RU2225722C1 - Method for preparing human interferon - Google Patents

Abstract

FIELD: biotechnology. SUBSTANCE: invention relates to methods for preparing and purification of genetic-engineering preparations of human interferon. Method involves culturing cells of microorganism Pseudomonas putida, cells lysis with their simultaneous disruption, treatment of cells with polyethyleneimine, separation of nucleic acids, proteins desalting with ammonium sulfate, three-stage chromatography on cation-exchange hydrophobic sorbent Solosa KG, anion-exchange resin Spherocell-QAE and hydrophobic sorbent Spherocell LP-M followed by concentrating by methods of ultrafiltration and gel-filtration on Sephadex G-100. The proposed purification schedule provides enhancing the yield of interferon up to 30%. EFFECT: improved preparing method, enhanced yield of interferon. 1 ex

Description

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к способам получения и очистки генно-инженерных препаратов интерферона человека.The invention relates to the field of biotechnology, and in particular to methods for producing and purifying genetically engineered human interferon preparations.

Известны способы получения человеческого интерферона из лейкоцитов донорской крови человека, индуцированных вирусами, двуцепочечными РНК и другими индукторами (авт. св. и пат. СССР №297296, 1970; №1366064, 1983, №1713591, 1986 - кл. С 12 N 15/00; пат. РФ №№1364343, 1984; 1709615, 1990; 2066188, 1993 - кл. C 12 N 15/00).Known methods for producing human interferon from leukocytes of human donor blood induced by viruses, double-stranded RNA and other inducers (ed. St. and Pat. USSR USSR No. 297296, 1970; No. 1366064, 1983, No. 1713591, 1986 - class C 12 N 15 / 00; Pat. Of the Russian Federation No. 1364343, 1984; 1709615, 1990; 2066188, 1993 - class C 12 N 15/00).

Недостатками этих способов являются, как правило, низкий выход продукта, невозможность масштабирования этого процесса, вероятность контаминации конечного продукта вирусами человека, такими, как вирусы гепатитов, иммунодефицита и др.The disadvantages of these methods are, as a rule, the low yield of the product, the inability to scale this process, the likelihood of contamination of the final product by human viruses, such as hepatitis viruses, immunodeficiency viruses, etc.

Более перспективным признан способ получения интерферона микробиологическим синтезом, который обеспечивает возможность получения целевого продукта со значительно более высоким выходом из сравнительно недорогого исходного сырья. Используемые при этом подходы позволяют создать оптимальные для бактериальной экспрессии варианты структурного гена, а также регуляторных элементов, контролирующих его экспрессию.More promising is the method for producing interferon by microbiological synthesis, which makes it possible to obtain the target product with a significantly higher yield from a relatively inexpensive starting material. The approaches used in this process allow creating variants of the structural gene that are optimal for bacterial expression, as well as regulatory elements that control its expression.

В настоящее время в качестве исходных микроорганизмов используют в основном различные искусственно сконструированные штаммы Р. pastoris, Ps. putida и Е. coli.Currently, various artificially constructed strains of P. pastoris, Ps are mainly used as initial microorganisms. putida and E. coli.

Наиболее распространены процесс на основе Ps. putida и Е. coli, т.к. при использовании штаммов Р.Pastoris (J.N.Garcia, J.A.Aguiar et. al. High level expression of human IFN-2b in Pichia pastoris. Biotecnologia Aplicada. 12(3), р.152-155, 1995), отмечается низкий уровень выхода целевого продукта на грамм биомассы.The most common process based on Ps. putida and E. coli, because when using strains of P. Pastoris (JNGarcia, JAAguiar et. al. High level expression of human IFN-2b in Pichia pastoris. Biotecnologia Aplicada. 12 (3), p. 152-155, 1995), a low yield of the target product per gram of biomass.

При использовании технологии получения интерферона на основе штаммов Е. coli: (пат. УР №13380, 1997, C 12 N 15/21, Кравченко В.В. и др. Биоорганическая химия. 1987, т.13, №9, с.1186-1193) отмечается нестабильность выхода и недостаточный уровень экспрессии интерферона.When using the technology for producing interferon based on E. coli strains: (US Pat. UR No. 13380, 1997, C 12 N 15/21, Kravchenko VV et al. Bioorganic Chemistry. 1987, v.13, No. 9, p. 1186-1193), output instability and insufficient expression of interferon are noted.

Использование штаммов Ps. putida более перспективно, т.к. позволяет получить достаточно высокий выход интерферона, однако для них характерна сложность выделения конечного продукта, что приводит к большой трудоемкости процесса и высокой себестоимости конечного продукта.The use of strains of Ps. putida is more promising because allows you to get a fairly high yield of interferon, however, they are characterized by the difficulty of isolating the final product, which leads to the high complexity of the process and the high cost of the final product.

