuickChange. RRE из HIV-1 заменяли RRE из HIV-2 и оба конструкта клонировали в вектор gag/pol/Rz. Вырожденные последовательности rev также непосредственно применяли для субклонирования в упаковывающий конструкт для таких векторов, как pVIRPac-2.Sequences containing the rev and RRE HIV-1 elements were obtained by excision of the third exon of rev along with RRE from pNL4-3 and cloning into plasmid pLITMUS38. The Rev sequence to nucleotide 208, which includes the second exon and part of the third exon to the BamHI site, was assembled from 3 synthetic nucleotides using ETR and PCR. The PCR product was cloned into pUC18 and then subcloned into pLIT / RRErev3. The two rev parts were connected using the QuickChange kit. HIV-1 RREs were replaced by HIV-2 RREs and both constructs were cloned into the gag / pol / Rz vector. Degenerate rev sequences were also directly used for subcloning into the packaging construct for vectors such as pVIRPac-2.

Для индукции вырождения первых 42 нуклеотидов gag, которые необходимы для упаковки и должны быть частью векторной плазмиды, фрагмент BssHII/SpeI из pNL4-3 субклонировали в pLITMUS38. Вырождение последовательности gag вызывали с помощью набора QuickChange, так что все компоненты сигнала упаковки были ликвидированы, и главный донор сплайсинга HIV был вновь вставлен перед первым кодоном ATG gag. Вырожденный gag субклонировали в плазмиду pNgp, любезно предоставленную Dr. Conde, на место 5' LTR для образования длинной последовательности gag. Данный конструкт все еще содержал последовательности акцептора сплайсинга (SA) и донора сплайсинга (SD), используемые для экспрессии белка vif. Данный сплайсинг может происходить в присутствии рибозимной кассеты в подвергаемой сплайсингу мРНК, что нежелательно из-за возможного расщепления подвергнутой сплайсингу ретровирусной (с зависимой от условий репликацией) векторной РНК и возникающего в результате снижения титра упакованного трансдуцирующего вектора. Для мутирования последовательностей SA и SD применяли перекрывающую ПЦР. Продукт ПЦР вставляли и клонировали в конструкт gag/pol с последующей вставкой рибозимовой кассеты против U5 и элементов rev и RRE.To induce degeneration of the first 42 gag nucleotides, which are necessary for packaging and must be part of a vector plasmid, the BssHII / SpeI fragment from pNL4-3 was subcloned into pLITMUS38. Degeneration of the gag sequence was caused by the QuickChange kit, so that all components of the packaging signal were eliminated and the main HIV splicing donor was reinserted before the first ATG gag codon. The degenerate gag was subcloned into the plasmid pNgp, kindly provided by Dr. Conde, in place of the 5 'LTR to form a long gag sequence. This construct still contained the sequences of the splicing acceptor (SA) and the splicing donor (SD) used to express the vif protein. This splicing can occur in the presence of a ribozyme cassette in the spliced mRNA, which is undesirable due to the possible cleavage of the spliced retroviral vector (depending on the replication conditions) vector RNA and the resulting titer of a packed transducing vector. Overlapping PCR was used to mutate the SA and SD sequences. The PCR product was inserted and cloned into the gag / pol construct followed by insertion of the anti-U5 ribozyme cassette and the rev and RRE elements.

Белок G везикулярного стоматита (VSV-G) клонировали в первый MCS вектора pMG-tat для создания экспрессионной кассеты оболочки. Для упрощения последующих этапов клонирования VSV-G клонировали в виде фрагмента с тупыми концами в Bg1II-сайт, замещенный с помощью полимеразы Кленова. Была создана конструкция со стартом репликации (ori) SV40. Для завершения построения плазмид упаковки в качестве хелперных векторов последовательность rev субклонировали во второй MCS. Полученная плазмида была названа pVIRPAC-2 (смотри фиг.6).Vesicular stomatitis protein G (VSV-G) was cloned into the first MCS of the pMG-tat vector to create an expression cassette for the membrane. To simplify the subsequent cloning steps, VSV-G was cloned as a blunt-ended fragment into the Bg1II site substituted by Klenov polymerase. The SV40 replication start (ori) design was created. To complete the construction of packaging plasmids as helper vectors, the rev sequence was subcloned into the second MCS. The resulting plasmid was named pVIRPAC-2 (see FIG. 6).

Для создания хелперных векторов из некоторых упаковывающих плазмид кассету gag/pol/Rz/RRE/rev субклонировали в плазмиду pMG-tat-G (без SV40 ori). Были получены конструкты с RRE либо из HIV-1, либо из HIV-2 (pVIRPac-1.1 и 1.2Rz на фиг.6). В качестве контроля для тестирования рибозимной функции из конечного содержащего RRE HIV-2 конструкта рибозимная кассета была удалена, что дало pVIRPac-1.2. Наконец, для проверки гипотезы о том, что введение РНК gal/pol в механизм сплайсинга может предотвращать расщепление ретровирусной (с зависимой от условий репликацией) векторной геномной РНК перед сигналом поли-A SV40 был вставлен интрон из β-глобина (pVIRPac-1.2RzIn). Разумеется, в других осуществлениях изобретения вставленный интрон происходит от HIV, предпочтительно полный интрон HIV с подтвержденной способностью направлять РНК в механизм клеточного сплайсинга (например, сплайсосому).To create helper vectors from some packaging plasmids, the gag / pol / Rz / RRE / rev cassette was subcloned into the pMG-tat-G plasmid (without SV40 ori). RRE constructs were obtained from either HIV-1 or HIV-2 (pVIRPac-1.1 and 1.2Rz in FIG. 6). As a control for testing ribozyme function, the ribozyme cassette was removed from the final HIV-2 RRE containing construct, resulting in pVIRPac-1.2. Finally, to test the hypothesis that the introduction of gal / pol RNA into the splicing mechanism can prevent the cleavage of the retroviral (conditionally dependent replication) vector genomic RNA, an β-globin intron (pVIRPac-1.2RzIn) was inserted before the poly-A SV40 signal . Of course, in other implementations of the invention, the inserted intron is derived from HIV, preferably a complete HIV intron with proven ability to direct RNA into the cell splicing mechanism (e.g., spliceosome).

Пример 4Example 4

В данном примере описывается эффективность различных хелперных векторных конструктов. В данных экспериментах применяли стандартные протоколы получения ретровирусных векторов путем преходящей трансфекции. Большие количества плазмидной ДНК получали с применением известных способов. Для получения вируса клетки 293T совместно трансфицировали ретровирусными векторными плазмидами и хелперными векторными плазмидами с помощью кальций-фосфатного способа. Супернатанты клеток собирали через приблизительно 40 ч после трансфекции, фильтровали через 0,45 мкм фильтры для шприца и титровали на клетках HT1080. Титр вектора рассчитывали на основе его трансдуцирующей эффективности, измеренной проточной цитометрией через приблизительно 72 ч после инфицирования. Для вычислений титров применяли условную формулу N*400000*, где N представляет долю трансдуцированных клеток; 400000 является приблизительным количеством клеток во время инфицирования; и F является фактором разведения.This example describes the effectiveness of various helper vector constructs. In these experiments, standard protocols for retroviral vectors by transient transfection were used. Large amounts of plasmid DNA were obtained using known methods. To obtain the virus, 293T cells were co-transfected with retroviral vector plasmids and helper vector plasmids using the calcium phosphate method. Cell supernatants were harvested approximately 40 hours after transfection, filtered through 0.45 μm syringe filters and titrated on HT1080 cells. The titer of the vector was calculated based on its transducing efficiency, measured by flow cytometry approximately 72 hours after infection. To calculate the titers, the conditional formula N * 400000 * was used, where N represents the proportion of transduced cells; 400,000 is the approximate number of cells at the time of infection; and F is a dilution factor.

Для повышения сохранности хелперного вектора путем снижения возможности возникновения RCV при рекомбинации с ретровирусным вектором на основе HIV-1 в некоторые конструкты хелперного вектора вставляли анти-U5 рибозимную кассету. Рибозим был бы должен разрезать и разрушать ретровирусную векторную РНК, если бы происходила совместная упаковка в вирион. Возможно, однако, что рибозим мог бы также расщеплять векторную РНК внутри продуцирующей клетки, что влияло бы на образование вируса. Для дополнительного повышения сохранности хелперные конструкты содержали элемент RRE-2 для дополнительного снижения вероятности совместной упаковки хелпера и вектора в вирусную частицу. Данные хелперы применяли для упаковки вектора pN1(cPT)GFP.To increase the safety of the helper vector by reducing the possibility of RCV occurring upon recombination with an HIV-1-based retroviral vector, an anti-U5 ribozyme cassette was inserted into some helper vector constructs. Ribozyme would have to cut and destroy the retroviral vector RNA if co-packing into virion occurred. It is possible, however, that the ribozyme could also cleave vector RNA inside the producing cell, which would affect the formation of the virus. To further enhance safety, helper constructs contained an RRE-2 element to further reduce the likelihood of a helper and a vector co-packaging into a viral particle. These helpers were used to package the pN1 (cPT) GFP vector.

Как показано на фиг.7, присутствие рибозима на хелперном конструкте оказывало слабое влияние на титр вектора. Важно, что хелперный конструкт (pVirPac1.2RzIn), содержащий интрон для влияния на перемещение в клетке хелперной РНК от векторной РНК, также не оказывал заметного влияния на титр вектора. Титр вектора, индуцированный данной 2-плазмидной системой, сопоставим с титром, полученным с применением традиционных 3-плазмидных систем трансфекции. Сходные эксперименты с хелперным конструктом, содержащим RRE-1, pVirPac1.1, показали приблизительно в 5 раз более низкую эффективность упаковки. Таким образом, включение RRE-2 в конструкт хелперного вектора не только увеличивало его сохранность за счет снижения возможности гомологичной рекомбинации, но также неожиданно повышало эффективность упаковки.As shown in FIG. 7, the presence of the ribozyme on the helper construct had a weak effect on the titer of the vector. It is important that the helper construct (pVirPac1.2RzIn), which contains an intron to influence the movement of helper RNA from vector RNA in the cell, also did not significantly affect the titer of the vector. The titer of the vector induced by this 2-plasmid system is comparable to the titer obtained using traditional 3-plasmid transfection systems. Similar experiments with a helper construct containing RRE-1, pVirPac1.1, showed about 5 times lower packaging efficiency. Thus, the inclusion of RRE-2 in the helper vector construct not only increased its safety by reducing the possibility of homologous recombination, but also unexpectedly increased the packaging efficiency.

