RU2230752C2

RU2230752C2 - Поперечносшитые гиалуроновые кислоты и их применение в медицине

Info

Publication number: RU2230752C2
Application number: RU2001112488/04A
Authority: RU
Inventors: Роландо БАРБУЧЧИ (IT); Роландо БАРБУЧЧИ; Роберто РАПУОЛИ (IT); Роберто РАПУОЛИ
Original assignee: Фармила-Теа Фармасьютичи,С.П.А.
Priority date: 1998-11-11
Filing date: 1999-11-08
Publication date: 2004-06-20
Also published as: EP1144459B1; ES2184521T5; DK1144459T3; HK1041011A1; HUP0104296A3; ATE225371T1; CN1328573A; HU229668B1; JP2002529550A; BR9915235A; NO20012315L; CZ296842B6; HK1041011B; IT1303735B1; IL143063A0; WO2000027887A2; DE69903351T2; NZ511306A; WO2000027887A3; EP1144459A2

Abstract

Изобретение относится к поперечносшитым гиалуроновым кислотам и может быть применено в медицинской и фармацевтической областях и в косметологии. Поперечносшитые гиалуроновые кислоты получают взаимодействием карбоксильных групп гиалуроновой кислоты и диамина общей формулы R₁-NH-A-NHR₂, где А является С₂-С₁₀линейной или разветвленной алкиленовой цепью, или полиоксиалкиленовой цепью [(СН₂)_n-О-(СН)₂]_m, где n равно 2 или 3, m - от 2 до 10, R₁и R₂являются одинаковыми или различными и представляют собой водород, С₁-С₆ алкильную, фенильную или бензильную группу. Комплексы цинка, меди или железа представляют собой комплексы металлов и вышеуказанных соединений гиалуроновых кислот. Биоматериалы представляют собой поперечносшитые кислоты и их комплексы. Изобретение позволяет получить соединения с высокой биосовместимостью, высокой устойчивостью к деградации под воздействием ферментов, высокой способностью к адсорбции воды и способностью хелатироваться с ионами металлов. 3 с. и 8 з.п. ф-лы, 3 табл.

Description

Область изобретения

Настоящее изобретение касается поперечносшитых гиалуроновых кислот, необязательно гемисукцинилированных или сульфатированных, их солей с биологически пригодными или фармацевтически активными катионами и их комплексов с тяжелыми металлами, такими как медь, цинк и железо.

Изобретение также касается применения указанных поперечносшитых гиалуроновых кислот, солей и комплексов в медицинской, фармацевтической областях и косметологии.

Предпосылки изобретения

Гиалуроновая кислота является гликозаминогликаном, состоящим из дисахаридных единиц D-глюкуроновой кислоты и N-ацетилглюкозамино-2-ацетамидо-2-дезокси-О-глюкозы, соединенных β (1→3)гликозидными связями.

Естественная гиалуроновая кислота имеет линейную, не поперечносшитую структуру с молекулярной массой в пределах от 50000 до 8000000 D или более, в зависимости от источника или способа экстракции.

Гиалуроновая кислота находится в синовиальной жидкости, соединительной ткани и жидкой части стекловидного тела высших животных, а также в некоторых бактериях.

Композиции гиалуроната натрия, имеющего различные молекулярные массы (в форме растворов, имеющих различную вязкость, гелей с различными вязкоупругими свойствами, тампонов, пленок или мембран), используются в гуманной медицине и в хирургии, например, в качестве заменителей синовиальной жидкости, противосклеивающих агентов для тканей, заменителей жидкой части стекловидного тела, искусственных слез, агентов для воспроизведения тканей in vivo (например, в качестве внеклеточных матриксов для образования костных сегментов, с последующим заселением остеобластами и последующим обызвествлением; соединительно-кожных тканей с последующим заселением фибробластами), материалов для получения искусственной кожи, пригодной для лечения ожогов или в пластической хирургии; агентов для покрытия биосовместимого протеза сосудов, носителей фармакологически активных ингредиентов в композициях с контролируемым высвобождением и т.д.

