RU2285525C2

RU2285525C2 - Лекарственное средство, содержащее эффектор метаболизма глутатиона вместе с альфа-липоевой кислотой, для терапии при пересадке почек

Info

Publication number: RU2285525C2
Application number: RU2003137772/15A
Authority: RU
Inventors: Михель ТЕГЕР (DE); Михель Тегер; Зигфрид АНЗОРГЕ (DE); Зигфрид Анзорге; Герхард ФРИС (DE); Герхард ФРИС; Дитер КОЕГСТ (DE); Дитер КОЕГСТ
Original assignee: Зерумверк Бернбург Аг
Priority date: 2001-05-28
Filing date: 2002-05-24
Publication date: 2006-10-20
Also published as: BR0209732A; ES2237683T3; RU2003137772A; HK1063606A1; CA2446673A1; DE10125883A1; PT1392285E; US7531567B2; MXPA03010833A; JP4245926B2; PE20030090A1; US20040127550A1; WO2002096414A1; ATE288750T1; DE10292279D2; DE50202227D1; EP1392285A1; AR034336A1; DK1392285T3; JP2004535410A

Abstract

Изобретение относится к области медицины и органической химии и касается комбинированного лекарственного препарата для лечения нарушения тиол-дисульфидного статуса при пересадке почек, содержащего эффектор метаболизма глутатиона амброксол, α-липоевую кислоту и добавки, а также применения ингибиторов ангиотензин-превращающего фермента каптоприла, эналаприла и рамиприла или амброксола вместе с α-липоевой кислотой для получения лекарственного средства для лечения нарушения тиол-дисульфидного статуса при пересадке почек Изобретение обеспечивает повышение эффективности лечения. 3 н. и 11 з.п. ф-лы, 7 ил., 7 табл.

Description

Изобретение относится к применению комбинации α-липоевой кислоты и эффекторов метаболизма глутатиона для лечения нарушений клеточного статуса тиола и сопровождающихся этим заболеваний в терапии при пересадке почек.

Тонкое регулирование тиол-дисульфидного статуса представляет одно из важнейших основных условий успеха биологического обмена веществ. Центральным элементом регулирования в этой системе является трипептид глутатиона, внутриклеточная концентрация в восстановленной форме достигает относительно высоких значений (до 10 мМ). Кроме глутатиона, другими важными элементами тиол-дисульфидного статуса каждой клетки являются содержащие тиоловые группы внутриклеточные белки, и особенно в связанной с клеточной мембраной форме.

Метаболизм дисульфидного расщепления и образования тиоловых групп, регулируемый различными классами ферментов, во всем многообразии своих биологических функций, в том числе в процессах клеточного роста и дифференциации, включая запрограммированную гибель клетки, а также механизмы защиты клеток и отравления, в исправном состоянии обязателен для каждой нормальной клеточной функции. Нарушения в этой системе и изменения концентрации тиолов ведут к серьезным нарушениям клеточных функций, которые только в отдельных случаях являются локально ограниченными, однако, как правило, затрагивают организм в целом.

Роль нарушенного тиол-дисульфидного статуса при острых и хронических. заболеваниях была подтверждена множеством исследований.

Так, например, в определенных нервных клетках три нейродегенеративных заболеваниях, таких как болезнь Паркинсона, наблюдались заметные изменения тиолового обмена (Brain Res. Rev. 1997; 25:335-358). Имеются четкие указания на то, что эти обменные нарушения ведут к увеличенной гибели нервных клеток, определяющих симптоматику заболевания, в функционально поврежденных отделах головного мозга, базальных ганглий (Ann. Neurol 1994:36:348-355).

Сниженный уровень глутатиона или, соответственно, пониженное внутриклеточное содержание глутатиона было обнаружено, кроме того, при заболеваниях сосудов и их последствий: артериосклероза и инфаркта сердца, - в эндотелиальных клетках, находящихся на внутренних стенках сосудов (Med. Sci. Res. 1998; 26:105-106).

Легочные заболевания, которые сопровождаются перестройкой легочной ткани, связаны обычно с дефицитом глутатиона в тканях. При подобном фиброзе легких тяжелая степень заболевания протекает параллельно с потерей тиола (Clin. Chim. Abta 1997; 265:113-119). Тяжелые воспалительные легочные заболевания, исследованные на примере острых синдромов удушья у взрослых, сопровождаются дисрегуляцией тиолового обмена принимающих в нем участие воспаленных клеток (гранулоцитов) (Chest 1996; 109:163-166).

Иммунокомпетентные защитные клетки бронхиальной системы (альвеолярные макрофаги) курильщиков и пациентов с хроническими обструктивными заболеваниями дыхательных путей имеют согласно собственным исследованиям сильный дефицит клеточного тиола. При этом степень нарушения клеточного статуса "тиола прямо коррелирует с ограничениями функций легких (Free Radio Biol. Med. 2000; 29:1160-1165).

В последние годы, кроме того, были получены многочисленные свидетельства нарушения тиолового обмена при хронических заболеваниях почек (Ren. Fail. 1998; 20:117-124), анемии (Br. J. Haematol. 1995; 91:811-819), у недоношенных младенцев (Pediptr. Pulmonol. 1995; 20:160-166), при вызванной шумом потери слуха (Brain. Res. 1998; 784:82-90), при воспалительных кишечных заболеваниях (Gut. 1998; 42:485-492), а также при сахарном диабете (Metabolism: Clinical and Experimental 1998; 47(8):993-997).

