RU2287571C2 - STRAIN OF MYCELIAL FUNGUS TRICHODERMA LONGIBRACHIATUM AS PRODUCER OF CARBOHYDRASES COMPLEX COMPRISING CELLULASES, β-GLUCANASES, XYLANASES, MANNANASES AND PECTINASES - Google Patents

Abstract

FIELD: biotechnology, biochemistry, enzymes.

SUBSTANCE: invention relates to the strain Trichoderma longibrachiatum VKM F-3865D (the All-Russian collection of microorganisms in IBFM named for G. K. Skryabin, RAS) that possesses ability to produce complex of carbohydrases comprising cellulases, beta-glucanases, xylanases, mannanases and pectinases with high level of their activity. Invention provides the possibility for preparing the full complex of enzymes used for hydrolysis of vegetable raw polysaccharides and, if necessary, separate individual enzymes (components) of this complex. Invention doesn't require using complex and expensive nutrient media for achievement of high productivity of the strain. Invention can be used in different fields of alcoholic and food processing industry and in agriculture.

EFFECT: valuable biological properties of strain.

6 ex

Description

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано в микробиологической промышленности, в различных отраслях спиртовой и пищевой промышленности, в кормопроизводстве, в сельском хозяйстве.The invention relates to the field of biotechnology and can be used in the microbiological industry, in various sectors of the alcohol and food industries, in fodder production, in agriculture.

Мультиферментные комплексы карбогидраз, содержащие целлюлазы, бета-глюканазы, ксиланазы, маннаназы, пектиназы и сопутствующие ферменты, могут применяться для обработки целлюлозе- и гемицеллюлозосодержащих субстратов, в том числе для осахаривания и переработки отходов промышленности и сельского хозяйства, для биодеградации клеточных стенок растений и микроорганизмов, в целлюлозно-бумажной промышленности, в пищевой и спиртовой промышленности, в пивоварении, в качестве кормовых добавок, для силосования кормов в сельском хозяйстве.Carbohydrase multienzyme complexes containing cellulases, beta-glucanases, xylanases, mannanases, pectinases and related enzymes can be used for the treatment of cellulose and hemicellulose-containing substrates, including for saccharification and processing of industrial and agricultural waste, for biodegradation of plant cell walls and microorganisms , in the pulp and paper industry, in the food and alcohol industries, in brewing, as feed additives, for silage of feeds in agriculture.

Известно много штаммов-продуцентов карбогидраз, главным образом целлюлаз, и способы их культивирования в аэробных условиях. Как правило, микроорганизмы, в частности мицелиальные грибы, образуют комплекс ферментов, разрушающих растительные субстраты. Обычно такой комплекс включает преимущественно целлюлазы, а также ксиланазы и пектиназы. Выбор штамма-продуцента определяется его способностью обеспечить высокие уровни активности карбогидраз в ферментационной среде, скоростью образования этих ферментов, выходом ферментов с единицы массы используемых для ферментации субстратов, а также стоимостью этих субстратов.Many strains producing carbohydrases, mainly cellulases, and methods for their cultivation under aerobic conditions are known. As a rule, microorganisms, in particular mycelial fungi, form a complex of enzymes that destroy plant substrates. Typically, such a complex comprises predominantly cellulases, as well as xylanases and pectinases. The choice of producer strain is determined by its ability to provide high levels of carbohydrase activity in the fermentation medium, the rate of formation of these enzymes, the release of enzymes per unit mass of the substrates used for fermentation, and the cost of these substrates.

Известны штаммы гриба Aspergillus niger, при глубинном культивировании которых на средах с индукторами целлюлолитических ферментов получают комплекс ферментов, включающих целлюлазу, ксиланазу, бета-глюкозидазу, бета-ксилозидазу, бета-глюканазу и ламинариназу (Патент РФ № 2057179, кл. C 12 N/42, 1996 г.). Активности ферментов в культуральной жидкости составляют соответственно: целлюлаза - 5,0 Е/мл; ксиланаза - 125,0 Е/мл; бета-глюкозидаза - 20,0 Е/мл; бета-ксилозидаза - 36,0; бета-глюканаза - 0,95 Е/мл и ламинариназа - 1,25 Е/мл.Known strains of the fungus Aspergillus niger, when deep cultivated on media with inducers of cellulolytic enzymes, a complex of enzymes is obtained including cellulase, xylanase, beta-glucosidase, beta-xylosidase, beta-glucanase and laminarinase (RF Patent No. 2057179, class C 12 N / CL 12 42, 1996). The enzyme activities in the culture fluid are, respectively: cellulase - 5.0 U / ml; xylanase - 125.0 U / ml; beta-glucosidase - 20.0 U / ml; beta-xylosidase - 36.0; beta-glucanase - 0.95 U / ml and laminarinase - 1.25 U / ml.