Пример 5Example 5

В данном примере проверяли, является ли экспрессия гена MGMT из подвергнутой сплайсингу РНК HIV-LTR достаточной для эффективной селекции трансдуцированных MGMT клеток с BG и BCNU. На фиг.10A показаны примененные векторы. На фиг.10B показаны эффективное выживание и размножение клеток в присутствии гибельных для клеток концентраций BG/BCNU. Буквенные обозначения представляют следующее: M, MGMT; I IRES; G, GFP; W, посттранскрипционный элемент Woodchuck; и C, промотор CMV. Все указанные выше элементы клонировали в вектор pN1 ниже элемента RRE, так что любой ген, расположенный сразу с 3' конца от элемента RRE, должен был бы экспрессироваться с подвергнутой сплайсингу РНК, поскольку акцепторный сайт сплайсинга был помещен непосредственно перед сайтом вставки гена. На фигуре показано, что в то время как контрольные клетки, не трансдуцированные лентивирусным вектором ("CGFP"), не распространялись или выживали, все векторы, экспрессирующие MGMT, выживали и увеличивались в числе.In this example, it was checked whether the expression of the MGMT gene from the spliced HIV-LTR RNA was sufficient to efficiently select transduced MGMT cells with BG and BCNU. 10A shows applied vectors. 10B shows effective cell survival and multiplication in the presence of cell death concentrations of BG / BCNU. The letter designations represent the following: M, MGMT; I IRES; G, GFP; W, Woodchuck post-transcriptional element; and C, CMV promoter. All of the above elements were cloned into the pN1 vector below the RRE element, so that any gene located immediately from the 3 'end of the RRE element would have to be expressed with RNA spliced, since the acceptor splicing site was placed immediately in front of the gene insertion site. The figure shows that while control cells not transduced with the lentiviral vector ("CGFP") did not spread or survive, all vectors expressing MGMT survived and increased in number.

Клетки, трансдуцированные pN1CMIG, погибали через 14 недель, в то время как клетки, трансдуцированные pN1MCG, гибли через 21 неделю. Важно, что клетки, трансдуцированные pN1MIG и pN1MIG-W, оставались живыми после 29 недель, что свидетельствует о длительном выживании клеток, трансдуцированных вектором без вставленного внутреннего промотора.Cells transduced with pN1CMIG died after 14 weeks, while cells transduced with pN1MCG died after 21 weeks. It is important that the cells transduced with pN1MIG and pN1MIG-W remained alive after 29 weeks, which indicates the long-term survival of cells transduced with the vector without an inserted internal promoter.

Неожиданно оказалось, что векторы, экспрессирующие MGMT с подвергнутой сплайсингу мРНК HIV-LTR, отбираются очень эффективно. Экспрессия MGMT не ограничивает объем загружаемых генов MGMT или генами селекции. Данные результаты показывают, что любой ген может быть экспрессирован с промотора HIV-LTR в T-клетках. Сходные данные были получены в клетках, отличных от T-клеток, что показывает, что экспрессия генов с подвергнутой сплайсингу мРНК HIV-LTR могла бы быть применена для экспрессии генов во многих типах клеток.Surprisingly, vectors expressing MGMTs with spliced HIV-LTR mRNA are selected very efficiently. The expression of MGMT does not limit the amount of loaded MGMT genes or selection genes. These results indicate that any gene can be expressed from the HIV-LTR promoter in T cells. Similar data were obtained in cells other than T cells, which shows that gene expression with the spliced HIV-LTR mRNA could be used to express genes in many types of cells.

Кроме того, бицистронная природа конструктов "MIG" показывает, что множество генов может быть экспрессировано после сращивания с помощью IRES. Примеры, выходящие за рамки описанного выше, включают MGMT или другой ген селекции с хемокином, интерфероном или другим генетическим противовирусным агентом.In addition, the bicistronic nature of the MIG constructs indicates that multiple genes can be expressed after splicing using IRES. Examples that go beyond those described above include MGMT or another selection gene with a chemokine, interferon, or other genetic antiviral agent.

Пример 6Example 6

T-клетки CD4+ человека тестировали на их чувствительность к BG и BCNU. Клетки CD4+ с недостаточностью CD14 очищали из периферической крови с или без мобилизации цитокином. Клетки культивировали с 3 мкг/мл PHA и 5 нг/мл ИЛ-2 в течение 4-7 дней перед обработкой BG и BCNU. В подходящих условиях в отсутствие BFG и BCNU клетки CD4+ могут разрастаться 100-кратно на протяжении 10 дней в культуре. Тестированные дозы равнялись 0, 0,2, 0,5, 2, 5, 10, 20, 30 и 40 мкМ BG и 0, 2, 5, 10, 20, 30 и 40 мкМ BCNU. Были проведены серии из трех экспериментов.Human CD4 + T cells were tested for their sensitivity to BG and BCNU. CD4 + cells with CD14 deficiency were purified from peripheral blood with or without cytokine mobilization. Cells were cultured with 3 μg / ml PHA and 5 ng / ml IL-2 for 4-7 days before treatment with BG and BCNU. Under suitable conditions, in the absence of BFG and BCNU, CD4 + cells can grow 100-fold over 10 days in culture. The tested doses were 0, 0.2, 0.5, 2, 5, 10, 20, 30, and 40 μM BG and 0, 2, 5, 10, 20, 30, and 40 μM BCNU. A series of three experiments were conducted.

На фиг.11 показаны типичные результаты указанных выше экспериментов. Разрастание снижалось до 20-кратного после 10 мкМ BG и мкМ BCNU и до 10-кратного или ниже после 20 мкМ или более BCNU. Обработка клеток CD4+ BCNU не приводила к задержке роста. Таким образом, в отличие от клеток SupT1, примененных в указанном выше примере, клетки CD4+ не чувствительны к низкой дозе одного BCNU. Это предполагает большую экспрессию MGMT в первичных клетках CD4+, хотя на основании вариации среди доноров T-клеток можно ожидать вариации в экспрессии MGMT.11 shows typical results of the above experiments. Growth decreased to 20-fold after 10 μM BG and μM BCNU and to 10-fold or lower after 20 μM or more BCNU. Treatment of CD4 + BCNU cells did not result in stunted growth. Thus, unlike SupT1 cells used in the above example, CD4 + cells are not sensitive to a low dose of BCNU alone. This suggests greater expression of MGMT in primary CD4 + cells, although variation in MGMT expression can be expected based on variation among T-cell donors.

Присутствие и BG, и BCNU, каждый в концентрации 10 мкМ или выше, было наилучшим при сенсибилизации клеток CD4+, тогда как BG в концентрации 0,5 мкМ и BCNU в концентрации 15 мкМ или выше сходно повышали чувствительность клеток. Повышение дозы BG не увеличивало гибели клеток, хотя токсичность к клеткам CD4 возрастала с дозой BCNU.The presence of both BG and BCNU, each at a concentration of 10 μM or higher, was best for sensitizing CD4 + cells, while BG at a concentration of 0.5 μM and BCNU at a concentration of 15 μM or higher similarly increased cell sensitivity. Increasing the dose of BG did not increase cell death, although toxicity to CD4 cells increased with a dose of BCNU.

Как показано на фиг.11, уровень селекции в целом возрастал 5-кратно от исходных 20% до 100%. В одном эксперименте селекция возрастала от 3% до >90%. 10-100-кратное разрастание наблюдалось после селекции и одной недели; 20-400-кратное разрастание наблюдалось при 2,5-кратной селекции при средней кратности, равной 80.As shown in figure 11, the level of selection as a whole increased 5-fold from the original 20% to 100%. In one experiment, selection increased from 3% to> 90%. 10-100-fold growth was observed after selection and one week; 20-400-fold overgrowth was observed with 2.5-fold selection with an average multiplicity of 80.

Пример 7Example 7

Предшествующая работа позволяет предполагать корреляцию между очисткой аутотрансплантатов костного мозга и улучшением безболезненного выживания после аутотрансплантации. Удаление нормальных T-клеток из аллотрансплантата было также применено для снижения риска заболевания трансплантат против хозяина. На фиг.13 показана эффективность трансдукции опухолевых клеток в одном раунде трансдукции с применением pN1(cPT)ASenvGFP. Фиг.13B подтверждает, что опухолевые клетки могут быть селективно и эффективно убиты по отношению к стволовым клеткам CD34+, поскольку последние не проявляют значительной трансдукции после одного раунда трансдукции.Previous work suggests a correlation between the purification of bone marrow autografts and improved painless survival after autotransplantation. Removal of normal T cells from an allograft has also been used to reduce the risk of graft versus host disease. On Fig shows the efficiency of transduction of tumor cells in a single round of transduction using pN1 (cPT) ASenvGFP. 13B confirms that tumor cells can be selectively and efficiently killed with respect to CD34 + stem cells, since the latter do not show significant transduction after one round of transduction.

Применение описанного выше для удаления опухолевых клеток из аутотрансплантата костного мозга начинают со сбора костного мозга или сбора стволовых клеток периферической крови. Клетки CD34+ очищают посредством колонки с антителом к CD34 и затем трансдуцируют вектором с зависимой от условий репликацией при MOI от 2 до 400 в течение от 2 до 16 часов. Клетки необязательно инкубируют в присутствии одного или более активирующих клетки факторов, таких как цитокины, либо для содействия трансдукции, либо для поддержания клеток. Клетки затем переносят в подлежащий лечению субъект.The application of the above to remove tumor cells from a bone marrow autograft begins with the collection of bone marrow or the collection of peripheral blood stem cells. CD34 + cells are purified by anti-CD34 antibody column and then transduced with conditionally dependent replication vector at an MOI of 2 to 400 for 2 to 16 hours. Cells are optionally incubated in the presence of one or more cell-activating factors, such as cytokines, either to facilitate transduction or to maintain cells. The cells are then transferred to the subject to be treated.

Способность сходным образом поражать T-клетки в аллотрансплантате применяет векторы с зависимой от условий репликацией в сочетании с высокоэффективным протоколом стабильной трансдукции, таким как имеющийся в параллельно поданной патентной заявке США с порядковым номером (еще не присвоенным), зарегистрированной 31 августа 2000 в качестве заверенной описи 397272000400, для селективной трансдукции T-клеток.The ability to similarly infect T cells in an allograft uses conditionally dependent replication vectors in combination with a highly efficient stable transduction protocol, such as that found in a parallel US patent application with serial number (not yet assigned), registered August 31, 2000 as a certified listing 397272000400, for the selective transduction of T cells.

Пример 8Example 8

На фиг.14, панель B, показано эффективное псевдотипирование векторов HIV-1 изобретения различными белками оболочки. Сходные исходные титры с лентивирусным вектором, псевдотипированным белком оболочки VSV-G, могут быть эффективно увеличены путем очистки с применением либо высокоскоростного центрифугирования, либо диафильтрации. Вектор pN1(cPT2)ASenvGFP упаковывали с pVirPac1.2Rz2. В таблице показаны (a) общий белок в образце, (b) титр вектора в образце и (c) кратность очистки вектора от чужеродного материала в образце.On Fig, panel B, shows the effective pseudotyping of the HIV-1 vectors of the invention by various envelope proteins. Similar starting titers with a lentiviral vector pseudotyped VSV-G envelope protein can be effectively increased by purification using either high speed centrifugation or diafiltration. Vector pN1 (cPT2) ASenvGFP was packaged with pVirPac1.2Rz2. The table shows (a) the total protein in the sample, (b) the titer of the vector in the sample, and (c) the frequency of purification of the vector from foreign material in the sample.

