RU2283346C1

RU2283346C1 - Method for production of l-amino acids by fermentation using bacteria having increased expression of xylose utilization gene

Info

Publication number: RU2283346C1
Application number: RU2005106720/13A
Authority: RU
Inventors: Алексей Николаевич Марченко (RU); Алексей Николаевич Марченко; Сергей Владимирович Беневоленский (RU); Сергей Владимирович Беневоленский; чко Елена Витальевна Кл (RU); Елена Витальевна Клячко; Юрий Иванович Козлов (RU); Юрий Иванович Козлов; Эльвира Борисовна Ворошилова (RU); Эльвира Борисовна Ворошилова; тинер Михаил Маркович Гус (RU); Михаил Маркович Гусятинер
Original assignee: Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ)
Priority date: 2005-03-14
Filing date: 2005-03-14
Publication date: 2006-09-10

Abstract

FIELD: biotechnology.

SUBSTANCE: L-amino acid is obtained by using bacteria belonging Escherichia genus having enhanced expression of xylose utilization gene. Claimed method includes culturing of said bacterium producer in cultural liquid containing xylose followed by isolation of L-amino acid from cultural liquid.

EFFECT: high effective method for production of l-amino acids.

18 cl, 1 dwg, 7 tbl, 6 ex

Description

Область техникиTechnical field

Настоящее изобретение относится к способу получения L-аминокислот путем ферментации пентоз и более конкретно к способу получения L-аминокислот с использованием бактерии с усиленной экспрессией генов утилизации ксилозы путем ферментации смеси арабинозы и/или ксилозы с глюкозой в качестве источника углерода. Недорогой источник углерода, представляющий собой смесь гексоз и пентоз из гемицеллюлозной фракции целлюлозной биомассы, может быть использована для промышленного производства L-аминокислот, например L-гистидина, L-треонина, L-лизина, L-аргинина, L-глутаминовой кислоты и L-триптофана.The present invention relates to a method for producing L-amino acids by fermentation of pentoses and more particularly to a method for producing L-amino acids using bacteria with enhanced expression of xylose utilization genes by fermenting a mixture of arabinose and / or xylose with glucose as a carbon source. An inexpensive carbon source, which is a mixture of hexoses and pentoses from the hemicellulose fraction of cellulosic biomass, can be used for the industrial production of L-amino acids, for example L-histidine, L-threonine, L-lysine, L-arginine, L-glutamic acid and L- tryptophan.

Описание предшествующего уровня техникиDescription of the Related Art

Традиционно L-аминокислоты получают промышленным способом с помощью ферментации штаммов различных микроорганизмов. Используемая при этом ферментационная среда обычно содержит достаточное количество различных источников углерода и азота.Traditionally, L-amino acids are obtained industrially by fermentation of strains of various microorganisms. The fermentation medium used in this case usually contains a sufficient amount of various sources of carbon and nitrogen.

Общепринятыми источниками углерода являются различные углеводы, такие как гексозы, пентозы, триозы; различные органические кислоты и спирты. К гексозам относятся глюкоза, фруктоза, манноза, сорбоза, галактоза и подобные им. Пентозы включают в себя арабинозу, ксилозу, рибозу и подобные им. Тем не менее, вышеупомянутые углеводы и другие традиционные источники углерода, такие как меласса, зерно, сахарный тростник, крахмал, их гидролизаты, и т.д., используемые в современной промышленности, достаточно дороги. Таким образом, необходим альтернативный более дешевый вариант источника углерода для получения L-аминокислот.Conventional carbon sources are various carbohydrates such as hexoses, pentoses, trioses; various organic acids and alcohols. Hexoses include glucose, fructose, mannose, sorbose, galactose, and the like. Pentoses include arabinose, xylose, ribose and the like. However, the aforementioned carbohydrates and other traditional carbon sources such as molasses, grain, sugarcane, starch, their hydrolysates, etc. used in modern industry are quite expensive. Thus, an alternative, cheaper carbon source is needed to produce L-amino acids.

Целлюлозная биомасса является перспективным субстратом для продукции L-аминокислот благодаря как своей готовности к применению, так и дешевизне по сравнению с чистыми углеводами, зерном, сахарным тростником или другими источниками углерода. Среднее содержание целлюлозы, гемицеллюлозы и лигнина в целлюлозной биомассе составляет примерно 40-60% целлюлозы, 20-40% гемицеллюлозы 10-25% лигнина и 10% других соединений. Целлюлозная фракция состоит из полимеров гексозных сахаров, обычно глюкозы. Гемицеллюлозная фракция состоит в основном из пентозных сахаров, включая ксилозу и арабинозу. Состав различных сырьевых биомасс приведен в Таблице 1 (http://www.ott.doe.gov/biofuels/understanding_biomass.html).Cellulosic biomass is a promising substrate for the production of L-amino acids due to both its readiness for use and low cost compared to pure carbohydrates, grain, sugarcane or other carbon sources. The average content of cellulose, hemicellulose and lignin in cellulosic biomass is approximately 40-60% of cellulose, 20-40% of hemicellulose, 10-25% of lignin and 10% of other compounds. The cellulosic fraction consists of polymers of hexose sugars, usually glucose. The hemicellulose fraction consists mainly of pentose sugars, including xylose and arabinose. The composition of various feed biomass is given in Table 1 (http://www.ott.doe.gov/biofuels/understanding_biomass.html).

Таблица 1.Table 1. ИсходныйSource ШестиуглеродныеSix carbon ПятиуглеродныеFive carbon ЛигнинLignin ЗольныйAshy материалmaterial сахараSahara сахараSahara остатокbalance ТвердаяSolid 39-50%39-50% 18-28%18-28% 15-28%15-28% 0.3-1.0%0.3-1.0% древесинаwood МягкаяSoft 41-57%41-57% 8-12%8-12% 24-27%24-27% 0.1-0.4%0.1-0.4% древесинаwood

Более детальную информацию о составе более 150 образцов биомассы можно получить в сводной таблице "Biomass Feedstock Composition and Property Database" (http://www.ott.doe.gov/biofuels/progs/searchl.cgi).More detailed information on the composition of more than 150 biomass samples can be obtained in the summary table "Biomass Feedstock Composition and Property Database" (http://www.ott.doe.gov/biofuels/progs/searchl.cgi).

В ближайшем будущем ожидается разработка промышленного процесса для эффективной конверсии целлюлозной биомассы в готовый к применению компонент ферментационной среды - как правило, это смесь углеводородов. Следовательно, вскоре ожидается также увеличение масштаба использования возобновляемых источников энергии, таких как целлюлоза и гемицеллюлоза, для продукции полезных веществ (Aristidou A., Pentila. M., Curr. Opin. Biotechnol, 2000, Apr., 11:2, 187-198). Тем не менее, подавляющее большинство опубликованных статей и патентов или патентных заявок описывают утилизацию целлюлозной биомассы с помощью биокатализа (бактерии и дрожжи) для получения этанола, который в перспективе должен стать альтернативным топливом. Такие процессы включают в себя ферментацию целлюлозной биомассы с использованием различных модифицированных штаммов Zymomonas mobilis (Deanda К. et al., Appl. Environ. MicrobioL, 1996 Dec., 62:12, 4465-70; Mohagheghi A. et al., Appl. Biochem. Biotechnol., 2002, 98-100:885-98; Lawford H.G., Rousseau J.D., Appl. Biochem. Biotechnol, 2002, 98-100:429-48; PCT applications WO 95/28476, WO 98/50524), модифицированных штаммов Escherichia coli (Dien B.S. et al., Appl. Biochem. Biotechnol, 2000, 84-86:181-96; Nichols N.N. et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 2001 Jul, 56:1-2, 120-5; патент США 5000000). В качестве продукта ферментации ксилозы из гемицеллюлозных сахаров с помощью дрожжей Candida tropicalis может быть получен ксилитол (Walthers Т. et al., Appl. Biochem. Biotechnol., 2001, 91-93:423-35). 1,2-Пропандиол может быть получен путем ферментации арабинозы, фруктозы, галактозы, глюкозы, лактозы, мальтозы, сахарозы, ксилозы и их комбинаций с использованием рекомбинантного штамма Escherichia coli (патент США 6303352). Также было показано, что 3-дегидрошикимовая кислота может быть получена путем ферментации глюкозо/ксилозо/арабинозной смеси с использованием штамма Escherichia coli. Максимальные концентрации и конверсии 3-дегидрошикимовой кислоты были получены в опыте, когда в качестве источника углерода использовали глюкозо/ксилозо/арабинозную смесь, по сравнению с использованными в том же качестве чистых ксилозы или глюкозы (Kai Li and J.W.Frost, Biotechnol. Prog., 1999, 15, 876-883).In the near future, it is expected to develop an industrial process for the efficient conversion of cellulosic biomass into a ready-to-use component of a fermentation medium - usually a mixture of hydrocarbons. Consequently, an increase in the use of renewable energy sources, such as cellulose and hemicellulose, for the production of beneficial substances is also expected soon (Aristidou A., Pentila. M., Curr. Opin. Biotechnol, 2000, Apr., 11: 2, 187-198 ) However, the vast majority of published articles and patents or patent applications describe the utilization of cellulosic biomass using biocatalysis (bacteria and yeast) to produce ethanol, which in the future should become an alternative fuel. Such processes include fermentation of cellulosic biomass using various modified strains of Zymomonas mobilis (Deanda K. et al., Appl. Environ. MicrobioL, 1996 Dec., 62:12, 4465-70; Mohagheghi A. et al., Appl. Biochem. Biotechnol., 2002, 98-100: 885-98; Lawford HG, Rousseau JD, Appl. Biochem. Biotechnol, 2002, 98-100: 429-48; PCT applications WO 95/28476, WO 98/50524), modified strains of Escherichia coli (Dien BS et al., Appl. Biochem. Biotechnol, 2000, 84-86: 181-96; Nichols NN et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 2001 Jul, 56: 1-2, 120 -5; U.S. Patent 5,000,000). Xylitol can be obtained as a product of xylose fermentation from hemicellulose sugars using Candida tropicalis yeast (Walthers T. et al., Appl. Biochem. Biotechnol., 2001, 91-93: 423-35). 1,2-Propanediol can be obtained by fermentation of arabinose, fructose, galactose, glucose, lactose, maltose, sucrose, xylose, and combinations thereof using a recombinant strain of Escherichia coli (US patent 6303352). It was also shown that 3-dehydroshikimic acid can be obtained by fermentation of a glucose / xylose / arabinose mixture using a strain of Escherichia coli. The maximum concentrations and conversions of 3-dehydroshikimic acid were obtained in an experiment when a glucose / xylose / arabinose mixture was used as a carbon source compared to pure xylose or glucose used in the same quality (Kai Li and JWFrost, Biotechnol. Prog., 1999, 15, 876-883).

Также было показано, что Escherichia coli способна утилизировать пентозы, такие как L-арабиноза и D-ксилоза (Escherichia coli and Salmonella, Second Edition, Editor in Chief: F.C. Neidhardt, ASM Press, Washington D.C., 1996). Транспорт L-арабинозы в клетку осуществляется двумя индуцируемыми системами: (1) пермеазой с низким сродством к субстрату (K_m около 0.1 мМ), кодируемой геном araE, и (2) системой с высоким сродством к арабинозе (К_m от 1 до 3 μM), кодируемой опероном araFG, Ген araF кодирует периплазматический связывающий белок (306 аминокислот) с функцией хемотактического рецептора, а локус araG кодирует белок, расположенный на внутренней стороне клеточной мембраны. Сахар утилизируется группой ферментов, кодируемых опероном araBAD: изомеразой (кодируемой геном araA), которая обратимо превращает альдозу в L-рибулозу; киназой (кодируемой геном araB), которая фосфорилирует кетозу, образуя L-рибулозо 5-фосфат; и L-рибулозо-5-фосфат-4-эпимеразой (кодируемой геном araD), которая катализирует образование D-ксилозо-5-фосфата (Escherichia coli and Salmonella, Second Edition, Editor in Chief: F.C.Neidhardt, ASM Press, Washington D.C., 1996).It has also been shown that Escherichia coli is capable of utilizing pentoses such as L-arabinose and D-xylose (Escherichia coli and Salmonella, Second Edition, Editor in Chief: FC Neidhardt, ASM Press, Washington DC, 1996). The transport of L-arabinose into the cell is accomplished by two inducible systems: (1) a low permease permease to the substrate (K _m about 0.1 mM) encoded by the araE gene, and (2) a high arabinose permease system (K _m from 1 to 3 μM ) encoded by the araFG operon, the araF gene encodes a periplasmic binding protein (306 amino acids) with a chemotactic receptor function, and the araG locus encodes a protein located on the inside of the cell membrane. Sugar is utilized by a group of enzymes encoded by the araBAD operon: an isomerase (encoded by the araA gene), which reversibly converts aldose to L-ribulose; a kinase (encoded by the araB gene) that phosphorylates ketose to form L-ribuloso 5-phosphate; and L-ribulose-5-phosphate-4-epimerase (encoded by the araD gene), which catalyzes the formation of D-xylose-5-phosphate (Escherichia coli and Salmonella, Second Edition, Editor in Chief: FCNeidhardt, ASM Press, Washington DC, 1996 )

Большинство штаммов Е.coli растет на D-ксилозе, но штамм К-12 без мутации не способен расти на этом сахаре. Утилизация этой пентозы происходит через индуцируемый и регулируемый также катаболитной репрессией путь, включающий в себя транспорт через плазматическую мембрану двумя индуцируемыми пермеазами (неактивными при росте на D-рибозе или D-арабинозе), изомеризацию в D-ксилулозу, и АТФ-зависимое фосфорилирование этой пентулозы с образованием D-ксилулозо 5-фосфата. Транспортная система с высоким сродством к субстрарту (K_m 0.3 до 3 μM) зависит от связывающего белка, расположенного в периплазме (37000 Da) и, возможно, запускается высокоэнергетическим веществом. Транспортная система с низким сродством к субстрарту (К_m около 170 μМ) получает энергию за счет энергии переноса протона. Эта система симпорта D-ксилозы-протона кодируется геном xylE. Основным кластером генов, определяющим утилизацию D-ксилозы, является оперон xylAB(RT). Ген xylA кодирует изомеразу (54000 Da) и ген xylE кодирует киназу (52000 Da). Оперон имеет две точки начала транскрипции, одна из которых расположена перед открытой рамкой считывания xylB. Поскольку пермеаза с низким сродством к субстрату кодируется не входящим в оперон геном xylE, то локус xylT, также обозначаемый как xylF (xylFGHR), возможно, кодирует транспортную систему с высоким сродством к субстрату и, таким образом, должен состоять как минимум из двух генов (один, кодирующий периплазматический белок, и другой, кодирующий мембранный белок) (Escherichia coli and Salmonella, Second Edition, Editor in Chief: F.C.Neidhardt, ASM Press, Washington D.C., 1996). Гены xylFGH кодируют АВС транспортеры ксилозы, при этом ген xylF кодирует гипотетический ксилозосвязывающий белок, ген xylG кодирует гипотетический АТФ-связывающий белок, ген xylH кодирует гипотетический мембранный компонент, и ген xylR кодирует ксилозный транскрипционный активатор.Most E. coli strains grow on D-xylose, but strain K-12 without mutation is not able to grow on this sugar. Utilization of this pentose occurs through a pathway induced by and also regulated by catabolite repression, which includes transport through the plasma membrane of two inducible permeases (inactive when growing on D-ribose or D-arabinose), isomerization to D-xylulose, and ATP-dependent phosphorylation of this pentulose with the formation of D-xylulose 5-phosphate. The transport system with a high affinity for the substrate (K _m 0.3 to 3 μM) depends on the binding protein located in the periplasm (37000 Da) and, possibly, is triggered by a high-energy substance. The transport system with low affinity for the substrate (K _m about 170 μM) receives energy due to the proton transfer energy. This D-xylose-proton symport system is encoded by the xylE gene. The main gene cluster that determines the utilization of D-xylose is the xylAB operon (RT). The xylA gene encodes an isomerase (54000 Da) and the xylE gene encodes a kinase (52000 Da). The operon has two transcription start points, one of which is located in front of the open xylB reading frame. Since permease with low affinity for the substrate is encoded by the non-operon xylE gene, the xylT locus, also referred to as xylF (xylFGHR), possibly encodes a transport system with high affinity for the substrate and, therefore, should consist of at least two genes ( one encoding a periplasmic protein, and another encoding a membrane protein) (Escherichia coli and Salmonella, Second Edition, Editor in Chief: FCNeidhardt, ASM Press, Washington DC, 1996). The xylFGH genes encode ABC xylose transporters, the xylF gene encodes a hypothetical xylose binding protein, the xylG gene encodes a hypothetical ATP binding protein, the xylH gene encodes a hypothetical membrane component, and the xylR gene encodes a xylose transcriptional activator.

Введение вышеупомянутых генов Е.coli, кодирующих L-арабинозоизомеразу, L-рибулокиназу, L-рибулозо 5-фосфат 4-эпимеразу, ксилозоизомеразу и ксилулокиназу в дополнение к трансальдолазе и транскетолазе в микроорганизм, такой как Zymomonas mobilis, позволяют этому микроорганизму перерабатывать арабинозу и ксилозу в этанол (WO/9528476, WO 98/50524). И, наоборот, гены Zymomonas, кодирующие алкогольдегидрогеназу (ADH) и пируватдекарбоксилазу (PDH), повышают продукцию этанола у штаммов Escherichia coli (Dien B.S. et al, Appl. Biochem. Biotechnol, 2000, 84-86:181-96; патент США 5000000).The introduction of the aforementioned E. coli genes encoding L-arabinose isomerase, L-ribulokinase, L-ribulose 5-phosphate 4-epimerase, xylose isomerase and xylulokinase in addition to transaldolase and transketolase into a microorganism such as Zymomonas mobilisa allows this microorganism to process and to ethanol (WO / 9528476, WO 98/50524). Conversely, Zymomonas genes encoding alcohol dehydrogenase (ADH) and pyruvate decarboxylase (PDH) increase ethanol production in Escherichia coli strains (Dien BS et al, Appl. Biochem. Biotechnol, 2000, 84-86: 181-96; US patent 5,000,000; )

Процесс получения L-аминокислот, таких как L-изолейцин, L-гистидин, L-треонин и L-триптофан, с помощью ферментации на смеси глюкозы и пентоз, таких как арабиноза и ксилоза, был уже раскрыт ранее авторами настоящего изобретения (патентная заявка России 2003105269).The process of obtaining L-amino acids, such as L-isoleucine, L-histidine, L-threonine and L-tryptophan, by fermentation on a mixture of glucose and pentoses, such as arabinose and xylose, has already been previously disclosed by the authors of the present invention (Russian patent application 2003105269).

Однако в настоящее время нет сообщений, описывающих бактерии с усиленной экспрессией генов утилизации ксилозы, таких как локус xylABFGHR, или описывающих использование этих генов для получения L-аминокислот из смеси сахаров - гексоз и пентоз.However, there are currently no reports describing bacteria with enhanced expression of xylose utilization genes, such as the xylABFGHR locus, or describing the use of these genes to obtain L-amino acids from a mixture of sugars - hexoses and pentoses.

Описание изобретенияDescription of the invention

Целью настоящего изобретения является повышение продукции штамма-продуцента L-аминокислоты, предоставление бактерии - продуцента L-аминокислоты с усиленной экспрессией генов утилизации ксилозы и предоставление способа получения L-аминокислот из смеси сахаров - гексоз, таких как глюкоза, и пентоз, таких как ксилоза или арабиноза, с использованием вышеупомянутой бактерии. Продукт переработки целлюлозной биомассы может быть использован как компонент ферментационной среды в качестве источника углерода. Данная цель была достигнута путем обнаружения того факта, что локус xylABFGHR, клонированный на низкокопийном векторе, повышает продукцию L-аминокислот, например L-гистидина, L-треонина, L-лизина, L-аргинина, L-глутаминовой кислоты и L-триптофана. Для этой цели использовался микроорганизм, способный расти на продукте переработки целлюлозной биомассы и являющийся продуцентом L-аминокислот. Продукт переработки целлюлозной биомассы состоит из ксилозы и арабинозы в смеси с глюкозой и служит источником углерода. Штаммы - продуценты L-аминокислоты представлены штаммом Escherichia coli. Таким образом, было совершено настоящее изобретение.The aim of the present invention is to increase the production of a producer strain of L-amino acids, providing bacteria producing L-amino acids with enhanced expression of xylose utilization genes and providing a method for producing L-amino acids from a mixture of sugars-hexoses, such as glucose, and pentoses, such as xylose or arabinose using the aforementioned bacteria. The cellulosic biomass processing product can be used as a component of the fermentation medium as a carbon source. This goal was achieved by detecting the fact that the xylABFGHR locus cloned on a low copy vector increases the production of L-amino acids, for example L-histidine, L-threonine, L-lysine, L-arginine, L-glutamic acid and L-tryptophan. For this purpose, a microorganism capable of growing on the product of the processing of cellulosic biomass and producing L-amino acids was used. The cellulosic biomass processing product consists of xylose and arabinose mixed with glucose and serves as a carbon source. The strains producing L-amino acids are represented by a strain of Escherichia coli. Thus, the present invention has been completed.