Как известно, наиболее активными продуцентами целлюлаз являются штаммы мицелиальных грибов рода Trichoderma. С целью повышения их способности к продукции ферментов и адаптации к более дешевым ферментационным средам были получены различные мутантные и рекомбинантные штаммы Tr.longibrachiatum (син. Tr.reesei). Мутант Tr.reesei MCG80 при глубинном культивировании на питательной среде с 8%-ной целлюлозой и биотином обеспечивает активность целлюлаз 17,2 ед/мл FPA (Патент США № 4472504, кл. C 12 N 9/42, 1984 г.). FPA - активность целлюлазного комплекса, определенная по фильтровальной бумаге и выраженная в международных единицах согласно рекомендации IUPAC (T.K.Ghose, Pure and Appl. Chem., 1987, vol.59, № 2, p.257-268).As is known, the most active producers of cellulases are strains of mycelial fungi of the genus Trichoderma. In order to increase their ability to produce enzymes and adapt to cheaper fermentation media, various mutant and recombinant strains of Tr.longibrachiatum (synonym Tr.reesei) were obtained. Mutant Tr.reesei MCG80 when deep cultured on a nutrient medium with 8% cellulose and biotin provides cellulase activity of 17.2 u / ml FPA (US Patent No. 4472504, CL 12 N 9/42, 1984). FPA is the activity of a cellulase complex, determined by filter paper and expressed in international units according to the IUPAC recommendation (T.K. Ghose, Pure and Appl. Chem., 1987, vol. 59, No. 2, p. 257-268).

Известен мутант Tr.reesei IMET 43803, который вследствие частичного уменьшения катаболитной репрессии биосинтеза ферментов обеспечивает высокую продуктивность целлюлаз и высокий (до 10 ед/мл FPA) уровень активности целлюлаз при культивировании на среде с лактозой (Патент ГДР № 291673, кл. C 12 N 9/42, 1991 г.).The mutant Tr.reesei IMET 43803 is known, which, due to a partial decrease in the catabolite repression of enzyme biosynthesis, provides high cellulase productivity and high (up to 10 units / ml FPA) cellulase activity when cultured on lactose-containing medium (GDR Patent No. 291673, class C 12 N 9/42, 1991).

Известен мутант Tr.reesei ВСМ 18.2/КК (ВГНКИ-28), полученный с помощью парасексульных процессов из исходной культуры Tr.reesei IMET 43803, который обладает повышенной продуктивностью и позволяет обеспечить высокий выход активности ферментов (целлюлаз) с единицы массы используемого субстрата (Патент РФ № 2001949, C 12 N 9/42, 1993 г.).Known mutant Tr.reesei BCM 18.2 / KK (VGNKI-28) obtained by parasexual processes from the original culture of Tr.reesei IMET 43803, which has increased productivity and allows for a high yield of enzyme activity (cellulase) per unit mass of the substrate used (Patent RF No. 2001949, C 12 N 9/42, 1993).

Штамм Tr.reesei BCM 18.2/КК имеет ферментные системы, позволяющие расти на среде с целлюлозой, крахмалом, хитином, пектином, ксиланом, ламинарином, лихенином. При глубинном культивировании на жидкой питательной среде на основе свекловичного жома в колбах на качалке достигается уровень активности в 3,5-4,2 ед/мл FPA (время культивирования 110 ч), при культивировании в ферментере на среде с лактозой - 18.2 ед/мл FPA (81 ч), при культивировании в ферментере на молочной сыворотке - 12-14 ед/мл FPA (100-110 ч).The strain Tr.reesei BCM 18.2 / KK has enzyme systems that allow it to grow on a medium with cellulose, starch, chitin, pectin, xylan, laminarin, lichenin. With deep cultivation in a liquid nutrient medium based on beet pulp in flasks on a rocking chair, an activity level of 3.5-4.2 u / ml FPA is achieved (cultivation time 110 h), when cultured in a fermenter on a medium with lactose - 18.2 u / ml FPA (81 h), when cultured in a whey fermenter - 12-14 u / ml FPA (100-110 h).

Наиболее близким по технической сущности к предлагаемому изобретению является мутант Tr.longibrachiatum TW-1 (F-3634D), полученный с помощью многоступенчатого классического мутагенеза из исходной культуры Tr.reesei var longibrachiatum QM6a (F-2047) с применением ультрафиолетового облучения (Патент РФ № 2195490, 7 C 12 N 1/14, 9/42, 2001 г.). Штамм обладает способностью продуцировать комплекс карбогидраз, что создает возможность получения полного комплекса ферментов для обработки растительного сырья, а также при необходимости - индивидуальных ферментов (компонентов) комплекса. Для получения высокой продуктивности штамма не требуется применение сложных и дорогих питательных сред. Штамм Tr.longibrachiatum TW-1 имеет ферментные системы, позволяющие расти на среде с целлюлозой, крахмалом, хитином, пектином, ксиланом, ламинарином, лихенином. При глубинном культивировании в колбах на жидкой питательной среде на основе свекловичного жома достигается уровень активности целлюлаз, бета-глюканаз, ксиланаз, пектиназ и маннаназ в 6,5; 25,0; 20,0; 7,0 и 0,5 ед/мл соответственно (время культивирования 120 ч). При культивировании в ферментере на среде с ферментативном гидролизатом крахмала, пшеничными отрубями и микрокристаллической целлюлозой (МКЦ) и с непрерывным внесением лактозы (во второй фазе) уровень активности целлюлаз (FPA), бета-глюканаз, ксиланаз, пектиназ и маннаназ составляет 25, 510, 108, 40 и 35 ед/мл соответственно (время культивирования 120 ч).The closest in technical essence to the present invention is a mutant Tr.longibrachiatum TW-1 (F-3634D), obtained using multistage classical mutagenesis from the original culture of Tr.reesei var longibrachiatum QM6a (F-2047) using ultraviolet radiation (RF Patent No. 2195490, 7 C 12 N 1/14, 9/42, 2001). The strain has the ability to produce a complex of carbohydrases, which makes it possible to obtain a complete complex of enzymes for processing plant materials, and also, if necessary, individual enzymes (components) of the complex. To obtain high productivity of the strain does not require the use of complex and expensive nutrient media. The strain Tr.longibrachiatum TW-1 has enzyme systems that allow it to grow on a medium with cellulose, starch, chitin, pectin, xylan, laminarin, lichenin. With deep cultivation in flasks on a liquid nutrient medium based on beet pulp, the activity level of cellulases, beta-glucanases, xylanases, pectinases and mannanases is reached at 6.5; 25.0; 20.0; 7.0 and 0.5 u / ml, respectively (cultivation time 120 h). When cultured in a fermenter on a medium with an enzymatic starch hydrolyzate, wheat bran and microcrystalline cellulose (MCC) and with the continuous introduction of lactose (in the second phase), the activity level of cellulases (FPA), beta-glucanases, xylanases, pectinases and mannanases is 25, 510, 108, 40 and 35 u / ml, respectively (cultivation time 120 h).

