RU2262703C1 - Способ получения контрольных образцов, используемых в иммуноферментном анализе - Google Patents
Способ получения контрольных образцов, используемых в иммуноферментном анализе Download PDFInfo
- Publication number
- RU2262703C1 RU2262703C1 RU2004128354/15A RU2004128354A RU2262703C1 RU 2262703 C1 RU2262703 C1 RU 2262703C1 RU 2004128354/15 A RU2004128354/15 A RU 2004128354/15A RU 2004128354 A RU2004128354 A RU 2004128354A RU 2262703 C1 RU2262703 C1 RU 2262703C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- solution
- fragments
- preparing
- serum
- control
- Prior art date
Links
Landscapes
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области иммунологии, медицины и биотехнологии. Способ включает получение контрольных образцов путем приготовления раствора гетерологичных химерных антител, состоящих из целых молекул или фрагментов иммуноглобулина, выделенных из сыворотки иммунизированного животного, ассоциированных с целыми молекулами или фрагментами иммуноглобулина человека в фосфатно-солевом буфере, рН 6.0, с последующим приготовлением различных разведений в указанном буфере, их контролем в ИФА и отбором разведений, значения оптической плотности которых не ниже 1,0. Изобретение обеспечивает получение контрольных образцов, содержащих специфические антитела, обладающих высокой специфичностью и детектируемостью и в то же время инфекционно безопасных, стандартных и экономически доступных. 2 з.п. ф-лы.
Description
Изобретение относится к области медицины, иммунологии и биотехнологии.
Иммуноферментный анализ является одним из высокочувствительных методов лабораторной диагностики. При его проведении предъявляются высокие требования к технике постановки, оборудованию, оснащению лаборатории.
Значительное внимание уделяется обеспечению качества иммуноферментных тест-систем разных производителей, в том числе оно осуществляется в настоящее время на государственном уровне.
Предприятия-производители выпускают различные иммуноферментные тест-системы, в том числе для диагностики вирусных гепатитов А, В, С, D, Е, ВИЧ-инфекции, сифилиса, хламидиоза, герпеса.
Основными показателями их качества являются:
- чувствительность - способность тест-системы обнаружить минимальное количество искомого вещества. Низкая чувствительность может привести к отрицательному ложному результату;
- специфичность - способность тест-системы детектировать искомое вещество;
- воспроизводимость - способность тест-системы давать устойчиво стабильный результат при многократном тестировании одного и того же образца.
Чем выше эти характеристики, тем качественнее тест-система.
Существуют национальные критерии чувствительности и специфичности отечественных препаратов. Например, для тест-систем на HBsAg с 2003 года регламентируется чувствительность 0,1 нг/мл.
С целью контроля качества тест-систем и других диагностических препаратов, как правило, используют стандартные тест-панели.
Тест-панель представляет собой подборку контрольных образцов, в которых с помощью тест-систем, международно-признанных как референтные, подтверждено наличие или отсутствие искомого компонента.
При производстве иммуноферментных диагностических систем для определения специфических антител, например антител к возбудителям инфекционных заболеваний, аутоантител, антител к специфическим маркерам, в качестве контрольного образца традиционно используются образцы сыворотки крови человека, содержащие антитела, аналогичные определяемым (аналиты) от пациентов с перенесенным или текущим патологическим процессом (инфекционным заболеванием, аллергией или злокачественными новообразованиями). Образование специфических антител является ответной реакцией организма на циркулирование биологических агентов, вызвавших данное инфекционное заболевание или патологический процесс.
Содержащий аналит контрольный образец должен отвечать следующим требованиям: специфичность (способность связываться с антигеном) и детектируемость (возможность определения антигенов с использованием антивидовых антител).
Тест-панели выпускаются немногочисленными зарубежными фирмами.