В частности, известен способ получения интерферона на основе биомассы бактериального продуцента Pseudomonas putida 84, содержащего рекомбинантную плазмиду p VG-3, включающий в себя разрушение бактериальных клеток в лизатном буфере при рН 6,7-8,2 и температуре 3-5°С, удаление нуклеиновых кислот обработкой лизата полиэтиленимином с последующим осаждением белков серно-кислым аммонием и очисткой конечного продукта последовательно гидрофобной на фенилсилохроме С-80 и иммуноаффинной хроматографией с использованием моноклональных антител 5А6.In particular, there is a known method for producing interferon based on the biomass of the bacterial producer Pseudomonas putida 84, containing recombinant plasmid p VG-3, including the destruction of bacterial cells in lysate buffer at a pH of 6.7-8.2 and a temperature of 3-5 ° C, nucleic acid removal by treatment of the lysate with polyethyleneimine followed by precipitation of proteins with ammonium sulfate and purification of the final product sequentially hydrophobic on C-80 phenylsilochrome and immunoaffinity chromatography using 5A6 monoclonal antibodies.

Недостатком способа является невозможность его осуществления в промышленных масштабах в связи с высокой себестоимостью и нестабильностью иммуноаффинных сорбентов.The disadvantage of this method is the impossibility of its implementation on an industrial scale in connection with the high cost and instability of immunoaffinity sorbents.

Наиболее близким к заявляемому решению по технической сущности является усовершенствованный способ получения интерферона из биомассы бактериального продуцента Pseudomonas putida 84, который включает в себя лизис бактериальных клеток, удаление нуклеиновых кислот обработкой лизата полиэтиленимином, с последующим осаждением белков сернокислым аммонием, фракционированием нерастворимых белков гидрофобной хроматографией на фенилсилохроме С-80, рН-фракционирование белков ортофосфорной кислотой, концентрирование и диафильтрация раствора белков, хроматографию на анионите-целлюлозе DE-52 с использованием для элюирования 0,04-0.06 М ацетатного буфера при рН 4,8-5,2, а затем на катионите - целлюлозе СМ-52 с элюированием линейным градиентом 0,1 М ацетатного буфера и 0,1 М ацетатного буфера с 0,3-0,5 М хлористого натрия при рН 4,8-5,2, концентрирование лизата с помощью фильтров типа PTGC с пределом 1000 дальтон и гель-фильтрацией на сефадексе G-100, уравновешенном 0,05-0,15 М фосфатным буфером с 0,15-0,25 М натрия хлористого при рН 7,15-7,25. (Пат. СССР №1640996, 1989, кл. C 12 N 15/00).Closest to the claimed solution in technical essence is an improved method for producing interferon from the biomass of the bacterial producer Pseudomonas putida 84, which includes lysis of bacterial cells, removal of nucleic acids by treatment of the lysate with polyethyleneimine, followed by precipitation of proteins with ammonium sulfate, fractionation of insoluble proteins by hydrophobic chromatography on phenyl C-80, pH-fractionation of proteins with phosphoric acid, concentration and diafiltration of a protein solution, chromatography on DE-52 cellulose anion exchange resin using 0.04-0.06 M acetate buffer for elution at pH 4.8-5.2, and then on CM-52 cellulose cation exchange resin eluting with a linear gradient of 0.1 M acetate buffer and 0.1 M acetate buffer with 0.3-0.5 M sodium chloride at pH 4.8-5.2, concentration of the lysate using PTGC filters with a limit of 1000 daltons and gel filtration on Sephadex G-100, balanced 0 05-0.15 M phosphate buffer with 0.15-0.25 M sodium chloride at pH 7.15-7.25. (Pat. USSR No. 1640996, 1989, class C 12 N 15/00).

Недостатком способа является низкий выход интерферона (12-13%) за счет больших потерь целевого продукта на стадии очистки.The disadvantage of this method is the low yield of interferon (12-13%) due to the large losses of the target product at the stage of purification.

Задачей, стоявшей перед авторами, являлось создание более селективной системы очистки интерферона.The challenge facing the authors was to create a more selective interferon purification system.