Также целью настоящего изобретения является предоставление бактерии - продуцента L-аминокислоты, при этом указанная бактерия принадлежит к семейству Enterobacteriaceae и обладает повышенной активностью любого из ферментов, участвующих в утилизации ксилозы.It is also an object of the present invention to provide an L-amino acid producing bacterium, said bacterium belonging to the Enterobacteriaceae family and having increased activity of any of the enzymes involved in xylose utilization.

Также целью настоящего изобретения является предоставление описанной выше бактерии, при этом указанная бактерия принадлежит к роду Escherichia.It is also an object of the present invention to provide the bacteria described above, wherein said bacterium belongs to the genus Escherichia.

Также целью настоящего изобретения является предоставление описанной выше бактерии, при этом указанная бактерия принадлежит к роду Pantoea.It is also an object of the present invention to provide the bacteria described above, wherein said bacterium belongs to the genus Pantoea.

Также целью настоящего изобретения является предоставление описанной выше бактерии, в которой активности ферментов, утилизирующих ксилозу, повышены за счет усиления экспрессии локуса xylABFGHR.It is also an object of the present invention to provide a bacterium as described above in which the activity of xylose utilizing enzymes is enhanced by enhancing the expression of the xylABFGHR locus.

Также целью настоящего изобретения является предоставление описанной выше бактерии, в которой активности ферментов, утилизирующих ксилозу, повышены путем увеличения количества копий локуса xylABFGHR или модификации нуклеотидной последовательности, контролирующей экспрессию этих генов таким образом, что экспрессия указанных генов усиливается.It is also an object of the present invention to provide a bacterium as described above in which the activity of xylose utilizing enzymes is increased by increasing the number of copies of the xylABFGHR locus or modifying the nucleotide sequence that controls the expression of these genes so that the expression of these genes is enhanced.

Также целью настоящего изобретения является предоставление описанной выше бактерии, в которой количество копий указанных генов в клетке увеличено за счет трансформации бактерии низкокопийным вектором, содержащим локус xylABFGHR.Another objective of the present invention is the provision of the bacteria described above, in which the number of copies of these genes in the cell is increased due to the transformation of the bacterium with a low copy vector containing the xylABFGHR locus.

Также целью настоящего изобретения является предоставление описанной выше бактерии, в которой локус xylABFGHR получен из бактерии, принадлежащей к роду Escherichia.It is also an object of the present invention to provide a bacterium as described above in which the xylABFGHR locus is derived from a bacterium belonging to the genus Escherichia.

Также целью настоящего изобретения является предоставление способа продукции L-аминокислот, включающего в себя выращивание описанной выше бактерии в культуральной жидкости, содержащей смесь сахаров - глюкозы и пентоз, и выделение из культуральной жидкости накопленной в ней L-аминокислоты.It is also an object of the present invention to provide a method for producing L-amino acids, including growing the bacteria described above in a culture fluid containing a mixture of sugars, glucose and pentoses, and isolating the L-amino acid accumulated therein from the culture fluid.

Также целью настоящего изобретения является предоставление описанного выше способа, в котором пентозами являются арабиноза и ксилоза.Another objective of the present invention is the provision of the above method, in which the pentoses are arabinose and xylose.

Также целью настоящего изобретения является предоставление описанного выше способа, в котором указанная смесь сахаров является продуктом переработки целлюлозной биомассы.It is also an object of the present invention to provide the process described above, wherein said sugar mixture is a cellulosic biomass processing product.

Также целью настоящего изобретения является предоставление описанного выше способа, в котором продуцируемой L-аминокислотой является L-гистидин.It is also an object of the present invention to provide a process as described above in which the L-amino acid produced is L-histidine.

Также целью настоящего изобретения является предоставление описанного выше способа, в котором у указанной бактерии экспрессия генов путей биосинтеза L-гистидина усилена.It is also an object of the present invention to provide a method as described above, wherein said bacterium has enhanced expression of genes for L-histidine biosynthesis pathways.

Также целью настоящего изобретения является предоставление описанного выше способа, в котором продуцируемой L-аминокислотой является L-треонин.It is also an object of the present invention to provide a process as described above in which the L-amino acid produced is L-threonine.

Также целью настоящего изобретения является предоставление описанного выше способа, в котором у указанной бактерии экспрессия генов путей биосинтеза L-треонина усилена.It is also an object of the present invention to provide a method as described above, wherein said bacterium has enhanced expression of L-threonine biosynthesis pathway genes.

Также целью настоящего изобретения является предоставление описанного выше способа, в котором продуцируемой L-аминокислотой является L-лизин.It is also an object of the present invention to provide a process as described above in which the L-amino acid produced is L-lysine.

Также целью настоящего изобретения является предоставление описанного выше способа, в котором у указанной бактерии экспрессия генов путей биосинтеза L-лизина усилена.It is also an object of the present invention to provide a method as described above, wherein said bacterium has enhanced expression of L-lysine biosynthesis pathway genes.

Также целью настоящего изобретения является предоставление описанного выше способа, в котором продуцируемой L-аминокислотой является L-аргинин.It is also an object of the present invention to provide a process as described above in which the L-amino acid produced is L-arginine.

Также целью настоящего изобретения является предоставление описанного выше способа, в котором у указанной бактерии экспрессия генов путей биосинтеза L-аргинин усилена.It is also an object of the present invention to provide a method as described above, wherein said bacterium has enhanced expression of L-arginine biosynthesis pathway genes.

Также целью настоящего изобретения является предоставление описанного выше способа, в котором продуцируемой L-аминокислотой является L-глутаминовая кислота.It is also an object of the present invention to provide a process as described above, wherein the L-amino acid produced is L-glutamic acid.

Также целью настоящего изобретения является предоставление описанного выше способа, в котором у указанной бактерии экспрессия генов путей биосинтеза L-глутаминовой кислоты усилена.It is also an object of the present invention to provide a method as described above, wherein said bacterium has enhanced expression of genes for L-glutamic acid biosynthesis pathways.

Также целью настоящего изобретения является предоставление описанного выше способа, в котором продуцируемой L-аминокислотой является L-триптофан.It is also an object of the present invention to provide the method described above, in which the L-amino acid produced is L-tryptophan.

Также целью настоящего изобретения является предоставление описанного выше способа, в котором у указанной бактерии экспрессия генов путей биосинтеза L-триптофана усилена.It is also an object of the present invention to provide a method as described above, wherein said bacterium has enhanced expression of L-tryptophan biosynthesis pathway genes.

Указанный способ получения L-аминокислот включает в себя способ получения L-гистидина с помощью ферментации на смеси сахаров - глюкозы и пентоз, таких как арабиноза и ксилоза. Также указанный способ получения L-аминокислот включает в себя способ получения L-треонина с помощью ферментации на смеси сахаров - глюкозы и пентоз, таких как арабиноза и ксилоза. Также указанный способ получения L-аминокислот включает в себя способ получения L-лизина с помощью ферментации на смеси сахаров - глюкозы и пентоз, таких как арабиноза и ксилоза. Также указанный способ получения L-аминокислот включает в себя способ получения L-аргинина с помощью ферментации на смеси сахаров - глюкозы и пентоз, таких как арабиноза и ксилоза. Также указанный способ получения L-аминокислот включает в себя способ получения L-глутаминовой кислоты с помощью ферментации на смеси сахаров - глюкозы и пентоз, таких как арабиноза и ксилоза. Также указанный способ получения L-аминокислот включает в себя способ получения L-триптофана с помощью ферментации на смеси сахаров - глюкозы и пентоз, таких как арабиноза и ксилоза. Указанная смесь сахаров - глюкозы и пентоз, используемая как компонент ферментационной среды, может быть получена из продуктов переработки растительной биомассы, таких как целлюлозная биомасса, предпочтительно гидролизат целлюлозы.The specified method for producing L-amino acids includes a method for producing L-histidine by fermentation on a mixture of sugars - glucose and pentoses, such as arabinose and xylose. Also, the specified method for producing L-amino acids includes a method for producing L-threonine by fermentation on a mixture of sugars - glucose and pentoses, such as arabinose and xylose. Also, the specified method for producing L-amino acids includes a method for producing L-lysine by fermentation on a mixture of sugars - glucose and pentoses, such as arabinose and xylose. Also, the specified method for producing L-amino acids includes a method for producing L-arginine by fermentation on a mixture of sugars - glucose and pentoses, such as arabinose and xylose. Also, said method for producing L-amino acids includes a method for producing L-glutamic acid by fermentation on a mixture of sugars — glucose and pentoses, such as arabinose and xylose. Also, the method for producing L-amino acids includes a method for producing L-tryptophan by fermentation on a mixture of sugars - glucose and pentoses, such as arabinose and xylose. Said sugar-glucose and pentose mixture used as a component of the fermentation medium can be obtained from plant biomass processing products, such as cellulosic biomass, preferably cellulose hydrolyzate.

Краткое описание рисунковBrief Description of Drawings

На чертеже изображена структрура локуса xylABFGHR на хромосоме штамма Е.coli MG1655. Стрелки на диаграмме указывают позиции праймеров, использованных для ПЦР.The drawing shows the structure of the xylABFGHR locus on the chromosome of E. coli strain MG1655. The arrows in the diagram indicate the positions of the primers used for PCR.

Наилучший способ осуществления изобретения.The best way of carrying out the invention.

Согласно настоящему изобретению "бактерия - продуцент L-аминокислоты" означает бактерию, обладающую способностью к накоплению этой L-аминокислоты в питательной среде в условиях, когда бактерия согласно настоящему изобретению выращивается в указанной питательной среде. Способность к продукции L-аминокислоты может быть придана или улучшена путем селекции. Используемый здесь термин «бактерия - продуцент L-аминокислоты» также означает бактерию, которая способна к продукции L-аминокислоты и вызывает накопление L-аминокислоты в питательной среде в количествах, больших, чем природный или родительский штамм, и, предпочтительно, означает, что микроорганизм способен производить и накапливать в ферментационной среде целевую L-аминокислоту в концентрациях не менее чем 0.5 г/л, более предпочтительно - не менее 1.0 г/л.According to the present invention, “bacterium producing L-amino acids” means a bacterium having the ability to accumulate this L-amino acid in a nutrient medium under conditions when the bacterium of the present invention is grown in the specified nutrient medium. The ability to produce L-amino acids can be given or improved by selection. As used herein, the term “bacterium-producing L-amino acid” also means a bacterium that is capable of producing L-amino acid and causes the accumulation of L-amino acid in a nutrient medium in quantities greater than the natural or parent strain, and preferably means that the microorganism capable of producing and accumulating in the fermentation medium the target L-amino acid in concentrations of not less than 0.5 g / l, more preferably not less than 1.0 g / l.

Термин «L-аминокислоты» включает в себя L-аланин, L-аргинин, L-аспарагин, L-аспарагиновую кислоту, L-цистеин, L-глутаминовую кислоту, L-глутамин, L-глицин, L-гистидин, L-изолейцин, L-лейцин, L-лизин, L-метионин, L-фенилаланин, L-пролин, L-серин, L-треонин, L-триптофан, L-тирозин и L-валин.The term “L-amino acids” includes L-alanine, L-arginine, L-asparagine, L-aspartic acid, L-cysteine, L-glutamic acid, L-glutamine, L-glycine, L-histidine, L-isoleucine , L-leucine, L-lysine, L-methionine, L-phenylalanine, L-proline, L-serine, L-threonine, L-tryptophan, L-tyrosine and L-valine.

Семейство Enterobacteriaceae включает в себя бактерий, принадлежащих к роду Escherichia, Erwinia, Pantoea, Providencia и Serratia. Роды Escherichia и Pantoea предпочтителены.The Enterobacteriaceae family includes bacteria belonging to the genus Escherichia, Erwinia, Pantoea, Providencia, and Serratia. The genera Escherichia and Pantoea are preferred.

Термин «обладает повышенной активностью ферментов утилизации ксилозы» означает то, что удельная активность становится выше, чем у немодифицированного штамма, например природного штамма. Например, в случае, когда количество молекул фермента в клетке увеличено, когда специфическая активность у молекулы фермента увеличена и так далее. Количество белка, кодируемого геном, может быть измерено известными методами, включающими SDS-электрофорез в полиакриламидном геле с последующим иммуноблоттингом (Western blotting analysis). Кроме того, в качестве природного штамма, который может служить объектом для сравнения, может быть упомянут штамм Escherichia coli К-12. В результате увеличения внутриклеточной активности ферментов утилизации ксилозы наблюдается эффект увеличения количества накопленного L-гистидина, L-треонина, L-лизина, L-аргинина, L-глутаминовой кислоты и L-триптофана.The term “has an increased activity of xylose utilization enzymes” means that the specific activity becomes higher than that of an unmodified strain, for example, a natural strain. For example, in the case when the number of enzyme molecules in the cell is increased, when the specific activity of the enzyme molecule is increased, and so on. The amount of protein encoded by the gene can be measured by known methods, including SDS-polyacrylamide gel electrophoresis followed by Western blotting analysis. In addition, a strain of Escherichia coli K-12 may be mentioned as a natural strain that can serve as an object for comparison. As a result of the increase in the intracellular activity of xylose utilization enzymes, the effect of increasing the amount of accumulated L-histidine, L-threonine, L-lysine, L-arginine, L-glutamic acid and L-tryptophan is observed.

"Ферменты утилизации ксилозы" включают в себя белки транспорта ксилозы, ферменты, катализирующие изомеризацию и фосфорилирование ксилозы, а также регуляторные белки. Более конкретно эти ферменты включают в себя ксилозоизомеразу, ксилулокиназу, транспортеры ксилозы и ксилозный транскрипционный активатор. Ксилозоизомераза катализирует реакцию изомеризации D-ксилозы в D-ксилулозу. Ксилулокиназа катализирует реакцию фосфорилирования D-ксилулозы с использованием АТФ, в результате чего образуется D-ксилулозо-5-фосфат и АДФ. Доказательством наличия активности ферментов утилизации ксилозы в клетке, таких как ксилозоизомераза, ксилулокиназа, определяется комплементацией соответствующих мутантов Е.coli, дефективных по ксилозоизомеразе или ксилулокиназе соответственно."Xylose utilization enzymes" include xylose transport proteins, enzymes that catalyze xylose isomerization and phosphorylation, as well as regulatory proteins. More specifically, these enzymes include xylose isomerase, xylulokinase, xylose transporters, and xylose transcriptional activator. Xylose isomerase catalyzes the isomerization of D-xylose to D-xylulose. Xylulokinase catalyzes the phosphorylation of D-xylulose using ATP, resulting in the formation of D-xylulose-5-phosphate and ADP. Evidence of the activity of xylose utilization enzymes in the cell, such as xylose isomerase, xylulokinase, is determined by complementation of the corresponding E. coli mutants deficient in xylose isomerase or xylulokinase, respectively.

Термин «бактерия, принадлежащая к роду Escherichia», означает, что бактерия относится к роду Escherichia в соответствии с классификацией, известной специалисту в области микробиологии. В качестве примера микроорганизма, принадлежащего к роду Escherichia, использованного в настоящем изобретении, может быть упомянута бактерия Escherichia coli (Е.coli).The term "bacterium belonging to the genus Escherichia" means that the bacterium belongs to the genus Escherichia in accordance with the classification known to the person skilled in the field of microbiology. As an example of a microorganism belonging to the genus Escherichia used in the present invention, the bacterium Escherichia coli (E. coli) may be mentioned.

Термин «увеличение экспрессируемого количества гена(ов)» означает, что экспрессируемое количество гена(ов) в клетке выше, чем количество этих генов в немодифицированном штамме, например природном. Примерами таких модификаций могут являться: увеличение количества экспрессируемых гена(ов) в пересчете на клетку, повышение уровня экспрессии этого(их) гена(ов) и так далее. Количество копий экспрессируемого гена измеряют, например, с помощью рестрикции хромосомной ДНК и последующей гибридизацией по Саузерну, при этом используется зонд, синтезированный на основе последовательности указанного гена, флюоресцентной гибридизацией in situ (FISH) и подобными им. Уровень экспрессии гена может быть измерен с помощью различных методов, включая гибридизацию по Нозерну, количественный ПЦР с обратной транскрипцией и подобные им. Кроме того, в качестве природного штамма, который может служить объектом для сравнения, может быть упомянут штамм Escherichia coli К-12. В результате увеличения внутриклеточной активности ферментов утилизации ксилозы наблюдается эффект увеличения количества накопленного L-гистидина, L-треонина, L-лизина, L-аргинина, L-глутаминовой кислоты и L-триптофана.The term "increase in the expressed amount of gene (s)" means that the expressed amount of gene (s) in a cell is higher than the number of these genes in an unmodified strain, for example, natural. Examples of such modifications may include: an increase in the number of expressed gene (s) per cell, an increase in the expression level of this (their) gene (s), and so on. The number of copies of an expressed gene is measured, for example, by restriction of chromosomal DNA and subsequent Southern hybridization, using a probe synthesized based on the sequence of the indicated gene, fluorescence in situ hybridization (FISH) and the like. Gene expression can be measured using various methods, including Northern hybridization, quantitative reverse transcription PCR, and the like. In addition, a strain of Escherichia coli K-12 may be mentioned as a natural strain that can serve as an object for comparison. As a result of the increase in the intracellular activity of xylose utilization enzymes, the effect of increasing the amount of accumulated L-histidine, L-threonine, L-lysine, L-arginine, L-glutamic acid and L-tryptophan is observed.

Увеличение активности в клетке бактерии может быть достигнуто путем увеличения уровня экспрессии генов, кодирующих ферменты утилизации ксилозы. Гены утилизации ксилозы могут включать в себя любые гены, выделенные как из бактерий, принадлежащих к семейству Enterobacteriaceae, так и из других бактерий, таких как коринеформные бактерии. Гены, выделенные из бактерий, принадлежащих к роду Escherichia, предпочтительны.An increase in activity in a bacterial cell can be achieved by increasing the level of expression of genes encoding xylose utilization enzymes. Xylose utilization genes can include any genes isolated from bacteria belonging to the Enterobacteriaceae family, as well as from other bacteria, such as coryneform bacteria. Genes isolated from bacteria belonging to the genus Escherichia are preferred.