В России доступны стандартные панели ГИСК им. Тарасовича. Это панели сывороток, содержащих специфические антитела к основным белкам тестируемого антигена, сделанные на основе разведений, лиофилизированные. Они дешевле зарубежных и удобны для транспортировки. Однако при производстве сыворотки подвергаются сложной технологической обработке и их уже нельзя считать естественными образцами сыворотки крови человека.
Известен также способ получения стандартной контрольной сыворотки для анализа из человеческой или животной сыворотки путем добавления определенного буфера с физиологически близким значением рН с последующей лиофилизацией (DE 3324626 А1, 1985-01-17, МПК: G 01 N 33/96, BOEHRINGER MANNHEIM GMBH). Однако такие сыворотки не обеспечивают требуемого контроля качества тест-систем и иммуноблотов.
Наиболее близким техническим решением (прототипом) является способ использования иммунных сывороток, содержащих специфические антитела ко всем основным белкам тестируемого антигена и имеющих разную концентрацию этих антител в качестве позитивных образцов при получении стандартной панели сывороток для контроля качества иммуноферментных тест-систем и иммуноблотов (патент RU 2094807 С1, МПК: G 01 N 33/96, G 01 N 33/53 - Научно-производственное объединение «Вектор»).
Использование в качестве контроля образцов сыворотки крови инфекционных больных полностью отвечает всем требованиям, однако имеет ряд существенных недостатков, особенно при промышленном производстве иммуноферментных диагностикумов. К основным недостаткам относятся:
1. Использование нативных сывороток крови инфекционных больных (в данном случае ВИЧ-инфицированных) представляет собой потенциальную инфекционную опасность как при производстве, так и при использовании контрольных панелей, содержащих данные сыворотки.
2. Неоднородность исходного материала и сложность стандартизации.
3. Труднодоступность для промышленного производства (в случае редких или эндемичных заболеваний).
4. Этические проблемы (использование сыворотки крови тяжелобольных людей).
5. Высокая стоимость.
В основу настоящего изобретения поставлена следующая задача: создание контрольных образцов, используемых в иммуноферментном анализе, содержащих специфические антитела, обладающих высокой специфичностью и детектируемостью, но в то же время инфекционно безопасных, стандартных, доступных для промышленного производства и экономически выгодных.
Задача решается разработанным способом получения контрольного образца на основе гетерологичных химерных молекул иммуноглобулинов.
Сущность предлагаемого технического решения состоит в том, что в качестве контрольных образцов при создании контрольных панелей для проведения сравнительных и аудиторских испытаний иммуноферментных тест-систем и других препаратов, а также в качестве «входного контроля» в диагностических центрах и лабораториях предлагается использовать образцы, содержащие специфические антитела, полученные химическим или биологическим методом и состоящие из целых молекул или фрагментов иммуноглобулинов иммунизированного животного, ассоциированных с целыми молекулами или фрагментами иммуноглобулина человека. Фрагментом иммуноглобулина может, например, являться фрагмент Fab, Fab', F(ab')2.
Использование «суррогатных» или эрзац контрольных образцов, содержащих специфические антитела, в производстве иммуноферментных тест-систем позволяет исключить из процесса инфекционный материал (сыворотки больного человека) при сохранении возможности использования видоспецифических детектирующих антител.
Химерные молекулы иммуноглобулинов использовались ранее в основном для диагностики ин виво и для лечения разнообразных расстройств у людей и животных.
В частности, чтобы уменьшить степень иммунологической несовместимости, были сконструированы "химерные" или "гуманизированные" антитела, сочетающие элементы структуры человеческих антител и антител животного, например мыши.
Молекула антитела человека сохраняет все элементы тяжелых и легких цепей за исключением их вариабельных N-концевых отрезков, на место которых вводят соответствующие отрезки моноклонального антитела животного. Таким образом, антитело человека становится носителем антигенсвязывающего центра антитела животного.
Более совершенным вариантом является "гуманизированное" антитело, в котором антителу животного принадлежат лишь гипервариабельные элементы, формирующие антигенсвязывающий центр.