Однако, как следует из имеющихся в нашем распоряжении сведений, полученных в результате научных исследований (O.F.Castellanos, A.P.Sinitsyn, E.Yu.Vlasenko. Comparative evaluation of hydrolytic efficiency toward microcrystalline cellulose of Penicillium and Trichoderma cellulases. Bioresource Technology, 1995, 52, 119-124), грибы рода Trichoderma, как правило, обладают высокой продуктивностью, преимущественно в отношении целлюлаз, но в гораздо меньшей степени - в отношении других карбогидраз (бета-глюканаз, ксиланаз, пектиназ, маннаназ), необходимых для гидролиза различных растительных полисахаридов, входящих (помимо целлюлозы) в состав растительного сырья. Штамм Tr.longibrachiatum TW-1 (F-3634D) не является в данном случае исключением и имеет тот же недостаток, что и другие штаммы Trichodrema - а именно, он имеет относительно низкую продуктивность по карбогидразам, не являющимися целлюлазами (бета-глюканазы, ксиланазы, пектиназы, маннаназы).However, as follows from the information at our disposal obtained as a result of scientific research (OFCastellanos, APSinitsyn, E.Yu. Vlasenko. Comparative evaluation of hydrolytic efficiency towards microcrystalline cellulose of Penicillium and Trichoderma cellulases. Bioresource Technology, 1995, 52, 119-124), fungi of the genus Trichoderma, as a rule, have high productivity, mainly in relation to cellulases, but to a much lesser extent in relation to other carbohydrases (beta-glucanases, xylanases, pectinases, mannanases) necessary for the hydrolysis of various plant polysaccharides, included (in addition to cellulose) in races itelnogo raw materials. The strain Tr.longibrachiatum TW-1 (F-3634D) is not an exception in this case and has the same drawback as other Trichodrema strains - namely, it has a relatively low productivity for carbohydrases that are not cellulases (beta-glucanases, xylanases , pectinases, mannanases).

Задача, на решение которой направлено заявляемое изобретение, заключается в получении нового высокоактивного штамма мицелиальных грибов - продуцента мультиферментного комплекса, содержащего спектр карбогидраз.The problem to which the invention is directed, is to obtain a new highly active strain of mycelial fungi - producer of a multienzyme complex containing a spectrum of carbohydrases.

Технический результат, который может быть получен при осуществлении изобретения, заключается в обеспечении высокого уровня активности как целлюлаз, так и других компонентов комплекса - бета-глюканаз, ксиланаз, маннаназ и пектиназ в ферментационной среде при культивировании на простой и недорогой среде в присутствии высоких концентраций Сахаров.The technical result that can be obtained by carrying out the invention is to provide a high level of activity of both cellulases and other components of the complex — beta-glucanases, xylanases, mannanases and pectinases in a fermentation medium when cultured on a simple and inexpensive medium in the presence of high concentrations of sugars .

Сущность объекта изобретения - специально селекционированный штамм мицелиального гриба Trichoderma longibrachiatum TW-307 - продуцент комплекса карбогидраз, содержащего целлюлазы, бета-глюканазы, ксиланазы, пектиназы и маннаназы.The essence of the object of the invention is a specially selected strain of the mycelial fungus Trichoderma longibrachiatum TW-307 - producer of a complex of carbohydrases containing cellulases, beta-glucanase, xylanase, pectinase and mannanase.

Штамм гриба Tr.longibrachiatum TW-307 депонирован во Всероссийской коллекции микроорганизмов при Институте биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К.Скрябина РАН под № ВКМ F-3865D.The strain of the fungus Tr.longibrachiatum TW-307 is deposited in the All-Russian collection of microorganisms at the Institute of Biochemistry and Physiology of Microorganisms named after G.K.Skryabin RAS under the number VKM F-3865D.

Штамм получают с помощью многоступенчатого классического мутагенеза и селекции из исходной культуры Tr.reesei var longibrachioatum QM6a (BKM F-2047). Суспензию спор исходного штамма облучают ультрафиолетом. Облученные споры высевают на чашки Петри с селективными средами, основу которых составляет среда Гетчинсона с добавлением 0,5% карбоксиметилцеллюлозы (КМЦ), культивируют при 28°С в течение 2 суток и проводят окрашивание Конго Красным. Мутанты с улучшенной продукцией отбирают визуально по увеличенным зонам просветления вокруг колоний. Наиболее активные мутанты, отобранные на чашках, проверяют на продуктивность синтеза целлюлаз, бета-глюканаз, ксиланаз, пектиназ и маннаназ при культивировании в жидкой среде в колбах. Отобранные при культивировании в колбах наиболее активные варианты снова (многократно) подвергают облучению и селекции на чашках и колбах, как описано выше.The strain is obtained using multistage classical mutagenesis and selection from the original culture of Tr.reesei var longibrachioatum QM6a (BKM F-2047). The spore suspension of the original strain is irradiated with ultraviolet light. Irradiated spores are plated on Petri dishes with selective media, which are based on Hetchinson medium supplemented with 0.5% carboxymethyl cellulose (CMC), cultured at 28 ° C for 2 days, and Congo Red is stained. Mutants with improved production are selected visually for the increased areas of enlightenment around the colonies. The most active mutants selected on the plates are tested for the productivity of the synthesis of cellulases, beta-glucanases, xylanases, pectinases and mannanases when cultured in a liquid medium in flasks. The most active variants selected during cultivation in flasks are again (repeatedly) subjected to irradiation and selection on dishes and flasks, as described above.