Обширные исследования роли глутатионового обмена при вирусных инфекциях обнаружили как более плохие прогнозы для тиол-дефицитных клеток, основывающиеся на поврежденной клеточной защите, так и антивирусную, тормозящую размножение вирусов функцию глутатиона (Proc. Natl. Acad. Sci USA 1997; 94:1967-1972).

Клеточная иммунная система человека, состоящая из белых кровяных телец гранулоцитов, лимфоцитов и моноцитов, является системой, особенно чувствительно реагирующей на нарушение тиолового обмена.

Минимальные изменения, в частности потеря клеточного глутатиона, могут запустить лавинообразную программу саморазрушения клетки, запрограммированную гибель клетки (апоптоз) (FASEB J 1998; 12:479-486). Тиол-дисульфидный обмен действует здесь как центральное исполнительное звено интактной иммунной системы, без которой организм не был бы жизнеспособен.

Собственные исследования показали, что особенно в условиях сильно ограниченной функции почек и, тем самым, требующей терапии при пересадке почек в форме гемо- или перитонального диализа, клеточный тиол-дисульфидный обмен сильно нарушен. Это нарушение приводит, помимо прочего, к существенной потере нормальных клеточных функций, таких как фагоцитарная способность перитональных макрофагов или активирующая способность лимфоцитов. У этих пациентов закономерно обнаруживалась, помимо возникающего локального иммунодефицита, отличающегося частыми инфекциями брюшной полости, также и заметно пониженная иммунологическая защита с повышением общей подверженности инфекциям. Здесь описаны, в частности, нарушения функций и пониженная активирующая способность лимфоцитов и макрофагов, а также дисбаланс иммунорегулирующих цитокинов (Immunobiol. 1999; 200:62-76).

Коррекция нарушенного тиолового обмена приобретает поэтому решающее значение в качестве основной терапии при лечении множества заболеваний различного происхождения, однако особенно в условиях необходимой терапии при пересадке почек.

α-Липоевая кислота до настоящего времени с относительным успехом применяется как нейропротекторное вещество для лечения обусловленных нейротоксическими причинами парестезии при диабетической полинейропатии (Diabetologica 1995; 38:1425-14 (33, Diabetes Res. Clin. Pract. 1995;29:19-26, Diab Care 1999; 22:1296-1301, Drug. Metab. Rev. 1997; 29:1025-1054, DE 4343592 C2). Из DE 4447599 C2 и ЕР 0530446 B1 известно, кроме того, применение α-липоевой кислоты при других нейрональных нарушениях, включая тиннитус и нарушения слуха.

Механизм цитопротективного действия основан наряду с влиянием зависящей от сахара модификации белка (глюкозилирование белков), а также снижением нейротоксичного генеза кетоновых телец в конечном счете на антиооксидантной функции α-липоевой кислоты и ее метаболитов (Free Radic Biol. Med. 1995; 19:227-250).

Эта защитная функция клеток была исследована, в частности, с точки зрения предотвращения окислительной перестройки незаменимых ненасыщенных жирных кислот. Такое подавление пероксидации липидов представляет помимо применения α-липоевой кислоты как нейропротективного вещества основу для применения в качестве медикамента для защиты печени при различных интоксикациях и заболеваниях печени (Biochemistry 1998; 37:1367-1364).

Кроме этого, было показано, что α-липоевая кислота торморит размножение ВИЧ на различных стадиях развития, и тем самым, прогрессирование СПИДа. Однако результаты этих лабораторных исследований могут быть перенесены на клинические испытания только ограниченно (FEBS-Lett 1996; 394:9-13). Это же справедливо для указания на противовоспалительную функцию вещества для генерирующих инсулин островных клеток поджелудочной железы (Agents Actions 1993; 38:60-65).

В ЕР 0812590 А2, а также ЕР 0427247 В1 раскрывается применение α-липоевой кислоты в качестве цитопротективного вещества, противоболевого средства, а также в качестве лекарственного средства для воспалительных заболеваний.

Антиоксидантные свойства α-липоевой кислоты основаны наряду с ее способностью образовывать хелаты с ионами металлов непосредственно на связывании радикалов особенно на ее функции в качестве сильного восстановителя. Для проведения этой реакции внутриклеточно α-липоевая кислота должна сама находиться в восстановленной форме в виде дигидролипоевой кислоты. Перевод (дисульфидной) α-липоевой кислоты в дитиоловую форму восстановлением дигидролипоевой кислоты требует со свой стороны восстанавливающего эквивалента, причем этот процесс, кроме прочего, катализируется ферментом глутатион-редуктазой (Gen Pharmacol 1997; 29:315-331). Это, очевидно, является причиной неудовлетворительного, с точки зрения восстановления тиола, действия вещества.

Заявка DE 4420102 А1 описывает комбинацию лекарственных средств из α-липоевой кислоты и веществ, способствующих сердечному кровообращению, в частности, органического нитрата, антагониста кальция, АСЕ-ингибитора или оксифедрина. Комбинация лекарственных средств должна применяться для лечения сердечно-сосудистых заболеваний, а также заболеваний, обусловленных диабетом.

Амброксол, т.е. транс-4-(2-амино-3,5-дибромбензиламино)-циклогексангидрохлорид, применяется в различных формах введения при бронхолегочных заболеваниях как растворяющее слизь лекарственное средство (WO 96/33704, GB 2239242, WO 01/05378). Кроме того, из патента DE 3530761 известно его применение при гиперурикемии. Действие амброксола как муколитического средства основывается как на стимуляции образования ПАВ бронхиальных клеток, так и особенно на способности улавливать свободные радикалы (Respir. Med. 1998; 92:609-23). Базирующаяся на этом антиоксидантная активность вещества была доказана преимущественно для легочных клеток (Pharmacol. 1999:59:135-141), но также и при воспалительных механизмах (Inflamm. Res. 1999; 48:86-93). Далее, известно, что in vitro добавлением амброксола в высоких дозах непосредственно влияют на регулирующие ферменты обмена глутатиона, а также ингибируются пероксидные процессы (Arch. Vet. Pol. 1992; 32:57-66).