Указанная задача решалась путем того, что лизис клеток осуществляют одновременно с их баллистической дезинтеграцией, а хроматографию проводят на катионгидрофобном сорбенте Солоза КГ при рН 7,0-7,2 с элюцией интерферона 0,05 М раствором трис-буферного раствора с рН 10,1- 10,3; очистку на второй стадии хроматографии проводят на анионите Сфероцелл-QAE с промывкой колонки 0.05М трис-ацетатным буферным раствором при рН 8,0 и отмывкой примесных белков 0,05М трис-ацетатным буферным раствором с добавлением 0,05 М NaCI, осуществляя элюцию интерферона 0,1 М натрий-ацетатным буферным раствором при рН 5,0. а на третьей стадии хроматографии очистку проводят на гидрофобном сорбенте - Сфероцелл ЛП-М с элюированием интерферона линейным градиентом концентрации хлористого натрия.This problem was solved by the fact that the lysis of cells is carried out simultaneously with their ballistic disintegration, and chromatography is performed on a cation-hydrophobic sorbent of Solosa KG at pH 7.0-7.2 with elution of interferon with a 0.05 M solution of Tris-buffer solution with pH 10.1 - 10.3; purification in the second stage of chromatography is carried out on Spherocell-QAE anion exchange resin with column washing with 0.05 M Tris-acetate buffer solution at pH 8.0 and washing of impurity proteins with 0.05 M Tris-acetate buffer solution with addition of 0.05 M NaCI, eluting interferon 0 , 1 M sodium acetate buffer solution at pH 5.0. and in the third stage of chromatography, purification is carried out on a hydrophobic sorbent - Spherocell LP-M with elution of interferon with a linear gradient of sodium chloride concentration.

Оптимально проводить на третьей стадии хроматографии промывку колонки 0.05 М натрий-ацетатным буферным раствором при рН 5,0. Однако возможно применение и иных буферных растворов с рН около 5,0, например 0,05 М натрий-фосфатного буферного раствора или 0,05 М аммоний-цитратного буферного раствора.It is optimal to carry out column washing with a 0.05 M sodium acetate buffer solution at pH 5.0 at the third stage of chromatography. However, it is possible to use other buffer solutions with a pH of about 5.0, for example, 0.05 M sodium phosphate buffer solution or 0.05 M ammonium citrate buffer solution.

Для хроматографии использовались разработанные в ГосНИИ ОЧБ следующие промышленные сорбенты: Солоза КГ - сополимер метакриловой кислоты, ее бутилового эфира и метилен-диакриламида; Сфероцелл-QAE - целлюлоза, сшитая эпихлоргидрином и модифицированная пришивкой диэтиламиноэтильных функциональных групп; Сфероцелл-ЛП-М - макропористая целлюлоза, модифицированная оксиглицидиловым эфиром.For chromatography, the following industrial sorbents developed at GosNII OCHB were used: Solosa KG - a copolymer of methacrylic acid, its butyl ether and methylene diacrylamide; Spherocell-QAE - cellulose crosslinked by epichlorohydrin and modified by sewing on diethylaminoethyl functional groups; Spherocell-LP-M is a macroporous cellulose modified with oxyglycidyl ether.

В результате совмещения лизиса и дезинтеграции клеток удается добиться не только более полного выхода интерферона из клеток, но одновременно исключить его связь с остатками клеточных стенок и ряда иных примесей, что позволило в результате на первой стадии хроматографии использовать более эффективный катионгидрофобный сорбент, что в свою очередь обеспечило повышенную очистку интерферона от примесных белков и оптимизировало протекание последующих стадий очистки интерферона, в частности возможность использования на третьей стадии гидрофобный сорбент и более высокий выход последнего в ходе процесса получения.As a result of combining the lysis and disintegration of cells, it is possible to achieve not only a more complete exit of interferon from the cells, but at the same time to eliminate its connection with the remnants of the cell walls and a number of other impurities, which allowed the use of a more efficient cation-hydrophobic sorbent in the first stage of chromatography, which, in turn, provided increased purification of interferon from impurity proteins and optimized the course of subsequent stages of purification of interferon, in particular, the possibility of using a guide at the third stage Anrophobic sorbent and a higher yield of the latter during the production process.

Сущность патентуемого процесса иллюстрируется следующим примером.The essence of the patented process is illustrated by the following example.