В дерматологии и косметологии с учетом вязкоупругих и увлажняющих свойств и высокой биосовместимости указанные композиции используются как в качестве основы для увлажняющих наружных композиций, так и в качестве инвазивных медико-хирургических устройств ("наполняющие агенты").

Однако применение естественной линейной гиалуроновой кислоты для указанных применительных целей ограничено в результате ее быстрой деградации in vivo под действием ферментных систем, таких как гиалуронидаза, глюкозидаза и глюкуронидаза, с последующим уменьшением молекулярной массы и прогрессирующим нарушением вязкоупругих свойств и в целом физических свойств конечных композиций и устройств (механической прочности, эластичности, размера пор) и т.д.

Для преодоления этой проблемы, в основном с целью увеличения ряда композиций и их применительной приспособляемости, были предложены химически модифицированные гиалуроновые кислоты.

Раскрывается поперечное сшивание полифункциональными эпоксидами (патенты США 4716224, 4772419, 4716154), полиспиртами (патент США 4957744), дивинилсульфоном (патент США 4582865, 4605601, 4636524), альдегидами (патент США 4713448, 5128326, 4582568), бискарбодиимидами (патент США 5356883), поликарбоновыми кислотами (ЕР-А-718312).

Указанные поперечносшитые гиалуроновые кислоты используются в качестве биоматериалов для имплантатов, протеза и медицинских устройств, в качестве матриц с контролируемым высвобождением для лекарственных препаратов, в качестве заживляющих, противосклеивающих и покровных агентов.

Сульфатирование не поперечносшитой гиалуроновой кислоты в общем раскрывается в патенте США 5013724, в основном касающегося сульфатирования гепаринов, гепаранов и дерматанов для применения в качестве противосвертывающих и антикоагулянтных агентов.

Воссоздание гиалуроновой кислоты (HY) гемисукцинилированием никогда не было раскрыто. Пример этой функционализации раскрывается в ЕР-В-200574, где заявляются сложные биоматериалы, состоящие из сукцинилированного коллагена и хитозана.

Поперечное сшивание карбоксиалкилцеллюлозы с помощью ди- или полиаминов раскрывается в ЕР-А-566118 (Kimberly Clark Corp.) для получения абсорбирующих материалов с НУ в качестве поперечносшивающего агента нагреванием. Подобный способ оказался экономически преимущественным и пригодным для крупномасштабных производств, нуждающихся в продуктах подобного вида.

В ЕР-А-462426 (Fidia) раскрываются перфорированные биосовместимые мембраны и их применения в качестве искусственной кожи. В общем приводится коллаген, поперечносшитый диаминами, и гиалуроновая кислота, в качестве возможных материалов для указанных мембран.

Краткое описание изобретения

В настоящее время было установлено, что новые поперечносшитые гиалуроновые кислоты, получаемые взаимодействием соответственно активированных карбоксильных групп НУ с полиамином, а также их соли и комплексы с пригодными органическими или неорганическими катионами, имеют преимущественные химико-физические и биологические свойства для биомедицинских и косметических применений.

Основными химико-физическими и биохимическими характеристиками соединений по изобретению являются:

- высокая биосовместимость;

- высокая устойчивость к деградации под воздействием ферментов, в основном после сульфатирования;

- высокая способность к адсорбции воды с образованием вязкоупругих свойств в зависимости от степени поперечного сшивания, а также от степени сульфатирования и/или гемисукцинилирования;

- способность хелатироваться с ионами металлов, такими как цинк или медь; указанные производные обладают очень хорошей стабильностью.