Ингибитор ангиотензин-превращающего фермента (Angiotensin-Converting Enzyme Inhibitors, АСЕ-ингибитор) с большим успехом применяется при лечении широкого спектра кардиоваскулярных заболеваний. Причина используемого понижающего кровяное давление действия основана на ингибировании превращения ангиотензина I в ангиотензин II. Исходя из этого АСЕ-ингибиторы описываются также как эффекторы глутатионового обмена. Наряду с исследованиями относящихся к этому эффектов при сердечно-сосудистых заболеваниях (J. Cardiovasc. Pharmacol. 2000; 36:503-509) исследовались общие принципы регулирования (Clin. Nephtol. 1997; 47:243-247). Следует различать действия АСЕ-ингибиторов, имеющих SH-группы, например каптоприл (1-[(2S)-3-меркапто-2-метилпропионил]-L-пролин) от не содержащих SH-группы ACE-ингибиторов, как например, эналаприл (1-{N[(S)-1-этоксикарбонил-3-фенилпропил]-L-аланил]-L-пролин). Первые реагируют непосредственно антиоксидантно как улавливатели радикалов, в то время как не содержащие SH-группы АСЕ-ингибиторы к этому не способны. Обе группы вместе влияют на глутатионовый редокс-цикл путем регулирования глутатион-редуктазы и глутатион-пероксидады, а также, кроме того, супер-оксиддисмутазы. (Am. J. Physiol. Regulatory Integrative Comp. Physiol. 2000; 278:572-577).

Поэтому задачей настоящего изобретения является получение лекарственных средств, содержащих тиол-активные вещества нового рода, для улучшенной стабилизации нарушенного тиол-дисульфидного статуса, в частности при почечной недостаточности, в рамках терапии при пересадке почек, и для восстановления вызванной этим потери функций.

Поставленная задача решается лекарственным средством согласно изобретению с признаками, описанными в п.1 формулы изобретения. В п.13 описано применение активного вещества для получения лекарственного средства. Дальнейшие зависимые пункты характеризуют соответственно предпочтительные модификации.

При этом согласно изобретению эффекторы метаболизма глутатиона используются в комбинации с α-липоевой кислотой, ее солями и/или ее пролекарствами.

Неожиданно было показано, что использованием применяющейся согласно изобретению комбинации α-липоевой кислоты и эффектора метаболизма глутатиона достигается нормализация первоначально пониженного тиолового статуса иммунных клеток. Тиол-стабилизирующее действие комбинаций при этом не только регулярно превосходило применение одной α-липоевой кислоты или соответствующих эффекторов, напротив, наблюдались также супераддитивные эффекты. Восстановление статуса тиола охватывало при этом как внутриклеточные тиолы, так и связанные на мембранах SH-группы, и оно является поэтому проявлением сложной биологической регуляции. Этот феномен основан на том, что эффекторы глутатионового обмена, с одной стороны, улавливают промежуточные возникающие свободные радикалы, а с другой стороны, повышают готовность окисляющего эквивалента к превращению α-липоевой кислоты из дисульфидной в восстановленную форму и, тем самым, улучшают вызывающее синтез действие α-липоевой кислоты на тиол-дисульфидный статус.

Кроме того, стало ясно, что повышающее уровень тиола действие комбинации эффекторов метаболизма глутатиона и α-липоевой кислоты происходит только в первично тиол-дефицитных иммунных клетках. Здоровые иммунные клетки, которые не обнаруживают никакого изменения тиол-дисульфидного статуса, не реагируют с дальнейшим повышением концентрации SH-групп.

Восстановление тиолового статуса иммунных клеток сопровождалось нормализацией функциональных параметров. Это касалось, в частности, иммуномодуляторных эффектов в рамках активирующей способности Т-лимфоцитов.

Кроме того, было показано, что применяемые согласно изобретению комбинации стабилизируют тиол-дисульфидный статус других иммунных клеток, а именно перитонеальных макрофагов у подвергающихся диализу пациентов. До лечения комбинацией α-липоевая кислота/амброксол или α-липоевая кислота/АСЕ-ингибитор перитонеальные макрофаги отличались, помимо дефицитного тиолового статуса, почти полной потерей функции своих фагоцитов, а также сильным нарушением дифференциации и синтеза цитокинов, которые описаны как причина высоких скоростей инфицирования у таких пациентов. Эти потери функций могли быть ликвидированы добавлением названных согласно изобретению комбинаций.

Особенно пригодно это лекарственное средство для терапии при пересадке почек, а также для других картин заболеваний, при которых происходит нарушение тиол-дисульфидного статуса иммунных клеток. При этом лечение может проводиться одновременно, в раздельных препаративных формах или также разделенных по времени.

Применяемые согласно изобретению комбинированные препараты могут вводиться в обычных фармакологических формах введения или через капельницу, как с профилактическими, так и с лечебными целями. Эффективную дозу при этом следует устанавливать в зависимости от конкретного случая. Предпочтительно при применении в медицине человека она составляет для пациентов ют 30 и до 1200 мг/сутки, особенно предпочтительно от 200 до 600 мг/сутки.