Ген, кодирующий ксилозоизомеразу из Е.coli (ЕС номер 5.3.1.5), известен и получил название xylA (номера нуклеотидов с 3727072 по 3728394 в последовательности с инвентарным номером NC_000913.1 в GenBank; gi: 16131436). Ген, кодирующий ксилулокиназу (ЕС номер 2.7.1.17) известен и получил название xylB (номера нуклеотидов с 3725546 по 3727000 в последовательности с инвентарным номером NC_000913.1 в GenBank; gi:16131435). Ген, кодирующий белок транспортной системы, связывающий ксилозу, известен и получил название xylF (номера нуклеотидов с 3728760 по 3729752 в последовательности с инвентарным номером NC_000913.1 в GenBank; gi: 16131437). Ген, кодирующий гипотетический АТФ-связывающий белок транспортной системы ксилозы, известен и получил название xylG (номера нуклеотидов с 3729830 по 3731371 в последовательности с инвентарным номером NC_000913.1 в GenBank; gi:16131438). Ген, кодирующий пермеазную составляющую транспортной системы ксилозы АВС-типа, известен и получил название xylH (номера нуклеотидов с 3731349 по 3732530 в последовательности с инвентарным номером NC_000913.1 в GenBank; gi:16131439). Ген, кодирующий регулятор транскрипции xyl оперона известен и получил название xylR (номера нуклеотидов с 3732608 по 3733786 в последовательности с инвентарным номером NC_000913.1 в GenBank; gi: 16131440). Таким образом, все вышеупомянутые гены могут быть получены с помощью ПЦР (полимеразная цепная реакция; refer to White, T.J. et al., Trends Genet., 5, 185 (1989)), используя праймеры, синтезированные на основе нуклеотидных последовательностей этих генов.The gene encoding xylose isomerase from E. coli (EC number 5.3.1.5) is known and is called xylA (nucleotide numbers 3727072 to 3728394 in sequence with accession number NC_000913.1 in GenBank; gi: 16131436). The gene encoding xylulokinase (EC number 2.7.1.17) is known and is called xylB (nucleotide numbers from 3725546 to 3727000 in sequence with accession number NC_000913.1 in GenBank; gi: 16131435). The gene encoding the xylose binding protein of the transport system is known and is called xylF (nucleotide numbers 3728760 to 3729752 in sequence with accession number NC_000913.1 in GenBank; gi: 16131437). The gene encoding the hypothetical ATP-binding protein of the xylose transport system is known and is called xylG (nucleotide numbers from 3729830 to 3731371 in the sequence with accession number NC_000913.1 in GenBank; gi: 16131438). The gene encoding the permease component of the ABC-type xylose transport system is known and is called xylH (nucleotide numbers from 3731349 to 3732530 in sequence with accession number NC_000913.1 in GenBank; gi: 16131439). The gene encoding the xyl operon transcription regulator is known and is called xylR (nucleotide numbers 3732608 through 3733786 in sequence with accession number NC_000913.1 in GenBank; gi: 16131440). Thus, all of the aforementioned genes can be obtained by PCR (polymerase chain reaction; refer to White, T.J. et al., Trends Genet. 5, 185 (1989)) using primers synthesized based on the nucleotide sequences of these genes.

Гены, кодирующие ферменты утилизации ксилозы у других микроорганизмов, могут быть получены аналогичным способом.Genes encoding xylose utilization enzymes in other microorganisms can be obtained in a similar manner.

Ген xylA из Escherichia coli представлен ДНК, кодирующей следующий белок (А) или (В):The xylA gene from Escherichia coli is represented by DNA encoding the following protein (A) or (B):

(A) белок, включающий последовательность аминокислот, приведенную в списке последовательностей под номером 2 (SEQ ID NO: 2); или(A) a protein comprising the amino acid sequence shown in sequence listing number 2 (SEQ ID NO: 2); or

(B) белок, включающий последовательность аминокислот, содержащей делеции, замены, вставки или добавление одной или нескольких аминокислот в последовательность аминокислот, приведенную в списке последовательностей под номером 2 (SEQ ID NO: 2), который обладает активностью ксилозоизомеразы.(B) a protein comprising an amino acid sequence containing deletions, substitutions, insertions, or the addition of one or more amino acids to the amino acid sequence listed in sequence number 2 (SEQ ID NO: 2), which has xylose isomerase activity.

Ген xylB из Escherichia coli представлен ДНК, кодирующей следующий белок (С) или (D):The xylB gene from Escherichia coli is represented by DNA encoding the following protein (C) or (D):

(C) белок, включающий последовательность аминокислот, приведенную в списке последовательностей под номером 4 (SEQ ID NO: 4); или(C) a protein comprising the amino acid sequence shown in the sequence list under number 4 (SEQ ID NO: 4); or

(D) белок, включающий последовательность аминокислот, содержащей делеции, замены, вставки или добавление одной или нескольких аминокислот в последовательность аминокислот, приведенную в списке последовательностей под номером 4 (SEQ ID NO: 4), который обладает активностью ксилулокиназы.(D) a protein comprising an amino acid sequence containing deletions, substitutions, insertions, or addition of one or more amino acids to the amino acid sequence listed in sequence number 4 (SEQ ID NO: 4), which has xylulokinase activity.

Ген xylF из Escherichia coli представлен ДНК, кодирующей следующий белок (Е) или (F):The xylF gene from Escherichia coli is represented by DNA encoding the following protein (E) or (F):

(Е) белок, включающий последовательность аминокислот, приведенную в списке последовательностей под номером 6 (SEQ ID N: 6); или(E) a protein comprising the amino acid sequence shown in the sequence list under number 6 (SEQ ID N: 6); or

(F) белок, включающий последовательность аминокислот, содержащей делеции, замены, вставки или добавление одной или нескольких аминокислот в последовательность аминокислот, приведенную в списке последовательностей под номером 6 (SEQ ID NO: 6), который обладает активностью, приводящей к повышению количества L-гистидина, L-треонина, L-лизина, L-аргинина, L-глутаминовой кислоты или L-триптофана, накопленного в культуральной среде, в случае когда количество этого белка в бактерии - продуценте L-аминокислоты увеличено одновременно с увеличением количества белков, кодируемых генами xylAB и xylGHR.(F) a protein comprising an amino acid sequence containing deletions, substitutions, insertions, or the addition of one or more amino acids to the amino acid sequence listed in sequence number 6 (SEQ ID NO: 6), which has activity leading to an increase in the amount of L- histidine, L-threonine, L-lysine, L-arginine, L-glutamic acid or L-tryptophan accumulated in the culture medium, when the amount of this protein in the bacteria producing L-amino acids is increased simultaneously with an increase in the number Wa proteins encoded by the xylAB and xylGHR genes.

Ген xylG из Escherichia coli представлен ДНК, кодирующей следующий белок (G) или (Н):The xylG gene from Escherichia coli is represented by DNA encoding the following protein (G) or (H):

(G) белок, включающий последовательность аминокислот, приведенную в списке последовательностей под номером 8 (SEQ ID NO: 8); или(G) a protein comprising the amino acid sequence shown in the sequence listing under number 8 (SEQ ID NO: 8); or

(Н) белок, включающий последовательность аминокислот, содержащей делеции, замены, вставки или добавление одной или нескольких аминокислот в последовательность аминокислот, приведенную в списке последовательностей под номером 8 (SEQ ID NO: 8), который обладает активностью, приводящей к повышению количества L-гистидина, L-треонина, L-лизина, L-аргинина, L-глутаминовой кислоты или L-триптофана, накопленного в культуральной среде, в случае когда количество этого белка в бактерии - продуценте L-аминокислоты увеличено одновременно с увеличением количества белков, кодируемых генами xylAB и xylFHR.(H) a protein comprising an amino acid sequence containing deletions, substitutions, insertions, or the addition of one or more amino acids to the amino acid sequence listed in the sequence number 8 (SEQ ID NO: 8), which has activity leading to an increase in the amount of L- histidine, L-threonine, L-lysine, L-arginine, L-glutamic acid or L-tryptophan accumulated in the culture medium, when the amount of this protein in the bacteria producing L-amino acids is increased simultaneously with an increase in the amount of Islands of the proteins encoded by genes xylAB and xylFHR.

Ген xylH из Escherichia coli представлен ДНК, кодирующей следующий белок (I) или (J):The xylH gene from Escherichia coli is represented by DNA encoding the following protein (I) or (J):

(I) белок, включающий последовательность аминокислот, приведенную в списке последовательностей под номером 10 (SEQ ID NO: 10); или(I) a protein comprising the amino acid sequence shown in the list of sequences at number 10 (SEQ ID NO: 10); or

(J) белок, включающий последовательность аминокислот, содержащей делеции, замены, вставки или добавление одной или нескольких аминокислот в последовательность аминокислот, приведенную в списке последовательностей под номером 10 (SEQ ID NO: 10), который обладает активностью, приводящей к повышению количества L-гистидина, L-треонина, L-лизина, L-аргинина, L-глутаминовой кислоты или L-триптофана, накопленного в культуральной среде, в случае когда количество этого белка в бактерии - продуценте L-аминокислоты увеличено одновременно с увеличением количества белков, кодируемых генами xylAB и xylFGR.(J) a protein comprising an amino acid sequence containing deletions, substitutions, insertions, or the addition of one or more amino acids to the amino acid sequence listed in sequence number 10 (SEQ ID NO: 10), which has an activity leading to an increase in the amount of L- histidine, L-threonine, L-lysine, L-arginine, L-glutamic acid or L-tryptophan accumulated in the culture medium, when the amount of this protein in the bacteria producing L-amino acids is increased simultaneously with an increase in the amount of Twa proteins encoded by the xylAB and xylFGR genes.

Ген xylR из Escherichia coli представлен ДНК, кодирующей следующий белок (К) или (L):The xylR gene from Escherichia coli is represented by DNA encoding the following protein (K) or (L):

(К) белок, включающий последовательность аминокислот, приведенную в списке последовательностей под номером 12 (SEQ ID NO: 12); или(K) a protein comprising the amino acid sequence shown in the sequence list under number 12 (SEQ ID NO: 12); or

(L) белок, включающий последовательность аминокислот, содержащей делеции, замены, вставки или добавление одной или нескольких аминокислот в последовательность аминокислот, приведенную в списке последовательностей под номером 12 (SEQ ID NO: 12), который обладает активностью, приводящей к повышению количества L-гистидина, L-треонина, L-лизина, L-аргинина, L-глутаминовой кислоты или L-триптофана, накопленного в культуральной среде, в случае когда количество этого белка в бактерии - продуценте L-амминокислоты увеличено одновременно с увеличением количества белков, кодируемых генами xylAB и xylFGH.(L) a protein comprising an amino acid sequence containing deletions, substitutions, insertions, or addition of one or more amino acids to the amino acid sequence listed in sequence number 12 (SEQ ID NO: 12), which has an activity leading to an increase in the amount of L- histidine, L-threonine, L-lysine, L-arginine, L-glutamic acid or L-tryptophan accumulated in the culture medium, when the amount of this protein in the bacteria producing L-amino acids is increased simultaneously with an increase in the amount of protein encoded by the xylAB and xylFGH genes.

ДНК, кодирующая ксилозоизомеразу, включает в себя ДНК, кодирующую белок, содержащий делеции, замены, вставки или добавления одной или нескольких аминокислот в одной или нескольких положениях в белке (А) при условии, что указанный белок не теряет своей активности. Несмотря на то что количество «нескольких» аминокислот может быть различным в зависимости от положения и типа аминокислотного остатка в трехмерной структуре указанного белка, это количество может варьировать от 2 до 50, предпочтительно от 2 до 20, и, более предпочтительно от 2 до 10 аминокислотных остатков для белка (А). Этот объясняется тем фактом, что некоторые аминокислоты обладают высокой гомологией друг к другу и замена таких аминокислот не оказывает существенного влияния на трехмерную структуру белка и его активность. Таким образом, белок (В) может иметь гомологию, не меньшую, чем от 30 до 50%, предпочтительно от 50 до 70%, более предпочтительно от 70 до 90% и наиболее предпочтительно - более 90%, по отношению к общему количеству аминокислотных остатков, входящих в состав ксилозоизомеразы, и обладающий активностью ксилозоизомеразы. Те же критерии и степень гомологии могут быть применены к остальным белкам (С), (Е), (G), (I) и (К).DNA encoding xylose isomerase includes DNA encoding a protein containing deletions, substitutions, insertions, or additions of one or more amino acids at one or more positions in protein (A), provided that the protein does not lose its activity. Despite the fact that the number of "several" amino acids may vary depending on the position and type of amino acid residue in the three-dimensional structure of the specified protein, this number can vary from 2 to 50, preferably from 2 to 20, and more preferably from 2 to 10 amino acid residues for protein (A). This is due to the fact that some amino acids have high homology to each other and the replacement of such amino acids does not significantly affect the three-dimensional structure of the protein and its activity. Thus, protein (B) can have a homology of not less than 30 to 50%, preferably 50 to 70%, more preferably 70 to 90%, and most preferably more than 90%, relative to the total amount of amino acid residues included in xylose isomerase, and having xylose isomerase activity. The same criteria and degree of homology can be applied to other proteins (C), (E), (G), (I) and (K).

Для оценки степени гомологии между ДНК возможно использование нескольких способов расчета, таких как BLAST search, FASTA search и CrustalW.Several methods of calculation, such as BLAST search, FASTA search, and CrustalW, can be used to assess the degree of homology between DNA.

BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) - это самообучающийся алгоритм поиска, используемый программами BLASTP, BLASTN, BLASTX, MEGABLAST, TBLASTN, и TBLASTX; эти программы оценивают значимость найденных результатов с использованием статистических методов Karlin, Samuel и Stephen F. Altschul ("Methods for assessing the statistical significance of molecular sequence features by using general scoring schemes". Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1990, 87: 2264-68; "Applications and statistics for multiple high-scoring segments in molecular sequences". Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1993, 90: 5873-7). Способ поиска FASTA описан W.R.Pearson ("Rapid and Sensitive Sequence Comparison with FASTP and FASTA", Methods in Enzymology, 1990 183: 63-98). Способ ClustalW описан Thompson J.D., Higgins D.G. и Gibson T.J. ("CLUSTAL W: improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, position-specific gap penalties and weight matrix choice", Nucleic Acids Res. 1994, 22: 4673-4680).BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) is a self-learning search algorithm used by BLASTP, BLASTN, BLASTX, MEGABLAST, TBLASTN, and TBLASTX; these programs evaluate the significance of the results using statistical methods Karlin, Samuel and Stephen F. Altschul ("Methods for assessing the statistical significance of molecular sequence features by using general scoring schemes". Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1990, 87 : 2264-68; "Applications and statistics for multiple high-scoring segments in molecular sequences". Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1993, 90: 5873-7). The FASTA search method is described by W.R. Pearson ("Rapid and Sensitive Sequence Comparison with FASTP and FASTA", Methods in Enzymology, 1990 183: 63-98). The ClustalW method is described by Thompson J.D., Higgins D.G. and Gibson T.J. ("CLUSTAL W: improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, position-specific gap penalties and weight matrix choice", Nucleic Acids Res. 1994, 22: 4673-4680).

ДНК, кодирующая практически такие же белки, как белок, описанный в пункте (А), может быть получена, например, путем модификации нуклеотидной последовательности ДНК, кодирующей белок, описанный в пункте (А), например, с помощью метода сайт-направленного мутагенеза, таким образом, что один или несколько аминокислотных остатков могут быть делегированы, заменены, вставлены или добавлены. ДНК, модифицированная, как описано выше, может быть получена традиционными известными методами обработками с целью получения мутаций. Такие методы включают обработку ДНК, кодирующей белок согласно настоящему изобретению, гидроксиламином или обработку бактерии, содержащей указанную ДНК, с помощью УФ излучения или реагентом, таким как N-метил-N'-нитро-N-нитрозогуанидин или азотистая кислота.DNA encoding almost the same proteins as the protein described in paragraph (A) can be obtained, for example, by modifying the nucleotide sequence of the DNA encoding the protein described in paragraph (A), for example, using the site-directed mutagenesis method, such that one or more amino acid residues can be delegated, replaced, inserted or added. DNA modified as described above can be obtained by conventional methods known in the art for the purpose of producing mutations. Such methods include treating the DNA encoding the protein of the present invention with hydroxylamine, or treating the bacterium containing said DNA with UV radiation or with a reagent such as N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine or nitrous acid.

ДНК, кодирующая ксилозоизомеразу, включает также ДНК, которая может быть получена из различных штаммов бактерий, принадлежащих к роду Escherichia ввиду природного разнообразия. ДНК, кодирующая такие белки, может быть получена путем выделения ДНК, которая гибридизуется геном xylA или его частью в жестких условиях, и кодирует белок, обладающий активностью ксилозоизомеразы. Термин «жесткие условия», упомянутый здесь, означает условия, при которых образуются так называемые специфические гибриды, а неспецифические - не образуются. Например, к жестким условиям относятся условия, при которых гибридизуются ДНК, обладающие высокой степенью гомологии, к примеру, ДНК, обладающие гомологией не менее 70% друг относительно друга. С другой стороны, примером жестких условий являются условия, при которых ДНК гибридизуются друг с другом, при концентрации солей, соответствующей стандартным условиям отмывки при гибридизации по Саузерну, например, 1×SSC, 0.1% SDS, предпочтительно 0.1×SSC, 0.1% SDS при 60°С. Продолжительность отмывки зависит от вида фильтра, используемого для блоттинга и, как правило, рекомендована изготовителем. Например, рекомендованная продолжительность отмывки нейлонового фильтра Hybond™ N+(Amersham) в жестких условиях составляет 15 минут. В качестве зонда для ДНК, кодирующей варианты и гибридизующейся с геном xylA, также может быть использована часть нуклеотидной последовательности под номером SEQ ID NO: 1. Зонд подобного рода может быть получен в результате ПЦР с использованием в качестве затравок олигонуклеотидов, полученных на основе нуклеотидной последовательности под номером SEQ ID NO: 1, и фрагмента ДНК, содержащего нуклеотидную последовательность под номером SEQ ID NO: 1, в качестве матрицы. В случае когда в качестве зонда используется фрагмент ДНК длиной около 300 пар оснований, условия отмывки при гибридизации соответствуют, например, 50°, 2×SSC и 0.1% SDS.The DNA encoding xylose isomerase also includes DNA that can be obtained from various strains of bacteria belonging to the genus Escherichia due to natural diversity. DNA encoding such proteins can be obtained by isolating DNA that hybridizes with the xylA gene or part thereof under stringent conditions and encodes a protein with xylose isomerase activity. The term "stringent conditions", mentioned here, means the conditions under which the so-called specific hybrids are formed, and non-specific ones are not formed. For example, stringent conditions include conditions under which DNA with a high degree of homology hybridizes, for example, DNA with a homology of at least 70% relative to each other. On the other hand, an example of stringent conditions is the conditions under which DNA hybridizes with each other, at a salt concentration corresponding to standard washing conditions for Southern hybridization, for example, 1 × SSC, 0.1% SDS, preferably 0.1 × SSC, 0.1% SDS at 60 ° C. The duration of washing depends on the type of filter used for blotting and, as a rule, recommended by the manufacturer. For example, the recommended washing time for a Hybond ™ N + nylon filter (Amersham) under harsh conditions is 15 minutes. Part of the nucleotide sequence numbered SEQ ID NO: 1 can also be used as a probe for DNA encoding variants and hybridizing with the xylA gene. A probe of this kind can be obtained by PCR using oligonucleotides obtained on the basis of the nucleotide sequence as seeds under the number SEQ ID NO: 1, and a DNA fragment containing the nucleotide sequence under the number SEQ ID NO: 1, as a matrix. When a DNA fragment with a length of about 300 base pairs is used as a probe, the washing conditions during hybridization correspond, for example, to 50 °, 2 × SSC, and 0.1% SDS.

ДНК, кодирующие практически такие же белки, как другие белки утилизации ксилозы, могут быть получены с применением методик, аналогичных тем, которые применяли для получения ксилозоизомеразы, как описано выше.DNAs encoding substantially the same proteins as other xylose utilization proteins can be obtained using techniques similar to those used to produce xylose isomerase as described above.

Трансформация бактерии с помощью ДНК, кодирующей белок, означает введение указанной ДНК в клетку бактерии, например, традиционными методами для увеличения экспрессии указанного гена, кодирующего белок согласно настоящему изобретению, и увеличения активности указанного белка в клетке бактерии.Transformation of a bacterium using DNA encoding a protein means introducing said DNA into a bacterial cell, for example, by conventional methods to increase the expression of said gene encoding a protein of the present invention and increase the activity of said protein in a bacterial cell.

Бактерия согласно настоящему изобретению также включает в себя бактерию, в которой активность белка согласно настоящему изобретению повышена благодаря трансформации указанной бактерии ДНК, кодирующей такой же белок, как описанный в пунктах (А) или (В), (С) или (D), (Е) или (F), (G) или (Н), (I) или (J), и (К) или (L), или благодаря усилению последовательности, регулирующей экспрессию вышеупомянутой ДНК на хромосоме указанной бактерии.The bacterium of the present invention also includes a bacterium in which the activity of the protein of the present invention is enhanced by transforming said bacterium with DNA encoding the same protein as described in points (A) or (B), (C) or (D), ( E) or (F), (G) or (H), (I) or (J), and (K) or (L), or by enhancing the sequence that regulates the expression of the aforementioned DNA on the chromosome of the specified bacterium.