Условия хранения: штамм может храниться в лиофилизированном состоянии в течение нескольких лет и/или на косячках с агаризованной средой Чапека или сусло-агаре при +4°С при обязательных пересевах не реже одного раза в течение 3-6 месяцев.Storage conditions: the strain can be stored in a lyophilized state for several years and / or on shoals with agarized Chapek’s medium or wort-agar at + 4 ° С with obligatory reseeding at least once for 3-6 months.

Культурально-морфологические признаки штамма.Cultural and morphological characteristics of the strain.

При росте на Мальц-агаре диаметр колонии достигает 80-90 мм на 7 сутки при росте при 25°С. Мицелий развит преимущественно субстратный, гиалиновый; воздушный скудный, белый.With growth on Maltz agar, the colony diameter reaches 80-90 mm on day 7 with growth at 25 ° C. Mycelium is developed mainly substrate, hyaline; airy meager, white.

Конидиальная зона сформирована многочисленными компактными подушечками диаметром до 2 мм, изначально белого цвета, с возрастом - зеленого. Обратная сторона - светло-зеленовато-желтая. Конидиеносцы неокрашенные, гладкостенные, формируются преимущественно на субстратном мицелии, главные ветви длинные и прямые, иногда извитые, до 5 мм шириной у основания, постепенно сужающиеся к вершине до 2 мкм ширины; боковые ветви образуются через неравные интервалы, обычно короткие, формируются под углом к вершине конидиеносцев. Фиалиды одиночные, булавовидные или широко бутыловидные, часто искривленные, размер - 5-10 ч 2-3 мкм. Конидии одноклеточные, зеленоватые, гладкостенные, эллипсоидальные, 4-7 ч 2,5-4 мкм, собраны в небольшие головки на вершинах фиалид.The conidial zone is formed by numerous compact pads with a diameter of up to 2 mm, originally white in color, green with age. The reverse side is light greenish yellow. Conidiophores are unpainted, smooth-walled, formed mainly on the substrate mycelium, the main branches are long and straight, sometimes crimped, up to 5 mm wide at the base, gradually tapering to the apex to 2 microns wide; lateral branches form at unequal intervals, usually short, are formed at an angle to the apex of the conidiophores. The phialides are single, club-shaped or broadly bottle-shaped, often curved, size - 5-10 h 2-3 microns. Conidia are unicellular, greenish, smooth-walled, ellipsoidal, 4-7 hours 2.5-4 microns, collected in small heads at the tops of the phialids.

При культивировании в глубинных условиях с использованием растворимых субстратов (глюкоза, фруктоза, лактоза) образуется рыхлый разветвленный мицелий со слабой пеллетизацией, удельная начальная скорость роста мицелия составляла 0,3 ч^-1, в конце культивирования 0,1 ч^-1.When cultured in deep conditions using soluble substrates (glucose, fructose, lactose), a loose branched mycelium with weak pelletization is formed, the specific initial growth rate of mycelium was 0.3 h ^-1 , at the end of cultivation 0.1 h ^-1 .

Физиолого-биохимические признаки штамма.Physiological and biochemical characteristics of the strain.

Мезофилен. Оптимальная температура роста мицелия 32°С (29-34°С), оптимум для образования целлюлаз 28°С (26-29°С). Оптимальные значения рН роста и секреции целлюлаз 3,5-5,0. Рост мицелия наблюдается и при рН 2,5, но при этом не наблюдается очень слабое образование целлюлаз и других карбогидраз.Mesophilen. The optimum mycelium growth temperature is 32 ° C (29-34 ° C), the optimum for cellulase formation is 28 ° C (26-29 ° C). The optimal pH of growth and secretion of cellulases is 3.5-5.0. The growth of mycelium is also observed at pH 2.5, but there is no very weak formation of cellulases and other carbohydrases.

Резистентность к нистатину слабая. При поверхностном культивировании устойчив к концентрации до 0,5 мкг/мл, при концентрации 2,5 мкг/мл рост полностью подавляется. При добавлении в среду дигитонина (3,5-4,0 мкг/мл) или бенгальского розового (30-50 мкг/мл) размер колоний уменьшается.Nystatin resistance is weak. With surface cultivation, it is resistant to concentrations up to 0.5 μg / ml, at a concentration of 2.5 μg / ml, growth is completely inhibited. When digitonin (3.5-4.0 μg / ml) or Bengal pink (30-50 μg / ml) is added to the medium, the colony size decreases.

Является прототрофом. Способен ассимилировать глюкозу, лактозу, глицерин, галактозу, ксилозу, D-маннит, маннозу, трегалозу, L- и D-арабинозу, сорбозу, сорбит, рибозу.It is a prototroph. It is able to assimilate glucose, lactose, glycerin, galactose, xylose, D-mannitol, mannose, trehalose, L- and D-arabinose, sorbose, sorbitol, ribose.