В одном варианте в качестве эффектора метаболизма глутатиона применяется амброксол общей формулы I

его соль и/или его пролекарство. При этом доза амброксола для применения в медицине человека находится предпочтительно между 7,5 и 90 мг/сутки, особенно предпочтительно между 60 и 75 мг/сутки.

В другом варианте в качестве эффектора метаболизма глутатиона применяется ингибитор ангиотензин-превращающего ферментра (АСЕ-ингибитор). В этом случае предпочтительная доза для применений в медицине человека составляет от 0,2 до 20 мг/сутки.

В качестве АСЕ-ингибиторов могут при этом применяться, например, следующие соединения:

А) 1-[(2S)-3-меркапто-2-метилпропионил]-L-пролин (каптоприл) формулы II

В) 1-{N-[(S)-1-этоксикарбонил-3-фенилпропил]-L-аланил}-L-пролин (эналаприл) формулы III

С) (2S,3aS,6aS)-1-{(S)-N-[(S)-1-этоксикарбонил-3-фенилпропил]аланил}октагидроциклопента[b]пиррол-2-карбоновая кислота (рамиприл) формулы IV

Лекарственные средства могут вводиться орально или также парентерально.

Дополнительно лекарственное средство может содержать обычные добавки. К ним относятся, например, водные растворители, стабилизаторы, суспензионные, дисперсионные и смачивающие средства.

Лекарственное средство может приготавливаться в любых лекарственных формах. Например, к ним относятся растворы, гранулаты, порошки, эмульсии, таблетки и/или таблетки с оболочкой.

Согласно изобретению эффектор метаболизма глутатиона применяется вместе с α-липоевой кислотой, ее солью и/или ее пролекарствами для получения лекарственного средства для лечения нарушения тиол-дисульфидного статуса иммунных клеток в терапии при пересадке почек.

Равным образом эффектор метаболизма глутатиона может использоваться вместе с α-липоевой кислотой, ее солью и/или ee пролекарствами для получения лекарственного средства для иммуномодуляторного, противовоспалительного и/или повышающего защитные силы организма лечения.

Компоненты комбинированного препарата могут находиться при этом как в единой лекарственной форме, так и в раздельных формах.

Применение согласно изобретению комбинации α-липоевой кислоты и эффекторов глутатионового обмена более детально описано с помощью следующих примеров и фигур.

Пример 1

Влияние на статус клеточного тиола периферических иммунных клеток человека

Периферические иммунные клетки здоровых доноров (n=9) выделяли центрифугированием по градиенту плотности из периферической крови. При этом основная фракция полученной суммарной популяции мононуклеарных клеток является обычно лимфоцитами с относительной долей мононуклеарных клеток в зависимости от донора около 90%. 10% мононуклеарных клеток замещалось моноцитами.

Полученные мононуклеарные клетки помещались в специальную среду клеточной культуры и инкубировались в дезинсекционном инкубаторе при 37°С, относительной влажности воздуха 98% и относительном содержании СО₂ в воздухе 5%. Обмен веществ первоначально покоящихся иммунных клеток активировался митогенной стимуляцией (0,5 мкг/мл фитогемаглутинина). Чтобы проверить влияние применяемых согласно изобретению комбинаций на статус тиола тиол-дефицитных иммунных клеток, в них искусственно понижался уровень тиола. Это происходило путем культивирования в тиол-дефицитных средах (RPMI 1603). Сравнительные культуры при применении полных сред (RPMI 1640) служили для определения наилучших нормальных значений, возможных в условиях культуры.

Определение межклеточного содержания тиола на уровне отдельной клетки происходило с помощью применения 5-хлорметилфлуоресцеин диацетата (CMFDA) путем проточной цитофлуорометрии.

При этом сначала нефлуорогенный CMFDA пассивно отбирался из клетки. По хлорметиловому остатку происходит связывание с цитоплазматическими тиоловыми группами. После отделения ацетатного остатка неспецифическими клеточными эстеразами этот теперь с непроницаемой клеточной мембраной комплекс становился флуорогенным с длиной волны возбуждения λ_ех=490 нм и длиной волны испускания λ_em=520 нм. Средняя интенсивность флуоресценции пробы (10000 клеток) прямо пропорциональна концентрации внутриклеточных тиоловых групп.

Экспрессия связанных в мембране тиоловых групп устанавливалось также с помощью проточной цитофлуорометрии, при этом хлорметилтетраметилродамин (CMTMR) применялся в условиях блокированного потенциала мембраны, а также пониженной диффузионной способности клетки тиолового конъюгата. Интенсивность флуоресценции связанных фторхромовых молекул на клеточной мембране при этом снова была пропорциональна количеству тиоловых групп на поверхности клетки.

На фиг.1 показано влияние комбинации α-липоевой кислоты и амброксола (фиг.1а), а также α-липоевой кислоты и эналаприла (фиг.1b) на экспрессию внутриклеточных тиолов лимфоцитов. Следующая таблица показывает результаты для комбинации α-липоевой кислоты и каптоприла. Данные представлены как отношение клеточной интенсивности флуоресценции к соответствующим анализированным параллельно калибровочным частицам (каплям). Концентрация активного вещества соответствующей комбинации идентична концентрациям отдельных компонентов.