К методам увеличения экспрессии генов относятся методы увеличения числа копий гена. Введение гена в вектор, способный к функционированию в бактерии, принадлежащей к роду Escherichia, увеличивает число копий указанного гена. Для подобных целей могут быть предпочтительно использованы векторы разной копийности. Более предпочтительно использование низкокопийных векторов. Примерами низкокопийных векторов являются pSC101, pMW118, pMW119 и подобные им. Термин "низкокопийный вектор" используется для обозначения векторов, количество копий которых на клетку не превышает 5. Способы трансформации включают в себя все возможные способы, известные специалисту в данной области. Например, может быть использован способ обработки клеток-реципиентов хлоридом кальция для повышения проницаемости клеточных стенок для ДНК, опубликованный для Escherichia coli K-12 (Mandel, M. and Higa, A., J. Mol. Biol, 53, 159 (1970)).Methods for increasing gene expression include methods for increasing the number of copies of a gene. The introduction of a gene into a vector capable of functioning in bacteria belonging to the genus Escherichia increases the number of copies of the specified gene. For such purposes, vectors of different copy numbers can preferably be used. More preferably, low copy vectors are used. Examples of low copy vectors are pSC101, pMW118, pMW119 and the like. The term "low copy vector" is used to denote vectors whose number of copies per cell does not exceed 5. Transformation methods include all possible methods known to one skilled in the art. For example, a method of treating recipient cells with calcium chloride to increase the permeability of cell walls for DNA, published for Escherichia coli K-12 (Mandel, M. and Higa, A., J. Mol. Biol, 53, 159 (1970), can be used. )

Кроме того, усиление экспрессии гена может также быть достигнуто путем введения нескольких копий гена в бактериальную хромосому, например, методом гомологичной рекомбинации, Mu интеграцией или подобными им. К примеру, один цикл Mu интеграции позволяет ввести в бактериальную хромосому до 3-х копий указанного гена.In addition, increased gene expression can also be achieved by introducing several copies of the gene into the bacterial chromosome, for example, by homologous recombination, Mu integration, or the like. For example, one Mu integration cycle allows up to 3 copies of the indicated gene to be introduced into the bacterial chromosome.

С другой стороны, усиление экспрессии генов может быть достигнуто помещением ДНК согласно настоящему изобретению под контроль более сильного промотора взамен природного. Сила промотора определяется частотой акта инициации синтеза РНК. Методы оценки силы промотера и примеры сильных промоторов описаны у Deuschle, U., Kammerer, W., Gentz, R., Bujard, H. (Promoters in Escherichia coli: a hierarchy of in vivo strength indicates alternate structures. EMBO J. 1986, 5, 2987-2994). Например, P_R промотор известен как сильный конститутивный промотор. В качестве сильных промоторов известны P_L промотор, lac промотор, trp промотор, trc промотор, фага лямбда и подобные им.On the other hand, increased gene expression can be achieved by placing the DNA of the present invention under the control of a stronger promoter instead of the natural one. The strength of the promoter is determined by the frequency of the act of initiation of RNA synthesis. Methods for evaluating promoter strength and examples of strong promoters are described by Deuschle, U., Kammerer, W., Gentz, R., Bujard, H. (Promoters in Escherichia coli: a hierarchy of in vivo strength indicates alternate structures. EMBO J. 1986, 5, 2987-2994). For example, the P _R promoter is known as a strong constitutive promoter. As strong promoters, the P _L promoter, lac promoter, trp promoter, trc promoter, phage lambda and the like are known.

Усиление трансляции может быть достигнуто путем введения в ДНК согласно настоящему изобретению более эффективной последовательности Shine-Dalgamo (SD последовательности) вместо природной SD последовательности. SD последовательностью является область, находящаяся на цепи ДНК перед старт-кодоном мРНК и взаимодействующая с 16SPHK рибосомы (Shine J. and Dalgamo L, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1974, 71,4, 1342-6).Enhanced translation can be achieved by introducing into the DNA of the present invention a more efficient Shine-Dalgamo sequence (SD sequence) instead of the native SD sequence. The SD sequence is the region located on the DNA chain in front of the start codon of the mRNA and interacting with 16SPHK ribosomes (Shine J. and Dalgamo L, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1974, 71.4, 1342-6).

Использование сильного промотора может быть совмещено с увеличением числа копий гена.Using a strong promoter can be combined with an increase in the number of copies of the gene.

Кроме того, промотор может быть усилен, например, введением мутации в последовательность промотора для повышения уровня транскрипции гена, расположенного за промотором. Уже известно, что замена нескольких нуклеотидов в спейсерном участке между сайтом связывания рибосомы (RBS) и старт кодоном и, в частности, в последовательностях, расположенных непосредственно перед старт кодоном, серьезно влияет на уровень трансляции мРНК. Например, была обнаружена 20-кратная разница в уровне экспрессии гена в зависимости от состава последовательности из трех нуклеотидов, находящихся перед старт кодоном (Gold et al., Annu. Rev. Microbiol., 35, 365-403,1981; Hui et al; EMBO J., 3, 623-629, 1984).In addition, the promoter can be enhanced, for example, by introducing a mutation in the sequence of the promoter to increase the level of transcription of the gene located behind the promoter. It is already known that the replacement of several nucleotides in the spacer region between the ribosome binding site (RBS) and the start codon, and, in particular, in the sequences located immediately before the start codon, seriously affects the level of mRNA translation. For example, a 20-fold difference in the level of gene expression was found depending on the composition of the sequence of the three nucleotides before the start of the codon (Gold et al., Annu. Rev. Microbiol., 35, 365-403.1981; Hui et al; EMBO J., 3, 623-629, 1984).

Методами получения хромосомной ДНК, гибридизации, ПЦР, получения плазмидной ДНК, разрезания и лигирования ДНК, трансформации, выбора олигонуклеотидов в качестве праймеров и подобные им могут являться обычные методы, хорошо известные специалисту в данной области. Эти методы описаны, например, в книге Sambrook, J., and Russell D., "Molecular Cloning A Laboratory Manual, Third Edition", Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001) и подобным ей.Methods for producing chromosomal DNA, hybridization, PCR, obtaining plasmid DNA, cutting and ligation of DNA, transformation, selection of oligonucleotides as primers and the like can be conventional methods well known to those skilled in the art. These methods are described, for example, in Sambrook, J., and Russell D., "Molecular Cloning A Laboratory Manual, Third Edition", Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001) and the like.

Бактерия согласно настоящему изобретению может быть получена путем введения вышеуказанных ДНК в бактерию, уже обладающую способностью к продукции L-аминокислоты. С другой стороны, бактерия согласно настоящему изобретению может быть получена путем придания бактерии, уже содержащей указанные ДНК, способности к продукции L-аминокислоты.A bacterium according to the present invention can be obtained by introducing the above DNA into a bacterium already possessing the ability to produce L-amino acids. On the other hand, a bacterium according to the present invention can be obtained by giving a bacterium already containing said DNA the ability to produce L-amino acids.

Примеры бактерий - продуцентов L-аминокислоты, принадлежащих к роду Escherichia, приведены ниже.Examples of bacteria producing L-amino acids belonging to the genus Escherichia are given below.

Бактерия - продуцент L-гистидинаBacteria - L-histidine producer

Примерами бактерий, принадлежащих к роду Escherichia, обладающих способностью к продукции L-гистидина, включают в себя штаммы бактерии - продуцента L-гистидина, принадлежащих к роду Escherichia, такие как штамм Е.coli 24 (ВКПМ В-5945, Российский патент 2003677); штамм Е.coli 80 (ВКПМ В-7270, Российский патент 2119536); штаммы Е.coli NRRL В-12116 - В12121 (патент США 4388405); штаммы Е.coli H-9342 (FERM ВР-6675) и Н-9343 (FERM ВР-6676) (патент США 6344347); штамм Е.coli H-9341 (FERM BP-6674) (Европейская патентная заявка 1085087А2); штамм Е.coli AI80/pFM201 (патент США 6258554) и подобные им.Examples of bacteria belonging to the genus Escherichia with the ability to produce L-histidine include strains of bacteria producing L-histidine belonging to the genus Escherichia, such as strain E. coli 24 (VKPM B-5945, Russian patent 2003677); E. coli strain 80 (VKPM B-7270, Russian patent 2119536); E. coli strains NRRL B-12116 - B12121 (US Pat. No. 4,388,405); E. coli strains H-9342 (FERM BP-6675) and H-9343 (FERM BP-6676) (US patent 6344347); E. coli strain H-9341 (FERM BP-6674) (European Patent Application 1085087A2); E. coli strain AI80 / pFM201 (US patent 6258554) and the like.

Предпочтительно, чтобы бактерия согласно настоящему изобретению была в дальнейшем модифицирована для усиления экспрессии одного или более генов гистидинового оперона, который предпочтительно включает в себя ген hisG, кодирующий АТФ фосфорибозилтрансферазу, не чуствительную к ингибированию гистидином по принципу обратной связи (патенты России 2003677 и 2119536), для бактерии - продуцента L-гистидина.Preferably, the bacterium of the present invention is further modified to enhance the expression of one or more histidine operon genes, which preferably includes hisG gene encoding ATP phosphoribosyltransferase, which is not sensitive to feedback inhibition by histidine (Russian patents 2003677 and 2119536), for bacteria - producer of L-histidine.

Бактерия - продуцент L-треонинаBacteria - producer of L-threonine

Примеры родительского штамма для получения бактерии - продуцента L-треонина согласно настоящему изобретению включают, но не ограничиваются штаммами, принадлежащими к роду Escherichia, такими как штамм Е.coli TDH-6/pVIC40 (ВКПМ В-3996) (патенты США 5175107 и 5705371), штамм Е.coli NRRL-21593 (патент США 5939307), штамм Е.coli FERM BP-3756 (патент США 5474918), штаммы Е.coli FERM ВР-3519 и FERM BP-3520 (патент США 5376538), штамм Е.coli MG442 (Гусятинер и др., Генетика, 14, 947-956 (1978)), штаммы Е.coli VL643 и VL2055 (Европейская патентная заявка ЕР1149911А) и подобными им.Examples of the parent strain for producing the L-threonine producing bacterium of the present invention include, but are not limited to, strains belonging to the genus Escherichia, such as E. coli strain TDH-6 / pVIC40 (VKPM B-3996) (US patents 5175107 and 5705371) , E. coli strain NRRL-21593 (US patent 5939307), E. coli strain FERM BP-3756 (US patent 5474918), E. coli strains FERM BP-3519 and FERM BP-3520 (US patent 5376538), strain E. coli MG442 (Gusyatiner et al., Genetics, 14, 947-956 (1978)), E. coli strains VL643 and VL2055 (European patent application EP1149911A) and the like.

Штамм TDH-6 является дефицитным по гену thrC, способен ассимилировать глюкозу и содержит ген ilvA с мутацией типа "leaky". Указанный штамм содержит мутацию в гене rhtA, которая обуславливает устойчивость к высоким концентрациям треонина и гомосерина. Штамм В-3996 содержит плазмиду pVIC40, которая была получена путем введения в вектор, производный от вектора RSF1010, оперона thrA^*BC, включающего мутантный ген thrA, кодирующий аспартокиназа-гомосериндегидрогеназу I, у которой существенно снижена чувствительность к ингибированию треонином по типу обратной связи. Штамм В-3996 был депонирован 19 ноября 1987 года во Всесоюзном научном центре антибиотиков (РФ, 113105 Москва, Нагатинская ул., 3-А) с инвентарным номером РИА 1867. Указанный штамм также был депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) (РФ, 113545 Москва, 1-й Дорожный проезд, 1) с инвентарным номером В-3996.Strain TDH-6 is deficient in the thrC gene, is capable of assimilating glucose, and contains the ilvA gene with a leaky mutation. The specified strain contains a mutation in the rhtA gene, which causes resistance to high concentrations of threonine and homoserine. Strain B-3996 contains the plasmid pVIC40, which was obtained by introducing into the vector derived from the RSF1010 vector the thrA ^* BC operon including the thrA mutant gene encoding aspartokinase-homoserine dehydrogenase I, which has a significantly reduced feedback sensitivity to threonine inhibition. Strain B-3996 was deposited on November 19, 1987 at the All-Union Scientific Center for Antibiotics (RF, 113105 Moscow, Nagatinskaya St., 3-A) with inventory number RIA 1867. This strain was also deposited in the All-Russian Collection of Industrial Microorganisms (VKPM) (RF , 113545 Moscow, 1st Road passage, 1) with inventory number B-3996.

Предпочтительно, чтобы бактерия согласно настоящему изобретению была далее модифицирована таким образом, чтобы иметь повышенную экспрессию одного или нескольких следующих генов:Preferably, the bacterium of the present invention is further modified so as to have increased expression of one or more of the following genes:

- мутантного гена thrA, кодирующего аспартокиназа-гомосериндегидрогеназу I, устойчивую к ингибированию треонином по типу обратной связи;- mutant thrA gene encoding aspartokinase-homoserine dehydrogenase I, resistant to threonine inhibition by feedback type;

- гена thrB, кодирующего гомосеринкиназу;- thrB gene encoding homoserine kinase;

- гена thrC, кодирующего треонинсинтазу;- thrC gene encoding threonine synthase;

- гена rhtA, предположительно кодирующего трансмембранный белок;- rhtA gene, presumably encoding a transmembrane protein;

- гена asd, кодирующего аспартат-β-семиальдегиддегидрогеназу;- asd gene encoding aspartate β-semialdehyde dehydrogenase;

- гена aspC, кодирующего аспартатаминотрансферазу (аспартат трансаминазу);- aspC gene encoding aspartate aminotransferase (aspartate transaminase);

Последовательность гена thrA, кодирующего аспартокиназа-гомосериндегидрогеназу I из Escherichia coli, известна (номера нуклеотидов с 337 по 2799 в последовательности с инвентарным номером NC_000913.2 в базе данных GenBank, gi: 49175990). Ген thrA расположен на хромосоме штамма Е.coli К-12 между генами thrL и thrB. Последовательность гена thrB, кодирующего гомосеринкиназу из Escherichia coli, известна (номера нуклеотидов с 2801 по 3733 в последовательности с инвентарным номером NC_000913.2 в базе данных GenBank, gi: 49175990). Ген thrB расположен на хромосоме штамма Е.coli K-12 между генами thrA и thrC. Последовательность гена thrC, кодирующего треонинсинтазу из Escherichia coli, известна (номера нуклеотидов с 3734 по 5020 в последовательности с инвентарным номером NC_000913.2 в базе данных GenBank, gi: 49175990). Ген thrC расположен на хромосоме штамма Е.coli K-12 между геном thrB и открытой рамкой считывания уааХ. Все три указанных гена функционируют как один треониновый оперон.The sequence of the thrA gene encoding aspartokinase homoserine dehydrogenase I from Escherichia coli is known (nucleotide numbers 337 to 2799 in sequence with accession number NC_000913.2 in the GenBank database, gi: 49175990). The thrA gene is located on the chromosome of E. coli K-12 strain between the thrL and thrB genes. The sequence of the thrB gene encoding homoserine kinase from Escherichia coli is known (nucleotide numbers 2801 to 3733 in sequence with accession number NC_000913.2 in the GenBank database, gi: 49175990). The thrB gene is located on the chromosome of E. coli K-12 strain between the thrA and thrC genes. The sequence of the thrC gene encoding a threonine synthase from Escherichia coli is known (nucleotide numbers 3734 to 5020 in sequence with accession number NC_000913.2 in the GenBank database, gi: 49175990). The thrC gene is located on the chromosome of the E. coli K-12 strain between the thrB gene and the open uaaX reading frame. All three of these genes function as one threonine operon.

Мутантный ген thrA, кодирующий аспартокиназу-гомосериндегидрогеназу I, устойчивую к ингибированию треонином по типу обратной связи, так же, как и гены thrB и thrC, могут быть получены в виде единого опреона из хорошо известной плазмиды pVIC40, которая представлена в штамме-продуценте Е.coli ВКПМ В-3996. Плазмида pVIC40 подробно описана в патенте США 5705371.The mutant thrA gene encoding aspartokinase homoserine dehydrogenase I, which is resistant to threonine inhibition by feedback type, as well as the thrB and thrC genes, can be obtained as a single opreon from the well-known plasmid pVIC40, which is represented in the producer strain E. coli VKPM B-3996. Plasmid pVIC40 is described in detail in US Pat. No. 5,705,371.

Ген rhtA находится на 18 минуте хромосомы Е.coli недалеко от оперона glnHPQ, кодирующего компоненты системы транспорта глутамина, при этом ген rhtA идентичен ORF1 (ген ybiF, нуклеотиды с 764 по 1651 в последовательности с номером ААА218541, gi:440181 в базе данных GenBank), расположенной между генами pexB и ompX. Элемент, экспрессирующий белок, кодируемый ORF1, был назван геном rhtA (rht: resistance to homoserine and threonine - устойчивость к гомосерину и треонину). Также было установлено, что мутацией rhtA23 является замена G на А в положении 1 по отношению к ATG старт-кодону (ABSTRACTS of 17^th International Congress of Biochemistry and Molecular Biology in conjugation with 1997 Annual Meeting of the American Society for Biochemistry and Molecular Biology, San Francisco, California August 24-29, 1997, abstract No. 457, EP 1013765 A).The rhtA gene is located at the 18th minute of the E. coli chromosome near the glnHPQ operon encoding the components of the glutamine transport system, while the rhtA gene is identical to ORF1 (ybiF gene, nucleotides 764 through 1651 in sequence number AAA218541, gi: 440181 in the GenBank database) located between the pexB and ompX genes. The protein expressing element encoded by ORF1 was called the rhtA gene (rht: resistance to homoserine and threonine - resistance to homoserin and threonine). It was also found that the rhtA23 mutation is the replacement of G by A at position 1 with respect to the ATG start codon (ABSTRACTS of 17 ^th International Congress of Biochemistry and Molecular Biology in conjugation with 1997 Annual Meeting of the American Society for Biochemistry and Molecular Biology, San Francisco, California August 24-29, 1997, abstract No. 457, EP 1013765 A).

Последовательность гена asd из E.coli известна (номера нуклеотидов с 3572511 по 3571408 в последовательности с номером NC_000913.1, gi: 16131307 в базе данных GenBank), и может быть получена методом ПЦР (полимеразной цепной реакции; ссылка на White, T.J. et al., Trends Genet., 5, 185 (1989)) с использованием праймеров, синтезированных на основе нуклеотидной последовательности указанного гена. Гены asd из других микроорганизмов могут быть получены подобным способом.The sequence of the asd gene from E. coli is known (nucleotide numbers 3572511 to 3571408 in sequence number NC_000913.1, gi: 16131307 in the GenBank database), and can be obtained by PCR (polymerase chain reaction; link to White, TJ et al ., Trends Genet., 5, 185 (1989)) using primers synthesized based on the nucleotide sequence of the gene. Asd genes from other microorganisms can be obtained in a similar way.

Также последовательность гена aspC из Е.coli известна (номера нуклеотидов с 983742 по 984932 в последовательности с с номером NC_000913,1, gi: 16128895 в базе данных GenBank) и может быть получена методом ПЦР. Гены aspC из других микроорганизмов могут быть получены подобным способом.Also, the sequence of the aspC gene from E. coli is known (nucleotide numbers 983742 to 984932 in sequence with the number NC_000913.1, gi: 16128895 in the GenBank database) and can be obtained by PCR. AspC genes from other microorganisms can be obtained in a similar way.

Бактерия - продуцент L-лизинаBacteria - Producer of L-Lysine

Примеры бактерий - продуцентов L-лизина, принадлежащих к роду Escherichia, включают мутантов, обладающих устойчивостью к аналогу L-лизина. Аналог L-лизина ингибирует рост бактерий, принадлежащих к роду Escherichia, но это ингибирование полностью или частично снимается, когда в среде также присутствует L-лизин. Примеры аналога L-лизина включают, но не ограничиваются оксализином, лизингидроксаматом, S-(2-аминоэтил)-L-цистеином (АЕС), γ-метиллизном, α-хлорокапролактамом и так далее. Мутанты, обладающие устойчивостью к указанным аналогам лизина, могут быть получены путем обработки бактерий, принадлежащих к роду Escherichia, традиционными мутагенами. Конкретные примеры бактериальных штаммов, используемых для получения L-лизина, включают штамм Escherichia coli AJ 11442 (PERM BP-1543, NRRL В-12185; смотри патент США 4346170) и штамм Escherichia coli VL611. В этих микроорганизмах аспартокиназа устойчива к ингибированию L-лизином по принципу обратной связи.Examples of bacteria producing L-lysine belonging to the genus Escherichia include mutants that are resistant to the L-lysine analogue. The L-lysine analogue inhibits the growth of bacteria belonging to the genus Escherichia, but this inhibition is completely or partially removed when L-lysine is also present in the medium. Examples of the L-lysine analogue include, but are not limited to, oxalysine, lysine hydroxyamate, S- (2-aminoethyl) -L-cysteine (AEC), γ-methyllysis, α-chlorocaprolactam, and so on. Mutants that are resistant to these lysine analogues can be obtained by treating bacteria belonging to the genus Escherichia with traditional mutagens. Specific examples of bacterial strains used to produce L-lysine include Escherichia coli strain AJ 11442 (PERM BP-1543, NRRL B-12185; see US Pat. No. 4,346,170) and Escherichia coli strain VL611. In these microorganisms, aspartokinase is resistant to feedback inhibition by L-lysine.