1. Пример. 600 г биомассы клеток Pseudomonas putida 84,содержавших рекомбинантную плазмиду p VG-3, после культивирования содержали 130 мг альфа-2 интерферона. Клетки загружали в емкость баллистического дезинтегратора с механической мешалкой вместимостью 5,0 л и приливали к ней 3,0 л лизисного буфера, содержащего 1,2% хлористого натрия, 1,2% трис-(гидроксиметил)-аминометана, 10% сахарозы, 0,15% этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА), 0,02% фенилметилсульфонилфторида и 0,01% дитиотреитола при рН 7,7. Биомассу перемешивали до получения однородной суспензии в течение 30 мин, затем дезинтегрировали в циркуляционном режиме в баллистическом дезинтеграторе в соответствии с инструкцией по эксплуатации. Время дезинтеграции составляло 1,5 ч. Процесс дезинтеграции заканчивали, когда при микроскопировании препарата в нескольких полях зрения микроскопа практически не наблюдается целых клеток микроорганизмов. Объем суспензии лизированной биомассы составил 3,5 л.1. An example. 600 g of the biomass of Pseudomonas putida 84 cells containing recombinant plasmid p VG-3, after cultivation, contained 130 mg of alpha-2 interferon. Cells were loaded into a capacity of a ballistic disintegrator with a mechanical stirrer with a capacity of 5.0 l and poured into it 3.0 l of lysis buffer containing 1.2% sodium chloride, 1.2% tris- (hydroxymethyl) aminomethane, 10% sucrose, 0 , 15% ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), 0.02% phenylmethylsulfonyl fluoride and 0.01% dithiothreitol at pH 7.7. The biomass was mixed until a homogeneous suspension was obtained for 30 minutes, then it was disintegrated in a circulating mode in a ballistic disintegrator in accordance with the operating instructions. The disintegration time was 1.5 hours. The disintegration process was completed when, upon microscopic examination of the drug, several whole microorganism cells were practically not observed in several fields of view of the microscope. The suspension volume of lysed biomass was 3.5 liters.

Полученный на данной стадии лизат затем поступал на стадию осаждения нуклеиновых кислот. Для этого в емкость, содержащую лизат при перемешивании со скоростью 1-1,2 л/ч подавали 180 мл 5% раствора полиэтиленимина. Суспензию перемешивали в течение 1 ч и центрифугировали для отделения осадка нуклеиновых кислот 1 ч при (9500±500) об/мин, при температуре (5±2)°С. После центрифугирования отделяли супернатант, объем которого составлял 3,0 л.The lysate obtained in this step was then transferred to the nucleic acid precipitation step. To do this, 180 ml of a 5% solution of polyethyleneimine were fed into a container containing a lysate with stirring at a speed of 1-1.2 l / h. The suspension was stirred for 1 h and centrifuged to separate the nucleic acid precipitate for 1 h at (9500 ± 500) rpm, at a temperature of (5 ± 2) ° С. After centrifugation, the supernatant was separated, the volume of which was 3.0 L.

При медленном перемешивании мешалкой в супернатант всыпали 182 г сухого сульфата аммония малыми порциями (каждую следующую порцию добавляли после полного растворения предыдущей). После окончания внесения сульфата аммония перемешивание продолжали до полного растворения соли и суспензию осадка белков выдерживали при температуре (5±2)°С 16 ч, а затем центрифугировали в течение 1 ч при (13500±500) об/мин при температуре (5±2)°С.While slowly stirring with a stirrer, 182 g of dry ammonium sulfate was poured into the supernatant in small portions (each subsequent portion was added after complete dissolution of the previous one). After the introduction of ammonium sulfate was completed, stirring was continued until the salt was completely dissolved and the protein precipitate suspension was kept at a temperature of (5 ± 2) ° С for 16 hours, and then centrifuged for 1 hour at (13500 ± 500) rpm at a temperature of (5 ± 2 ) ° C.

Полученный осадок растворяли в дистиллированной воде, доводя общий объем до 4 л. Для осаждения сопутствующих белков проводили кислотное фракционирование полученного раствора, содержащего альфа-2 интерферон. Для этого в раствор добавляли 5,0 мл 50%-ной уксусной кислоты до рН 4,75. Полученную смесь переносили в холодильник и оставляли при температуре (5±2)°С в течение 3 ч, затем центрифугировали суспензию белков при (13500±500) об/мин 30 мин при (5±2)°С.The resulting precipitate was dissolved in distilled water, bringing the total volume to 4 L. To precipitate the accompanying proteins, acid fractionation of the resulting solution containing interferon alpha-2 was carried out. For this, 5.0 ml of 50% acetic acid was added to the solution to a pH of 4.75. The resulting mixture was transferred to a refrigerator and left at a temperature of (5 ± 2) ° С for 3 h, then a protein suspension was centrifuged at (13500 ± 500) rpm for 30 min at (5 ± 2) ° С.