Экспрессия внутриклеточных тиолов [СИФ_{капли/отнош.}]
Возраст культуры [сутки]	Контроль	а-липоевая кислота [50 мкМ]	Каптоприл [10 мкМ]	α-липоевая кислота + каптоприл
0	2,88±0,20	2,88±0,20	2,88±0,20	2,88±0,20
1	2,31±0,20	2,81±0,23	2,80±0,21	2,89±0,31
2	1,98±0,16	2,76±0,50	2,76±0,22	2,92±0,32
3	1,63±0,15	2,63±0,60	2,49±0,26	2,88+0,41
4	1,30±0,16	2,41±0,40	2,21±0,36	2,91±0,39
6	1,10±0,13	2,23±0,50	1,83±0,33	2,93±0,35
8	0,95±0,10	2,02+0,30	1,02±0,39	2,93±0,41
10	0,81±0,10	1,89±0,30	0,91±0,46	2,90±0,45
12	0,69±0,10	1,86±0,68	0,76±0,49	2,88±0,49
14	0,65±0,08	1,83±0,60	0,75±0,56	2,86±0,47

Периферические иммунные клетки культивировались в течение 4 дней в нормальных (контроль 1640) или тиол-дефицитных условиях (1603) для вызывания 10-20%-ного снижения тиола. Как показано на фиг.1а, добавление амброксола в комбинации с α-липоевой кислотой приводит начиная с 48 часов от начала лечения к полной компенсации внутриклеточного дефицита тиола. При применении комбинации α-липоевой кислоты и не содержащего SH-группы АСЕ-ингибитора эналаприла, а также имеющего SH-группу АСЕ-ингибитора каптоприла эти эффекты были количественно еще более сильными и наблюдались уже через 2-4 часа. Ни отдельным применением α-липоевой кислоты, ни применением только эффекторов полной компенсации дефицита тиола достичь было невозможно.

Результаты, полученные в этом эксперименте, по влиянию комбинаций согласно изобретению на экспрессию связанных в клеточных мембранах тиолов представлены на фиг.2 для комбинации α-липоевой кислоты и амброксола (фиг.2а), а также α-липоевой кислоты и эналаприла (фиг.2b); в следующей таблице приведены результаты для комбинации α-липоевой кислоты и каптоприла.

Экспрессия связанных в мембране тиолов [СИФ_{капли/отнош.}]
Возраст культуры [сутки]	Контроль	α-липоевая кислота [50 мкМ]	Каптоприл [10 мкМ]	α-липоевая кислота f каптопри
0	2,37±0,45	2,37±0,45	2,37±0,45	2,37±0,39
1	2,79±0,50	2,65±0,39	2,63±0,39	2,38+0,36
2	2,35±0,45	2,43±0,52	2,54±0,41	2,42±0,41
3	1,98±0,43	2,31±0,36	2,52±0,38	2,49±0,46
4	1,63±0,43	2,26±0,20	2,50+0,41	2,39±0,52
6	1,10±0,46	2,19±0,13	2,46±0,50	2,40±0,50
8	0,98±0,31	1,93+0,20	2,01±0,39	2,40±0,53
ДО	0,96±0,32	1,63±0,16	1,68±0,29	2,36±0,52
12	0,95±0,33	1,32±0,21	1,02±0,51	2,38+0,49
14	0,98±0,33	1,34±0,20	0,99+0,46	2,36±0,55

При лечении комбинацией α-липоевой кислоты и амброксола снова наступало начиная с 48 часов значительное улучшение экспрессии мембранно-связанкых тиолов. Особенно необычным было то, что добавление отдельных веществ не оказывало существенного влияния независимо от времени. Добавление комбинации α-липоевой кислоты и соответствующих АСЕ-ингибиторов приводило как в случае эналаприла, так и каптоприла, к супераддитивному (синергическому) эффекту.

Пример 2.

Влияние на статус клеточного активирования периферических Т-лимфоцитов человека

В описанной в примере 1 методике приготовления культуры человеческие Т-лимфоциты стимулировались 1,0 мкг/мл фитогемаглютинина. В течение 72 часов цитофлуорометрически путем регистрации моноклональных антител количественно подтверждалась специфические маркеры клеточного активирования. Исследовалась влияние применяемых согласно изобретению комбинаций на маркеры активизации Т-лимфоцитов CD69 (ранний антиген активирования), CD25 (промежуточный антиген активирования) и CD71 (поздний антиген активирования). На фиг.3 показано влияние комбинации α-липоевой кислоты и амброксола (фиг.3а), а также α-липоевой кислоты и эналаприла (фиг.3b) на индекс активирования Т-лимфоцитов. По сравнению с нормальными Т-лимфоцитами (индекс активирования = 1,0) для тиол-дефицитных клеток нужно отметить заметное снижение способности активирования, которые подтверждает нарушение клеточных функций. При добавлении α-липоевой кислоты наступает известный эффект небольшого улучшения способности клеточного активирования, который, однако, никогда не устраняет значительное отклонение от нормальной контрольной группы. Амброксол не оказывает никакого влияния ни на один из трех маркеров активирования; АСЕ-ингибитор эналаприл равноценен α-липоевой кислоте только в случае срабатывания антигена CD25. В противоположность этому при комбинированном применении как α-липоевой кислоты и амброксола, так и α-липоевой кислоты и эналаприла, наблюдалось повышение индекса активирования Т-клетки в нормальном диапазоне. Этот эффект наблюдался для ранних, промежуточных и поздних маркеров активирования. Таким образом, можно сделать вывод, что стимулированная комбинированным применением α-липоевой кислоты и соответствующих эффекторов глутатионового обмена нормализация статуса клеточного тиола идет с восстановлением клеточкой функциональности.