Штамм WC196 может быть использован в качестве бактерии - продуцента L-лизина Escherichia coli. Данный бактериальный штамм был получен путем селекции фенотипа устойчивости к АЕС у штамма W3110, производного от штамма Escherichia coli К-12. Полученный штамм был назван Escherichia coli AJ 13069 и был депонирован в Национальном Институте Биологических Наук и Человеческих Технологий, Агенство Промышленной Науки и Технологии, Министерство Международной Торговли и Промышленности (National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry) (в настоящее время называющийся Национальный Институт Прогрессивной Промышленной Науки и Технологии, Международный Депозитарий Организмов для Целей Патентования, Централ 6, 1-1, Хигаши 1-Чоме, Тсукуба-ши, Ибараки-кен, 305-8566, Япония (National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, International Patent Organism Depositary, Central 6, 1-1, Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305-8566, Japan) 6 декабря, 1994 г. и получил инвентарный номер PERM P-14690. Затем было произведено международное депонирование этого штамма согласно условиям Будапештского Договора 29 сентября 1995 г., и штамм получил инвентарный номер FERM ВР-5252 (смотри патент США 5827698).Strain WC196 can be used as a bacterium-producer of L-lysine Escherichia coli. This bacterial strain was obtained by selection of the phenotype of resistance to AEC in strain W3110, derived from the strain Escherichia coli K-12. The resulting strain was named Escherichia coli AJ 13069 and was deposited at the National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry) (currently called the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, International Depository of Organizations for Patenting Purposes, Central 6, 1-1, Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305-8566, Japan (National I nstitute of Advanced Industrial Science and Technology, International Patent Organism Depositary, Central 6, 1-1, Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305-8566, Japan) December 6, 1994 and received accession number PERM P-14690. Then, the strain was internationally deposited in accordance with the terms of the Budapest Treaty on September 29, 1995, and the strain was assigned accession number FERM BP-5252 (see US Patent 5827698).

Бактерия - продуцент L-аргининаBacteria - L-Arginine Producer

Примеры родительских штаммов, используемых для получения бактерии - продуцента L-аргинина согласно настоящему изобретению, включают в себя, но не ограничиваются штаммами, принадлежащими к роду Escherichia, такими как штамм Е.coli 237 (ВКПМ В-7925) и его штаммами-производными, содержащими мутантную N-ацетилглутаматсинтазу (патентная заявка РФ 2001112869), штамм-продуцент аргинина, в который введен ген argA, кодирующий N-ацетилглутаматсинтетазу (выложенная патентная заявка Японии №57-5693) и подобные им.Examples of parental strains used to produce L-arginine producing bacteria according to the present invention include, but are not limited to, strains belonging to the genus Escherichia, such as E. coli strain 237 (VKPM B-7925) and its derivative strains, containing mutant N-acetylglutamate synthase (RF patent application 2001112869), an arginine producing strain into which the argA gene encoding N-acetylglutamate synthetase (Japanese Patent Application Laid-Open No. 57-5693) and the like are introduced.

Бактерия - продуцент L-глутаминовой кислотыBacteria - Producer of L-Glutamic Acid

Примеры родительских штаммов, используемых для получения бактерии - продуцента L-глутаминовой кислоты согласно настоящему изобретению, включают в себя, но не ограничиваются штаммами, принадлежащими к роду Escherichia, такими как штамм Е.coli VL334 thrC⁺ (Европейский патент ЕР 1172433). Штамм Е.coli VL334 (ВКПМ В-1641) является ауксотрофом по L-изолейцину и L-треонину с мутациями в генах thrC и ilvA (патент США 4278765). В этот штамм была перенесена природная аллель гена thrC методом общей трансдукции с использованием бактериофага Р1, выращенного на клетках природного штамма Е.coli K12 (ВКПМ В-7). В результате был получен штамм, ауксотроф по L-изолейцину, VL334thrC⁺. Этот штамм обладает способностью к продукции L-глутаминовой кислоты.Examples of parental strains used to produce L-glutamic acid producing bacteria of the present invention include, but are not limited to, strains belonging to the genus Escherichia, such as E. coli strain VL334 thrC ⁺ (European patent EP 1172433). Strain E. coli VL334 (VKPM B-1641) is an auxotroph of L-isoleucine and L-threonine with mutations in the thrC and ilvA genes (US patent 4278765). The natural allele of the thrC gene was transferred to this strain by the general transduction method using bacteriophage P1 grown on cells of the natural E. coli K12 strain (VKPM B-7). The result was a strain, auxotroph for L-isoleucine, VL334thrC ⁺ . This strain has the ability to produce L-glutamic acid.

Примеры родительских штаммов, используемых для получения бактерии - продуцента L-глутаминовой кислоты согласно настоящему изобретению, включают в себя мутантные штаммы, лишенные активности α-кетоглутаратдегидрогеназы или обладающие сниженной активностью α-кетоглутаратдегидрогеназы. Бактерии, принадлежащие к роду Escherichia, лишенные активности α-кетоглутаратдегидрогеназы или обладающие сниженной активностью α-кетоглутаратдегидрогеназы, и способы их получения описаны в патентах США 5378616 и 5573945. Конкретно примеры таких штаммов включают в себя следующие штаммы:Examples of parental strains used to produce L-glutamic acid producing bacteria of the present invention include mutant strains lacking α-ketoglutarate dehydrogenase activity or having reduced α-ketoglutarate dehydrogenase activity. Bacteria belonging to the genus Escherichia, lacking the activity of α-ketoglutarate dehydrogenase or having reduced activity of α-ketoglutarate dehydrogenase, and methods for their preparation are described in US patents 5378616 and 5573945. Specifically, examples of such strains include the following strains:

E.coli W3110sucA::KmrE.coli W3110sucA :: Kmr

Е.coli AJ12624 (FERM ВР-3853)E. coli AJ12624 (FERM BP-3853)

Е.coli AJ12628 (FERM BP-3854)E. coli AJ12628 (FERM BP-3854)

Е.coli AJ2949 (FERMBP-4881)E. coli AJ2949 (FERMBP-4881)

Е.coli W3110sucA::Kmr - это штамм, полученный в результате разрушения гена α-кетоглутаратдегидрогеназы (далее называемого "sucA ген") в штамме Е.coli W3110. У этого штамма активность α-кетоглутаратдегидрогеназы отсутствует полностью.E. coli W3110sucA :: Kmr is a strain obtained by disrupting the α-ketoglutarate dehydrogenase gene (hereinafter referred to as the “sucA gene”) in the E. coli W3110 strain. In this strain, the activity of α-ketoglutarate dehydrogenase is completely absent.

Другие примеры бактерии - продуцента L-глутаминовой кислоты включают в себя бактерии, принадлежащие к роду Pantoea, которые лишены активности α-кетоглутаратдегидрогеназы или имеющют сниженную активность α-кетоглутаратдегидрогеназы, и могут быть получены описанным выше способом. Примерами таких штаммов являются штамм Pantoea ananatis A J 13356 (патент США 6331419), штамм Pantoea ananatis AJ13356, депонированный в Национальном Институте Биологических Наук и Человеческих Технологий, Агенство Промышленной Науки и Технологии, Министерство Международной Торговли и Промышленности (National Institute ofBioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry) (в настоящее время называющийся Национальный Институт Прогрессивной Промышленной Науки и Технологии, Международный Депозитарий Организмов для Целей Патентования, Централ 6,1-1, Хигаши 1-Чоме, Тсукуба-ши, Ибараки-кен, 305-8566, Япония - National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, International Patent Organism Depositary, Central 6, 1-1, Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305-8566, Japan) 19 февраля, 1998 и получивший инвентарный номер FERM P-16645. Затем было произведено международное депонирование этого штамма согласно условиям Будапештского Договора от 11 января 1999 г., и штамм получил инвентарный номер FERM BP-6615. Штамм Pantoea ananatis AJ13356 не имеет α-KGDH активности в результате разрушения гена αKGDH-E1 субъединицы (sucA). Вышеупомянутый штамм при выделении был идентифицирован как Enterobacter agglomerans и депонирован как штамм Enterobacter agglomerans AJ13355. Тем не менее, позднее он был классифицирован как Pantoea ananatis на основе нуклеотидной последовательности 16S рРНК и других доказательств (смотри раздел Примеры). Несмотря на то что оба штамма - AJ13355 и полученный из него штамм AJ13356 были депонированы в указанный выше депозитарий как Enterobacter agglomerans, для целей данного описания они будут упоминаться как Pantoea ananatis.Other examples of bacteria producing L-glutamic acid include bacteria belonging to the genus Pantoea, which lack the activity of α-ketoglutarate dehydrogenase or have reduced activity of α-ketoglutarate dehydrogenase, and can be obtained as described above. Examples of such strains are Pantoea ananatis AJ 13356 strain (US Pat. No. 6,331,419), Pantoea ananatis AJ13356 strain deposited at the National Institute of Biological Sciences and Human Technologies, Agency for Industrial Science and Technology, Department of International Trade and Industry, National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry) (currently called the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, International Organizational Depository for Patenting Purposes, Central 6.1-1, Higashi 1-Cho me, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305-8566, Japan - National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, International Patent Organism Depositary, Central 6, 1-1, Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305-8566, Japan) February 19, 1998 and received FERM P-16645. Then, the international deposit of this strain was made according to the conditions of the Budapest Treaty of January 11, 1999, and the strain received accession number FERM BP-6615. The Pantoea ananatis strain AJ13356 does not have α-KGDH activity as a result of the destruction of the αKGDH-E1 gene subunit (sucA). The above strain, when isolated, was identified as Enterobacter agglomerans and deposited as Enterobacter agglomerans AJ13355 strain. However, it was later classified as Pantoea ananatis based on the 16S rRNA nucleotide sequence and other evidence (see Examples section). Although both strains — AJ13355 and the strain AJ13356 obtained from it — were deposited as Enterobacter agglomerans in the above depository, for the purposes of this description they will be referred to as Pantoea ananatis.

Бактерия - продуцент L-триптофанаBacteria producing L-tryptophan

Примеры родительских штаммов, используемых для получения бактерии - продуцента L-триптофана согласно настоящему изобретению, включают в себя, но не ограничиваются штаммами - продуцентами L-триптофана, принадлежащими к роду Escherichia, такими как штаммы Е.coli JP4735/pMU3028 (DSM10122) и JP6015/pMU91 (DSM10123), дефицитные по триптофанил-тРНК синтетазе, кодируемой мутантным геном trpS (патент США 5756345); штамм Е.coli SV164 (pGH5), содержащий аллель serA, не ингибирующийся серином по принципу обратной связи (патент США 6180373); штаммы Е.coli AGX17 (pGX44) (NRRL В-12263) и AGX6(pGX50)aroP (NRRL B-12264), дефицитные по ферменту триптофаназе (патент США 4371614); штамм Е.coli AGX17/pGX50, pACKG4-pps, в котором способность к продукции фосфоенолпирувата усилена (WO 9708333, патент США 6319696) и подобные им.Examples of parent strains used to produce L-tryptophan producing bacteria of the present invention include, but are not limited to, L-tryptophan producing strains belonging to the genus Escherichia, such as E. coli strains JP4735 / pMU3028 (DSM10122) and JP6015 / pMU91 (DSM10123), tryptophanyl-tRNA-deficient synthetase deficient encoded by the trpS mutant gene (US Pat. No. 5,753,345); E. coli strain SV164 (pGH5) containing a serA allele not inhibited by serine by the feedback principle (US Pat. No. 6,180,373); E. coli strains AGX17 (pGX44) (NRRL B-12263) and AGX6 (pGX50) aroP (NRRL B-12264) deficient in the tryptophanase enzyme (US patent 4371614); E. coli strain AGX17 / pGX50, pACKG4-pps, in which the ability to produce phosphoenolpyruvate is enhanced (WO 9708333, US patent 6319696) and the like.

Ранее было показано, что ген yddG, кодирующий мембранный белок, не вовлеченный ни в один путь биосинтеза L-аминокислот, сообщает микроорганизму устойчивость к L-фенилаланину и нескольким аналогам аминокислот при амплификации природного аллеля данного гена на многокопийном векторе в указанном микроорганизме. Кроме того, ген yddG может положительно влиять на продукцию L-фенилаланина или L-триптофана, когда дополнительные копии этого гена введены в клетки соответствующего штамма-продуцента (WO 03044192). Таким образом, желательно, чтобы бактерия - продуцент L-триптофана была далее модифицирована таким образом, что экспрессия открытой рамки считывания yddG в указанной бактерии была усилена.It was previously shown that the yddG gene, which encodes a membrane protein that is not involved in any L-amino acid biosynthesis pathway, gives the microorganism resistance to L-phenylalanine and several amino acid analogs when the natural allele of this gene is amplified on a multi-copy vector in the specified microorganism. In addition, the yddG gene can positively affect the production of L-phenylalanine or L-tryptophan when additional copies of this gene are introduced into the cells of the corresponding producer strain (WO 03044192). Thus, it is desirable that the bacterium producing L-tryptophan be further modified so that the expression of the open reading frame of yddG in the bacterium is enhanced.

Бактерия - продуцент L-фенилаланинаBacteria - Producer of L-Phenylalanine

Примеры родительских штаммов, используемых для получения бактерии - продуцента L-фенилаланина согласно настоящему изобретению, включают в себя, но не ограничиваются штаммами, принадлежащими к роду Escherichia, такими как штамм AJ12739 (tyrA::Tn10, tyrR) (ВКМП В-8197); штамм HW1089 (АТСС-55371), содержащий ген pheА34 (патент США 5354672); мутантный штамм MWEC101-b (KR8903681); штаммы NRRL B-12141, NRRL В-12145, NRRL В-12146 и NRRL В-12147 (патент США 4407952) и пободные им. Также в качестве родительских штаммов могут быть использованы бактерии, принадлежащие к роду Escherichia, - продуценты L-фенилаланина, такие как штамм E.coli K-12[W3110(tyrA)/pPHAB] (FERM ВР-3566), штамм E.coli К-12[W3110(tyrA)/pPHAD] (FERM ВР-12659), штамм E.coli К-12[W3110(tyrA)/pPHATerm] (FERM ВР-12662) и штамм E.coli К-12[W3110(tyrA)/pBR-aroG4, рАСМАВ], названный как AJ12604 (FERM BP-3579) (Европейский патент ЕР 488424В1). Кроме того, также могут быть использованы бактерии - продуценты L-фенилаланина, принадлежащие к роду Escherichia с повышенной активностью белков, кодируемых геном yedA или геном yddG (патентные заявки США 2003/0148473 А1 и 2003/0157667 А1).Examples of parental strains used to produce L-phenylalanine-producing bacteria of the present invention include, but are not limited to, strains belonging to the genus Escherichia, such as strain AJ12739 (tyrA :: Tn10, tyrR) (VKMP B-8197); strain HW1089 (ATCC-55371) containing the pheA34 gene (US patent 5354672); mutant strain MWEC101-b (KR8903681); strains NRRL B-12141, NRRL B-12145, NRRL B-12146 and NRRL B-12147 (US Pat. No. 4,407,952) and the like. Also, bacteria belonging to the genus Escherichia, producers of L-phenylalanine, such as E. coli K-12 strain [W3110 (tyrA) / pPHAB] (FERM BP-3566), E. coli K strain, can be used as parent strains. -12 [W3110 (tyrA) / pPHAD] (FERM BP-12659), E. coli strain K-12 [W3110 (tyrA) / pPHATerm] (FERM BP-12662) and E. coli strain K-12 [W3110 (tyrA ) / pBR-aroG4, pACMAB], named as AJ12604 (FERM BP-3579) (European patent EP 488424B1). In addition, bacteria producing L-phenylalanine belonging to the genus Escherichia with increased activity of the proteins encoded by the yedA gene or yddG gene can also be used (US patent applications 2003/0148473 A1 and 2003/0157667 A1).

Бактерия - продуцент L-цистеинаBacteria - L-cysteine producer

Примеры родительских штаммов, используемых для получения бактерии - продуцента L-цистеина согласно настоящему изобретению, включают в себя, но не ограничиваются штаммами, принадлежащими к роду Escherichia, такими как штамм Е.coli JM15, трансформированный различными аллелями гена cysE, кодирующих устойчивые к ингибированию по типу обратной связи серинацетилтрансферазы (патент США 6218168, патентная заявка РФ 2003121601); штамм Е.coli W3110, содержащий сверхэкспрессированные гены, кодирующие белок, способный к секреции соединений, токсичных для клетки (патент США 5972663); штаммы Е.coli, содержащие цистеиндесульфогидразу со сниженной активностью (патент Японии JP 11155571 А2); штамм Е.coli W3110 с повышенной активностью позитивного транскрипционного регулятора цистеинового регулона, кодируемого геном cysB (заявка РСТ WO 0127307 A1), и подобные им.Examples of parental strains used to produce L-cysteine-producing bacteria according to the present invention include, but are not limited to, strains belonging to the genus Escherichia, such as E. coli strain JM15 transformed with various alleles of the cysE gene coding for resistance to inhibition by feedback type serine acetyltransferase (US patent 6218168, patent application of the Russian Federation 2003121601); E. coli strain W3110 containing overexpressed genes encoding a protein capable of secretion of compounds toxic to the cell (US patent 5972663); E. coli strains containing cysteine desulfohydrase with reduced activity (Japanese patent JP 11155571 A2); E. coli strain W3110 with increased activity of the positive transcriptional regulator of the cysteine regulon encoded by the cysB gene (PCT application WO 0127307 A1), and the like.

Бактерия - продуцент L-лейцинаBacteria - Producer of L-Leucine

Примеры родительских штаммов, используемых для получения бактерии - продуцента L-лейцина согласно настоящему изобретению, включают в себя, но не ограничиваются штаммами, принадлежащими к роду Escherichia, такими как штаммы Е.coli, устойчивые к аналогам лейцина, включающих, например, β-2-тиенилаланин, 3-гидроксилейцин, 4-азалейцин и 5,5,5-трифлуоролейцин (выложенные патентные заявки Японии 62-34397 и 8-70879), штаммы Е.coli, полученные с помощью генно-инженерных методов, описанных в заявке РСТ 96/06926; Е.coli штамм Н-9068 (JP8-70879A2), и подобные им.Examples of parent strains used to produce the L-leucine producing bacterium of the present invention include, but are not limited to, strains belonging to the genus Escherichia, such as E. coli strains that are resistant to leucine analogues, including, for example, β-2 -thienylalanine, 3-hydroxyleucine, 4-azaleucine and 5,5,5-trifluoroleucine (Japanese Patent Laid-open 62-34397 and 8-70879), E. coli strains obtained using the genetic engineering methods described in PCT 96 / 06926; E. coli strain H-9068 (JP8-70879A2), and the like.

Бактерия согласно настоящему изобретению может быть улучшена путем усиления экспрессии одного или нескольких генов, вовлеченных в биосинтез L-лейцина. Примеры таких генов включают в себя гены оперона leuABCD и предпочтительно представлены мутантным геном leuA, кодирующим изопропилмалатсинтазу со снятым ингибированием L-лейцином по типу обратной связи (патент США 6403342). Кроме того, бактерия согласно настоящему изобретению может быть улучшена путем усиления экспрессии одного или нескольких генов, кодирующих белки, которые экспортируют L-аминокислоту из бактериальной клетки. Примеры таких генов включают в себя гены b2682 и b2683 (refiviygaZH) (патентная заявка РФ 2001117632, Европейская патентная заявка ЕР 1239041 А2).The bacterium of the present invention can be improved by enhancing the expression of one or more genes involved in the biosynthesis of L-leucine. Examples of such genes include the leuABCD operon genes and are preferably represented by the mutant leuA gene encoding feedback feedback depleted L-leucine isopropyl malate synthase (US Pat. No. 6,333,342). In addition, the bacterium of the present invention can be improved by enhancing the expression of one or more genes encoding proteins that export the L-amino acid from a bacterial cell. Examples of such genes include the b2682 and b2683 genes (refiviygaZH) (RF patent application 2001117632, European patent application EP 1239041 A2).