Стадия процессаProcess stage Общий белок, мгTotal protein mg Титр вектора, TU/млTitle vector, TU / ml Очистка (кратность)Cleaning (multiplicity) Начало после осветленияStart after lightening 32073207 5,9×10⁶ 5.9 × 10 ⁶ Не опред.Not identified. КонцентрированиеConcentration 722722 8,2×10⁷ 8.2 × 10 ⁷ 61,761.7 ДиафильтрацияDiafiltration 224224 6,8×10⁸ 6.8 × 10 ⁸ 16501650

Как видно из таблицы, общий белок в образце векторного супернатанта после осветления от обломков клеток равен 3072 мг, а титр вектора на этой стадии равен 5,9×10⁶. Образец затем подвергают концентрированию ультрафильтрацией, и к этому моменту общий белок в этом образце составляет 722 мг, а титр вектора возрастает до 8,2×10⁷ при 61,7-кратной очистке. После концентрирования ультрафильтрацией образец подвергают диафильтрации, и к этому моменту общий белок в образце дополнительно снизился до 224 мг, тогда как титр вектора увеличился до 6,8×10⁸ на мл, что соответствует 1650-кратной очистке. Это показывает, что невекторный чужеродный белок может быть удален, и лентивирусный вектор, который псевдотипируется с VSV-G, может быть очищен с применением описанного выше протокола.As can be seen from the table, the total protein in the vector supernatant sample after clarification from cell debris is 3072 mg, and the titer of the vector at this stage is 5.9 × 10 ⁶ . The sample is then concentrated by ultrafiltration, and at this point the total protein in this sample is 722 mg, and the titer of the vector increases to 8.2 × 10 ⁷ with 61.7-fold purification. After concentration by ultrafiltration, the sample was diafiltered, and by this time, the total protein in the sample was further reduced to 224 mg, while the titer of the vector had increased to 6.8 × 10 ⁸ per ml, which corresponded to 1650-fold purification. This indicates that a non-vectorial foreign protein can be removed and the lentiviral vector that is pseudotyped with VSV-G can be purified using the protocol described above.

Описанное выше может быть также применено в сочетании с векторами, продуцированными в линии клеток HeLa-tat, дающей титры приблизительно 10¹⁰, как показано на фиг.16.The above can also be used in combination with vectors produced in a HeLa-tat cell line giving titers of approximately 10 ¹⁰ , as shown in FIG. 16.

Пример 9Example 9

Альтернативные хелперные конструкты для псевдотипирования векторов с зависимой от условий репликацией были разработаны путем постановки экспрессии VSV-G под зависимый от Rev контроль. Поскольку содержащие RRE мРНК не экспрессируются в отсутствие Rev, было предположено, что они дефективны из-за наличия репрессорных цис-последовательностей (CRS), находящихся в генах gag/pol, pol и env. Сообщалось, что CRS улавливает мРНК в ядре, дестабилизирует мРНК или предотвращает ассоциацию мРНК с рибосомами. Таким образом, присутствие CRS и Rev, расположенных в транс-положении, в сочетании со сплайсингом мРНК может быть применено для получения регулируемой экспрессии гена.Alternative helper constructs for pseudotyping vectors with conditionally dependent replication have been developed by placing the expression of VSV-G under Rev-dependent control. Since RRE-containing mRNAs are not expressed in the absence of Rev, it was suggested that they are defective due to the presence of repressor cis sequences (CRS) located in the gag / pol, pol, and env genes. It has been reported that CRS traps mRNA in the nucleus, destabilizes mRNA, or prevents the association of mRNA with ribosomes. Thus, the presence of CRS and Rev located in the trans position, in combination with splicing of mRNA, can be used to obtain regulated gene expression.

Систему Rev/RRE/CRS использовали для контроля экспрессии VSV-G зависимым от Rev образом. Хелперные конструкты для данного подхода содержат 5'донорный сайт сплайсинга; RRE HIV-2 и 3'акцепторный сайт сплайсинга (предпочтительно для tat/rev); фрагмент CRS из области pol HIV-2 для снижения вероятности рекомбинации с основанными на HIV-1 векторами; и необязательно неиндуцибельный промотор, такой как немедленный ранний (IE) промотор CMV, вместо любых индуцибельных промоторов. РНК, кодирующие VSV-G, образующиеся в отсутствие индукции, продолжают оставаться регулируемыми благодаря присутствию Rev, поскольку лишь не подвергнутые сплайсингу РНК могут быть экспортированы и экспрессированы в цитоплазме без Rev. Экспрессия VSV-G остается опосредуемой Rev, поскольку Rev препятствует ядерной задержке транскриптов, контролируемых сплайсингом мРНК и CRS.The Rev / RRE / CRS system was used to control the expression of VSV-G in a Rev dependent manner. Helper constructs for this approach contain a 5 'donor splicing site; HIV-2 RRE and the 3 'acceptor splicing site (preferably for tat / rev); a CRS fragment from the pol region of HIV-2 to reduce the likelihood of recombination with HIV-1 based vectors; and an optionally non-inducible promoter, such as the immediate early (IE) CMV promoter, instead of any inducible promoters. RNAs encoding VSV-G generated in the absence of induction continue to be regulated due to the presence of Rev, since only non-spliced RNAs can be exported and expressed in cytoplasm without Rev. The expression of VSV-G remains mediated by Rev since Rev inhibits nuclear retention of transcripts controlled by mRNA and CRS splicing.

Предпочтительно, чтобы донорный сайт сплайсинга не был синтетическим 5' донорным сайтом сплайсинга β-глобина, а был нативным донорным сайтом сплайсинга HIV или аналога HIV. RRE HIV-2 представляет собой фрагмент из 280 п.н., содержащий и RRE HIV-2, и акцепторный сайт сплайсинга для Tat/Rev; а CRS является внутренним фрагментом размером 550 п.н. из последовательности pol HIV-2. Элементы CRS и RRE из HIV-2 могут быть получены с помощью ПЦР. Неограничивающие примеры таких хелперных конструктов включают pCGCRSRRE, pCGCRSRzRRE и другие, показанные на фиг.15A-15E. Конечные плазмидные конструкты были подтверждены расщеплением множеством ферментов рестрикции. Хотя pEH-GP и pCMV-GP являются конструктами, которые конститутивно экспрессируют полипротеин gag-pol, могут быть применены другие промоторы, включая лентивирусный промотор или промотор HIV, если это желательно.Preferably, the donor splicing site is not a synthetic 5 'donor β-globin splicing site, but is a native donor splicing site of HIV or an HIV analogue. HIV-2 RRE is a 280 bp fragment containing both HIV-2 RRE and a splice acceptor site for Tat / Rev; and CRS is an internal fragment of 550 bp from the sequence pol HIV-2. Elements of CRS and RRE from HIV-2 can be obtained by PCR. Non-limiting examples of such helper constructs include pCGCRSRRE, pCGCRSRzRRE, and others shown in FIGS. 15A-15E. Final plasmid constructs were confirmed by cleavage by a variety of restriction enzymes. Although pEH-GP and pCMV-GP are constructs that constitutively express gag-pol polyprotein, other promoters can be used, including the lentiviral promoter or the HIV promoter, if desired.

На фиг.17 показаны результаты, полученные при применении различных комбинаций доноров сплайсинга для зависимой от Rev экспрессии VSV-G. Как показано, удаление тетрациклина приводит к зависимой от Rev экспрессии.17 shows the results obtained using various combinations of splicing donors for Rev dependent VSV-G expression. As shown, the removal of tetracycline leads to Rev-dependent expression.

Дополнительные примеры сочетаний донорных сайтов сплайсинга, а также консенсусная последовательность приведены ниже. Хотя все они могут быть использованы, сочетания доноров сплайсинга главного HIV, HIV-1 env, главного HIV-2 и аналога являются предпочтительными.Additional examples of combinations of donor splicing sites, as well as the consensus sequence are given below. Although all of them can be used, combinations of splicing donors of major HIV, HIV-1 env, major HIV-2 and analogue are preferred.

Консенсусный донор сплайсинга:Consensus Splicing Donor: NNNNAGGTAAGTNNNNNNNAGGTAAGTNNN SEQ ID NO: 7SEQ ID NO: 7 Донор сплайсинга бета-глобина:Beta globin splicing donor: NGGGCAGGTAAGTATNGGGCAGGTAAGTAT SEQ ID NO: 8SEQ ID NO: 8 Главный донор сплайсинга HIV:The main donor of splicing HIV: NNGACTGGTGAGTANNNGACTGGTGAGTAN SEQ ID NO: 9SEQ ID NO: 9 Донор сплайсинга HIV-1 env:Splicing donor HIV-1 env: AAAGCAGTAAGTAGTAAAGCAGTAAGTAGT SEQ ID NO: 10SEQ ID NO: 10 Донор сплайсинга HIV-2 env:Splicing donor HIV-2 env: AGACAAGTGAGTAAGAGACAAGTGAGTAAG SEQ ID NO: 11 SEQ ID NO: 11 Главный донор сплайсинга HIV-2:The main donor of splicing HIV-2: NNGAAGGTAAGTGCNNNGAAGGTAAGTGCN SEQ ID NO: 12SEQ ID NO: 12 Донор сплайсинга аналога:Donor splicing analogue: CTTCAGGGTGAGTTNNCTTCAGGGTGAGTTNN SEQ ID NO: 13SEQ ID NO: 13

Пример 10Example 10

Для выявления подходящих условий для хранения векторов перед применением было проверено множество буферов для хранения и условий. Результаты показаны на фиг.18. Возможность хранить векторы при -20°С в фармацевтически приемлемом буфере без значительного снижения выхода вектора должно быть огромным достижением в сохранении векторов перед применением. Разумеется, хранение векторов при приблизительно -80°С, приблизительно -20°С и приблизительно 4°С в других фармацевтически приемлемых композициях также может быть легко осуществлено на практике.To identify suitable conditions for storing vectors, many storage buffers and conditions were tested before use. The results are shown in FIG. The ability to store vectors at -20 ° C in a pharmaceutically acceptable buffer without significantly reducing the yield of the vector should be a huge achievement in preserving the vectors before use. Of course, storing the vectors at about −80 ° C., about −20 ° C., and about 4 ° C. in other pharmaceutically acceptable compositions can also be easily practiced.

Пример 11Example 11

В данном примере описана аминокислотная последовательность гибридного эпитопа ЦТЛ ВИЧ для практического применения изобретения. Последовательность (SEQ ID NO: 18) содержит первый метионин (M) для инициации трансляции, сопровождаемый различными смежными последовательностями, соответствующими p17, p24, p15, Pol, Rev, gp120env, gp41env и nef соответственно.This example describes the amino acid sequence of a hybrid HIV CTL epitope for the practical use of the invention. The sequence (SEQ ID NO: 18) contains the first methionine (M) to initiate translation, followed by various contiguous sequences corresponding to p17, p24, p15, Pol, Rev, gp120env, gp41env and nef, respectively.