Пример 3

Влияние на статус клеточного тиола перитонеальных макрофагов в терапии при пересадке почек

Перитонеальные макрофаги выделялись из вытяжки перитонеального диализа пациентов с высокой степенью почечной недостаточности, помещались в среду клеточной культуры и инкубировались в дезинсекционном инкубаторе при 37°C, относительной влажности воздуха 98% и относительном содержании CO₂ в воздухе 7,5%. Чтобы проверить влияние применяемых согласно изобретению комбинаций на статус тиола перитонеальных макрофагов, одна фракция обрабатывалась соответственно α-липоевой кислотой, эффектором метаболизма глутатиона амброксолом или АСЕ-ингибитором эналаприлом, или комбинацией α-липоевая кислота/амброксол или α-липоевая кислота/эналаприл, с другая фракция являлась необработанным контролем.

Определение статуса клеточного тиола проходило с помощью измерительных методов, описанных в примере 1. Экспрессия мембранных тиолов определялась по средней интенсивности флуоресценции (СИФ) пробы (3000 клеток/измерение) по сопряжению с хлорметилфторхром-производным.

На фиг.4 представлен эффект комбинации α-липоевой кислоты и амброксола (фиг.4а), а также α-липоевой кислоты и эналаприла (фиг.4b) в динамике за 14 дней (n=12).

При добавлении моновеществ подъем экспрессии клеточного тиола снова наблюдался при применении α-липоевой кислоты, тогда как амброксол и АСЕ-ингибитор не оказывали никакого эффекта]. В противоположность этому, при комбинации α-липоевой кислоты и амброксола через 72 часа начиналось заметное повышение экспрессии клеточного тиола, который через 4 дня лечения достигал супераддитивного эффекта, а через 8 дней также достигал максимума, три раза превышающего исходные, соответственно контрольные данные (фиг.4а). Комбинация α-липоевой кислоты и АСЕ-ингибитора (фиг.4b) приводила к сходному, однако еще более заметному сокращению временной динамики. Максимум супераддитивного действия достигался уже через 48-72 часов продолжительности лечения.

На фиг.5 показано влияние комбинации α-липоевой кислоты и эналаприла (фиг.5b) на экспрессию мембранно-связанных тиолов перитонеальных макрофагов в описанном выше опыте. Мембранная экспрессия тиолов определялась по средней интенсивности (СИФ) пробы (3000 клеток/измерение) по сопряжению на хлорметилфторхром-производном. По сравнению с результатами экспрессии внутриклеточных тиолов в этом случае следует отметить очень заметный эффект отдельной подачи α-липоевой кислоты, который, однако, через 4 дня лечения снова исчезает. В противоположность этому комбинированное применение α-липоевой кислоты и амброксола (фиг.5а) или α-липоевой кислоты и АСЕ-ингибитора (фиг.5b) вызывает как более заметное вначале, так и стабильное в течение срока наблюдения супераддитивное повышение экспрессии мембранно-связанных тиолов.

Пример 4

Влияние на фагоцитарную способность перитонеальных макрофагов

Для того чтобы охарактеризовать перитонеальные макрофаги с точки зрения их оригинальных функций, в качестве измеряемой величины была выбрана фагоцитарная способность.

Перитонеальные макрофаги выделялись аналогично способу, описанному в примере 3, и культивировались ex vivo. Определение мощности фагоцитоза проводилось цитофлуорометрическим тестом на уровне отдельной клетки. При этом макрофаги сокультивировались с опсонированными и фтор-хром-меченными бактериями. Количество бактерий, выделенных за определенный промежуток времени, регистрировалось количественно по интенсивности флуоресценции в макрофагах и считалось мерой их фагоцитарной способности.

Влияние применяемых согласно изобретению комбинаций на фагоцитарную способность перитонеальных макрофагов через 6 дней от начала лечения представлено в следующей таблице.

Скорость фагоцитоза [СИФ/10000 клеток]
контроль	371±39
α-липоевая кислота [50 мкМ]	687±59
амброксол [10 мкМ]	501±52
α-липоевая кислота + амброксол	1,398±286 (р<0,05)
эналаприл [5 мкМ]	567±59
α-липоевая кислота + эналаприл	1,698±241 (р<0,05)
каптоприл [10 мкМ]	653±43
α-липоевая кислота + каптоприл	1,589+176 (Р<0,05)

После инкубирования с α-липоевой кислотой, амброксолом или соответственно эналаприлом скорость фагоцитоза по сравнению с необработанным контролем увеличивалась в 1,85 (α-липоевая кислота), 1,35 (амброксол) или 1,53 (эналаприл) раз. В противоположность этому при применении комбинации α-липоевой кислоты и амброксола коэффициент повышения скорости фагоцитоза достигал 3,7, при применении комбинации α-липоевой кислоты и АСЕ-ингибитора - 4,6 (эналаприл) или 4,3 (каптоприл).

Отсюда можно сделать вывод о прямой корреляции между скоростью фагоцитоза и содержанием внутриклеточных тиолов перитонеальных макрофагов для комбинации α-липоевой кислоты и амброксола (r=0,79; р<0,01), α-липоевой кислоты и каптоприла (r=0,86; р<0,01), а также α-липоевой кислоты и эналаприла (r=0,82; р<0,01).

Пример 5

Влияние на степень дифференциации и активирования, а также синтез цитокинов перитонеальных макрофагов

Перитонеальные макрофаги выделялись у пациентов в случае терапии при пересадке почек аналогично примеру 3, и культивировались в присутствии указанных комбинаций согласно изобретению α-липоевой кислоты и эффекторов глутатионового метаболизма. Через 6 дней инкубирования цитофлуорометрически определяли степень дифференциации перитонеальных макрофагов по экспрессии антигенов поверхности клетки CD15 и CD11c, а также степень клеточного активирования по соэкспрессии антигена активирования CD69 на С015-положительных клетках, а также СD71 на CD11c-положительных клетках.