Бактерия - продуцент L-пролинаBacteria - producer of L-proline

Примеры бактерий-продуцентов L-пролина, используемых в качестве родительского штамма согласно настоящему изобретению, включают в себя, но не ограничиваются штаммами, принадлежащими к роду Escherichia, такими как штамм Е.coli 702ilvA (ВКПМ В-8012), дефицитного по гену ilvA и способного к продукции L-пролина (Европейский патент ЕР 1172433). Бактерия согласно настоящему изобретению может быть улучшена путем усиления экспрессии одного или нескольких генов, вовлеченных в биосинтез L-пролина. Предпочтительно примеры таких генов для бактерий - продуцентов L-пролина включают ген proB, кодирующий глутаматкиназу с десенсибилизированной регуляцией L-пролином по типу обратной связи (патент Германии 3127361). Кроме того, бактерия согласно настоящему изобретению может быть улучшена путем усиления экспрессии одного или нескольких генов, кодирующих белки, экскретирующие L-аминокислоту из бактериальной клетки. Примерами таких генов являются гены b2682 и b2683 (гены ygaZH) (патентная заявка РФ 2001117632, Европейская патентная заявка ЕР 1239041 А2).Examples of L-proline producing bacteria used as the parent strain of the present invention include, but are not limited to, strains belonging to the genus Escherichia, such as E. coli strain 702ilvA (VKPM B-8012) deficient in the ilvA gene and capable of producing L-proline (European patent EP 1172433). The bacterium of the present invention can be improved by enhancing the expression of one or more genes involved in the biosynthesis of L-proline. Preferably, examples of such genes for bacteria producing L-proline include the proB gene encoding glutamate kinase with desensitized feedback regulation of L-proline (German patent 3127361). In addition, the bacterium of the present invention can be improved by enhancing the expression of one or more genes encoding proteins that secrete the L-amino acid from a bacterial cell. Examples of such genes are the b2682 and b2683 genes (ygaZH genes) (RF patent application 2001117632, European patent application EP 1239041 A2).

Примеры бактерий, принадлежащих к роду Escherichia и обладающих способностью к продукции L-пролина, включают следующие штаммы Е.coli: NRRL В-12403 и NRRL В-12404 (патент Великобритании GB 2075056), ВКПМ В-8012 (патентная заявка РФ 2000124295), плазмидные мутанты описаны в патенте Германии DE 3127361, плазмидные мутанты описаны у Bloom F.R. et al (The 15^thMiami winter symposium, 1983, p.34) и подобные им.Examples of bacteria belonging to the genus Escherichia and having the ability to produce L-proline include the following E. coli strains: NRRL B-12403 and NRRL B-12404 (UK patent GB 2075056), VKPM B-8012 (RF patent application 2000124295), plasmid mutants are described in German patent DE 3127361, plasmid mutants are described in Bloom FR et al (The 15 ^th Miami winter symposium, 1983, p. 34) and the like.

Вышеупомянутые штаммы - продуценты L-аминокислоты могут в дальнейшем быть модифицированными таким образом, что скорость ассимиляции пентоз повышена или усилена способность к биосинтезу L-аминокислоты с использованием широкого спектра методов, хорошо известных специалисту в данной области.The above-mentioned strains producing L-amino acids can be further modified in such a way that the rate of assimilation of pentoses is increased or enhanced the ability to biosynthesis of L-amino acids using a wide range of methods well known to the person skilled in the art.

Скорость утилизации пентозных сахаров может быть в дальнейшем повышена за счет амплификации генов ассимиляции пентоз, гены araFG и araBAD для ассимиляции арабинозы, или путем введения мутаций в систему ассимиляции глюкозы (PTS или non-PTS), таких как мутация ptsG (Nichols N.N. et al., Appl. Microbiol. BiotechnoL, 2001, Jul. 56: 1-2, 120-5).The rate of utilization of pentose sugars can be further increased by amplification of the pentose assimilation genes, araFG and araBAD genes to assimilate arabinose, or by introducing mutations into the glucose assimilation system (PTS or non-PTS), such as the ptsG mutation (Nichols NN et al. , Appl. Microbiol. BiotechnoL, 2001, Jul. 56: 1-2, 120-5).

К способу согласно настоящему изобретению относится способ продукции L-аминокислоты, включающий стадии выращивания бактерии - продуцента L-аминокислоты в питательной среде с целью продукции с целью накопления указанной L-аминокислоты в питательной среде, и сбора L-аминокислоты из культуральной жидкости.The method according to the present invention relates to a method for producing an L-amino acid, comprising the steps of growing a bacterium-producer of an L-amino acid in a nutrient medium for the purpose of production for the purpose of accumulating said L-amino acid in a nutrient medium and collecting the L-amino acid from the culture fluid.

Процесс согласно настоящему изобретению включает в себя процесс получения L-аминокислоты, включающего в свою очередь в себя стадии культивирования бактерии - продуцента L-аминокислоты в ферментационной среде, что позволяет накапливать указанную L-аминокислоту в культуральной жидкости, и выделения L-аминокислоты из культуральной жидкости, при этом ферментационная среда содержит смесь глюкозы и пентоз. Также способ согласно настоящему изобретению включает в себя процесс получения L-гистидина, включающего в свою очередь в себя стадии культивирования бактерии - продуцента L-гистидина в ферментационной среде, что позволяет накапливать L-гистидин в культуральной жидкости, и выделения L-гистидина из культуральной жидкости, при этом ферментационная среда содержит смесь глюкозы и пентоз. Также способ согласно настоящему изобретению включает в себя процесс получения L-треонина, включающего в свою очередь в себя стадии культивирования бактерии - продуцента L-треонина в ферментационной среде, что позволяет накапливать L-треонин в культуральной жидкости, и выделения L-треонина из культуральной жидкости, при этом ферментационная среда содержит смесь глюкозы и пентоз. Также способ согласно настоящему изобретению включает в себя процесс получения L-лизина, включающего в свою очередь в себя стадии культивирования бактерии - продуцента L-лизина в ферментационной среде, что позволяет накапливать L-лизин в культуральной жидкости, и выделения L-лизина из культуральной жидкости, при этом ферментационная среда содержит смесь глюкозы и пентоз. Также способ согласно настоящему изобретению включает в себя процесс получения L-аргинина, включающего в свою очередь в себя стадии культивирования бактерии - продуцента L-аргинина в ферментационной среде, что позволяет накапливать L-аргинин в культуральной жидкости, и выделения L-аргинина из культуральной жидкости, при этом ферментационная среда содержит смесь глюкозы и пентоз. Также способ согласно настоящему изобретению включает в себя процесс получения L-глутаминовой кислоты, включающего в свою очередь в себя стадии культивирования бактерии - продуцента L-глутаминовой кислоты в ферментационной среде, что позволяет накапливать L-глутаминовую кислоты в культуральной жидкости, и выделения L-глутаминовой кислоты из культуральной жидкости, при этом ферментационная среда содержит смесь глюкозы и пентоз. Также способ согласно настоящему изобретению включает в себя процесс получения L-триптофана, включающего в свою очередь в себя стадии культивирования бактерии - продуцента L-триптофана в ферментационной среде, что позволяет накапливать L-триптофан в культуральной жидкости, и выделения L-триптофана из культуральной жидкости, при этом ферментационная среда содержит смесь глюкозы и пентоз.The process according to the present invention includes a process for producing an L-amino acid, which in turn includes the steps of culturing a bacterium-producer of an L-amino acid in a fermentation medium, which allows the accumulation of said L-amino acid in the culture fluid, and the isolation of the L-amino acid from the culture fluid while the fermentation medium contains a mixture of glucose and pentoses. Also, the method according to the present invention includes a process for producing L-histidine, which in turn includes the steps of culturing the bacterium producing L-histidine in a fermentation medium, which allows the accumulation of L-histidine in the culture fluid, and the isolation of L-histidine from the culture fluid while the fermentation medium contains a mixture of glucose and pentoses. Also, the method according to the present invention includes a process for producing L-threonine, which in turn includes the steps of culturing the bacterium producing L-threonine in a fermentation medium, which allows the accumulation of L-threonine in the culture fluid, and the isolation of L-threonine from the culture fluid while the fermentation medium contains a mixture of glucose and pentoses. Also, the method according to the present invention includes a process for producing L-lysine, which in turn includes the stages of culturing the bacterium-producer of L-lysine in a fermentation medium, which allows the accumulation of L-lysine in the culture fluid, and the allocation of L-lysine from the culture fluid while the fermentation medium contains a mixture of glucose and pentoses. Also, the method according to the present invention includes a process for producing L-arginine, which in turn includes the steps of culturing the bacterium producing L-arginine in a fermentation medium, which allows the accumulation of L-arginine in the culture fluid, and the isolation of L-arginine from the culture fluid while the fermentation medium contains a mixture of glucose and pentoses. Also, the method according to the present invention includes a process for producing L-glutamic acid, which in turn includes the steps of culturing a bacterium producing L-glutamic acid in a fermentation medium, which allows the accumulation of L-glutamic acid in the culture fluid, and the isolation of L-glutamic acid acid from the culture fluid, while the fermentation medium contains a mixture of glucose and pentoses. Also, the method according to the present invention includes a process for producing L-tryptophan, which in turn includes the steps of culturing the bacterium producing L-tryptophan in a fermentation medium, which allows the accumulation of L-tryptophan in the culture fluid, and the isolation of L-tryptophan from the culture fluid while the fermentation medium contains a mixture of glucose and pentoses.

Смесь пентоз, таких как ксилоза и арабиноза, и гексоз, таких как глюкоза, может быть получена из недопереработанных источников биомассы. Глюкоза, ксилоза, арабиноза и другие углеводы могут быть выделены из растительной биомассы благодаря обработке паром и/или гидролизу концентрированной кислотой, гидролизу разведенной кислотой, ферментативному гидролизу, с использованием таких ферментов, как целлюлаза, или щелочной обработке. Когда субстратом для ферментации является целлюлозный материал, целлюлоза может быть гидролизована до сахаров в процессе ферментации или отдельно, после чего может быть утилизована в L-аминокислоту. Поскольку гемицеллюлоза легче, чем целлюлоза гидролизуется до сахаров, то предпочтительна предварительная гидролизация целлюлозного субстрата, отделение пентоз и последующий гидролиз целлюлозы паром, кислотой, щелочью, ферментами или сочетанием этих разрушителей для получения глюкозы.A mixture of pentoses, such as xylose and arabinose, and hexoses, such as glucose, can be obtained from untreated biomass sources. Glucose, xylose, arabinose and other carbohydrates can be isolated from plant biomass by steam treatment and / or concentrated acid hydrolysis, dilute acid hydrolysis, enzymatic hydrolysis using enzymes such as cellulase, or alkaline treatment. When the substrate for the fermentation is cellulosic material, the cellulose can be hydrolyzed to sugars during the fermentation process or separately, after which it can be recycled to the L-amino acid. Since hemicellulose is easier than cellulose to hydrolyze to sugars, pre-hydrolysis of the cellulose substrate, separation of pentoses and subsequent hydrolysis of the cellulose with steam, acid, alkali, enzymes, or a combination of these breakers are preferred to produce glucose.

В настоящем изобретении использовали смесь, содержащую в различных пропорциях глюкозу/ксилозу/арабинозу для того, чтобы оценить состав глюкозо-пентозной смеси для ферментации, которую потенциально можно получить из растительных гидролизатов (смотри раздел Примеры).In the present invention, a mixture containing glucose / xylose / arabinose in various proportions was used in order to evaluate the composition of the glucose-pentose fermentation mixture that could potentially be obtained from plant hydrolysates (see the Examples section).

В настоящем изобретении выращивание, сбор и очистка L-аминокислоты из культуральной или подобной ей жидкости может быть осуществлена способом, подобным традиционным способам ферментации, в которых аминокислота продуцируется с использованием микроорганизма. Питательная среда, используемая для выращивания, может быть как синтетической, так и натуральной при условии, что указанная среда содержит источники углерода, азота, минеральные добавки и, если необходимо, соответствующее количество питательных добавок, которые требуются микроорганизму для роста.In the present invention, the cultivation, collection and purification of an L-amino acid from a culture or similar liquid may be carried out in a manner similar to traditional fermentation methods in which the amino acid is produced using a microorganism. The nutrient medium used for growing can be either synthetic or natural, provided that the medium contains sources of carbon, nitrogen, mineral additives and, if necessary, the appropriate amount of nutrient additives that the microorganism needs for growth.

К источникам углерода относятся различные углеводы, такие как глюкоза, сахароза, арабиноза, ксилоза и другие пентозы и гексозы, которые бактерия - продуцент L-аминокислоты может использовать как источник углерода. Глюкоза, ксилоза, арабиноза и другие углеводы могут являться компонентом смеси сахаров, полученных в результате гидролиза целлюлозной биомассы.Carbon sources include various carbohydrates such as glucose, sucrose, arabinose, xylose, and other pentoses and hexoses, which the L-amino acid producing bacterium can use as a carbon source. Glucose, xylose, arabinose and other carbohydrates can be a component of a mixture of sugars obtained by hydrolysis of cellulosic biomass.

Пентозы, котрые можно использовать как компонент ферментационной среды согласно настоящему изобретению, включают ксилозу и арабинозу, но не ограничиваются ими.Pentoses that can be used as a component of the fermentation medium of the present invention include, but are not limited to xylose and arabinose.

В качестве источника азота могут использоваться различные соли аммония, такие как аммиак и сульфат аммония, другие соединения азота, такие как амины, природные источники азота, такие как пептон, гидролизат соевых бобов и ферментолизат микроорганизмов. В качестве минеральных добавок используются монофосфат калия, сульфат магния, хлорид натрия, сульфат железа, сульфат марганца, хлорид кальция и подобные соединения. Некоторые питательные добавки могут быть при необходимости добавлены в питательную среду. Например, если микроорганизму для роста необходим пролин (ауксотрофия по пролину), соответствующее количество тирозина может быть добавлено в питательную среду для выращивания.As a source of nitrogen, various ammonium salts such as ammonia and ammonium sulfate, other nitrogen compounds such as amines, natural nitrogen sources such as peptone, soybean hydrolyzate and microorganism fermentolizate can be used. As mineral additives, potassium monophosphate, magnesium sulfate, sodium chloride, iron sulfate, manganese sulfate, calcium chloride and the like are used. Some nutritional supplements may be added to the culture medium if necessary. For example, if a microorganism needs proline for growth (proline auxotrophy), an appropriate amount of tyrosine can be added to the growth medium.

Выращивание осуществляется предпочтительно в аэробных условиях, таких как перемешивание, ферментация с аэрацией, при температуре от 20 до 40°С, предпочтительно от 30 до 38°C. рН питательной среды находится в пределах от 5 до 9, предпочтительно от 6.5 до 7.2. рН среды может регулироваться аммиаком, карбонатом кальция, различными кислотами, основаниями и буферами. Обычно выращивание в течение от 1 до 5 дней приводит к накоплению целевой L-аминокислоты в культуральной жидкости.The cultivation is preferably carried out under aerobic conditions, such as stirring, fermentation with aeration, at a temperature of from 20 to 40 ° C, preferably from 30 to 38 ° C. The pH of the nutrient medium is in the range from 5 to 9, preferably from 6.5 to 7.2. The pH of the medium can be adjusted by ammonia, calcium carbonate, various acids, bases and buffers. Typically, growing for 1 to 5 days leads to the accumulation of the target L-amino acid in the culture fluid.

После выращивания твердые остатки, такие как клетки, могут быть удалены из культуральной жидкости методом центрифугирования или фильтрацией через мембрану, а затем целевая L-аминокислота может быть собрана и очищена методами ионообменной хроматографии, концентрирования и кристаллизации.After growth, solid residues, such as cells, can be removed from the culture fluid by centrifugation or filtration through a membrane, and then the target L-amino acid can be collected and purified by ion exchange chromatography, concentration and crystallization.

ПримерыExamples

Более детально настоящее изобретение будет разъяснено ниже со ссылкой на следующие примеры, не ограничивающие область применения настоящего изобретения.In more detail, the present invention will be explained below with reference to the following examples, not limiting the scope of the present invention.

Пример 1. Клонирование локуса xylABFGHR из хромосомы штамма Е.coli MG1655.Example 1. Cloning of the xylABFGHR locus from the chromosome of E. coli strain MG1655.

На основании анализа генома штамма Е.coli MG1655 гены xylABFGHR могли быть клонированы единым HindIII фрагментом (13.1 т.п.о.) из общего количества 556 HindIII хромосомных фрагментов (чертеж). Для этой цели была создана библиотека генов, клонированных в вектор pUC 19, этот вектор сохраняет стабильность в Е.coli с полученными размерами вставок.Based on the analysis of the genome of E. coli strain MG1655, the xylABFGHR genes could be cloned with a single HindIII fragment (13.1 kbp) from a total of 556 HindIII chromosomal fragments (drawing). For this purpose, a library of genes cloned into pUC 19 vector was created; this vector remains stable in E. coli with the obtained insert sizes.

Для конструирования такой лаборатории генов хромосомная ДНК штамма MG1655 была обработана рестриктазой HindIII, а вектор pUC19 был обработан рестриктазой XbaI. Для предотвращения лигирования среди фрагментов ДНК одного типа липкие концы всех полученных фрагментов ДНК были достроены с помощью фрагмента Кленова (достройка двух нуклеотидов). После лигирования был получен набор рекомбинантных pUC19 плазмид. Размер библиотеки составлял более чем 200 тысяч клонов. Библиотека была проанализирована при помощи ПЦР с использованием праймеров, комплементарных нуклеотидной последовательности вектора, и праймеров, комплементарных клонированному фрагменту хромомсомы. После ПЦР-анализа среди проверенных фрагментов ДНК не было обнаружено продуктов ПЦР искомого молекулярного веса, и это означало, что фрагмент, соответствующий оперону xylABFGHR, отсутствовал в полученной библиотеке. Такой результат мог быть получен из-за негативного влияния гена malS, а также из-за открытых рамок считывания yiaA и yiaB ORFs (с неизвестными функциями), которые также располагались в целевом HindIII фрагменте. Другой возможной причиной негативного отбора данного фрагмента мог служить большой размер Xyl-локуса. Для того чтобы снять эту проблему, были сконструированы новые библиотеки генов на модифицированной плазмиде pUC19. Основная идея состояла в том, чтобы клонировать Xyl-локус как набор фрагментов без лишнего гена malS и рамок считывания yiaA и yiaB.To construct such a laboratory of genes, the chromosomal DNA of strain MG1655 was treated with HindIII restriction enzyme, and the pUC19 vector was treated with XbaI restriction enzyme. To prevent ligation among DNA fragments of the same type, the sticky ends of all the obtained DNA fragments were completed using a Klenov fragment (completion of two nucleotides). After ligation, a set of recombinant pUC19 plasmids was obtained. The size of the library was more than 200 thousand clones. The library was analyzed by PCR using primers complementary to the nucleotide sequence of the vector, and primers complementary to the cloned chromosome fragment. After PCR analysis, the PCR products of the desired molecular weight were not found among the tested DNA fragments, and this meant that the fragment corresponding to the xylABFGHR operon was absent in the resulting library. This result could be obtained due to the negative influence of the malS gene, as well as due to the open reading frames of yiaA and yiaB ORFs (with unknown functions), which were also located in the target HindIII fragment. Another possible reason for the negative selection of this fragment could be the large size of the Xyl locus. In order to solve this problem, new gene libraries were constructed on the modified plasmid pUC19. The main idea was to clone the Xyl locus as a set of fragments without the extra malS gene and the reading frames yiaA and yiaB.