Пример 12Example 12

В данном примере предлагается краткое изложение осуществлений изобретения, как описано выше. Изобретение включает вирусный вектор с зависимой от условий репликацией, включающий ген (или другую нуклеиновую кислоту), подлежащий экспрессии, и одну или более первых нуклеотидных последовательностей, где вектор (a) реплицируется в клетке-хозяине лишь при комплементации штаммом вируса дикого типа, хелперным вирусом или хелперным вектором, каждый из которых чувствителен к присутствию указанных одной или более первых нуклеотидных последовательностей; (b) устойчив к присутствию указанных одной или более первых нуклеотидных последовательностей; и (c) содержит одну или более замен, вставок или делеций, что снижает вероятность возникновения способного к репликации вектора.This example provides a summary of embodiments of the invention as described above. The invention includes a conditionally replicating viral vector, comprising a gene (or other nucleic acid) to be expressed, and one or more of the first nucleotide sequences, where vector (a) is replicated in the host cell only when complemented by a wild-type strain of helper virus or a helper vector, each of which is sensitive to the presence of said one or more first nucleotide sequences; (b) resistant to the presence of said one or more first nucleotide sequences; and (c) contains one or more substitutions, insertions, or deletions, which reduces the likelihood of a replicable vector.

Для снижения вероятности возникновения способного к репликации вектора в изобретении предлагаются векторы, содержащие вырожденные последовательности в отношении одной или более последовательностей хелперного конструкта, состава нуклеиновой кислоты клетки-хозяина или других нуклеиновых кислот. Кроме того, предлагаются хелперные конструкты для применения в сочетании с такими векторами для их упаковки. Такие хелперные конструкты могут также содержать вырожденные последовательности в отношении одной или более последовательностей вектора, состава нуклеиновой кислоты клетки-хозяина или других нуклеиновых кислот.To reduce the likelihood of a replicable vector, the invention provides vectors containing degenerate sequences for one or more helper construct sequences, the nucleic acid composition of a host cell, or other nucleic acids. In addition, helper constructs for use in conjunction with such vectors for packaging are provided. Such helper constructs may also contain degenerate sequences in relation to one or more vector sequences, the nucleic acid composition of the host cell or other nucleic acids.

Векторы изобретения могут также содержать одну или более последовательностей, которые направлены на хелперный конструкт. Такие последовательности включают генетические противовирусные агенты и предпочтительно являются рибозимами или антисмысловыми нуклеиновыми кислотами (или кодируют их). Предпочтительные рибозимы и антисмысловые последовательности способны к формированию комплементарных пар оснований со своими соответствующими мишенями посредством спаривания оснований G-U в дополнение к стандартному спариванию оснований A-T, A-U и G-C. Сходным образом хелперные конструкты изобретения могут также содержать тот же тип последовательностей, направленных на вектор.The vectors of the invention may also contain one or more sequences that are directed to a helper construct. Such sequences include genetic antiviral agents and are preferably (or encode) ribozymes or antisense nucleic acids. Preferred ribozymes and antisense sequences are capable of forming complementary base pairs with their respective targets by G-U base pairing in addition to standard A-T, A-U and G-C base pairing. Similarly, helper constructs of the invention may also contain the same type of sequences directed to the vector.

Хелперные векторы изобретения могут также содержать одну или более последовательностей, которые влияют на локализацию или перемещение в клетке экспрессируемых хелпером РНК по сравнению с вектором. Например, хелперные векторы могут содержать интрон, гетерологичный RRE по сравнению с вектором или гетерологичную последовательность gag по сравнению с вектором. Хелперные векторы могут также содержать вырожденную последовательность(последовательности) gag и/или pol по сравнению с вектором, в результате чего совместная локализация хелперных и векторных РНК является менее вероятной. Хелперные векторы могут также содержать донорные сайты сплайсинга, в результате чего сигналы (последовательности) упаковки и RRE удаляются из РНК для предотвращения их совместной локализации с векторными РНК. Такие донорные сайты сплайсинга могут также иметься в хелперных векторах для индукции дифференцированного перемещения вектора по сравнению с хелперным вектором или вирусами дикого типа.The helper vectors of the invention may also contain one or more sequences that affect the localization or movement of helper expressed RNAs in the cell compared to the vector. For example, helper vectors may contain an intron heterologous to RRE compared to a vector, or a heterologous gag sequence compared to a vector. Helper vectors may also contain a degenerate sequence (s) of gag and / or pol compared to the vector, as a result of which the joint localization of helper and vector RNAs is less likely. Helper vectors can also contain splicing donor sites, as a result of which the packaging signals and sequences of RRE are removed from RNA to prevent their joint localization with vector RNAs. Such donor splicing sites can also be present in helper vectors to induce differentiated vector movement compared to helper vectors or wild-type viruses.

Хелперные векторы изобретения могут быть также способны псевдотипировать векторы изобретения. Типичные примеры включают VSV-G, RD114, вирус бешенства, GALV и гибридные белки оболочки. Хелперные векторы изобретения также предпочтительно берут свое начало от гетерологичного вируса в отношении вектора. Примером являются хелперные векторы, происходящие от HIV-2. Способы изобретения включают применение таких хелперных векторов для репликации векторов изобретения.Helper vectors of the invention may also be capable of pseudotyping the vectors of the invention. Typical examples include VSV-G, RD114, rabies virus, GALV, and hybrid envelope proteins. The helper vectors of the invention also preferably originate from a heterologous virus with respect to the vector. An example is helper vectors derived from HIV-2. The methods of the invention include the use of such helper vectors for replicating the vectors of the invention.

Типичные векторы изобретения включают векторы серий pN1 и pN2, показанные на фиг.1A-1K, в особенности с удаленными или замененными последовательностями GFP. Предпочтительно, чтобы векторы сохраняли, по меньшей мере, антисмысловую последовательность и содержащую cPT последовательность. Типичные хелперные конструкты изобретения включают конструкты серии pVirPac, как показано на фиг.6A-6G, с рибозимами или без них.Typical vectors of the invention include pN1 and pN2 series vectors shown in FIGS. 1A-1K, in particular with deleted or replaced GFP sequences. It is preferred that the vectors retain at least the antisense sequence and the cPT sequence. Typical helper constructs of the invention include constructs of the pVirPac series, as shown in FIGS. 6A-6G, with or without ribozymes.

Все векторы и хелперы изобретения могут быть вырожденными, как описано выше, или в других частях конструктов, как это необходимо. Предпочтительная вырожденность касается кодонов, предпочтительно используемых в клетках человека. Векторы и хелперы могут быть также гибридными по своей природе, такими что они происходят от различных естественно существующих, а также синтетических нуклеиновых кислот. Предпочтительные гибридные конструкты содержат последовательности и HIV-1, и HIV-2. Однако особенно предпочтительными векторами являются производные HIV-1 или кодирующие белок Tat HIV-1. В противоположном варианте векторы не кодируют белок Tat, который обеспечивается хелперным вектором, вирусом дикого типа или клеткой-хозяином.All vectors and helpers of the invention may be degenerate, as described above, or in other parts of the constructs, as necessary. Preferred degeneracy relates to codons, preferably used in human cells. Vectors and helpers can also be hybrid in nature, such that they come from various naturally occurring as well as synthetic nucleic acids. Preferred hybrid constructs contain the sequences of both HIV-1 and HIV-2. However, particularly preferred vectors are HIV-1 derivatives or HIV-1 Tat coding for protein. Alternatively, the vectors do not encode Tat protein, which is provided by a helper vector, wild-type virus, or a host cell.

Векторы изобретения также предпочтительно не кодируют или не экспрессируют вспомогательные вирусные белки. Векторы могут также включать нуклеиновую кислоту, которая снижает, минимизирует или предотвращает вирусную инфекцию при ее наличии в клетке-хозяине или придает указанной клетке устойчивость к токсичным агентам. Примеры таких нуклеиновых кислот включают белок клеточной поверхности или укороченный белок CCR5, предпочтительно белок CCR5Δ32T. Другие примеры включают нуклеиновые кислоты, кодирующие устойчивость к лекарствам или повреждающий ДНК агент, предпочтительно устойчивость ко многим лекарствам или вариант MGMT, в особенности вариант G156A. Дополнительные примеры включают нуклеиновые кислоты, кодирующие трансдоминантный фенотип. Типичным примером является последовательность трансдоминантного gag HIV-1.The vectors of the invention also preferably do not encode or express auxiliary viral proteins. The vectors may also include nucleic acid, which reduces, minimizes, or prevents viral infection when present in the host cell or confers resistance to toxic agents on said cell. Examples of such nucleic acids include a cell surface protein or a truncated CCR5 protein, preferably a CCR5Δ32T protein. Other examples include nucleic acids encoding drug resistance or a DNA damaging agent, preferably multi-drug resistance or an MGMT variant, especially variant G156A. Additional examples include nucleic acids encoding a transdominant phenotype. A typical example is the sequence of the transdominant gag HIV-1.

Векторы изобретения также могут содержать последовательности для помощи в экспрессии гетерологичной последовательности. Типичным примером служит последовательность изолятора. Векторы также могут содержать последовательность, которая улучшает трансдукцию вектора в клетки. Типичным примером является последовательность из 545 пар нуклеотидов, содержащая описанный выше cPT, хотя могут быть применены также меньшие или большие фрагменты, содержащие cPT. Векторы могут также содержать LTR для экспрессии генов, а также нуклеиновые кислоты, включающие LTR, модифицированные по локализованным в них транскрипционным сайтам связывания. Предпочтительно, чтобы такие модифицированные LTR содержались в лентивирусных векторах. Способы изобретения включают применение таких векторов.The vectors of the invention may also contain sequences to aid in the expression of a heterologous sequence. A typical example is the sequence of an insulator. The vectors may also contain a sequence that improves the transduction of the vector into cells. A typical example is a sequence of 545 nucleotides containing the cPT described above, although smaller or larger fragments containing cPT can also be used. Vectors can also contain LTRs for gene expression, as well as nucleic acids, including LTRs, modified at their localized transcriptional binding sites. Preferably, such modified LTRs are contained in lentiviral vectors. Methods of the invention include the use of such vectors.

Векторы изобретения могут также экспрессировать, по меньшей мере, два гена с использованием подходящим образом расположенных сайтов сплайсинга или элементов IRES. Векторы могут быть также упакованы в вирусные частицы с одним или более гибридными белками оболочки, которые стимулируют мишень или клетку-хозяин для трансдукции. Кроме того, векторы могут быть упакованы в клетках, где хелпером является белок, или хелпер содержит систему Rev/RRE/CRS для регуляции генной экспрессии. Способы изобретения включают применение таких векторов.The vectors of the invention can also express at least two genes using suitably located splicing sites or IRES elements. The vectors can also be packaged in viral particles with one or more hybrid envelope proteins that stimulate the target or host cell for transduction. In addition, the vectors can be packaged in cells where the helper is a protein, or the helper contains a Rev / RRE / CRS system for regulating gene expression. Methods of the invention include the use of such vectors.