Результаты представлены в следующей таблице.

Удалось показать, что экспрессия маркеров созревания CD15 и CD11c при применении комбинации α-липоевой кислоты и амброксола заметно, а при применении комбинации α-липоевой кислоты и АСЕ-ингибитора - значительно увеличивается. Это указывает на заметный прирост антигенов активирования CD69 или CD71 на соответствующих клеточных популяциях. Использование моновеществ не имело никакого или только минимальное влияние на степени дифференциации и активирования перитонеальных макрофагов.

Параллельно этому в данном эксперименте получали супернатант клеточных культур и определяли содержащиеся в них синтезированные и секретированные перитонеальными макрофагами цитокины интерлейкин-6 (IL-6), а также антагонист рецептора интерлейкина-1 (IL-1ra). Анализ проводили с применением метода ферментного иммунного анализа со стандартизованной измерительной системой и представлен в следующей таблице, которая показывает влияние α-липоевой кислоты и эффекторов метаболизма клеточного глутатиона на синтез цитокинов перитонеальными макрофагами через 6 дней от начала лечения (n=10).

В присутствии комбинации α-липоевой кислоты и амброксола, а также комбинации α-липоевой кислоты и различных АСЕ-ингибиторов наблюдалось значительное снижение синтеза IL-6. Этот эффект заметно превышал суммарное снижение, вызванное моновеществами. В этих условиях значительно индуцировался синтез IL-1ra. В этом случае также следует отметить супераддитивное влияние комбинации α-липоевой кислоты и амброксола или АСЕ-ингибиторов.

Пример 6

Влияние на стабильность восстановления тиола в случае перитонеальных макрофагов в модели диализа

Описанные в примере 3 перитонеальные макрофаги, содержание тиола в которых восстановлено с помощью применяемых согласно изобретению комбинаций, отбирались через 6 дней из этой тестовой системы и культивировались в течение 14 дней в модели диализа. При этом перитонеальные макрофаги адаптировали на мобильных матрицах, покрытых коллагеном IV и 3 раза в день приводили на 60 минут в контакт с обычным раствором для диализа. Эта модель служила в данном случае для инициирования комбинированного гипергликемического/осмотического стресса. На фиг.6 показано влияние комбинации α-липоевой кислоты и амброксола (фиг.6а), а также α-липоевой кислоты и эналаприла (фиг.6b) на экспрессию внутриклеточных тиолов перитонеальных макрофагов в динамике. Мембранная экспрессия тиолов определялась по средней интенсивности флуоресценции (СИФ) пробы (3000 клеток/измерение) по сопряжению на хлорметилфторхром-производном.

В то время как у контрольных образцов, первоначально имеющих восстановленный уровень тиола и необработанных в этой модели диализа, в течение первых 4 дней наблюдалось линейно снижение концентрации внутриклеточных тиолов, комбинированное введение α-липоевой кислоты и амброксола, а также α-липоевой кислоты и эналаприла приводило к сохранению постоянного статуса внутриклеточного тиола на уровне первоначального восстановления. Здесь также отмечается, в частности, моноэффект α-липоевой кислоты, который, однако, сохраняется лишь короткое время и через приблизительно 4 дня в модели диализа показывает только около 50% от эффекта комбинаций.

Подобная картина имеет место при рассмотрении представленного на фиг.7 хода экспрессии, связанного в мембранах тиола. Опять количество тиола, полученное первоначальным восстановлением, путем применения комбинации α-липоевой кисоты и амброксола (фиг.7а) или АСЕ-ингибиторов (фиг.7b) будет оставаться постоянным, в то время как при добавлении моновеществ наблюдались лишь промежуточные (α-липоевая кислота) или минимальные эффекты (амброксол, эналаприл).

Вместе взятые, эти опыты ясно показывают, что применение комбинации α-липоевой кислоты и эффекторов метаболизма глутатиона амброксола или АСЕ-ингибиторов стабилизируют первоначально сильно нарушенный статус тиола в различных клеточных системах. Благодаря этой нормализации происходит восстановление центральных клеточных иммунорегулирующих функций, которое без такого лечения не достигалось.

Пример 7 выполнения лекарственного средства согласно изобретению, использованного для клинического предварительного исследования, для подтверждения активности тиол-активного цитопротективного средства в перитонеальном диализе (PD).

Пациентам вводили при этом клиническом исследовании в перевернутом виде стандартный и тестируемый растворы для перитонеального диализа. Использованные в клиническом исследовании растворы были готовыми стандартными PD-растворами в мешке 51. Этот раствор содержал компоненты, такие как глюкоза, NaCl, CaCl₂, MgCl₂ и лактат натрия, в концентрациях, указанных в таблице. Активные вещества: α-липоевая кислота и амброксол, были инъецированы в этот мешок. Затем раствор перемешивали, и пациент получал готовый PD-раствор. Цитопротективный PD-раствор предлагается как готовый продукт в трехкамерном мешке, так как отдельные компоненты должны быть разделены друг от друга автоклавированием. Непосредственно перед применением растворы отдельных камер смешивают, чтобы получить готовый для применения раствор.

Активные вещества: α-липоевая кислота и амброксол, могут находиться также в двухкамерном мешке. При этом этот мешок должен совмещаться с уже имеющимися PD-системами. Активность была подтверждена in vitro с различными PD-растворами, т.е. с растворами, забуференными ламтатом или бикарбонатом, кислыми или нейтральными растворами или растворами с различными концентрациями солей.