Для этой цели был модифицирован полилинкер вектора pUC19, а именно в полилинкер вставили синтетический фрагмент ДНК, содержащий сайт рестрикции MluI. На основе модифицированного вектора pUC19 было создано две библиотеки генов. Первую библиотеку сконструировали, расщепив хромосомную ДНК штамма MG1655 и модифицированный вектор pUC19 рестриктазами HindIII и MluI с последующим лигированием. Объем библиотеки составил более чем 4000 клонов. Библиотеку генов проанализировали при помощи ПЦР с использованием праймеров, комплементарных нуклеотидной последовательности плазмиды, и праймеров 1 (SEQ ID NO: 13) и 2 (SEQ ID NO: 14), которые комплементарны нуклеотидной последовательности фрагмента xylABFG локуса xyl. Среди полученных ПЦР-продуктов были обнаружены фрагменты ДНК с нужным молекулярным весом. Следующей задачей было обогащение библиотеки генов нужным фрагментом. Для ее решения ДНК из исходной библиотеки генов была обработана энодонуклеазами, сайты рестрикции не встречаются в целевом фрагменте. Это следующие рестриктазы - Есо1471, KpnI, MlsI, Bst11071. Частота встречаемости нужной плазмиды в обогащенной библиотеки равнялась 1/800 клонов. Обогащенная библиотека была проанализирована с помощью ПЦР, как описано выше. После пяти последовательных обогащений библиотеки генов в клеточной популяции было отобрано только десять клонов, содержащих гены xylABFG. Полученная плазмида, содержащая фрагмент ДНК HindIII - MluI с генами xylABFG, была названа pUC19/xylA-G. Затем фрагмент HindIII-MphI 103I, содержащий открытые рамки считывания yiaA viyiaB, был удален из плазмиды pUC19/xylA-G; липкие концы затупили с помощью фрагмента Кленова и вставили лигированием синтетический линкер, содержащий сайт рестрикции EcoRI. Таким образом была получена плазмида pUC19/xylA-G-2. Далее, полученная плазмида pUC19/xylA-G-2 была обработана рестриктазой EheI; липкие концы затупили с помощью фрагмента Кленова и вставили лигированием синтетический линкер, содержащий сайт рестрикции HindIII. Так была получена плазмида pUC19/xylA-G-3. Сайт рестрикции HindIII был введен в имеющийся фрагмент ДНК, содержащий гены xylHR, восстановив таким образом локус xyl.For this purpose, the polylinker of the vector pUC19 was modified, namely, a synthetic DNA fragment containing the MluI restriction site was inserted into the polylinker. Based on the modified vector pUC19, two gene libraries were created. The first library was constructed by cleaving the chromosomal DNA of strain MG1655 and the modified vector pUC19 with restriction enzymes HindIII and MluI, followed by ligation. The volume of the library was more than 4000 clones. The gene library was analyzed by PCR using primers complementary to the nucleotide sequence of the plasmid and primers 1 (SEQ ID NO: 13) and 2 (SEQ ID NO: 14), which are complementary to the nucleotide sequence of the xylABFG fragment of the xyl locus. Among the obtained PCR products, DNA fragments with the desired molecular weight were detected. The next task was to enrich the gene library with the desired fragment. To solve it, DNA from the source gene library was processed with enodonucleases, restriction sites are not found in the target fragment. These are the following restrictase enzymes - Eco1471, KpnI, MlsI, Bst11071. The frequency of occurrence of the desired plasmid in the enriched library was 1/800 clones. The enriched library was analyzed by PCR, as described above. After five sequential enrichments of the gene library in the cell population, only ten clones containing xylABFG genes were selected. The resulting plasmid containing the HindIII - MluI DNA fragment with xylABFG genes was named pUC19 / xylA-G. The HindIII-MphI 103I fragment containing the open reading frames of yiaA viyiaB was then removed from the plasmid pUC19 / xylA-G; the sticky ends were blunted using a Klenov fragment and a synthetic linker containing an EcoRI restriction site was inserted by ligation. Thus, the plasmid pUC19 / xylA-G-2 was obtained. Further, the resulting plasmid pUC19 / xylA-G-2 was digested with restriction enzyme EheI; the sticky ends were blunted using a Klenov fragment and a synthetic linker containing the HindIII restriction site was inserted by ligation. Thus, the plasmid pUC19 / xylA-G-3 was obtained. The HindIII restriction site was introduced into an existing DNA fragment containing xylHR genes, thereby restoring the xyl locus.

Вторую библиотеку сконструировали, расщепив хромосомную ДНК штамма MG1655 и модифицированный вектор pUC19 рестриктазами PstI и MluI с последующим лигированием. Объем библиотеки составил более чем 6000 клонов. Библиотеку генов проанализировали при помощи ПЦР с использованием праймеров, комплементарных нуклеотидной последовательности плазмиды, и праймеров 3 (SEQ ID NO: 15) и 4 (SEQ ID NO: 16), которые комплементарны нуклеотидной последовательности клонируемого хромосомного фрагмента. Среди полученных ПЦР-продуктов были обнаружены фрагменты ДНК с нужным молекулярным весом. Следующим шагом было последовательное разделение клеточной популяции с библиотекой генов с помощью ПЦР-анализа. В результате семи последовательных разделений клеточной популяции с клонированным фрагментом, содержащим гены xylHR, были отобраны только 10 клонов. Среди этой популяции целевой фрагмент ДНК был найден с помощью рестрикционного анализа. Полученная плазмида, содержащая фрагмент ДНК PstI-MluI с генами xylHR, была названа pUC19/xylHR. Затем фрагмент ДНК HindIII-MluI из плазмиды pUC19/xylHR был введен лигированием в плазмиду pUC19/xylA-G-3, предварительно обработааную рестриктазами HindIII и MluI. В итоге был получен полный xyl локус штамма MG1655. Полученная в результате многокопийная плазмида, содержащая полный локус xylABFGHR, была названа pUC19/xylA-R.The second library was constructed by cleaving the chromosomal DNA of strain MG1655 and the modified vector pUC19 with restriction enzymes PstI and MluI, followed by ligation. The volume of the library was more than 6,000 clones. The gene library was analyzed by PCR using primers complementary to the nucleotide sequence of the plasmid, and primers 3 (SEQ ID NO: 15) and 4 (SEQ ID NO: 16), which are complementary to the nucleotide sequence of the cloned chromosome fragment. Among the obtained PCR products, DNA fragments with the desired molecular weight were detected. The next step was the sequential separation of the cell population with the gene library using PCR analysis. As a result of seven consecutive separations of the cell population with a cloned fragment containing xylHR genes, only 10 clones were selected. Among this population, the target DNA fragment was found using restriction analysis. The resulting plasmid containing the PstI-MluI DNA fragment with xylHR genes was named pUC19 / xylHR. Then, the HindIII-MluI DNA fragment from the pUC19 / xylHR plasmid was introduced by ligation into the pUC19 / xylA-G-3 plasmid pretreated with HindIII and MluI restriction enzymes. The result was a complete xyl locus of strain MG1655. The resulting multicopy plasmid containing the complete xylABFGHR locus was named pUC19 / xylA-R.

Затем фрагмент ДНК HindIII-EcoRI из плазмиды pUC19/xylA-R был переклонирован на низкокопийный вектор pMW119mod, предварительно обработанный рестриктазами HindIII и EcoRI, в результате была получена плазмида pMW119mod-xylA-R, содержащая полный локус xylABFGHR. Низкокопийный вектор pMW119mod был сконструирован на основе коммерчески доступного вектора pMW119 путем удаления фрагмента PvuII-PvuII. Этот фрагмент содержит полилинкер и является большей частью гена lacZ. Ген lacZ содержит сайты связывания репрессора lacl, после которых на плазмиде расположена вставка синтетического линкера, содержащего сайты EcoRI и HindIII, необходимых для дотирования локуса xylABFGHR из плазмиды pUC19/xylA-R.Then, the HindIII-EcoRI DNA fragment from the plasmid pUC19 / xylA-R was cloned onto the low copy vector pMW119mod pretreated with HindIII and EcoRI restriction enzymes, resulting in the plasmid pMW119mod-xylA-R containing the complete xylABFGHR locus. The low copy vector pMW119mod was constructed based on the commercially available vector pMW119 by removing the PvuII-PvuII fragment. This fragment contains a polylinker and is a large part of the lacZ gene. The lacZ gene contains lacl repressor binding sites, after which the insert of a synthetic linker containing the EcoRI and HindIII sites necessary for subsidizing the xylABFGHR locus from plasmid pUC19 / xylA-R is located on the plasmid.

Пример 2: Продукция L-гистидина бактерией - продуцентом L-гистидина в результате ферментации на смеси глюкозы и пентоз.Example 2: Production of L-histidine by the bacterium producing L-histidine as a result of fermentation on a mixture of glucose and pentoses.

Штамм-продуцент L-гистидина Е.coli 80 был использован для оценки продукции L-гистидина в результате ферментации на смеси глюкозы и пентоз. Штамм Е.coli 80 (ВКПМ В-7270) детально описан в патенте России RU2119536. Трансформация штамма 80 плазмидой pMW119mod-xylA-R была произведена традиционным методом с получением штамма 80/pMW119mod-xylA-R. Для получения посевной культуры оба штамма 80 и 80/pMW119mod-xylA-R выращивались на роторной качалке (250 об/мин) при 27°C в течение 6 часов в лабораторных пробирках 40 мл (⌀ 18 мм), содержащих 2 мл L-бульона со стрептомицином 1 г/л. Для штамма 80/pMW119mod-xylA-R в среду дополнительно добавляли ампициллин 100 мг/л. Затем 2 мл (5%) посевного материала вносили в ферментационную среду. Ферментация производилась на роторной качалке (250 об/мин) при 27°C в течение 65 часов в лабораторных пробирках 40 мл, содержащих 2 мл ферментационной среды.The E. coli 80 L-histidine producing strain was used to evaluate L-histidine production as a result of fermentation on a mixture of glucose and pentoses. Strain E. coli 80 (VKPM B-7270) is described in detail in Russian patent RU2119536. Transformation of strain 80 with plasmid pMW119mod-xylA-R was performed by the traditional method to obtain strain 80 / pMW119mod-xylA-R. To obtain a seed culture, both strains 80 and 80 / pMW119mod-xylA-R were grown on a rotary shaker (250 rpm) at 27 ° C for 6 hours in 40 ml laboratory tubes (⌀ 18 mm) containing 2 ml of L-broth with streptomycin 1 g / l. For strain 80 / pMW119mod-xylA-R, ampicillin 100 mg / L was additionally added to the medium. Then 2 ml (5%) of inoculum was introduced into the fermentation medium. Fermentation was carried out on a rotary shaker (250 rpm) at 27 ° C for 65 hours in 40 ml laboratory tubes containing 2 ml of fermentation medium.

После выращивания, количество L-гистидина, накопленного в среде, определяли методом бумажной хроматографии. Бумага экспонировалась с подвижной фазой следующего состава: н-бутанол: уксусная кислота: вода = 4:1:1 (v/v). В качестве реагента для визуализации использовался 0,5% раствор нингидрина в ацетоне. Результаты представлены в Таблице 2.After growing, the amount of L-histidine accumulated in the medium was determined by paper chromatography. The paper was exposed with a mobile phase of the following composition: n-butanol: acetic acid: water = 4: 1: 1 (v / v). A 0.5% solution of ninhydrin in acetone was used as a reagent for visualization. The results are presented in Table 2.

Состав среды для ферментации, (г/л):The composition of the medium for fermentation, (g / l):

Углеводы (сумма) Carbohydrates (amount) 100.0100.0 МаменоMemeno 0.2 суммарного азота0.2 total nitrogen L-пролинL-proline 0.80.8 (NH₄)₂SO₄ (NH ₄ ) ₂ SO ₄ 25.025.0 КН₂PO₄ KN ₂ PO ₄ 2.02.0 MgSO₄×7H₂OMgSO ₄ × 7H ₂ O 1.01.0 FeSO₄×7H₂OFeSO ₄ × 7H ₂ O 0.010.01 MnSO₄×5H₂OMnSO ₄ × 5H ₂ O 0.010.01 Тиамин HClThiamine HCl 0.0010.001 БетаинBetaine 2.02.0 СаСО₃ CaCO ₃ 6.06.0 СтрептомицинStreptomycin 1.01.0

Углеводы (глюкозу, арабинозу, ксилозу), L-пролин, бетаин и сульфат марганца стерилизовали отдельно. СаСО₃ стерилизовали сухим жаром при 110°C в течение 30 мин. рН доводили до 6.0 с помощью КОН перед стерилизацией.Carbohydrates (glucose, arabinose, xylose), L-proline, betaine and manganese sulfate were sterilized separately. CaCO _{3 was} dry heat sterilized at 110 ° C for 30 minutes. The pH was adjusted to 6.0 with KOH before sterilization.

Таблица 2table 2 ШтаммStrain ГлюкозаGlucose КсилозаXylose Глюкоза/ксилоза 1:1Glucose / Xylose 1: 1 АрабинозаArabinose Глюкоза/арабиноза 1:1Glucose / Arabinose 1: 1 OD₄₅₀ OD ₄₅₀ His, г/лHis, g / l OD₄₅₀ OD ₄₅₀ His, г/лHis, g / l OD₄₅₀ OD ₄₅₀ His, г/лHis, g / l OD₄₅₀ OD ₄₅₀ His, г/лHis, g / l OD₄₅₀ OD ₄₅₀ His, г/лHis, g / l 8080 4343 8.98.9 НетNo 0.40.4 3939 3.23.2 3737 10.310.3 4040 8.78.7 ростаgrowth 80/pMW119mod-80 / pMW119mod- 3939 9.39.3 50fifty 9.69.6 3939 9.99.9 3636 10.510.5 4040 9.1.9.1. xylA-RxylA-R

Как видно из Таблицы 2, усиление экспрессии локуса xylABFGHR, увеличивает продукцию гистидина штаммом Е.coli 80, выращиваемом на среде, содержащей ксилозу.As can be seen from Table 2, increased expression of the xylABFGHR locus increases histidine production by E. coli 80 strain grown on xylose-containing medium.

Пример 3. Продукция L-треонина путем ферментации смеси глюкозы и пентозы с использованием бактерии - продуцента L-треонина.Example 3. Production of L-threonine by fermentation of a mixture of glucose and pentose using bacteria producing L-threonine.

Для оценки продукции L-треонина путем ферментации смеси глюкозы и пентоз использовали штамм Е.coli В-3996. Трансформацию штамма В-3996 плазмидой pMW119mod-xylA-R или вектором pMW119 осуществляли традиционным методом с использованием CaCl₂ с получением штаммов 3996/pMW119mod-xylA-R и 3996/pMW119 соответственно.To assess the production of L-threonine by fermentation of a mixture of glucose and pentoses, E. coli strain B-3996 was used. Transformation of strain B-3996 with the plasmid pMW119mod-xylA-R or the vector pMW119 was carried out by the traditional method using CaCl ₂ to obtain strains 3996 / pMW119mod-xylA-R and 3996 / pMW119, respectively.

Каждый из штаммов Е.coli B-3996/pMW119 и B-3996/pMW119mod-xylA-R выращивали в течение 12-15 часов при 37°C на чашках с L-агаром, содержащим стрептомицин (50 мг/л) и ампициллин (150 мг/л). Затем одну петлю каждого из штаммов переносили в ферментационную среду, содержащую в качестве источника углерода ксилозу (4%). Выращивание проводили в 2 мл ферментационной среды, содержащей стрептомицин (50 мг/л) в 20×200 мм пробирках. Клетки выращивали в течение 25 часов при 32°C на роторной качалке при 250 об/мин.Each of the E. coli strains B-3996 / pMW119 and B-3996 / pMW119mod-xylA-R was grown for 12-15 hours at 37 ° C on plates with L-agar containing streptomycin (50 mg / l) and ampicillin ( 150 mg / l). Then, one loop of each strain was transferred to a fermentation medium containing xylose as a carbon source (4%). Cultivation was carried out in 2 ml of fermentation medium containing streptomycin (50 mg / l) in 20 × 200 mm tubes. Cells were grown for 25 hours at 32 ° C on a rotary shaker at 250 rpm.

После выращивания количество L-треонина, накопленного в среде, определяли методом бумажной хроматографии с использованием с подвижной фазой следующего состава: н-бутанол : уксусная кислота : вода = 4:1:1 (v/v). В качестве реагента для визуализации использовали 2% раствор нингидрина в ацетоне. Пятно, содержащее L-треонин, вырезали, L-треонин элюировали 0.5% водным раствором CdCl₂, а количество L-треонина определяли спектрофотометрически при 540 нм. Результаты представлены в Таблице 3.After growing, the amount of L-threonine accumulated in the medium was determined by paper chromatography using the following composition with a mobile phase: n-butanol: acetic acid: water = 4: 1: 1 (v / v). As a reagent for visualization, a 2% solution of ninhydrin in acetone was used. A spot containing L-threonine was excised, L-threonine was eluted with a 0.5% aqueous solution of CdCl ₂ , and the amount of L-threonine was determined spectrophotometrically at 540 nm. The results are presented in Table 3.

Состав среды для ферментации (г/л):The composition of the medium for fermentation (g / l):

УглеводыCarbohydrates 40.040.0 (NH₄)₂SO₄ (NH ₄ ) ₂ SO ₄ 24.024.0 NaClNaCl 0.80.8 KH₂PO₄ KH ₂ PO ₄ 2.02.0 MgSO₄×7H₂OMgSO ₄ × 7H ₂ O 0.80.8 FeSO₄×7H₂OFeSO ₄ × 7H ₂ O 0.020.02 MnSO₄×5H₂OMnSO ₄ × 5H ₂ O 0.020.02 Тиамин HClThiamine HCl 0.00020.0002 Дрожжевой экстракт Yeast extract 1.01.0 СаСО₃ CaCO ₃ 30.030.0

Ксилозу и сульфат магния стерилизовали отдельно. СаСО₃ стерилизовали при 180°C в течение 2 часов. рН доводили до 7.0. Антибиотики вносили в среду после стерилизации.Xylose and magnesium sulfate were sterilized separately. CaCO _{3 was} sterilized at 180 ° C for 2 hours. The pH was adjusted to 7.0. Antibiotics were added to the medium after sterilization.

Таблица 3Table 3 ШтаммStrain КсилозаXylose OD₅₄₀ OD ₅₄₀ Thr, г/лThr, g / l B-3996/pMW119B-3996 / pMW119 13.9±1.013.9 ± 1.0 7.0±0.27.0 ± 0.2 B-3996/pMW119mod-xylA-RB-3996 / pMW119mod-xylA-R 16.1±0.916.1 ± 0.9 9.3±0.99.3 ± 0.9

Как видно из Таблицы 3, повышенная экспрессия локуса xylABFGHR повышала продукцию L-треонина штаммом Е.coli B-3996/pMW119, выращиваемом на среде, содержащей ксилозу.As can be seen from Table 3, increased expression of the xylABFGHR locus increased the production of L-threonine by E. coli strain B-3996 / pMW119 grown on xylose-containing medium.

Пример 4. Продукция L-лизина путем ферментации смеси глюкозы и пентозы с использованием бактерии - продуцента L-лизина.Example 4. The production of L-lysine by fermentation of a mixture of glucose and pentose using bacteria producing L-lysine.

Для оценки продукции L-треонина путем ферментации смеси глюкозы и пентоз использовали штамм Е.coli WC196ΔcadA Δldc. Штамм WC196ΔcadA ΔldcC получен из штамма WC 196 путем инактивации лизидекарбоксилаз, кодируемых генами ldC и cadA, как описано в патенте США 5827698. Трансформацию штамма WC196ΔcadA Δldc плазмидой pMW119mod-xylA-R или вектором pMW119 осуществляли традиционным методом с использованием CaCl₂ с получением штаммов WC196ΔcadA Δldc/pMW119mod-xylA-R и WC196ΔcadA Δldc/pMW119 соответственно.To assess the production of L-threonine by fermentation of a mixture of glucose and pentoses, E. coli strain WC196ΔcadA Δldc was used. Strain WC196ΔcadA ΔldcC prepared from WC 196 strain by inactivating lizidekarboksilaz encoded genes ldC and cadA, as described in U.S. Patent 5827698. Transformation of strain WC196ΔcadA Δldc plasmid pMW119mod-xylA-R and vector pMW119 was performed by conventional methods using CaCl ₂ to obtain strains WC196ΔcadA Δldc / pMW119mod-xylA-R and WC196ΔcadA Δldc / pMW119, respectively.