Векторы изобретения могут быть также применены для индукции селективной гибели трансдуцированных клеток в сочетании с вводимым агентом, который в нормальных условиях не является токсичным для нетрансдуцированных клеток. Предпочтительно, чтобы такие векторы действовали путем образования молекулы нуклеиновой кислоты, а не белка. Типичным примером является образование антисмысловой последовательности против MGMT или молекула рибозимной нуклеиновой кислоты. Способы изобретения включают применение таких векторов.The vectors of the invention can also be used to induce selective death of transduced cells in combination with an administered agent, which under normal conditions is not toxic to non-transduced cells. Preferably, such vectors act by forming a nucleic acid molecule rather than a protein. A typical example is the formation of an antisense sequence against MGMT or a ribozyme nucleic acid molecule. Methods of the invention include the use of such vectors.

В изобретении также предлагаются способы хранения векторов изобретения.The invention also provides methods for storing the vectors of the invention.

Все цитированные здесь ссылки, включая патенты, патентные заявки и публикации, включены здесь во всей своей полноте в качестве ссылки. Все примененные здесь термины, представленные в форме единственного числа, предназначены для включения форм как единственного, так и множественного числа.All references cited herein, including patents, patent applications, and publications, are hereby incorporated by reference in their entireties. All terms used herein, presented in the singular form, are intended to include both singular and plural forms.

Хотя данное изобретение было описано с подчеркиванием предпочтительных осуществлений, специалистам в данной области техники должно быть ясно, что могут быть осуществлены и применены вариации в предпочтительных осуществлениях и что изобретение может быть реализовано на практике иначе, чем это конкретно описано здесь. Настоящее изобретение предназначено для включения таких вариаций и альтернативных практических осуществлений. Соответственно, данное изобретение включает все модификации, охватываемые духом и объемом изобретения, как определено формулой изобретения.Although the invention has been described with emphasis on preferred embodiments, it will be apparent to those skilled in the art that variations in preferred embodiments can be made and applied, and that the invention can be practiced differently than is specifically described herein. The present invention is intended to include such variations and alternative practical implementations. Accordingly, this invention includes all modifications encompassed by the spirit and scope of the invention, as defined by the claims.

Claims

1. Лентивирусный вектор с зависимой от условий репликацией, содержащий1. Lentiviral vector with conditional replication, containing

(a) по меньшей мере первую нуклеотидную последовательность, содержащую последовательность, которая снижает вероятность образования лентивирусного вектора, способного к репликации, и(a) at least a first nucleotide sequence containing a sequence that reduces the likelihood of formation of a lentiviral vector capable of replication, and

(b) одну или несколько вторых нуклеотидных последовательностей, содержащих(b) one or more second nucleotide sequences containing

(i) нуклеотидную последовательность, которая ингибирует репликацию лентивируса штамма дикого типа, хелперного вируса или хелперного вектора, но не ингибирует репликацию лентивирусного вектора с зависимой от условий репликацией; или(i) a nucleotide sequence that inhibits the replication of a lentivirus of a wild-type strain, helper virus or helper vector, but does not inhibit the replication of the lentiviral vector with conditionally dependent replication; or

(ii) нуклеотидную последовательность, которая кодирует белок, который ингибирует репликацию лентивируса штамма дикого типа, хелперный вектор или хелперный вирус, но не ингибирует репликацию лентивирусного вектора с зависимой от условий репликацией;(ii) a nucleotide sequence that encodes a protein that inhibits the replication of the lentivirus of the wild-type strain, helper vector or helper virus, but does not inhibit the replication of the lentiviral vector with conditional replication;

где первая нуклеотидная последовательность, которая снижает вероятность образования лентивирусного вектора, способного к репликации, содержит одну или несколько модификаций пар нуклеотидных оснований последовательности, включающих замену, инсерцию или делецию, что уменьшает вероятность событий гомологичной репликации между лентивирусной последовательностью в векторе и лентивирусной последовательностью в вирусе дикого типа, хелперным вирусом или хелперным вектором и что может привести к образованию лентивирусного вектора, способного к репликации, и замену, инсерцию или делецию вводят в любую часть лентивирусного вектора, которая, по существу, гомологична последовательности лентивируса дикого типа, с тем, чтобы происходили события гомологичной рекомбинации, если последовательность не подвергалась модификациям, и, необязательно, первая нуклеотидная последовательность, которая снижает вероятность события гомологичной рекомбинации, содержит по меньшей мере один вырожденный кодон вместо кодона, предпочтительно использующегося в клетке-хозяине, где указанная одна или несколько первых нуклеотидных последовательностей представляют собой один или несколько рибозимов или антисмысловых последовательностей или кодируют один или несколько рибозимов или антисмысловых последовательностей для профилактического и терапевтического лечения заболеваний, особенно вирусной инфекции и, в частности, HIV инфекции, для лечения инфекционных заболеваний, рака и других заболеваний, имеющих отношение к генетике, и для методов диагностики.where the first nucleotide sequence, which reduces the likelihood of the formation of a replication-capable lentiviral vector, contains one or more modifications of the nucleotide base pair sequences, including substitution, insertion, or deletion, which reduces the likelihood of homologous replication events between the lentiviral sequence in the vector and the lentiviral sequence in the wild virus type, helper virus or helper vector and that can lead to the formation of a lentiviral vector, way to replication, and a substitution, insertion or deletion is introduced into any part of the lentiviral vector that is essentially homologous to the wild-type lentivirus sequence so that homologous recombination events occur if the sequence has not undergone modifications and, optionally, the first nucleotide sequence , which reduces the likelihood of a homologous recombination event, contains at least one degenerate codon instead of the codon, preferably used in the host cell, where on or the first few nucleotide sequences are one or more ribozymes or antisense sequences or encode one or more ribozymes or antisense sequences for the prophylactic and therapeutic treatment of diseases, especially a viral infection and, in particular, HIV infection, for the treatment of infectious diseases, cancer and other diseases related to genetics, and for diagnostic methods.

2. Вектор с зависимой от условий репликацией по п.1, где одна или несколько указанных замен пар нуклеотидных оснований снижает вероятность образования вектора, способного к репликации, содержащий вырожденную нуклеотидную последовательность, где, необязательно, вырожденность кодона предпочтительно относится к кодону, предпочтительно использующемуся в клетках человека.2. The conditionally dependent replication vector according to claim 1, wherein one or more of said substitutions of nucleotide base pairs reduces the likelihood of formation of a replication capable vector comprising a degenerate nucleotide sequence, where, optionally, the codon degeneracy preferably refers to a codon, preferably used in human cells.

3. Вектор с зависимой от условий репликацией по п.1, где указанный вектор3. The vector with conditional replication according to claim 1, where the specified vector

(a) является химерным вектором, содержащим последовательности ретровируса и одного или несколько других вирусов, где, необязательно, ретровирус содержит HIV и, необязательно, HIV представляет собой HIV-1 или HIV-2, и, необязательно, последовательности с связаны с последовательностями модифицированного штамма (неприродного типа) аденовируса, аденоассоциированного вируса, вируса рода Alphaviridae, вируса рода Flaviviridae, вируса рода Hepadnaviridae, вируса рода Papovaviridae, вируса рода Parvoviridae, вируса рода Herpesviridae, вируса рода Poxiviridae, вируса рода Paramyxoviridae, вируса рода Rhabdoviridae, вируса рода Retroviridae, онкоретровируса, спумаретровируса или лентиретровируса; или(a) is a chimeric vector containing the sequences of a retrovirus and one or more other viruses, where, optionally, the retrovirus contains HIV and, optionally, HIV is HIV-1 or HIV-2, and, optionally, the sequences associated with the sequences of the modified strain (non-natural type) adenovirus, adeno-associated virus, virus of the genus Alphaviridae, virus of the genus Flaviviridae, virus of the genus Hepadnaviridae, virus of the genus Papovaviridae, virus of the genus Parvoviridae, virus of the genus Herpesviridae, virus of the genus Poxiviridae, virus of the genus Paramyovov, Paramyx virus Paramyov dae, a virus of the genus Retroviridae, oncoretrovirus, spumaretrovirus or lentiretrovirus; or

(b) содержит последовательность ретровируса, где, необязательно, ретровифус содержит HIV, и, необязательно, HIV представляет собой HIV-1 или HIV-2, или их сочетание.(b) contains a retrovirus sequence, where, optionally, the retrovifus contains HIV, and, optionally, HIV is HIV-1 or HIV-2, or a combination thereof.

4. Вектор с зависимой от условий репликацией по п.1, где указанный вектор не кодирует или не экспрессирует вспомогательные вирусные белки.4. The vector with condition-dependent replication according to claim 1, wherein said vector does not encode or express auxiliary viral proteins.

5. Вектор с зависимой от условий репликацией по п.1, где указанный вектор получен из HIV-1 или вектор кодирует белок Tat HIV-1 или химерный белок Tat, где, необязательно, химерным белком Tat является Tat-IFN-альфа, Tat-TNF-альфа, Tat-IL-4, Tat-G-GSF или Tat-Rev.5. The conditionally dependent replication vector according to claim 1, wherein said vector is derived from HIV-1 or the vector encodes Tat HIV-1 protein or Tat chimeric protein, where, optionally, Tat chimeric protein is Tat-IFN alpha, Tat- TNF-alpha, Tat-IL-4, Tat-G-GSF or Tat-Rev.

6. Вектор с зависимой от условий репликацией по п.1, где одна или несколько первых нуклеотидных последовательностей кодируют рибозим, направленный против области U генома HIV.6. The condition-dependent replication vector according to claim 1, wherein one or more of the first nucleotide sequences encode a ribozyme directed against region U of the HIV genome.

7. Вектор с зависимой от условий репликацией по п.1, где указанный вектор не кодирует или не экспрессирует белок Vif, Vpu, Vpr, Nef, Rev или Tat, или любое их сочетание, или их фрагмент, что могло бы сделать вектор способным к репликации или патогенным.7. The conditionally dependent replication vector according to claim 1, wherein said vector does not encode or express Vif, Vpu, Vpr, Nef, Rev or Tat protein, or any combination thereof, or a fragment thereof, which would make the vector capable of replication or pathogenic.

8. Вектор с зависимой от условий репликацией по п.1, дополнительно содержащий последовательность нуклеиновой кислоты, которая снижает, минимизирует или предотвращает вирусную инфекцию при введении в клетку-хозяин или придает указанный клетке устойчивость к токсичным агентам.8. The conditionally dependent replication vector according to claim 1, further comprising a nucleic acid sequence that reduces, minimizes or prevents viral infection when introduced into a host cell or confers resistance to toxic agents on said cell.

9. Вектор с зависимой от условий репликацией по п.1, где указанная первая последовательность нуклеиновой кислоты кодирует трансдоминантный фенотип.9. The condition-dependent replication vector of claim 1, wherein said first nucleic acid sequence encodes a transdominant phenotype.

10. Вектор с зависимой от условий репликацией по п.1, где указанный вектор дополнительно содержит молчащую последовательность или последовательность инсулятора.10. A conditionally dependent replication vector according to claim 1, wherein said vector further comprises a silent or insulator sequence.