Биологическое поведение является новым и удивительным; известно, что сульфатирование (или суперсульфатирование) глюкозаминогликанов, таких как гепарин, дерматансульфат, хондроитин и естественная гиалуроновая кислота, усиливает их антикоагулянтные свойства (ингибирование Ха- и IIa-факторов и/или изменение их соотношения) по сравнению с исходным продуктом (патент США 5013724).

Соединения по изобретению, когда сульфатированы, обладают незначительной антикоагулянтной активностью, в то время как совершенно удивительным является отсутствие активирования и агрегации тромбоцитов (определено в виде противосклеивающей активности; PRP-модель на кроликах, подвергнутых поведенческому стрессу, описанная в "Abstract IL 15" - International Conference on Advances in Biomaterials and Tissue Engineering, 14-19 Juin 1998, Capri Italy) как для поперечносшитой гиалуроновой кислоты по изобретению (с различными степенями поперечного сшивания), так и для соответствующих сульфатных эфиров; это свойство полностью отсутствует у естественной гиалуроновой кислоты и эфирных производных.

До настоящего времени не известны полимерные материалы для медицинского применения, явно разделяющие это свойство.

Подробное описание изобретения

Изобретение касается новых поперечносшитых гиалуроновых кислот, получаемых взаимодействием активированных карбоксильных групп естественной линейной гиалуроновой кислоты, полученной экстракцией или биосинтетическим путем, с полиамином, в частности, линейным алкилдиамином.

По предпочтительному воплощению поперечносшитая гиалуроновая кислота по изобретению дополнительно подвергается сульфатированию или гемисукцинилированию. Полученные продукты и их соли или комплексы обладают полностью новыми свойствами (например, набуханием, подвижностью внутри геля; хемотактической активностью на эндотелиальных клетках, вязкоупругими свойствами).

Указанную этерификацию проводят известными способами (использование реагентов пиридина/SО₃, хлорсульфоновой кислоты, янтарного ангидрида в гомогенной или гетерогенной фазе при рН от 6,5 до 8).

Примеры гемисукцинилирования коллагена сообщаются в WO 88/10123 и в патенте США 4493829.

Полиамином, используемым в качестве поперечносшивающего агента по изобретению, предпочтительно является диамин формулы R₁NH-A-NHR₂, где А является С₂-С₁₀ линейной или разветвленной алкиленовой цепью, предпочтительно С₂-С₆ цепью, необязательно замещенной гидроксильной, карбоксильной, галогеном, алкоксильной или аминогруппами; полиоксиалкиленовой цепью [(CH₂)_n-O-(CH₂)_n]_m, где n равно 2 или 3, m равно целому числу от 2 до 10; C₅-C₇ циклоалкильной, арильной или гетарильной группой, предпочтительно 1,4- или 1,3-двузамещенным бензолом; R₁ и R₂, которые являются одинаковыми или различными, представляют водород, C₁-C₆ алкильную, фенильную или бензильную группы.

Предпочтительными значениями А являются С₂-С₆ алкилен или цепь [(CH₂)_n-O-(CH₂)_n]_m, R₁ и R₂ предпочтительно представляют водород.

Полиамин взаимодействует с гиалуроновой кислотой или ее солями, карбоксильные группы которой предварительно активированы.

Активирование можно проводить обычными способами, например, и предпочтительно таковыми, обычно используемыми в безводном апротонном растворителе для образования амидных связей в синтезе пептидов, таких как карбонилдиимидазол, карбонилтриазол, гидроксибензотриазол, N-гидроксисукцинимид, п-нитрофенол + п-нитрофенилтрифторацетат, хлорметилпиридилий йодид, предпочтительно хлорметилпиридилий йодид, и тому подобное; эти активаторы позволяют получить наилучшие выходы и наиболее высокую воспроизводимость в плане степени поперечного сшивания.

Гиалуроновую кислоту предварительно подвергают образованию соли с липофильным катионом, например, тетралкиламмонием или другими липофильными органическими основаниями, способными индуцировать пригодную растворимость в полярном апротонном растворителе, таком как диметилформамид, тетрагидрофуран или тому подобное.