Не ассимилирует: L-рамнозу, D-глюкозамин, дезоксирибозу, дезоксигалактозу, 2-дезокси-D-глюкозу, 5-тио-D-глюкозу.Does not assimilate: L-ramnose, D-glucosamine, deoxyribose, deoxygalactose, 2-deoxy-D-glucose, 5-thio-D-glucose.

Использует аммонийный и органический азот, очень плохо ассимулирует нитратную форму азота.Uses ammonium and organic nitrogen, very poorly assimilates the nitrate form of nitrogen.

Образует ферментные системы, позволяющие расти на соответствующих комплексных субстратах: целлюлозе, крахмале, ксилане, ламинарине, бета-глюкане, лихенине, галактоманнане, пектине и хитине. Способен утилизировать молочную кислоту при концентрации ниже ингибирующей.It forms enzyme systems that allow it to grow on the corresponding complex substrates: cellulose, starch, xylan, laminarin, beta-glucan, lichenin, galactomannan, pectin and chitin. Able to utilize lactic acid at a concentration below inhibitory.

Катаболитная репрессия биосинтеза карбогидраз значительно снижена. Проверка катаболитной репрессии биосинтеза карбогидраз заключается в следующем. Конидии пересевают в пробирки с минимальной средой, содержащей минеральные соли, следовое количество (0,5 г/л) дрожжевого экстракта, аморфную целлюлозу, а также исследуемый репрессор или антиметаболит (глюкоза, 2-дезокси-D-глюкоза, лактоза, глицерин и др.). Диаметр пробирки - 9 мм, высота столбика агара 50-60 мм. Пробирку инкубируют 4 суток при 30°С и затем 20 ч при 45°С. Об устойчивости биосинтеза карбогидраз к катаболитной репрессии судят по глубине зоны деструкции аморфной целлюлозы (по размеру зоны просветления столбика агара в пробирке) в присутствии репрессора или антиметаболита).The catabolite repression of the biosynthesis of carbohydrases is significantly reduced. Verification of the catabolite repression of the biosynthesis of carbohydrase is as follows. Conidia are subcultured in test tubes with a minimal medium containing mineral salts, trace amount (0.5 g / l) of yeast extract, amorphous cellulose, as well as the test repressor or antimetabolite (glucose, 2-deoxy-D-glucose, lactose, glycerin, etc. .). The diameter of the test tube is 9 mm, the height of the agar column is 50-60 mm. The tube is incubated for 4 days at 30 ° C and then 20 hours at 45 ° C. The stability of the carbohydrase biosynthesis to catabolite repression is judged by the depth of the destruction zone of amorphous cellulose (by the size of the clarification zone of the agar column in vitro) in the presence of a repressor or antimetabolite).

Полученный мутант Tr.longibrachiatum BKM F-3865D по своим морфологическим признакам при росте на глюкозокартофельном агаре, на агаре для споруляции (СМ-агаре) отличается от исходного штамма Tr.reesei var longibrachiatum QM6a сниженной интенсивностью спороношения, цветом пигмента спор и окраской колонии (зеленовато-желтые) с обратной стороны при выращивании на агаризованных средах, более медленным ростом на твердых средах, повышенной способностью при глубинном культивировании на жидких средах к биосинтезу целлюлаз и других, кроме целлюлазы, карбогидраз - бета-глюканаз, ксиланаз, маннаназ и пектиназ.The obtained mutant Tr.longibrachiatum BKM F-3865D in its morphological characteristics when growing on glucose potato agar, on sporulation agar (CM agar) differs from the original strain Tr.reesei var longibrachiatum QM6a in reduced sporulation, color of colorectal pigment and spore pigment (yellow) on the reverse side when grown on agarized media, slower growth on solid media, increased ability to deep cellulose biosynthesis in liquid media, and carbohydrase-beta-glucose other than cellulase az, xylanases, mannanases and pectinases.

Данный вид мицелиального гриба не числится в качестве патогенного в "Положении о порядке учета, хранения, обращения, отпуска и пересылки культур бактерий, вирусов, риккетсий, грибов, простейших, микоплазм, бактериальных токсинов, ядов биологического происхождения".This type of mycelial fungus is not listed as pathogenic in the "Regulation on the procedure for recording, storing, handling, dispensing and sending cultures of bacteria, viruses, rickettsia, fungi, protozoa, mycoplasmas, bacterial toxins, poisons of biological origin."

Культивирование штамма Tr.longibrachiatum BKM F-3865D проводят в аэробных условиях в погруженном состоянии на питательной среде, содержащей один или несколько субстратов - источников углерода, являющихся индукторами биосинтеза ферментов. В качестве субстратов могут использоваться и субстраты, не являющиеся индукторами. Штамм способен в соответствующих условиях проведения процесса культивирования на основе использования растворимых субстратов, например глюкозы или лактозы, секретировать в культуральную среду комплекс ферментов - карбогидраз (целлюлаз, бета-глюканаз, ксиланаз, пектиназ и маннаназ). Глюкоза в среде культивирования может быть заменена более дешевым продуктом - гидролизатом крахмала.The cultivation of the strain Tr.longibrachiatum BKM F-3865D is carried out under aerobic conditions in a submerged state on a nutrient medium containing one or more substrates - carbon sources, which are inducers of enzyme biosynthesis. Non-inductor substrates can also be used as substrates. The strain is capable of secreting a complex of enzymes - carbohydrases (cellulase, beta-glucanases, xylanases, pectinases and mannanases) into the culture medium under appropriate conditions of the cultivation process based on the use of soluble substrates, for example glucose or lactose. Glucose in the cultivation medium can be replaced by a cheaper product - starch hydrolyzate.