Однако до настоящего времени из уровня техники не выявлено способов получения контрольных образцов для контроля качества иммуноферментных диагностических систем и препаратов на основе подобных молекул.
Изобретение иллюстрируется следующими примерами.
Технология получения гетерологичных химерных молекул иммуноглобулинов.
Получение иммунных сывороток
Для получения антивидовых сывороток животных (например, коз) иммунизируют путем многоточечных инфекций подкожно и внутрибрюшинно по следующей схеме: 200 мкг смеси рекомбинантных антигенов в 0,5 мл физиологического раствора смешивают с 0,5 мл полного адъюванта Фрейнда и вводят животному в 1, 8, 15 дни иммунизации. После 30 дней перерыва животное иммунизируют ежедневно в течение 3-х дней, вводя 150 мкг белка в 0,7 мл физиологического раствора. Через 7-9 дней проводят отбор крови из сердца.
Приготовление растворов.
0,3% раствор этакридина лактата
3,0 г этакридина лактата растворяют в 1,0 л дистиллированной воды.
0,1 М фосфатный буферный раствор, рН 6,8
Готовят два раствора:
Раствор 1. 0,2 М раствор двузамещенного фосфата натрия.
71,64 г двузамещенного фосфата натрия 12-водного или 35,61 г двузамещенного фосфата натрия 2-водного растворяют в 1 л дистиллированной воды.
Раствор 2. 0,2 М раствор однозамещенного фосфата натрия.
31,21 г однозамещенного фосфата натрия 2-водного или 27,6 г двузамещенного фосфата натрия растворяют в 1 л дистиллированной воды.
Далее смешивают 245 мл раствора 1, 255 мл раствора 2 и 500 мл дистиллированной воды.
2 М раствор глицина
150,14 г глицина растворяют в 1 л дистиллированной воды.
Выделение IgG из плазмы человека или иммунного животного.
К 100 мл плазмы человека добавляют 500 мл 0,3% раствора этакридина лактата, перемешивают и выдерживают 10-12 часов при температуре 2-8°С. Раствор фильтруют и добавляют хлористый натрий до конечной концентрации 4%. После растворения раствор выдерживают 16-18 часов при температуре 2-8°С. Раствор фильтруют и добавляют сульфат аммония до конечной концентрации 20%, тщательно перемешивают и оставляют на 16-18 часов при температуре 2-8°С. Далее раствор центрифугируют в течение 30 минут при 6000 об/мин. Надосадочную жидкость сливают, осадок разводят в 10 мл физиологического раствора. Концентрацию выделенных IgG рассчитывают по формуле С=ОП/1,4 мг/мл, где ОП - оптическая плотность образца, измеренная на спектрофотометре при длине волны 280 нм.
Получение химерных молекул иммуноглобулинов (целая молекула)
Приготовление растворов
0,1 М раствор глютаральдегида
10,01 г глютаральдегида растворяют в 1 л дистиллированной воды.
Фосфатно-солевой раствор (ФСР), рН6,8
22.5 г натрия фосфорнокислого 2-х замещенного 12-ти водного и 225,0 г натрия хлористого разводят в 1,0 л дистиллированной воды.
По 2 мг IgG человека и иммунного животного смешивают и доводят 0,1 М фосфатным буферным раствором, рН 6,8 до объема 25 мл. Затем, осторожно помешивая, по каплям вносят 2,8 мл 0,1 М раствора глютаральдегида и выдерживают 2 часа при комнатной температуре. Раствор диализуют против фосфатно-солевого раствора на протяжении 16-18 часов при температуре 2-8°С,
Получение химерных молекул иммуноглобулинов (Получение гибридных F(ab')2 фрагментов)
Приготовление растворов
0,1 M Na-ацетатный буфер, рН 4,5
13,6 г ацетата натрия 3-х водного и 630 мл 0,1 М уксусной кислоты разводят в 1,0 л дистиллированной воды.