Состав цитопротектизных PD-растворов

Активные компоненты лекарственного средства	1,36% вес/объем	2,27% вес/объем	3,86% вес/объем
	г/л	г/л	г/л
Глюкоза моногидрат	15,0	25,0	42,5
NaCl	5,4	5,4	5,4
CaCl₂×2Н₂O	0,184	0,184	0,184
MgCl₂×6Н₂O	0,051	0,051	0,051
Na-(S)-naicraT	4,5	4,5	4,5
α-Липоевая кислота, этилендиаминовая соль (1:1)	0,013323	0,013323	0,013323
Амброксол гидрохлорид	0,0041461	0,0041461	0,0041461

Необязательные компоненты
Вода для инъекций
Соляная кислота
Натрий гидрохлорид

Смесь всех трех камер содержит, ммоль/л или мкмоль/л:

	ммоль/л	ммоль/л	ммоль/л
Глюкоза (обезвоженная)	75,5	126	214
Натрий	133	133	133
Кальций	1,25	1,25	1,25
Магний	0,25	0,25	0,25
Хлорид	96	96	96
Лактат	40	40	40
	мкмоль/л	мкмоль/л	мкмоль/л
α-Липоевая кислота	50	50	50
Амброксол	10	10	10

Claims

1. Комбинированный лекарственный препарат в любой пригодной форме, содержащий эффектор метаболизма глутатиона вместе с α-липоевой кислотой, ее солями и/или ее пролекарствами и добавки, для одновременного, раздельного или разделенного по времени введения для лечения нарушения тиол-дисульфидного статуса в терапии при пересадке почек, а также при заболеваниях, при которых происходит нарушение тиол-дисульфидного статуса иммунных клеток, причем в качестве эффектора содержит амброксол общей формулы I

его соли и/или его пролекарства, при этом доза амброксола, его солей и/или его пролекарств составляет от 7,5 до 90 мг/сутки и доза α-липоевой кислоты, ее солей и/или ее пролекарств составляет от 30 до 1200 мг/сутки.

2. Комбинированный препарат по п.1, отличающийся тем, что доза α-липоевой кислоты, ее солей и/или ее пролекарств для применений в медицине человека составляет от 200 до 600 мг/сутки.

3. Комбинированный препарат по п.1 или 2, отличающийся тем, что доза амброксола, его солей и/или его пролекарств для применений в медицине человека составляет от 60 до 75 мг/сутки.

4. Комбинированный препарат по одному из пп.1-3, отличающийся тем, что введение осуществляется оральным или парентеральным путем.

5. Комбинированный препарат по меньшей мере по одному из пп.1-4, отличающийся тем, что последующие добавки выбраны из группы водных растворителей, стабилизаторов, суспензионных, дисперсионных и смачивающих средств.

6. Комбинированный препарат по меньшей мере по одному из пп.1-5 в виде раствора, гранулята, порошка, эмульсии, таблетки и/или таблетки с оболочкой.

7. Применение по меньшей мере одного ингибитора ангиотензинпревращающего фермента (АСЕ-ингибитора), представляющего собой каптоприл, эналаприл и рамиприл, или амброксола формулы I, его солей и/или его пролекарств, вместе с α-липоевой кислотой, ее солями и/или ее пролекарствами для получения лекарственного средства для одновременного, раздельного или разделенного по времени лечения нарушения тиол-дисульфидного статуса в терапии при пересадке почек в виде процесса гемодиализа или перитонеального диализа.

8. Применение по меньшей мере одного АСЕ-ингибитора, представляющего собой каптоприл, эналаприл или рамиприл, или амброксола формулы I, его солей и/или его пролекарств, вместе с α-липоевой кислотой, ее солями и/или ее пролекарствами для получения лекарственного средства для одновременного, раздельного или разделенного по времени лечения нарушения тиол-дисульфидного статуса при заболеваниях, при которых происходит нарушение тиол-дисульфидного статуса иммунных клеток, в частности для иммуномодуляторного, противовоспалительного и/или повышающего защитные силы организма лечения.

9. Применение по пп.7 и 8, отличающееся тем, что доза АСЕ-ингибитора для применений в медицине человека составляет для пациентов от 0,2 до 20 мг/сутки.

10. Применение по пп.7, 8 или 9, отличающееся тем, что каптоприл представляет собой 1-[(2S)-3-меркапто-2-метилпропионил]-L-пролин формулы II

11. Применение по пп.7, 8 или 9, отличающееся тем, что эналаприл представляет собой 1-{N-[(S)-1-этоксикарбонил-3-фенилпропил]-L-аланил}-L-пролин формулы III

12. Применение по пп.7, 8 или 9, отличающееся тем, что рамиприл представляет собой {2S,3aS,6aS)-1-{(S)-N-[(S)-1-этокси-карбонил-3-фенилпропил]аланил}октагидроциклопента[b]пиррол-2-карбоновую кислоту формулы IV

13. Применение по меньшей мере по одному из пп.7-12, отличающееся тем, что по меньшей мере один АСЕ-ингибитор или амброксол формулы I, его соли и/или его пролекарства, и α-липоевая кислота, ее соли и/или ее пролекарства находятся в единой препаративной форме.

14. Применение по меньшей мере по одному из пп.7-12, отличающееся тем, что по меньшей мере один АСЕ-ингибитор или амброксол формулы I, его соли и/или его пролекарства, и α-липоевая кислота, ее соли и/или ее пролекарства находятся в раздельных препаративных формах.