Активность целлюлаз определяют по FPA (согласно рекомендации IUPAC, T.K.Ghose, Pure and Appl. Chem.,1987, vol.59, № 2, p.257-268), активность бета-глюканаз, ксиланаз, маннаназ и пектиназ в культуральной жидкости определяют по способности расщеплять бета-глюкан, ксилан, галактоманнан и полигалактуроновую кислоту, соответственно. За единицу δ-глюканазной, ксиланазной, маннаназной и пектиназной активностей принимают такое количество ферментов, которое в течение 1 мин при температуре 50°С и рН 5,0 освобождает 1 мкмоль редуцирующих сахаров, эквивалентных 1 мкмолю глюкозы и определяемых методом Сомоджи-Нельсона (А.П.Синицын, А.В.Гусаков, И.М.Черноглазов. Биоконверсия лигноцеллюлозных материалов, Учеб. пособие. М.: Изд-во МГУ, 1995, с.144-156).Cellulase activity is determined by FPA (according to the recommendations of IUPAC, TKGhose, Pure and Appl. Chem., 1987, vol. 59, No. 2, p. 257-268), the activity of beta-glucanases, xylanases, mannanases and pectinases in the culture fluid is determined by their ability to cleave beta-glucan, xylan, galactomannan and polygalacturonic acid, respectively. For a unit of δ-glucanase, xylanase, mannanase and pectinase activities, one takes such a number of enzymes that within 1 min at a temperature of 50 ° C and pH 5.0 it releases 1 μmol of reducing sugars equivalent to 1 μmol of glucose and determined by the Somogy-Nelson method (A .P.Sinitsyn, A.V. Gusakov, I.M. Chernoglazov, Bioconversion of lignocellulosic materials, Textbook, Moscow: Publishing House of Moscow State University, 1995, p.144-156).

Ферментные препараты, полученные с помощью предлагаемого штамма, могут быть использованы в виде культуральной жидкости, в виде жидких концентрированных препаратов, получаемых с помощью ультрафильтрации или упаривания культуральной жидкости, или в виде сухих препаратов, получаемых высушиванием или гранулированием.Enzyme preparations obtained using the proposed strain can be used in the form of a culture fluid, in the form of concentrated concentrated preparations obtained by ultrafiltration or evaporation of a culture fluid, or in the form of dry preparations obtained by drying or granulation.

Возможность использования изобретения иллюстрируется примерами, которые не ограничивают объем и сущность притязаний, связанных с ними.The possibility of using the invention is illustrated by examples, which do not limit the scope and essence of the claims associated with them.

Пример 1. Для получения посевного материала (инокулята) культуру гриба Tr.longibrachiatum BKM F-3865D выращивают на сусло- или СМ-агаре при 29°С в течение 7 суток и далее - при комнатной температуре на свету с течение 5 суток.Example 1. To obtain seed (inoculum), the culture of the fungus Tr.longibrachiatum BKM F-3865D is grown on wort or CM agar at 29 ° C for 7 days and then at room temperature in the light for 5 days.

Засев колб проводят 1 мл суспензии спор, смытых с агара водой, содержащей 0,1% твина-80. Культивирование штамма осуществляют в аэробных условиях в качалочных колбах Эрленмейера объемом 750 мл, содержащих 100 мл жидкой среды следующего состава, в г/л: свекловичный жом - 40,0; солодовые ростки - 14,0; (NH₄)₂SO₄ - 6,0; КН₂PO₄ - 2,0; MgSO₄×7H₂O - 0,6; рН 4,2. Колбы инкубируют на качалке при 29°С и 200 об/мин в течение 120 ч.Inoculation of flasks is carried out with 1 ml of a suspension of spores washed with agar with water containing 0.1% Tween-80. The cultivation of the strain is carried out under aerobic conditions in Erlenmeyer rocking flasks with a volume of 750 ml, containing 100 ml of a liquid medium of the following composition, in g / l: beet pulp - 40.0; malt sprouts - 14.0; (NH ₄ ) ₂ SO ₄ - 6.0; KH ₂ PO ₄ - 2.0; MgSO ₄ × 7H ₂ O - 0.6; pH 4.2. The flasks are incubated on a rocking chair at 29 ° C and 200 rpm for 120 hours.

Активность целлюлаз, бета-глюканаз, ксиланаз, пектиназ и маннаназ составляет 8, 28, 25, 8 и 1 ед/мл соответственно.The activity of cellulases, beta-glucanases, xylanases, pectinases and mannanases is 8, 28, 25, 8 and 1 unit / ml, respectively.

Пример 2. Культивирование осуществляют в качалочных колбах Эрленмейера как описано в примере 1, используя жидкую питательную среду следующего состава, в г/л: МКЦ - 4,0; лактоза - 20,0; (NH₄)₂SO₄ - 6,0; КН₂PO₄ - 2,0; MgSO₄×7H₂O - 0,6; рН 4,2. Колбы инкубируют на качалке при 29°С и 200 об/мин в течение 120 ч.Example 2. Cultivation is carried out in Erlenmeyer rocking flasks as described in example 1, using a liquid nutrient medium of the following composition, in g / l: MCC - 4.0; lactose - 20.0; (NH ₄ ) ₂ SO ₄ - 6.0; KH ₂ PO ₄ - 2.0; MgSO ₄ × 7H ₂ O - 0.6; pH 4.2. The flasks are incubated on a rocking chair at 29 ° C and 200 rpm for 120 hours.