Превращение неорганических солей, таких как соли натрия, в пригодные органические липофильные катионы, можно проводить известными ионообменными способами в гомогенной фазе или осаждением кислотного компонента с последующим выделением последнего и образованием соли с желаемым органическим основанием.

Реакцию активирования карбоксильных групп проводят в гомогенной фазе и в безводном полярном апротонном растворителе.

Поперечносшивающий полиамин добавляют к раствору активированного эфира в том же безводном растворителе, поддерживая температуру от 0°С до 30°С. Время реакции находится в пределах от 1 до 12 ч, в зависимости от присутствия пригодных оснований, таких как триэтиламин.

В основном желаемый конечный продукт выделяют добавлением другого растворителя при пониженном давлении с последующей обработкой.

Степень поперечного сшивания может находиться в широких пределах и может регулироваться изменением количества агента, активирующего карбоксильные группы, поскольку реакции активирования и поперечного сшивания являются практически количественными.

В результате желаемая степень поперечного сшивания (CLD: процент карбоксильных групп, участвующих в поперечном сшивании) является полностью воспроизводимой, что показано данными ЯМР. Следовательно, конечные продукты, полученные в одинаковых рабочих условиях, имеют постоянные характеристики.

Исходной гиалуроновой кислотой может быть любая гиалуроновая кислота, имеющая молекулярную массу примерно от 5000 до 8000000 D, предпочтительно от 10000 до 200000 D, экстрагированная из обычных источников или полученная ферментацией микроорганизмов группы Streptococcus или других сконструированных штаммов.

Поперечносшитую гиалуроновую кислоту по изобретению можно подвергнуть сульфатированию с пригодным реагентом, предпочтительно комплексом пиридина/трехокиси серы в диметилформамиде.

Реакцию проводят в гетерогенной фазе при температуре 0-10°С в течение времени реакции примерно от 0,5 до примерно 6 ч.

Получаемая степень сульфатирования может находиться в широких пределах и может регулироваться временем реакции и температурой.

В общем, степень сульфатирования (определенная в виде экв. сульфатных групп/г) может находиться в пределах от 1×10^-6до 6×10^-6, предпочтительно примерно 2×10^-6 экв/г при CLD=0,5.

Поперечносшитую гиалуроновую кислоту по изобретению можно также подвергнуть реакциям гемисукцинилирования в известных условиях (водная гетерогенная фаза, при энергичном перемешивании, добавление твердого янтарного ангидрида в соответствующих пропорциях, в соотношении от 1:1 до 1:5 по массе; поддерживание рН от 7 до 8,5 щелочью, при температуре в пределах от 5 до 30°С). Степень гемисукцинилирования может находиться в широких пределах, в зависимости от следующих параметров: времени реакции и температуры, скорости перемешивания полифазной системы и скорости добавления твердого янтарного ангидрида. Поддерживая указанные параметры постоянными, реакция дает воспроизводимые продукты. Поперечносшитые гиалуроновые кислоты, необязательно сульфатированные или гемисукцинилированные, по изобретению показывают способность к образованию комплексов с ионами металлов, такими как медь, цинк, железо.

Эти комплексы можно легко получить растворением или диспергированием до полного набухания производного гиалуроновой кислоты в воде и добавлением при перемешивании при комнатной температуре концентрированного раствора органической или неорганической соли меди, цинка или железа, например, CuCl₂, ZnCl₂ или Fе₂(SO₄)₃; через 12-24 ч при перемешивании комплекс выделяют центрифугированием или осаждением после смены растворителя (например, при добавлении этанола или ацетона) или выпариванием при пониженном давлении; выделенный сырой продукт тщательно промывают дистиллированной водой для удаления избыточных ионов.

Комплексы сушат вымораживанием.