Каждый из штаммов Е.coli WC196ΔcadA Δldc/pMW119 и WC196ΔcadA Δldc/pMW119mod-xylA-R выращивали в течение 12-15 часов при 37°С на чашках с L-агаром, содержащим ампициллин (150 мг/л). Затем одну петлю каждого из штаммов переносили в ферментационную среду, содержащую в качестве источника ушерода либо ксилозу (4%), либо смесь ксилозы (2%) с глюкозой (2%). Выращивание проводили в 2 мл ферментационной среды 20×200 мм пробирках. Клетки выращивали в течение 25 часов при 32°С на ротоной качалке при 250 об/мин.Each of the E. coli strains WC196ΔcadA Δldc / pMW119 and WC196ΔcadA Δldc / pMW119mod-xylA-R was grown for 12-15 hours at 37 ° C on plates with L-agar containing ampicillin (150 mg / l). Then, one loop of each of the strains was transferred to a fermentation medium containing either xylose (4%) or a mixture of xylose (2%) with glucose (2%) as a source of usherod. Cultivation was carried out in 2 ml of fermentation medium in 20 × 200 mm test tubes. Cells were grown for 25 hours at 32 ° C on a roton shaker at 250 rpm.

После выращивания количество L-лизина, накопленного в среде, определяли методом бумажной хроматографии с использованием с подвижной фазой следующего состава: н-бутанол: уксусная кислота: вода = 4:1:1 (v/v). В качестве реагента для визуализации использовали 2% раствор нингидрина в ацетоне. Пятно, содержащее L-лизин, вырезали, L-лизин элюировали 0.5% водным раствором CdCl₂, количество L-лизина определяли спектрофотометрически при 540 нм. Результаты представлены в Таблице 4.After growing, the amount of L-lysine accumulated in the medium was determined by paper chromatography using the following composition with mobile phase: n-butanol: acetic acid: water = 4: 1: 1 (v / v). As a reagent for visualization, a 2% solution of ninhydrin in acetone was used. A spot containing L-lysine was excised, L-lysine was eluted with a 0.5% aqueous solution of CdCl ₂ , the amount of L-lysine was determined spectrophotometrically at 540 nm. The results are presented in Table 4.

УглеводыCarbohydrates 40.040.0 (NH₄)₂SO₄ (NH ₄ ) ₂ SO ₄ 24.024.0 КН₂PO₄ KN ₂ PO ₄ 1.01.0 MgSO₄×7H₂OMgSO ₄ × 7H ₂ O 1.01.0 FeSO₄×7H₂OFeSO ₄ × 7H ₂ O 0.010.01 MnSO₄×5H₂OMnSO ₄ × 5H ₂ O 0.010.01 Дрожжевой экстрактYeast extract 2.02.0 СаСО₃ CaCO ₃ 30.030.0

Глюкозу, ксилозу и сульфатмагния стерилизовали раздельно. СаСО₃ стерилизовали при 180°С в течение 2 часов. рН доводили до 7.0 с помощью КОН. Антибиотики вносили в среду после стерилизации.Glucose, xylose and magnesium sulfate were sterilized separately. CaCO _{3 was} sterilized at 180 ° C for 2 hours. The pH was adjusted to 7.0 with KOH. Antibiotics were added to the medium after sterilization.

Таблица 4Table 4 ШтаммStrain КсилозаXylose Глюкоза/ксилоза 1:1Glucose / Xylose 1: 1 OD₅₄₀ OD ₅₄₀ Lys, г/лLys, g / l OD₅₄₀ OD ₅₄₀ Lys, г/лLys, g / l WC196ΔcadA Δldc/pMW119/pMW119WC196ΔcadA Δldc / pMW119 / pMW119 5.7±0.25.7 ± 0.2 0.00.0 24.5±0.224.5 ± 0.2 1.0±0.31.0 ± 0.3 WC196ΔcadA ΔldcWC196ΔcadA Δldc 35.2±0.735.2 ± 0.7 1.8±0.21.8 ± 0.2 36.7±0.236.7 ± 0.2 2.0±0.32.0 ± 0.3 /pMW119mod-xylA-R/ pMW119mod-xylA-R

Как видно из Таблицы 4, повышенная экспрессия локуса xylABFGHR повышала продукцию L-лизина штаммом Е.coli WC196ΔcadA Δldc/pMW119, выращиваемом на среде, содержащей ксилозу.As can be seen from Table 4, increased expression of the xylABFGHR locus increased L-lysine production by E. coli strain WC196ΔcadA Δldc / pMW119 grown on xylose-containing medium.

Пример 5. Продукция L-глутаминовой кислоты путем ферментации смеси глюкозы и пентозы с использованием штамма - продуцента L-глутаминовой кислоты.Example 5. The production of L-glutamic acid by fermentation of a mixture of glucose and pentose using a strain producing L-glutamic acid.

Для оценки продукции L-глутаминовой кислоты путем ферментации смеси глюкозы и пентоз использовали штамм Е.coli AJ12624. Трансформацию штамма AJ1AJ12624 плазмидой pMW119mod-xylA-R или вектором pMW119 осуществляли традиционным методом с использованием CaCl₂ с получением штаммов AJ12624/pMW119mod-xylA-R и AJ12624/pMW119 соответственно.To assess the production of L-glutamic acid by fermentation of a mixture of glucose and pentoses, E. coli strain AJ12624 was used. Transformation of the AJ1AJ12624 strain with the pMW119mod-xylA-R plasmid or the pMW119 vector was carried out using the traditional method using CaCl ₂ to obtain the AJ12624 / pMW119mod-xylA-R and AJ12624 / pMW119 strains, respectively.

Каждый из штаммов Е.coli AJ12624/pMW119 и AJ12624/pMW119mod-xylA-R выращивали в течение 12-15 часов при 37°С на чашках с L-агаром, содержащим ампициллин (150 мг/л). Затем одну петлю каждого из штаммов переносили в ферментационную среду, содержащую в качестве источника углерода ксилозу (4%). Выращивание проводили в 2 мл ферментационной среды 20×200 мм пробирках. Клетки выращивали в течение 48 часов при 32°С на ротоной качалке при 250 об/мин.Each of the E. coli strains AJ12624 / pMW119 and AJ12624 / pMW119mod-xylA-R was grown for 12-15 hours at 37 ° C on plates with L-agar containing ampicillin (150 mg / l). Then, one loop of each strain was transferred to a fermentation medium containing xylose as a carbon source (4%). Cultivation was carried out in 2 ml of fermentation medium in 20 × 200 mm test tubes. Cells were grown for 48 hours at 32 ° C on a roton shaker at 250 rpm.

После выращивания количество L-глутаминовой кислоты, накопленной в среде, определяли методом бумажной хроматографии с использованием с подвижной фазой следующего состава: н-бутанол: уксусная кислота: вода = 4:1:1 (v/v). В качестве реагента для визуализации использовали 2% раствор нингидрина в ацетоне. Пятно, содержащее L-глутаминовую кислоту, вырезали, L-глутаминовую кислоту элюировали 0.5% водным раствором CdCl₂, количество L-глутаминовой кислоты определяли спектрофотометрически при 540 нм. Результаты представлены в Таблице 5.After growing, the amount of L-glutamic acid accumulated in the medium was determined by paper chromatography using the following composition with a mobile phase: n-butanol: acetic acid: water = 4: 1: 1 (v / v). As a reagent for visualization, a 2% solution of ninhydrin in acetone was used. The spot containing L-glutamic acid was excised, L-glutamic acid was eluted with a 0.5% aqueous solution of CdCl ₂ , the amount of L-glutamic acid was determined spectrophotometrically at 540 nm. The results are presented in Table 5.

УглеводыCarbohydrates 40.040.0 (NH₄)₂SO₄ (NH ₄ ) ₂ SO ₄ 25.025.0 КН₂PO₄ KN ₂ PO ₄ 2.02.0 MgSO₄×7H₂OMgSO ₄ × 7H ₂ O 1.01.0 Тиамин HClThiamine HCl 0.00010.0001 L-изолейцинL-isoleucine 0.070.07 СаСО₃ CaCO ₃ 25.025.0

Ксилозу и сульфат магния стерилизовали раздельно. СаСО₃ стерилизовали при 180°С в течение 2 часов. рН доводили до 7.2Xylose and magnesium sulfate were sterilized separately. CaCO _{3 was} sterilized at 180 ° C for 2 hours. pH adjusted to 7.2

Таблица 5Table 5 ШтаммStrain КсилозаXylose OD₅₄₀ OD ₅₄₀ Glu, г/лGlu, g / l AJ12624/pMW119AJ12624 / pMW119 8.6±0.38.6 ± 0.3 4.5±0.24.5 ± 0.2 AJ12624/pMW119mod-xylA-RAJ12624 / pMW119mod-xylA-R 8.0±0.28.0 ± 0.2 5.3±0.25.3 ± 0.2

Как видно из Таблицы 5, повышенная экспрессия локуса xylABFGHR повышала продукцию L-глутаминовой кислоты штаммом Е.coli AJ12624/pMW119, выращиваемом на среде, содержащей ксилозу.As can be seen from Table 5, increased expression of the xylABFGHR locus increased the production of L-glutamic acid by E. coli strain AJ12624 / pMW119 grown on xylose-containing medium.

Пример 6. Продукция L-триптофана путем ферментации смеси глюкозы и пентоз с использованием штамма - продуцента L-триптофана.Example 6. Production of L-tryptophan by fermentation of a mixture of glucose and pentoses using a strain producing L-tryptophan.

Для оценки продукции L-триптофана путем ферментации смеси глюкозы и пентоз использовали штамм Е.coli SV164/pGH5. Трансформацию штамма SV164/pGH5 плазмидой pMW119mod-xylA-R или вектором pMW119 осуществляли традиционным методом с использованием CaCl₂ с получением штаммов SV164/pGH5/pMW119mod-xylA-R и SV164/pGH5/pMW119, соответственно.To assess the production of L-tryptophan by fermentation of a mixture of glucose and pentoses, E. coli strain SV164 / pGH5 was used. Transformation of the strain SV164 / pGH5 with plasmid pMW119mod-xylA-R or the vector pMW119 was carried out using the traditional method using CaCl ₂ to obtain strains SV164 / pGH5 / pMW119mod-xylA-R and SV164 / pGH5 / pMW119, respectively.

Каждый из штаммов Е.coli SV164/pGH5/pMW119 и SV164/pGH5/pMW119mod-xylA-R выращивали в течение 12-15 часов при 37°C на чашках с L-агаром, содержащим тетрациклин (30 мг/л) и ампициллин (150 мг/л). Затем одну петлю каждого из штаммов переносили в ферментационную среду, содержащую в качестве источника углерода либо ксилозу (4%), либо смесь глюкозы (2%) с ксилозой (2%). Выращивание проводили в 2 мл ферментационной среды 20×200 мм пробирках. Клетки выращивали в течение 48 часов при 32°C на ротоной качалке при 250 об/мин.Each of the E. coli strains SV164 / pGH5 / pMW119 and SV164 / pGH5 / pMW119mod-xylA-R was grown for 12-15 hours at 37 ° C on plates with L-agar containing tetracycline (30 mg / l) and ampicillin ( 150 mg / l). Then, one loop of each strain was transferred to a fermentation medium containing either xylose (4%) or a mixture of glucose (2%) with xylose (2%) as a carbon source. Cultivation was carried out in 2 ml of fermentation medium in 20 × 200 mm test tubes. Cells were grown for 48 hours at 32 ° C on a roton shaker at 250 rpm.

После выращивания количество L-триптофана, накопленного в среде, определяли методом тонкослойной хроматографии. Использовали 10×15 см пластинки, покрытые 0.11 мм слоем силикагеля Сорбфил без флуоресцентного индикатора (АО Сорбполимер, Краснодар, РФ). Пластинки Сорбфилэкспонировали с подвижной фазой следующего состава: пропан-2-ол: этилацетат: 25% водный аммиак: вода = 40:40:7:16 (v/v). В качестве реагента для визуализации использовали 2% раствор нингидрина в ацетоне. Результаты представлены в Таблице 7. Компоненты среды для ферментации приведены в Таблице 6, но указанные компоненты должны быть стерилизованы отдельными группами А, В, С, D, Е, F и Н для предотвращения их взаимодействия во время стерилизации.After growing, the amount of L-tryptophan accumulated in the medium was determined by thin layer chromatography. We used 10 × 15 cm plates coated with a 0.11 mm layer of Sorbfil silica gel without a fluorescent indicator (AO Sorbpolymer, Krasnodar, RF). Sorbfilex plates were exposed with a mobile phase of the following composition: propan-2-ol: ethyl acetate: 25% aqueous ammonia: water = 40: 40: 7: 16 (v / v). As a reagent for visualization, a 2% solution of ninhydrin in acetone was used. The results are presented in Table 7. The components of the fermentation medium are shown in Table 6, but these components must be sterilized by separate groups A, B, C, D, E, F and H to prevent their interaction during sterilization.

Таблица 6Table 6 РатсворыRatsvory КомпонентComponent Конечная концентрация, г/лFinal concentration, g / l АBUT КН₂PO₄ KN ₂ PO ₄ 1.51.5 NaClNaCl 0.50.5 (NH₄)₂SO₄ (NH ₄ ) ₂ SO ₄ 1.51.5 L-MethionineL-methionine 0.050.05 L-PhenylalanineL-phenylalanine 0.10.1 L-TyrosineL-tyrosine 0.10.1 Mameno (total N)Mameno (total N) 0,070,07 ВAT GlucoseGlucose 40.040.0 MgSO₄×7H₂OMgSO ₄ × 7H ₂ O 0.30.3 СFROM CaCl₂ CaCl ₂ 0.0110.011 DD FeSO₄×7H₂OFeSO ₄ × 7H ₂ O 0.0750.075 Sodium citrateSodium citrate 1.01.0 ЕE Na₂MoO₄×2H₂ONa ₂ MoO ₄ × 2H ₂ O 0.000150.00015 Н₃ВО₃ H ₃ IN ₃ 0.00250.0025 CoCl₂×6Н₂ОCoCl ₂ × 6H ₂ O 0.000070.00007 CuSO₄×5H₂OCuSO ₄ × 5H ₂ O 0.000250.00025 MnCl₂×4H₂OMnCl ₂ × 4H ₂ O 0.00160.0016 ZnSO₄×7H₂OZnSO ₄ × 7H ₂ O 0.00030.0003 FF Thiamine HClThiamine hcl 0.0050.005 GG СаСО₃ CaCO ₃ 30.030.0 НN PyridoxinePyridoxine 0.030.03 рН раствора А доводили до 7.1 с помошью NH₄OH.The pH of solution A was adjusted to 7.1 with NH ₄ OH. Таблица 7Table 7 ШтаммStrain КсилозаXylose Глюкоза/ксилоза 1:1Glucose / Xylose 1: 1 OD₅₄₀ OD ₅₄₀ Trp, г/лTrp, g / l OD₅₄₀ OD ₅₄₀ Trp, г/лTrp, g / l SV164/pGH5/pMW119SV164 / pGH5 / pMW119 3.5±0.43.5 ± 0.4 0.5±0.20.5 ± 0.2 15.3±0.215.3 ± 0.2 5.3±0.75.3 ± 0.7 SV 164/pGH5/pMW119mod-xylA-RSV 164 / pGH5 / pMW119mod-xylA-R 13.9±0.513.9 ± 0.5 3.6±0.53.6 ± 0.5 15.1±0.815.1 ± 0.8 6.0±0.56.0 ± 0.5

Как видно из Таблицы 7, повышенная экспрессия локуса xylABFGHR повышала продукцию L-триптофана штаммом Е.coli SV164/pGH5/pMW119, выращиваемом на среде, содержащей ксилозу.As can be seen from Table 7, increased expression of the xylABFGHR locus increased the production of L-tryptophan by E. coli strain SV164 / pGH5 / pMW119 grown on xylose-containing medium.

Хотя указанное изобретение описано в деталях со ссылкой на конкретные примеры, для специалиста в указанной области техники очевидно, что могут быть совершены различные изменения и произведены эквивалентные замены и такие изменения и замены не выходят за рамки настоящего изобретения. Каждый из вышеупомянутых документов, на который существует ссылка, включен в настоящее описание во все полноте.Although the invention has been described in detail with reference to specific examples, it will be apparent to those skilled in the art that various changes may be made and equivalent replacements may be made, and such changes and replacements are not outside the scope of the present invention. Each of the aforementioned referenced documents is included in its entirety in the present description.

Claims

1. Бактерия, принадлежащая к роду Escherichia, - продуцент L-аминокислоты, обладающая повышенной экспрессией генов утилизации ксилозы.1. A bacterium belonging to the genus Escherichia is a producer of L-amino acids with increased expression of xylose utilization genes.

2. Бактерия по п.1, отличающаяся тем, что экспрессия генов утилизации ксилозы повышена за счет усилия экспрессии локуса xylABFGHR.2. The bacterium according to claim 1, characterized in that the expression of xylose utilization genes is increased due to the expression force of the xylABFGHR locus.

3. Бактерия по п.2, отличающаяся тем, что активность ферментов утилизации ксилозы повышена за счет увеличения количества копий локуса xylABFGHR или модификации последовательности, контролирующей экспрессию генов таким образом, что экспрессия указанных генов усилена.3. The bacterium according to claim 2, characterized in that the activity of xylose utilization enzymes is increased by increasing the number of copies of the xylABFGHR locus or by modifying the sequence that controls gene expression so that the expression of these genes is enhanced.

4. Бактерия по п.3, отличающаяся тем, что количество копий указанного локуса увеличено за счет трансформации бактерии низкокопийным вектором, содержащим локус xylABFGHR.4. The bacterium according to claim 3, characterized in that the number of copies of the specified locus is increased due to the transformation of the bacterium with a low copy vector containing the xylABFGHR locus.

5. Бактерия по любому из пп.1-4, отличающаяся тем, что локус xylABFGHR получен из бактерии, принадлежащей к роду Escherichia.5. The bacterium according to any one of claims 1 to 4, characterized in that the xylABFGHR locus is obtained from a bacterium belonging to the genus Escherichia.

6. Способ получения L-аминокислоты, включающий стадии выращивания бактерии по любому из пп.1-5 в питательной среде, содержащей смесь глюкозы и пентоз, и выделения накопленной L-аминокислоты из культуральной жидкости.6. A method for producing an L-amino acid, comprising the steps of growing a bacterium according to any one of claims 1 to 5 in a nutrient medium containing a mixture of glucose and pentoses, and isolating the accumulated L-amino acid from the culture fluid.

7. Способ по п.6, отличающийся тем, что пентозами являются арабиноза и ксилоза.7. The method according to claim 6, characterized in that the pentoses are arabinose and xylose.

8. Способ по п.6, отличающийся тем, что указанная смесь сахаров является продуктом переработки целлюлозной биомассы.8. The method according to claim 6, characterized in that said mixture of sugars is a product of processing cellulosic biomass.

9. Способ по п.6, отличающийся тем, что получаемой L-аминокислотои является L-гистидин.9. The method according to claim 6, characterized in that the resulting L-amino acid is L-histidine.

10. Способ по п.9, отличающийся тем, что в указанной бактерии усилена экспрессия генов биосинтеза L-гистидина.10. The method according to claim 9, characterized in that in said bacterium the expression of L-histidine biosynthesis genes is enhanced.

11. Способ по п.6, отличающийся тем, что получаемой L-аминокислотой является L-треонин.11. The method according to claim 6, characterized in that the resulting L-amino acid is L-threonine.

12. Способ по п.11, отличающийся тем, что в указанной бактерии усилена экспрессия генов биосинтеза L-треонина.12. The method according to claim 11, characterized in that in said bacterium the expression of L-threonine biosynthesis genes is enhanced.

13. Способ по п.6, отличающийся тем, что получаемой L-аминокислотой является L-лизин.13. The method according to claim 6, characterized in that the resulting L-amino acid is L-lysine.

14. Способ по п.13, отличающийся тем, что в указанной бактерии усилена экспрессия генов биосинтеза L-лизина.14. The method according to item 13, wherein the specified bacteria enhanced expression of L-lysine biosynthesis genes.

15. Способ по п.6, отличающийся тем, что получаемой L-аминокислотой является L-глутаминовая кислота.15. The method according to claim 6, characterized in that the resulting L-amino acid is L-glutamic acid.

16. Способ по п.15, отличающийся тем, что в указанной бактерии усилена экспрессия генов биосинтеза L-глутаминовой кислоты.16. The method according to clause 15, characterized in that the specified bacteria enhanced expression of the biosynthesis genes of L-glutamic acid.

17. Способ по п.6, отличающийся тем, что получаемой L-аминокислотой является L-триптофан.17. The method according to claim 6, characterized in that the resulting L-amino acid is L-tryptophan.

18. Способ по п.17, отличающийся тем, что в указанной бактерии усилена экспрессия генов биосинтеза L-триптофан.18. The method according to 17, characterized in that in said bacterium the expression of L-tryptophan biosynthesis genes is enhanced.