Активность целлюлаз, бета-глюканаз, ксиланаз, пектиназ и маннаназ составляет на 120 ч культивирования 8, 35, 30, 10 и 2 ед/мл соответственно.The activity of cellulases, beta-glucanases, xylanases, pectinases and mannanases for 120 hours of cultivation is 8, 35, 30, 10 and 2 units / ml, respectively.

Пример 3. Культивирование осуществляют в качалочных колбах Эрленмейера на среде как описано в примере 1, используя жидкую питательную среду следующего состава, в г/л: МКЦ - 20; глюкоза - 20,0; кукурузный экстракт - 60; (NH₄)₂SO₄ - 6,0; KH₂PO₄ - 2,0; MgSO₄×7H₂O - 0,6; рН 4,2. Колбы инкубируют на качалке при 29°С и 200 об/мин в течение 120 ч.Example 3. Cultivation is carried out in Erlenmeyer rocking flasks on a medium as described in example 1, using a liquid nutrient medium of the following composition, in g / l: MCC - 20; glucose - 20.0; corn extract - 60; (NH ₄ ) ₂ SO ₄ - 6.0; KH ₂ PO ₄ - 2.0; MgSO ₄ × 7H ₂ O - 0.6; pH 4.2. The flasks are incubated on a rocking chair at 29 ° C and 200 rpm for 120 hours.

Активность целлюлаз, бета-глюканаз, ксиланаз, пектиназ и маннаназ составляет на 120 ч культивирования 14, 80, 95, 11 и 2 ед/мл соответственно.The activity of cellulases, beta-glucanases, xylanases, pectinases and mannanases for 120 hours of cultivation is 14, 80, 95, 11 and 2 units / ml, respectively.

Пример 4. Культивирование осуществляют в качалочных колбах Эрленмейера на среде состава, приведенного в примере 3, но с исходными значениями рН 6,0.Example 4. Cultivation is carried out in Erlenmeyer rocking flasks on the medium of the composition shown in example 3, but with initial pH values of 6.0.

Активность целлюлаз, бета-глюканаз, ксиланаз, пектиназ и маннаназ составляет на 120 ч культивирования 8, 105, 250, 9 и 1 ед/мл соответственно.The activity of cellulases, beta-glucanases, xylanases, pectinases and mannanases for 120 hours of cultivation is 8, 105, 250, 9 and 1 u / ml, respectively.

Пример 5. Проводят процесс культивирования в ферментере типа АНКУМ 2М с рабочим объемом 6,0 л. Аэрация составляет 1 объем воздуха на 1 объем среды в ферментере. Ферментер инокулируют 500 мл вегетативного мицелия, полученного через 36 ч культивирования на качалочных колбах Эрленмейера (по примеру 1).Example 5. A cultivation process is carried out in an ANKUM 2M type fermenter with a working volume of 6.0 l. Aeration is 1 volume of air per 1 volume of medium in the fermenter. The fermenter is inoculated with 500 ml of vegetative mycelium obtained after 36 hours of cultivation on Erlenmeyer rocking flasks (as in Example 1).

Первую фазу культивирования (на которой гриб главным образом растет и накапливает биомассу) осуществляют в течение 24-36 ч при 32°С и рН 4,2 на жидкой питательной среде следующего состава, в г/л: МКЦ - 5,0; глюкоза - 50,0; кукурузный экстракт - 60,0; (NH₄)₂SO₄ - 6,0; KH₂PO₄ - 3,0; MgSO₄×7H₂O - 0,6. Через 24-36 ч начинают вторую фазу культивирования (на протяжении которой происходит накопление ферментов в среде роста). На второй фазе ферментации (фаза биосинтеза внеклеточных ферментов) в ферментер непрерывно добавляют лактозу так, чтобы ее концентрация в среде не превышала уровня 1-2 г/л. Температуру во второй фазе поддерживают 28°С, а рН - 4,2. Ферментация заканчивается через 120 ч, к концу ферментации первоначальный объем среды в ферментере увеличивается за счет вносимого раствора лактозы на 50% и составляет 9-9,5 л.The first phase of cultivation (in which the fungus mainly grows and accumulates biomass) is carried out for 24-36 hours at 32 ° C and pH 4.2 on a liquid nutrient medium of the following composition, in g / l: MCC - 5.0; glucose - 50.0; corn extract - 60.0; (NH ₄ ) ₂ SO ₄ - 6.0; KH ₂ PO ₄ - 3.0; MgSO ₄ × 7H ₂ O - 0.6. After 24-36 hours, the second phase of cultivation begins (during which the accumulation of enzymes in the growth medium). In the second phase of fermentation (the phase of biosynthesis of extracellular enzymes), lactose is continuously added to the fermenter so that its concentration in the medium does not exceed the level of 1-2 g / l. The temperature in the second phase is maintained at 28 ° C, and the pH is 4.2. Fermentation ends after 120 hours, by the end of fermentation, the initial volume of medium in the fermenter increases due to the introduced lactose solution by 50% and amounts to 9-9.5 liters.

Активности целлюлаз, бета-глюканаз, ксиланаз, пектиназ и маннаназ составляют на 110-120 ч культивирования 32, 620, 580, 25 и 28 ед/мл соответственно.The activities of cellulases, beta-glucanases, xylanases, pectinases and mannanases for 110-120 hours of cultivation are 32, 620, 580, 25 and 28 units / ml, respectively.