Содержание ионов металлов зависит от используемых рабочих условий: молярных соотношений полимера к ионам, концентрации и рН раствора, времени реакции и особенно степени поперечного сшивания. Оно может достичь максимальной полноты 1 ион металла на дисахаридную единицу, не участвующую в поперечном сшивании.

Важное преимущество изобретения состоит в возможности получения при соответствующем изменении степени поперечного сшивания и/или степени сульфатирования или сукцинилирования производных гиалуроновой кислоты в широком ряду различных форм, отличающихся различными свойствами (такими, как вязкоупругость, ионы металлов, способность к образованию гелей, пленок, тампонов, механическая прочность и т.д.).

Это позволяет использовать производные гиалуроновой кислоты по изобретению в различных медицинских и фармацевтических областях, в области гуманной и ветеринарной медицины:

1) в качестве межсуставных заменителей синовиальной жидкости при лечении остеоартритных состояний;

2) в качестве заменителей жидкой части стекловидного тела при лечении патологий и побочных эффектов, связанных с офтальмологической операцией;

3) в качестве основы композиции искусственных слез, пригодной для лечения сухости глаза;

4) в качестве матриц для контролируемого высвобождения лекарственных препаратов (например, противовоспалительных препаратов, антибиотиков, агонистов и антагонистов β-адренергических рецепторов, ингибиторов альдозаредуктазы, противоугревых, антиаллергических препаратов, средств против алопеции, антинеопластических, противоглаукомных препаратов, средств против зуда, антипсориазных, антисеборрейных, противоязвенных, антивирусных препаратов, факторов роста и т.д.) простым включением в гели, полученные из соединений по изобретению. Альтернативно включению лекарственный препарат может быть окружен ковалентными связями с матрицами из гиалуроновой кислоты посредством:

a) этерификации или амидирования СООН, не участвующих в поперечном сшивании полиаминами, когда лекарственный препарат является спиртом или амином;

b) этерификации свободных гидроксильных групп производных гиалуроновой кислоты, когда лекарственный препарат имеет свободные карбоксильные группы.

Продукты по п. а) можно получить, используя тот же способ активирования карбоксильных групп, описанный выше, в тщательно обезвоженной среде, или трансэтерификацией;

5) для получения устройства для заживления ран или язв на коже в виде пленок различной толщины, более или менее проницаемых для газов, тампонов и т.д. Указанные устройства предпочтительно содержат пригодные препараты, такие как антибиотики, факторы заживления. Они также пригодны в культуре эпителиальных клеток, кератиноцитов и т.д.;

6) для всех применений, для которых уже предложено применение известных гиалуроновых кислот, например для получения твердых или полутвердых форм или отлитой формы для производства протеза сосудов (противосклеивающих покрытий кровеносных сосудов, искусственных сердечных клапанов и т.д.); биогибридных органов (искусственной поджелудочной железы, печени); офтальмологических продуктов (заменители хрусталика, контактных линз); отиатрических продуктов; в большинстве противосклеивающих имплантатов для использования в брюшной, гинекологической, пластической, ортопедической, нейрологической, офтальмологической, грудной, оториноларингологической хирургии; медицинских устройств, таких как расширители, катетеры, канюли и тому подобное.

Известны и описаны применения поперечносшитой гиалуроновой кислоты и биоматериалов, полученных из нее, например, в WO 97/39788, WO 97/22629, WO 97/18244, WO 97/7833, ЕР 763754, ЕР 718312, WO 96/40005, WO 96/33751, патенте США 5532221, WO 95/1165 и ЕР 320164.

Применение поперечносшитых гиалуроновых кислот по изобретению в косметической дерматологии представляет особый интерес, например, в качестве увлажняющих агентов, основ для различных косметологических композиций, инъекционных наполнителей и т.д.

Относящиеся продукты, полученные из производных поперечносшитой гиалуроновой кислоты по изобретению, можно подвергнуть стерилизации (например, нагреванием до 120°С или с помощью окиси этилена) без изменения технологических свойств, что, конечно, является дополнительным преимуществом, обеспечиваемым настоящим изобретением.