0,1 М Na-фосфатный буферный раствор, рН 6,0
2,19 г натрия фосфорнокислого 2-х замещенного 2-х водного и 13,68 г натрия фосфорнокислого однозамещенного 2-х водного разводят в 1,0 л дистиллированной воды.
5 мМ раствор ЭДТА
1,86 г ЭДТА растворяют в 1 л 0,1 М Na-фосфатном буферном растворе, рН 6,0.
0,1 М раствор 2-меркаптоэтанола
7,81 г 2-меркаптоэтанола растворяют в 1 л 0,1 М Na-фосфатном буферном растворе, рН 6,0.
Получение F(ab')2-фрагментов
Раствор антител диализуют против 0,1 М Na-ацетатного буфера рН 4,5 при +5°С.
Затем в раствор антител вносят пепсин из расчета 0,2 мг на 10 мг IgG.
Смесь инкубируют при 37°С в течении 18-24 ч.
рН раствора доводят 1М NaOH до 8,0.
Раствор IgG в буфере рН 8,0 наносят на колонку с сефадексом G-150, предварительно уравновешенную 0,1 M Na-боратным буфером, рН 8,0.
б. Концентрацию F(ab)2-фрагмента рассчитывают, используя коэффициент молярного поглощения ε F(ab)2=1,48 г - 1. л. см-1
Получение гибридных F(ab')2-фрагментов
Готовят раствор, содержащий 0,3 мг F(ab')2-фрагментов IgG козы и 2-2,5 мг F(ab')2-фрагментов IgG человека в 0,45 мл 0,1 М Na-фосфатном буфере рН 6,0.
Добавляют 0,05 мл 0,1 М 2-меркаптоэтанола в том же буфере, содержащем 5 мМ ЭДТА.
Смесь инкубируют при 37°С в течение 1,5 ч.
Освобождают от солей на колонке (0,9×15 см) с сефадексом G-25, уравновешенной 0,1 М Na-фосфатным буфером, рН 0,6 с 5 мМ ЭДТА.
Получение контрольного образца, содержащего специфические антитела.
Полученный раствор химерных молекул иммуноглобулинов или их фрагментов используют для приготовления контрольного образца. Для этого осуществляют метод кратного разведения раствора химерных молекул иммуноглобулинов в фосфатно-солевом растворе (ФСР) 1:5, 1:10, 1:20, 1:40 и т.п., контролируют в ИФА и выбирают раствор той степени разведения, значение оптической плотности которого не ниже 1,0.
Преимущество предлагаемого способа получения контрольных образцов химерных молекул иммуноглобулинов, содержащих специфические антитела, используемых при конструировании иммуноферментных тест-систем, при создании контрольных панелей для проведения сравнительных и аудиторских испытаний иммуноферментных тест-систем, в качестве «входного контроля» в диагностических центрах и лабораториях заключается в следующем:
1. Безопасность при производстве и использовании (исключена работа с инфекционным материалом)
2. Возможность получения стандартного материала в неограниченном количестве.
Claims (3)
1. Способ получения контрольных образцов, содержащих специфические антитела, используемых для проведения сравнительных и аудиторских испытаний иммуноферментных тест-систем и препаратов, отличающийся тем, что готовят раствор гетерологичных химерных антител, состоящих из целых молекул или фрагментов иммуноглобулина, выделенных из сыворотки иммунизированного животного, ассоциированных с целыми молекулами или фрагментами иммуноглобулина человека в фосфатно-солевом буфере, рН 6,0, разводят его методом кратных разведений в указанном буфере, контролируют в ИФА и отбирают растворы со степенью разведения, значения оптической плотности которых не ниже 1,0.
2. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве фрагмента иммуноглобулина используют фрагмент Fab, Fab', F(ab')2.
3. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве сыворотки иммунизированного животного используют антивидовую сыворотку козы.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2004128354/15A RU2262703C1 (ru) | 2004-09-24 | 2004-09-24 | Способ получения контрольных образцов, используемых в иммуноферментном анализе |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2004128354/15A RU2262703C1 (ru) | 2004-09-24 | 2004-09-24 | Способ получения контрольных образцов, используемых в иммуноферментном анализе |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2262703C1 true RU2262703C1 (ru) | 2005-10-20 |
Family
ID=35863178
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2004128354/15A RU2262703C1 (ru) | 2004-09-24 | 2004-09-24 | Способ получения контрольных образцов, используемых в иммуноферментном анализе |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
RU (1) | RU2262703C1 (ru) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2472158C1 (ru) * | 2011-11-30 | 2013-01-10 | Федеральное государственное Бюджетное учреждение "Государственный научный центр дерматовенерологии и косметологии Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации (ФГБУ "ГНЦДК" Минздравсоцразвития России) | Состав расширенной квалификационной панели контрольных материалов для осуществления внешнего и внутрилабораторного контроля качества серологической диагностики сифилитической инфекции |
-
2004
- 2004-09-24 RU RU2004128354/15A patent/RU2262703C1/ru active
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2472158C1 (ru) * | 2011-11-30 | 2013-01-10 | Федеральное государственное Бюджетное учреждение "Государственный научный центр дерматовенерологии и косметологии Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации (ФГБУ "ГНЦДК" Минздравсоцразвития России) | Состав расширенной квалификационной панели контрольных материалов для осуществления внешнего и внутрилабораторного контроля качества серологической диагностики сифилитической инфекции |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
WO2010058860A1 (ja) | 試料中のc反応性蛋白質の測定方法及び測定試薬 | |
JP4625879B2 (ja) | モノクローナル抗体及びこれを用いた免疫学的測定方法 | |
CN101253198A (zh) | 使用鸵鸟产生的抗体及其制备方法 | |
JPH0720127A (ja) | 各種pivkaの測定方法および測定試薬 | |
CN108780095A (zh) | 利用简易免疫测定的癌胚纤连蛋白检测方法 | |
JP7385296B2 (ja) | 生体試料中のβ-D-グルカンの免疫学的分析方法、及びβ-D-グルカン分析用キット | |
JP2016053044A (ja) | ヒトインスリン測定方法及び測定試薬 | |
JP2011502244A (ja) | Edta耐性s100a12複合体(erac) | |
JP4536588B2 (ja) | 成人t細胞白血病の診断器具 | |
US20220120762A1 (en) | Immunoassay method for free aim in biological sample, and method for detecting nash in subject | |
CN109069600A (zh) | Il-21抗体及其用途 | |
RU2262703C1 (ru) | Способ получения контрольных образцов, используемых в иммуноферментном анализе | |
JP2932837B2 (ja) | ヒトポドカリキシンの測定方法 | |
Stinghen et al. | Specific immunoassays for placental alkaline phosphatase as a tumor marker | |
JP2675117B2 (ja) | がんの血清測定法 | |
JP7054378B2 (ja) | Ca19-9測定方法及びca19-9測定キット、並びに、これらに用いる抗体固定化担体及びその製造方法 | |
McIntosh et al. | Acute poststreptococcal glomerulonephritis in Maracaibo. II: Studies on the incidence, nature, and significance of circulating anti-immunoglobulins. | |
WO2019230874A1 (ja) | ヒト由来サンプルにおける可溶型tlr7の分析 | |
CN113196057A (zh) | 病毒性肝癌的检测方法 | |
EP3919509A1 (en) | Method for immunological analysis of free aim in biological sample | |
JP4422291B2 (ja) | ヒトメダラシンの免疫学的測定方法 | |
KR102244121B1 (ko) | 브루셀라균의 omp28에 특이적으로 결합하는 단일클론항체, 상기 항체를 생산하는 하이브리도마 세포주 및 이의 용도 | |
KR920010224B1 (ko) | 응집반응 측정법 | |
RU2110276C1 (ru) | Способ получения бета-2-глобулина мекония плодов человека | |
CN116626307A (zh) | 一种IgA抗体检测试剂盒及检测方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PD4A | Correction of name of patent owner |