11. Вектор с зависимой от условий репликацией по п.1, дополнительно содержащий длинный концевой повтор (LTR) или модифицированный LTR для регуляции экспрессии первой последовательности, второй, или третьей, или дополнительной последовательности нуклеиновой кислоты, находящейся в указанном векторе, где, необязательно, молчащая последовательность или последовательность инсулятора введены в промоторную или энхансерную область LTR, и, необязательно, молчащая последовательность или последовательность инсулятора может регулировать экспрессию из промотора или энхансера.11. The condition-dependent replication vector of claim 1, further comprising a long terminal repeat (LTR) or modified LTR to regulate expression of a first sequence, a second, or third, or additional nucleic acid sequence located in the vector, where, optionally, a silent or insulator sequence is introduced into the LTR promoter or enhancer region, and, optionally, a silent or insulator sequence may control expression and h promoter or enhancer.

12. Вектор с зависимой от условий репликацией по п.1, дополнительно содержащий сайты сплайсинга HIV или внутренний рибосомальный сайт (IRES).12. The conditionally dependent replication vector of claim 1, further comprising HIV splicing sites or an internal ribosomal site (IRES).

13. Вектор с зависимой от условий репликацией по п.1, упакованный в вирусную частицу, содержащую один или несколько химерных белков оболочки, где, необязательно, химерным белком оболочки является белок оболочки вируса везикулярного стоматита VSV-G, белок бешенства G, белок GaL V, гликопротеин альфа-вируса Е1/2, белок RD114, белок env эндогенного вируса кошек или химерный белок оболочки вируса везикулярного стоматита VSV-G и, необязательно, химерным белком оболочки VSV-G является химерный белок RD114-VSV-G, химерный белок Notch-VSV-G, химерный белок дельта-VSV-G, химерный белок FLT-3 лиганд-VSV-G, химерный белок ТРО-VSV-G, химерный белок Kit лиганд-VSV-G, лиганд, который связан с химерным белком CD3-VSV-G, лиганд, который связан с химерным белком CD28-VSV-G, или лиганд, который связан с химерным белком GM-CSF-VSV-G.13. The conditionally dependent replication vector of claim 1, packaged in a viral particle containing one or more chimeric sheath proteins, where, optionally, the chimeric sheath protein is vesicular stomatitis virus sheath protein VSV-G, rabies protein G, GaL V protein , the alpha virus E1 / 2 glycoprotein, RD114 protein, enogenous endogenous virus env protein or chimeric vesicular stomatitis virus sheath protein VSV-G and, optionally, VSV-G chimeric sheath protein is RD114-VSV-G chimeric protein, Notch- chimeric protein VSV-G, chimeric Delta-VSV-G protein, chimeras th protein FLT-3 ligand-VSV-G, chimeric protein TPO-VSV-G, chimeric protein Kit ligand-VSV-G, ligand that is bound to the chimeric protein CD3-VSV-G, ligand that is bound to the chimeric protein CD28- VSV-G, or a ligand that is bound to the chimeric protein GM-CSF-VSV-G.

14. Вектор с зависимой от условий репликацией по п.1, дополнительно содержащий экспрессируемый ген или третью нуклеиновую кислоту, где, необязательно, экспрессируемый ген или третья нуклеиновая кислота содержит антисмысловую последовательность или рибозим, который направлен на окогенный белок, где, необязательно, антисмысловая последовательность или рибозим направлен на слитый белок Bcr-Abl, который является этиологическим агентом хронического миелолейкоза.14. The conditionally dependent replication vector according to claim 1, further comprising an expressed gene or a third nucleic acid, where, optionally, an expressed gene or third nucleic acid contains an antisense sequence or ribozyme that is directed to an oxygenated protein, where, optionally, an antisense sequence or the ribozyme is directed to a Bcr-Abl fusion protein, which is the etiological agent of chronic myelogenous leukemia.

15. Вектор с зависимой от условий репликацией по п.1, где по меньшей мере один вектор с зависимой от условий репликацией содержит последовательность, которая экспрессируется в клетке только временно и, необязательно, вектор с зависимой от условий репликацией содержит интеграза-негативный ген Pol и не содержит интегразу.15. The condition-dependent replication vector according to claim 1, wherein the at least one condition-dependent replication vector contains a sequence that is only temporarily expressed in a cell and, optionally, the condition-dependent replication vector contains an integrase-negative Pol gene and does not contain integrase.

16. Вектор с зависимой от условий репликацией по п.1, где вектор с зависимой от условий репликацией получен из клона pNL4-3 HIV-1.16. The condition-dependent replication vector of claim 1, wherein the condition-dependent replication vector is derived from clone pNL4-3 of HIV-1.

17. Вектор с зависимой от условий репликацией по пп.1-16 для получения фармацевтического препарата.17. A vector with conditionally dependent replication according to claims 1-16 for obtaining a pharmaceutical preparation.

18 Лентивирусный вектор с пониженной, зависимой от условий репликацией, содержащий18 Lentiviral vector with reduced, dependent on replication, containing

(a) первую нуклеотидную последовательность, функционально связанную с промотором, которая снижает вероятность образования вектора, способного к репликации, где последовательность нуклеиновой кислоты, которая снижает вероятность образования вектора, способного к репликации, снижает вероятность рекомбинации между одним или несколькими гомологичными областями лентивирусного вектора с зависимой от условий репликацией, и геномом лентивируса, способного к репликации, хелперным вектором или хелперным вирусом, следовательно, снижает вероятность рекомбинантного события в клетке-хозяине, что модифицирует лентивирусный вектор с зависимой от условий репликацией в форму, способную к репликации; и(a) a first nucleotide sequence operably linked to a promoter that reduces the likelihood of replication-capable vector formation, where a nucleic acid sequence that reduces the likelihood of replication-capable vector reduces the likelihood of recombination between one or more homologous regions of a lentiviral vector with a dependent from replication conditions, and the genome of a lentivirus capable of replication, a helper vector or helper virus, therefore, reduces the likelihood the relevance of the recombinant event in the host cell, which modifies the lentiviral vector with conditionally dependent replication into a form capable of replication; and

(b) вторую неуклеотидную последовательность, которая ингибирует или предотвращает репликацию или упаковку генома лентивируса с зависимой от условий репликацией в клетке-хозяине, таким образом давая преимущество селективной репликации или упаковки лентивирусному вектору с зависимой от условий репликацией по сравнению с репликацией или упаковкой генома лентивируса, где указанная одна или несколько первых нуклеотидных последовательностей представляют собой один или несколько рибозимов или антисмысловых последовательностей или кодируют один или несколько рибозимов или антисмысловых последовательностей, для профилактического и терапевтического лечения заболеваний, особенно вирусной инфекции, и, в частности, HIV инфекции, для лечения инфекционных заболеваний, рака и других заболеваний, имеющих отношение к генетике, и для методов диагностики.(b) a second non-nucleotide sequence that inhibits or prevents replication or packaging of the lentivirus genome with conditionally dependent replication in the host cell, thus giving the advantage of selective replication or packaging of the lentiviral vector with conditional replication over replication or packaging of the lentivirus genome, where the specified one or more first nucleotide sequences are one or more ribozymes or antisense sequences or coding cosiness is one or more ribozymes or antisense sequences for the prophylactic and therapeutic treatment of diseases, especially viral infections, and in particular HIV infections, for the treatment of infectious diseases, cancer and other diseases related to genetics, and for diagnostic methods.

19. Лентивирусный вектор с пониженной, зависимой от условий репликацией по п.18, где лентивирусный вектор с зависимой от условий репликацией содержит третью последовательность нуклеиновой кислоты, содержащую по крайней мере одну последовательность, которая ингибирует или предотвращает упаковку генома лентивируса с зависимой от условий репликацией, хелперного вектора или хелперного вируса, или одновременную упаковку генома лентивируса с зависимой от условий репликацией, хелперного вектора или хелперного вируса и лентивирусного вектора с зависимой от условий репликацией.19. The lentiviral vector with reduced conditional replication according to claim 18, wherein the lentiviral vector with conditional replication contains a third nucleic acid sequence containing at least one sequence that inhibits or prevents packaging of the lentivirus genome with conditional replication, helper vector or helper virus, or simultaneous packaging of the lentivirus genome with conditional replication, helper vector or helper virus and lentiviral vector a replication-dependent conditions.

20. Лентивирусный вектор с пониженной, зависимой от условий репликацией по п.18, где лентивирусный вектор с зависимой от условий репликацией содержит третью последовательность нуклеиновой кислоты, содержащую по крайней мере одну последовательность, которая может излечивать или предотвращать заболевание или состояние или представляет собой генетический противовирусный агент, где, необязательно, заболеванием или состоянием является рак, и, необязательно, последовательность, которая может излечивать или предотвращать заболевание или состояние или которая представляет собой генетический противовирусный агент, содержит антисмысловую молекулу, РНК-ловушку, трансдоминантный мутант, токсин, модификатор или модулятор РНК или белкового сплайсинга, внешнюю вспомогательную последовательность (EGS), иммуноген, PHKi, нуклеотидную последовательность или молекулу, которая модифицирует или модулирует сплайсинг, конститутивный транспортный элемент (СТЕ), нуклеарный фактор импорта и экспорта, факторы интеграции ДНК, элементы, стабилизирующие или дестабилизирующие РНК, пост-транскрипционные регуляторные элементы (PRE), белок, который препятствует вирусной репликации, интерферон, антитело, молекулу-лиганд или рибозим.20. Lentiviral vector with reduced, dependent on replication according to claim 18, where the lentiviral vector with dependent on replication contains a third nucleic acid sequence containing at least one sequence that can cure or prevent a disease or condition or is a genetic antiviral an agent where, optionally, the disease or condition is cancer, and, optionally, a sequence that can cure or prevent the disease or condition a thaw, or which is a genetic antiviral agent, contains an antisense molecule, an RNA trap, a transdominant mutant, a toxin, an RNA or protein splicing modifier or modulator, an external auxiliary sequence (EGS), an immunogen, PHKi, a nucleotide sequence or a molecule that modifies or modulates splicing, constitutive transport element (STE), nuclear import and export factor, DNA integration factors, elements stabilizing or destabilizing RNA, post-transcript ion regulatory elements (PRE), a protein that inhibits viral replication, an interferon, an antibody, ligand molecule or a ribozyme.

21. Лентивирусный вектор с пониженной, зависимой от условий репликацией по п.18, где нуклеотидная последовательность, которая снижает вероятность внутриклеточной рекомбинации между одним или несколькими гомологичными областями лентивирусного вектора с зависимой от условий репликацией и лентивирусного генома, хелперного вектора, хелперного вируса, содержит по крайней мере один вырожденный кодон вместо кодона, предпочтительно использующегося в клетке-хозяине.21. The lentiviral vector with reduced, conditionally dependent replication according to claim 18, wherein the nucleotide sequence that reduces the likelihood of intracellular recombination between one or more homologous regions of the lentiviral vector with conditional replication and the lentiviral genome, helper vector, helper virus, contains at least one degenerate codon instead of the codon, preferably used in the host cell.

22. Лентивирусный вектор с пониженной, зависимой от условий репликацией по п.18, где клеткой-хозяином является клетка человека.22. Lentiviral vector with reduced, conditionally dependent replication according to claim 18, wherein the host cell is a human cell.