Настоящее изобретение описывается более детально в следующих примерах.

Пример 1

Натриевую соль гиалуроновой кислоты (1×10^-3 моль по отношению к дисахаридной единице) превращают в соль ТВА одним из следующих способов:

a) 1% водный раствор гиалуроната натрия переводят в Н⁺-форму с помощью сильной Н⁺-катионообменной смолы (Amberlite IR 120); конечный раствор обработали 0,5% раствором ТВА-ОН до рН примерно 9.

b) 1% водный раствор гиалуроната натрия переводят в соль ТВА обработкой слабой катионной смолой в ТВА⁺-форме (Amberlite IRC 50).

В обоих случаях конечные растворы лиофилизуют. Затем соль ТВА растворяют в 15 мл безводного ДМФА в атмосфере N₂, и при 0°С к хранившемуся раствору соли ТВА добавляют по каплям 0,02 г хлорметилпиридилия йодида (CMPJ) в 2 мл безводного ДМФА.

Затем к реакционной смеси добавляют 0,1 мл триэтиламина и затем добавляют по каплям раствор 1,3-диаминопропана (d=0,88 в большом избытке так, чтобы легче провести поперечное сшивание активированных карбоксильных групп) в 2 мл безводного ДМФА. Когда добавление закончено, реакционную смесь перемешивают по меньшей мере в течение 30 мин и растворитель удаляют при пониженном давлении, остаток переводят в ДМФА, который затем удаляют отгонкой; остаток обрабатывают этанолом, этанолом-водой и в конце водой.

Затем продукт лиофилизуют и остаток подвергают анализу.

ИК (пленка): 1630 см^-1 (-CO-NH-); 1740 см^-1 (-COОН, полисахарид); 3200 см^-1 (-NH-).

3D (степень набухания в воде и при комнатной температуре через 15 мин; гравиметрическое определение; высчитано по

где W_s = масса гидратированного геля; W_d = масса сухого геля): 31,000.

Степень поперечного сшивания: 0,05 (5% первоначально имеющихся карбоксильных групп).

Пример 2

Поперечносшитую гиалуроновую кислоту, имеющую степень поперечного сшивания 0,05, получают способом и в условиях, описанных в примере 1, используя ту же НУ и тот же активирующий агент, но вместо 1,3-диаминопропана 1,6-диаминогексан.

Пример 3.

Гиалуроновую кислоту, имеющую степень поперечного сшивания 0,05, получают способом и в условиях, использованных в примере 1, используя в качестве поперечносшивающего агента 0,0’-бис-(2-аминопропил) ПЭГ 500.

SD: 31,000.

Пример 4.

0,6 г соли гиалуроновой кислоты и трибутиламмония (1×10^-3моль, по отношению к дисахаридной единице) растворяют при перемешивании в 30 мл ДМФА в атмосфере азота. К перемешиваемому раствору добавляют по каплям 0,08 г хлорметилпиридилия йодида (3,5×10^-4 моль), растворенного в 2 мл ДМФА, поддерживая при 0°С. Следовательно, молярное соотношение равняется примерно 3:1.

Через 20 мин добавляют 2 мл 1,3-диаминопропана (0,024 моль), затем сразу же 0,5 мл триэтиламина. Получают твердый желатинообразный продукт, затем продукту дают набухнуть в воде и вновь промывают этанолом.

Конечный продукт после лиофилизации показывает под сканирующим микроскопом неоднородный образец с гладкими зонами, чередующимися с пористыми зонами.

Степень поперечного сшивания составляет 0,3 (30% от первоначально имеющихся карбоксильных групп).

ИК (пленка): 1740 см^-1 (-COОН); 1630 см^-1 (-CO-NH-); 1610 см^-1 (-COO-); 1560 см^-1 (-CO-NH-).