Пример 6. Проводят процесс культивирования в ферментере типа АНКУМ 2М с рабочим объемом 6,0 л. Аэрация составляет 1 объем воздуха на 1 объем среды в ферментере. Ферментер инокулируют 500 мл вегетативного мицелия, полученного через 36 ч культивирования на качалочных колбах Эрленмейера (по примеру 3).Example 6. A cultivation process is carried out in an ANKUM 2M type fermenter with a working volume of 6.0 l. Aeration is 1 volume of air per 1 volume of medium in the fermenter. The fermenter is inoculated with 500 ml of vegetative mycelium obtained after 36 hours of cultivation on Erlenmeyer rocking flasks (according to Example 3).

Первую фазу культивирования (накопление биомассы гриба) осуществляют в течение 24-36 ч при 32°С при рН 6,0 на жидкой питательной среде следующего состава, в г/л: глюкоза - 20,0; кукурузный экстракт - 120; ферментативный гидролизат крахмала амилосубтилином (600 мл на 6 л среды, начальная концентрация восстанавливающих сахаров в среде 4,9-5,5%) (NH₄)₂SO₄ - 6,0; KH₂PO₄ - 3,0; MgSO₄×7H₂O - 0,6. На второй фазе в ферментер непрерывно добавляют лактозу так, чтобы ее концентрация в среде не превышала уровня 1-2 г/л. Температуру во второй фазе поддерживают 32°С, а рН - 6,0. В процессе ферментации через 60 ч после ее начала в среду вносят минеральные соли в количестве, которое добавляли в начале процесса культивирования. Ферментация заканчивается через 120 ч, к концу ферментации первоначальный объем среды в ферментере увеличивается за счет вносимого раствора лактозы на 50% и составляет 9-9,5 л.The first phase of cultivation (accumulation of fungal biomass) is carried out for 24-36 hours at 32 ° C at pH 6.0 in a liquid nutrient medium of the following composition, in g / l: glucose - 20.0; corn extract - 120; enzymatic starch hydrolyzate with amylosubtilin (600 ml per 6 l of medium, initial concentration of reducing sugars in the medium is 4.9-5.5%) (NH ₄ ) ₂ SO ₄ - 6.0; KH ₂ PO ₄ - 3.0; MgSO ₄ × 7H ₂ O - 0.6. In the second phase, lactose is continuously added to the fermenter so that its concentration in the medium does not exceed the level of 1-2 g / l. The temperature in the second phase is maintained at 32 ° C, and the pH is 6.0. In the fermentation process, 60 hours after its start, mineral salts are added to the medium in an amount that was added at the beginning of the cultivation process. Fermentation ends after 120 hours, by the end of fermentation, the initial volume of medium in the fermenter increases due to the introduced lactose solution by 50% and amounts to 9-9.5 liters.

Через 120 ч ферментации активность целлюлаз, бета-глюканаз, ксиланаз, пектиназ и маннаназ составляет 30,0; 810, 2500, 33 и 30 ед/мл соответственно.After 120 hours of fermentation, the activity of cellulases, beta-glucanases, xylanases, pectinases and mannanases is 30.0; 810, 2500, 33, and 30 units / ml, respectively.

Таким образом, предлагаемый штамм Tr.longibrachiatum BKM F-3865D обладает способностью продуцировать комплекс, содержащий ферменты высокого уровня активности и состоящий из карбогидраз - целлюлаз, бета-глюканаз, ксиланаз, маннаназ и пектиназ. Это создает возможность получения полного комплекса ферментов для гидролиза полисахаридов растительного сырья, а также при необходимости - отдельных индивидуальных ферментов (компонентов) комплекса.Thus, the proposed strain Tr.longibrachiatum BKM F-3865D has the ability to produce a complex containing enzymes of a high level of activity and consisting of carbohydrases - cellulases, beta-glucanases, xylanases, mannanases and pectinases. This makes it possible to obtain a complete complex of enzymes for hydrolysis of polysaccharides of plant materials, as well as, if necessary, individual individual enzymes (components) of the complex.

Для достижения высокой продуктивности штамма не требуется применения сложных и дорогих питательных сред. Для культивирования могут использоваться питательные среды, традиционно применяемые в промышленных технологиях получения такого рода ферментных препаратов.To achieve high productivity of the strain does not require the use of complex and expensive nutrient media. For cultivation, nutrient media traditionally used in industrial technologies for producing such enzyme preparations can be used.

Препараты, получаемые на основе предлагаемого штамма, позволяют существенно увеличить эффективность и расширить спектр использования ферментных препаратов в различных областях биотехнологии и, особенно, в качестве кормовых добавок.The preparations obtained on the basis of the proposed strain can significantly increase the efficiency and expand the range of use of enzyme preparations in various fields of biotechnology and, especially, as feed additives.

Claims (1)

Штамм мицелиального гриба Trichoderma longibrachiatum BKM F-3865D (Всероссийская коллекция микроорганизмов при ИБФМ им. Г.К.Скрябина РАН) - продуцент комплекса карбогидраз, содержащего целлюлазы, бета-глюканазы, ксиланазы, маннаназы и пектиназы.The strain of mycelial fungus Trichoderma longibrachiatum BKM F-3865D (All-Russian Collection of Microorganisms at the IBPM named after G.K.Skryabin RAS) is a producer of a complex of carbohydrases containing cellulases, beta-glucanase, xylanase, mannanase and pectinase.