23. Лентивирусный вектор с пониженной, зависимой от условий репликацией по п.18, где лентивирусный геном, способный к репликации, из которого получен лентивирусный вектор, или лентивирусный геном, способный к репликации, репликация или упаковка которого ингибируется или предотвращается первой последовательностью нуклеиновой кислоты, содержит геном лентивируса дикого типа.23. The lentiviral vector with reduced, conditionally dependent replication according to claim 18, wherein the lentiviral genome capable of replication from which the lentiviral vector is derived, or the lentiviral genome capable of replication, replication or packaging of which is inhibited or prevented by the first nucleic acid sequence, contains the genome of wild-type lentivirus.

24. Лентивирусный вектор с пониженной, зависимой от условий репликацией по п.18, где геном лентивируса дикого типа является геном HIV дикого типа, где, необязательно, геном HIV дикого типа представляет собой геном HIV-1 дикого типа или HIV-2 дикого типа.24. The reduced-conditional lentiviral vector of claim 18, wherein the wild-type lentivirus genome is the wild-type HIV gene, where, optionally, the wild-type HIV gene is the wild-type HIV-1 or wild-type HIV-2 gene.

25. Лентивирусный вектор с пониженной, зависимой от условий репликацией по пп.18-24 для получения фармацевтического препарата.25. Lentiviral vector with reduced, conditionally dependent replication according to claims 18-24 for obtaining a pharmaceutical preparation.

26. Способ получения вектора по п.1 или 18, предусматривающий стадию высокоскоростного центрифугирования, стадию эксклюзионной хроматографии и, необязательно, не предусматривающий стадию ультрацентрифугирования, где способ предусматривает26. The method of obtaining the vector according to claim 1 or 18, comprising a step of high-speed centrifugation, a step of size exclusion chromatography and, optionally, not providing a step of ultracentrifugation, where the method provides

(a) стадии(a) stages

1. очистки вирусного супернатанта,1. purification of the viral supernatant,

2. концентрирования путем ультрацентрифугирования или высокоскоростного центрифугирования,2. concentration by ultracentrifugation or high speed centrifugation,

3. диафильтрации с обработкой бензоназой или без нее;3. diafiltration with or without benzonase treatment;

4. необязательной ионно-обменной хроматографии,4. optional ion exchange chromatography,

5. эксклюзионной хроматографии,5. size exclusion chromatography,

6. необязательного концентрирования ультрафильтрацией или6. optional concentration by ultrafiltration or

(b) стадии(b) stages

2. ионно-обменной хроматографии,2. ion exchange chromatography,

3. диафильтрации или эксклюзионной хроматографии,3. diafiltration or size exclusion chromatography,

4. необязательной обработки бензоназой,4. optional benzonase treatment,

5. эксклюзионной хроматографии или диафильтрации,5. size exclusion chromatography or diafiltration,

6. необязательного концентрирования путем ультрафильтрации.6. optional concentration by ultrafiltration.

27. Способ получения вектора с зависимой от условий репликацией по п.1 или 18, предусматривающий27. The method of obtaining a vector with conditional replication according to claim 1 or 18, comprising

(a) получение клетки-хозяина, вектора с зависимой от условий репликацией по п.1 или 18, нуклеиновой кислоты вируса штамма дикого типа, хелперного вируса или хелперного вектора, способного дополнять вектор с зависимой от условий репликацией в клетке-хозяина;(a) obtaining a host cell, a conditionally replicating vector according to claim 1 or 18, a nucleic acid of a wild-type strain virus, a helper virus, or a helper vector capable of complementing a conditionally replicating vector in a host cell;

(b) временную трансфекцию, инфицирование или введение последовательности вектора с зависимой репликацией и хелперной последовательности с высокой трансфецирующей или трансдуцирующей эффективностью, необязательно, используя трансфецирующий агент;(b) transiently transfecting, infecting, or introducing a sequence of a vector with dependent replication and a helper sequence with high transfecting or transducing efficiency, optionally using a transfecting agent;

где, необязательно, трансфицирующим агентом является фосфат кальция, реагент липидной трансфекции, или трансфекцию осуществляют электропорацией; иwhere, optionally, the transfection agent is calcium phosphate, a lipid transfection reagent, or transfection is carried out by electroporation; and

(с) выделение вектора из супернатанта;(c) isolating the vector from the supernatant;

где, необязательно, выделение проводят не ранее, чем через 12 ч после трансфекции, и не позднее, чем через 7 дней после трансфекции,where, optionally, the isolation is carried out no earlier than 12 hours after transfection, and no later than 7 days after transfection,

и, необязательно, выделяемый вектор концентрируют, необязательно, с помощью высокоскоростного центрифугирования без осаждения или ультрацентрифугирования,and, optionally, the isolated vector is concentrated, optionally, by high speed centrifugation without precipitation or ultracentrifugation,

и, необязательно, выделяемый вектор дополнительно очищают с помощью по крайней мере одной, нескольких или всех стадий способа по п.26.and, optionally, the isolated vector is further purified using at least one, several, or all of the steps of the method of claim 26.

28. Применение вектора по любому из пп.1-24 для получения фармацевтического препарата для ингибирования репликации вируса в клетки,28. The use of the vector according to any one of claims 1 to 24 for obtaining a pharmaceutical preparation for inhibiting the replication of the virus into cells,

где, необязательно, вирусом является лентивирус и, необязательно, лентивирус представляет собой HIV.where, optionally, the virus is a lentivirus and, optionally, the lentivirus is HIV.

29. Способ индукции гибели клеток, где способ предусматривает трансдукцию клеток вектором по любому из пп.1-24.29. A method for inducing cell death, wherein the method comprises transducing cells with a vector according to any one of claims 1-24.

30. Способ ингибирования репликации вируса в клетке, где способ предусматривает трансдукцию клеток вектором по любому из пп.1-24.30. A method of inhibiting viral replication in a cell, wherein the method comprises transducing cells with a vector according to any one of claims 1-24.

31. Способ селекции гематопоэтических стволовых клеток (HSC), где способ предусматривает31. A method for selecting hematopoietic stem cells (HSC), wherein the method comprises

(а) трансдукцию HSC вектором по любому из пп.1-24,(a) transduction of the HSC vector according to any one of claims 1 to 24,

где вектор кодирует последовательность варианта О⁶-метилгуанин-ДНК-метилтрансферазы (MGMT), устойчивого к инактивации, опосредованной O-бензилгуанином (BG), и, необязательно, вариантом является G ¹⁵⁶A MGMT;where the vector encodes the sequence of the O ⁶ -methylguanine DNA methyltransferase (MGMT) variant resistant to O-benzylguanine (BG) mediated inactivation, and optionally the variant is G ¹⁵⁶ A MGMT;

(b) контактирование клеток с O-бенизлгуанином (BG) в количестве, достаточном для инактивации MGMT дикого типа, при котором не происходит инактивации варианта MGMT, устойчивого к инактивации, опосредованной O-бензилгуанином (BG);(b) contacting the cells with O-benzylguanine (BG) in an amount sufficient to inactivate wild-type MGMT, in which there is no inactivation of the MGMT variant resistant to O-benzylguanine (BG) mediated inactivation;

(c) контактирование клеток с цитотоксическим алкилирующим агентом после контакта этих клеток с количеством, достаточным для индукции гибели нетрансдуцированных клеток, при котором не происходит индукции гибели трансдуцированных клеток HSC;(c) contacting the cells with a cytotoxic alkylating agent after contacting these cells with an amount sufficient to induce the death of non-transduced cells, in which there is no induction of the death of transduced HSC cells;

и, необязательно, цитотоксический алкилирующий агент представляет собой 6-гуанинметилирующий или хлорэтилирующий агент или, необязательно, цитотоксический алкилирующий агент представляет собой темозоломид, нитрозомочевину, тетразины, триазины, дакабазин, темозоломид, стрептозотоцин, прокарбазин, BCNU (1,3-бис(2-хлорэтил)-1-нитрозомочевину, CCNU (3-циклогексил-1-хлорэтил-нитрозомочевину), ACNU (1-(4-амино-2-метил-5-пиримидинил)метил-3-(2-хлор)-3-нитрозомочевину) и MeCCNU (1-(2-хлорэтил)-3-(4-метилциклогексил)-1-нитрозомочевину).and, optionally, the cytotoxic alkylating agent is a 6-guanine methylating or chloroethylating agent or, optionally, the cytotoxic alkylating agent is temozolomide, nitrosourea, tetrazines, triazines, dacabazine, temozolomide, streptozotocin, procarbazine, BCNU (1,3-bis (2-bis (2- chloroethyl) -1-nitrosourea, CCNU (3-cyclohexyl-1-chloroethyl-nitrosourea), ACNU (1- (4-amino-2-methyl-5-pyrimidinyl) methyl-3- (2-chloro) -3-nitrosourea ) and MeCCNU (1- (2-chloroethyl) -3- (4-methylcyclohexyl) -1-nitrosourea).

32. Клетка-хозяин, содержащая по меньшей мере один вектор с зависимой от условий репликацией по любому из пп.1-17 и по меньшей мере один хелперный вектор, способный дополнять этот вектор,32. A host cell containing at least one conditionally replicated vector according to any one of claims 1-17 and at least one helper vector capable of complementing this vector,

где, необязательно, клетка-хозяин содержит любое сочетание двух, трех или более векторов с зависимой от условий репликацией или хелперных векторов,where, optionally, the host cell contains any combination of two, three or more vectors with conditionally dependent replication or helper vectors,

для профилактического и терапевтического лечения заболеваний, особенно вирусной инфекции и, в частности, HIV инфекции, для лечения инфекционных заболеваний, рака и других заболеваний, имеющих отношение к генетике, и для методов диагностики.for the prophylactic and therapeutic treatment of diseases, especially viral infections and, in particular, HIV infections, for the treatment of infectious diseases, cancer and other diseases related to genetics, and for diagnostic methods.

33. Клетка-хозяин по п.32, где по меньшей мере один указанный хелперный вектор, кроме того, способен псевдотипировать указанный вектор с зависимой от условий репликацией.33. The host cell according to p, where at least one of the specified helper vector, in addition, is capable of pseudotyping the specified vector with conditional replication.

34. Клетка-хозяин по п.32, где по меньшей мере один вектор с зависимой от условий репликацией, кроме того, содержит один или несколько рибозимов или антисмысловых последовательностей, направленных по меньшей мере на один указанный хелперный вектор.34. The host cell of claim 32, wherein the at least one conditionally replicating vector further comprises one or more ribozymes or antisense sequences directed to at least one said helper vector.

35. Клетка-хозяин по п.32, где по меньшей мере один указанный вектор с зависимой от условий репликацией получен из HIV-2, или HIV-1, или их сочетания.35. The host cell of claim 32, wherein at least one of the conditionally replicated vector is derived from HIV-2, or HIV-1, or a combination thereof.