Пример 5

0,6 г соли гиалуроновой кислоты и трибутиламмония (HY ТВА) (1×10^-3 моль, по отношению к дисахаридной единице) растворяют при перемешивании в 30 мл ДМФА в атмосфере азота. 0,15 г хлорметилпиридилия йодида (CMPJ) (6×10^-6 моль), растворенного в 2 мл ДМФА, добавляют по каплям к раствору, поддерживая при 0°С. Молярное соотношение составляет 2HY·TBA:1 CMPJ. Через 20 мин к раствору добавляют 2 мл 1,3-диаминопропана (0,024 моль).

Затем добавляют 0,5 мл триэтиламина.

Получают твердый желеобразный продукт и его тщательно промывают ДМФА.

После отгонки ДМФА продукту дают набухнуть в воде и промывают этанолом перед лиофилизацией.

Полученный продукт имеет степень поперечного сшивания 0,5 и он показывает под сканирующим микроскопом зернистый внешний вид с крупными отверстиями в промежутках. При большем увеличении две морфологические картины одинаковы и показывают наличие выпячиваний округлой формы диаметром несколько микрон.

ИК (пленка): 1740 см^-1 (-COОН); 1630 см^-1 (-CO-NH-); 1610 см^-1 (-COО-); 1560 см^-1 (-CO-NH-).

Гели подвергают набуханию в PBS и оценивают максимальную способность к набуханию.

SD = 23,500.

ЯМР = (13 С; ppm): 29,3 и 39,3 (связь -

-

-пропандиамин);

Реологические свойства, оцененные на реометре Bohlin VOR при температуре 23±0,1°С, показывают, что динамический модуль упругости G’ (100 Па при 10 Гц), одинаковый при двух рассматриваемых концентрациях (10 и 20 мг/мл), всегда выше, чем динамический коэффициент вязкости (G” 40 Па для 20 мг при 10 Гц и 20 Па для 10 мл при 10 Гц).

Примеры 6-9

Способами, раскрытыми в предыдущих примерах, получают поперечносшитые производные гиалуроновой кислоты, имеющие характеристики, обобщенные в следующей таблице 1, начиная с 1×10^-3 моль (0,6 г) соли гиалуроновой кислоты и трибутиламмония.

Полученные производные имеют следующие характеристики:

Пример 10. Сульфатирование 50% поперечносшитой HY.

Производное, полученное в примере 8, диспергируют в 5 мл ДМФА при энергичном перемешивании в атмосфере азота.

Добавляют раствор 1 г SО₃/пиридина в моль ДМФА при 0°С и перемешивают в течение 3 ч. Реакцию гасят добавлением избытка Н₂O (50 мл) и рН доводят до 9 0,1М NaOH.

Продукт тщательно промывают этанолом и Н₂О и затем лиофилизуют.

ИК-спектр показывает в дополнение к полосам исходного продукта пик при 1260 см^-1 и более сильную полосу при 1025 см^-1.

Гель набух в PBS с SD=33,000. 13С-ЯМР высокого разрешения показывает сигналы в Н₂O при 37°С, приведенные в таблице 2. Интенсивность ЯМР-сигналов при 29,3 и 38,8 ppm (-СН₂-) и сигнала при 172,5 ppm (CONH) подтверждает степень поперечного сшивания, равную примерно 50%.

Реологические свойства характеризуются динамическими модулями упругости G’ (2500 Па с 20 мг и 1000 Па с 10 мг при 10 Гц), которые всегда выше, чем динамические коэффициенты вязкости G” (600 Па с 20 мг и 150 Па с 10 мг при 10 Гц) и значительно выше, чем соответствующие значения, полученные с несульфатированной НУ (13 при 50% - пример 5). Это соединение имеет время свертывания (ТТ) выше (61±5 сек), чем в контроле (14,0 сек) и соответствующего соединения без поперечного сшивания (14,6 сек).

Соединение является также активным в тесте PRP при использовании кроликов в состоянии стресса.

Пример 11

Используя ту же методологию, синтезируют сульфатированные производные 50% поперечносшитых продуктов из примеров 1, 8 и 9.

Колориметрические характеристики сульфатированных производных представлены в таблице 3 наряду с продуктами, происходящими из примеров 5 и 10.

Пример 12. Получение комплексов Сu, Zn и Fe.

100 мг лиофилизованного геля из примера 5 добавляют при перемешивании и при комнатной температуре к 200 мл концентрированного раствора хлорида меди (II) в дистиллированной воде. Суспензию перемешивают в течение 24 ч и комплекс осаждают добавлением этанола. После центрифугирования остаток повторно промывают водой и этанолом для удаления избыточных ионов.

Конечный гель сине-зеленого цвета лиофилизуют и анализируют.

Тот же способ проводят, используя ZnCl₂ и FeCl₂. Анализ (ЕДАХ, полярография, титрование 0,1Н НСl, атомная адсорбция) показывают содержание меди 0,5 моль/дисахаридные единицы.

Claims

1. Поперечно-сшитые гиалуроновые кислоты, получаемые взаимодействием карбоксильных групп гиалуроновой кислоты и диамина, имеющего общую формулу

R₁-NH-A-NHR₂,

где А является С₂-С₁₀ линейной или разветвленной алкиленовой цепью, предпочтительно С₂-С₆ цепью, необязательно замещенной гидроксильной, карбоксильной, галогеном, алкоксильной и аминогруппами; полиоксиалкиленовой цепью [(СН₂)_n-O-(СН₂)_n]_m, где n равно 2 или 3, m равно целому числу 2 - 10; арильной или гетарильной группой, предпочтительно 1,4-или 1,3-двузамещенным бензолом;

R₁ и R₂, которые являются одинаковыми или различными, представляют водород, C₁-C₆ алкильную, фенильную или бензильную группы.

2. Поперечно-сшитые гиалуроновые кислоты по п.1, где А является линейным С₂-С₆ алкиленом или цепью формулы

[СН_2n-O-СН_2n]_m,

где n равно 2;

m равно целому числу 2 - 10.

3. Поперечно-сшитые гиалуроновые кислоты по одному из п.1 или 2, где гидроксильные группы сульфатированы или гемисукцинилированы.

4. Поперечно-сшитые гиалуроновые кислоты по одному из предыдущих пунктов в виде геля.

5. Поперечно-сшитые гиалуроновые кислоты по одному из предшествующих пунктов в твердой или полутвердой формах.

6. Поперечно-сшитые гиалуроновые кислоты по п.4, применяемые в качестве заменителей синовиальной жидкости, жидкой части стекловидного тела, в качестве матриц в формах с контролируемым высвобождением, в качестве заживляющих и противосклеивающих агентов.

7. Поперечно-сшитые гиалуроновые кислоты по п.5, применяемые в качестве заменителей синовиальной жидкости, жидкой части стекловидного тела, в качестве матриц в формах с контролируемым высвобождением, в качестве заживляющих и противосклеивающих агентов.

8. Поперечно-сшитые гиалуроновые кислоты по п.5, применяемые для получения протеза сосудов, биогибридных органов, заживляющих устройств, офтальмологических и отиатрических композиций, протеза, имплантатов и медицинских устройств.

9. Комплексы цинка, меди или железа соединений по пп.1-5.

10. Комплексы поперечно-сшитых гиалуроновых кислот по п.9, применяемые в качестве заменителей синовиальной жидкости, жидкой части стекловидного тела, в качестве матриц в формах с контролируемым высвобождением, в качестве заживляющих и противосклеивающих агентов.

11. Биоматериалы, включающие поперечно-сшитые гиалуроновые кислоты и их комплексы по пп.1-9.