36. Клетка-хозяин по п.32, где по меньшей мере один хелперный вектор дополнительно содержит одну или несколько замен, инсерций или делеций пар нуклеотидных оснований, что уменьшает вероятность образования вектора, способного к репликации, и по меньшей мере один хелперный вектор, необязательно, содержит по меньшей мере один вырожденный кодон вместо кодона, предпочтительно использующегося в клетке-хозяине.36. The host cell according to p, where at least one helper vector further comprises one or more substitutions, insertions or deletions of pairs of nucleotide bases, which reduces the likelihood of the formation of a vector capable of replication, and at least one helper vector, optional , contains at least one degenerate codon instead of the codon, preferably used in the host cell.

37. Клетка-хозяин по п.32, где по меньшей мере один хелперный вектор содержит последовательность, которая экспрессируется в клетке только временно, и, необязательно, по крайней мере один вектор с зависимой от условий репликацией и хелперный вектор не содержит интегразу.37. The host cell according to p, where at least one helper vector contains a sequence that is expressed in the cell only temporarily, and, optionally, at least one vector with conditional replication and the helper vector does not contain integrase.

38. Клетка-хозяин по п.32, где вектор с зависимой от условий репликацией не содержит функциональную интегразу и функциональную интегразу вводят in trrans путем экспрессии из хелперного вектора или хелперной конструкции или функциональная интеграза упакована в хелперный вектор, или хелперную конструкцию, или вирусную частицу.38. The host cell of claim 32, wherein the conditionally replicating vector does not contain functional integrase and functional integrase is introduced in trrans by expression from a helper vector or helper construct, or functional integrase is packaged in a helper vector, or helper construct, or viral particle .

39. Конструкция нуклеиновой кислоты, которая ингибирует репликацию ретровируса дикого типа или дает некоторые преимущества репликации генома ретровируса с зависимой от условий репликацией по сравнению с репликацией генома ретровируса дикого типа, где нуклеиновая кислота включает (1) геном ретровируса с зависимой репликацией; (2) нуклеиновую кислоту, кодирующую последовательность, ингибирующую репликацию ретровируса, или последовательность, ингибирующую упаковку вируса, содержащую один или несколько рибозимов или антисмысловых последовательностей или кодирующую один или несколько рибозимов или антисмысловых последовательностей; и (3) последовательность нуклеиновой кислоты, которая снижает вероятность образования вектора, способного к репликации, где последовательность снижает вероятность рекомбинации между одним или несколькими гомологичными областями ретровирусного вектора с зависимой от условий репликацией и генома ретровируса, способного к репликации, хелперного вектора или хелперного вируса, таким образом, снижает вероятность рекомбинационного события в клетке-хозяине, что модифицирует ретровирусный вектор с зависимой от условий репликацией в форму, способную к репликации,39. A nucleic acid construct that inhibits wild-type retrovirus replication or provides some of the benefits of replication of the genome of a retrovirus with conditional replication compared to replication of the wild-type retrovirus genome, where the nucleic acid comprises (1) a dependent replication retrovirus gene; (2) a nucleic acid encoding a sequence that inhibits the replication of a retrovirus, or a sequence that inhibits the packaging of a virus, containing one or more ribozymes or antisense sequences, or encoding one or more ribozymes or antisense sequences; and (3) a nucleic acid sequence that reduces the likelihood of a replication capable vector, wherein the sequence reduces the likelihood of recombination between one or more homologous regions of a conditionally replicating retroviral vector and the replication capable genome of a retrovirus helper vector or helper virus, thus, it reduces the likelihood of a recombination event in the host cell, which modifies the retroviral vector with conditionally dependent replication to the form, with replication aids

где геном ретровируса с зависимой от условий репликацией включает длинный 5' концевой повтор (LTR) и длинный 3' концевой повтор (LTR) и транскрипционная активность последовательности, ингибирующей репликацию ретровируса, находится под контролем ретровирусного LTR,where the genome of the conditionally replicating retrovirus includes a long 5 'terminal repeat (LTR) and a long 3' terminal repeat (LTR) and the transcriptional activity of the retrovirus replication inhibitory sequence is controlled by a retroviral LTR,

и последовательность, ингибирующая репликацию вируса, или продукт последовательности, ингибирующей репликацию вируса, ингибирует репликацию ретровируса или дает некоторые преимущества репликации генома ретровируса с зависимой от условий репликацией по сравнению с репликацией генома ретровируса дикого типа.and a virus replication inhibitory sequence, or a product of a virus replication inhibitory sequence, inhibits retrovirus replication or provides some advantages for replication of the retrovirus genome with conditional replication compared to replication of the wild-type retrovirus genome.

40. Конструкция нуклеиновой кислоты по п.39 для получения фармацевтического препарата.40. The design of the nucleic acid according to § 39 to obtain a pharmaceutical preparation.

41. Конструкция нуклеиновой кислоты по п.39, где геном ретровируса включает геном лентивируса или ретровирус дикого типа включает лентивирус и, необязательно, лентивирус включает геном HIV и, необязательно, HIV включает HIV-1 или HIV-2,41. The nucleic acid construct according to claim 39, wherein the retrovirus genome comprises the lentivirus genome or the wild-type retrovirus includes the lentivirus and optionally the lentivirus includes the HIV genome and optionally HIV includes HIV-1 or HIV-2,

42. Применение конструкции нуклеиновой кислоты по п.39 для получения фармацевтического средства для ингибирования репликации вируса, способного в репликации, в клетке, где, необязательно, ретровирус представляет собой лентивирус и, необязательно, лентивирус является HTV и, необязательно, HIV представляет собой HIV-1 или HIV-2.42. The use of the nucleic acid construct of claim 39 for the manufacture of a pharmaceutical agent for inhibiting replication of a virus capable of replication in a cell where, optionally, the retrovirus is a lentivirus and, optionally, the lentivirus is HTV and, optionally, HIV is HIV- 1 or HIV-2.

43. Композиция для трансдукции клеток для профилактического и терапевтического лечения заболеваний, особенно вирусной инфекции, и, в частности, HIV инфекции, для лечения инфекционных заболеваний, рака и других заболеваний, имеющих отношение к генетике, и для методов диагностики, содержащая вектор с зависимой от условий репликацией по п.1 или 17 или конструкцию нуклеиновой кислоты по п.39 и раствор, буфер или носитель;43. Composition for transduction of cells for the prophylactic and therapeutic treatment of diseases, especially viral infections, and, in particular, HIV infections, for the treatment of infectious diseases, cancer and other diseases related to genetics, and for diagnostic methods, containing a vector dependent on replication conditions according to claim 1 or 17 or the nucleic acid construct according to claim 39 and a solution, buffer or carrier;

где раствор, буфер или носитель включает фосфатно-буферный солевой раствор (PBS) или PBS включает PBS, который смешан с 1-50%-ным раствором трегалозы в воде (1:1) или с 10%-ным раствором трегалозы в воде (1:1) так, чтобы конечная концентрация составляла 5% трегалозы; или PBS смешан с 1-50%-ным раствором глюкозы в воде (1:1) или с 10% раствором глюкозы в воде (1:1), так, чтобы конечная концентрация глюкозы составляла 5%; 20 мМ HEPES-забуференный солевой раствор, который смешан с 1-50%-ным раствором трегалозы в воде (1:1) или с 10%-ным раствором трегалозы в воде (1:1) так, чтобы конечная концентрация трегалозы составляла 5%; или PBS смешан с 1-50%-ным раствором маннита в воде (1:1) или 5%-ным раствором маннита в воде (1:1) так, чтобы конечная концентрация маннита составляла 2,5%,where the solution, buffer or carrier comprises phosphate buffered saline (PBS) or PBS includes PBS that is mixed with a 1-50% solution of trehalose in water (1: 1) or with a 10% solution of trehalose in water (1 : 1) so that the final concentration is 5% trehalose; or PBS is mixed with a 1-50% solution of glucose in water (1: 1) or with a 10% solution of glucose in water (1: 1), so that the final glucose concentration is 5%; 20 mM HEPES-buffered saline, which is mixed with a 1-50% solution of trehalose in water (1: 1) or with a 10% solution of trehalose in water (1: 1) so that the final concentration of trehalose is 5% ; or PBS is mixed with a 1-50% solution of mannitol in water (1: 1) or a 5% solution of mannitol in water (1: 1) so that the final concentration of mannitol is 2.5%,

или композиция находится в лиофилизируемой форме.or the composition is in lyophilized form.

44. Применение композиции по п.43 для получения фармацевтической композиции для ингибирования репликации вируса в клетке, где, необязательно, вирусом является лентивирус и, необязательно, лентивирусом является HIV.44. The use of the composition according to item 43 to obtain a pharmaceutical composition for inhibiting virus replication in a cell, where, optionally, the virus is lentivirus and, optionally, lentivirus is HIV.

45. Лентивирусный вектор, представленный на фиг.1a-k, кроме того, содержащий45. The lentiviral vector shown in figa-k, in addition, containing

(i) экспрессируемый ген или последовательность, где ген или последовательность: (а) могут излечивать или предотвращать развитие заболевания или состояния или (b) могут действовать как генетический противовирусный агент, где, необязательно, генетический противовирусный агент содержит антисмысловую молекулу, РНК-ловушку, трансдоминантный мутант, токсин, модификатор или модулятор РНК или белкового сплайсинга, внешнюю вспомогательную последовательность (EGS), иммунноген, мРНК, нуклеотидную последовательность или молекулу, которая модифицирует или модулирует спласинг, конститутивный транспортный элемент (СТЕ), нуклеарный фактор импорта и экспорта, факторы интеграции ДНК, элементы, стабилизирующие или дестабилизирующие РНК, посттранскрипционные регуляторные элементы (PRE), белок, который препятствует вирусной репликации, интерферон, антитело, молекулу-лиганд или рибозим, и(i) an expressed gene or sequence, where the gene or sequence: (a) can cure or prevent the development of a disease or condition, or (b) can act as a genetic antiviral agent, where, optionally, the genetic antiviral agent contains an antisense molecule, an RNA trap, transdominant mutant, toxin, modifier or modulator of RNA or protein splicing, external auxiliary sequence (EGS), immunogen, mRNA, nucleotide sequence or molecule that modifies it or modulates splicing, constitutive transport element (CTE), nuclear import and export factor, DNA integration factors, RNA stabilizing or destabilizing elements, post-transcriptional regulatory elements (PRE), protein that inhibits viral replication, interferon, antibody, ligand molecule or ribozyme, and

(ii) нуклеотидную последовательность, которая снижает вероятность образования лентивирусного вектора, способного к репликации, содержащего одну или несколько замен, инсерций или делеций пар нуклеотидных оснований, что уменьшает вероятность событий гомологичной рекомбинации между последовательностью лентивируса в векторе и последовательностью лентивируса дикого типа, хелперным вирусом или хелперным вектором, и что может привести к образованию лентивирусного вектора, способного к репликации.(ii) a nucleotide sequence that reduces the likelihood of a replication capable lentiviral vector containing one or more substitutions, insertions or deletions of base pairs, which reduces the likelihood of homologous recombination events between the lentivirus sequence in the vector and the wild-type lentivirus sequence, helper virus, or helper vector, and which can lead to the formation of a lentiviral vector capable of replication.