К 4 л супернатанта добавляли 50,0 мл 1 М раствора Триса до рН (6,9±0,1). Концентрация общего белка, определенная методом Лоури, составляла 9,0 мг/мл, биологическая активность альфа-2 интерферона (6,8±0,5)×10⁶ МЕ/мл. Удельная активность 8,5×10⁵ МЕ/мг. Общее содержание альфа-2 интерферона на данной стадии 2,9×10¹⁰ ME.To 4 L of supernatant was added 50.0 ml of a 1 M Tris solution to pH (6.9 ± 0.1). The concentration of total protein determined by the Lowry method was 9.0 mg / ml, the biological activity of alpha-2 interferon (6.8 ± 0.5) × 10 ⁶ IU / ml. The specific activity of 8.5 × 10 ⁵ IU / mg. The total alpha-2 interferon content at this stage is 2.9 × 10 ¹⁰ ME.

Сорбент Солоза КГ в количестве 0,6 л в виде водной взвеси помещали в хроматографическую колонку. Затем с помощью перистальтического насоса через сорбент последовательно пропускали 2,0 л 0,2 М раствора гидроокиси натрия, 6,0 л дистиллированной воды и 4,5 л 0,05 М трис-ацетатного буферного раствора при рН (7,1±0,1), который на выходе из колонки контролировали рН-метром.Sorbent Solosa KG in the amount of 0.6 l in the form of an aqueous suspension was placed in a chromatographic column. Then, using a peristaltic pump, 2.0 L of a 0.2 M solution of sodium hydroxide, 6.0 L of distilled water and 4.5 L of a 0.05 M Tris-acetate buffer solution at pH (7.1 ± 0, 1), which at the outlet of the column was controlled by a pH meter.

Раствор белков, содержащий альфа-2 интерферон, разбавляли дистиллированной водой до проводимости (6,0+2,0) мСм/см при комнатной температуре. Объем раствора при этом составил 19,2 л.A protein solution containing alpha-2 interferon was diluted with distilled water to a conductivity of (6.0 + 2.0) mS / cm at room temperature. The volume of the solution was 19.2 liters.

Раствор наносили на колонку со скоростью 1,5 л/час, затем промывали сорбент 2,0 л трис-ацетатного буфера 0,05 М при рН 7,0. Элюцию проводили 1,2 л 0,05 М раствором Триса с рН (10,2±0,1) Содержание интерферона во фракциях, собранных с помощью коллектора фракций, определяли иммуноферментным методом.The solution was applied to the column at a rate of 1.5 l / h, then the sorbent was washed with 2.0 l of Tris-acetate buffer 0.05 M at pH 7.0. The elution was performed with 1.2 L of a 0.05 M Tris solution with a pH (10.2 ± 0.1). The interferon content in the fractions collected using the fraction collector was determined by enzyme immunoassay.

Концентрация общего белка, определенная методом Лоури, составляет (2,2±0,2) мг/мл, биологическая активность альфа-2 интерферона (2,1±0,5)×10⁷ МЕ/мл, удельная активность препарата (9,7±0,5)×10⁶ МЕ/мг. Общее содержание альфа-2 интерферона на данной стадии составляет (1,5±0,5)×10¹⁰ ME.The concentration of total protein determined by the Lowry method is (2.2 ± 0.2) mg / ml, the biological activity of alpha-2 interferon (2.1 ± 0.5) × 10 ⁷ IU / ml, the specific activity of the drug (9, 7 ± 0.5) × 10 ⁶ IU / mg. The total alpha-2 interferon content at this stage is (1.5 ± 0.5) × 10 ¹⁰ ME.

Сорбент Сфероцелл qae в количестве 0,15 л в виде водной суспензии загружали в колонку и промывали со скоростью 0,15 л/ч последовательно 0,5 л 2 М раствора хлористого натрия, 1,5 л дистиллированной воды и 1,0 л трис-ацетатного буферного раствора 0,05 М с рН 8,0, контролируя рН буферного раствора на выходе из колонки рН-метром.The sorbent Spherocell qae in an amount of 0.15 L in the form of an aqueous suspension was loaded into the column and washed at a speed of 0.15 L / h sequentially with 0.5 L of a 2 M sodium chloride solution, 1.5 L of distilled water and 1.0 L of tris- acetate buffer solution 0.05 M with pH 8.0, controlling the pH of the buffer solution at the column outlet with a pH meter.

Раствор белков объемом 0,7 л, содержащий альфа-2 интерферон наносили на колонку с сорбентом Сфероцелл-QAE объемом 0,15 л со скоростью 0,2 л/час. Промывку колонки осуществляли трис-ацетатным 0,05 М буферным раствором (рН 8,0) объемом 0,1 л, затем примесные белки отмывали 1,0 л того же буферного раствора с добавлением 0,05 М NaCI. Элюцию интерферона проводили 0,8 л 0,1 М натрий-ацетатным буферным раствором при рН 5,0. Содержание альфа-2 интерферона во фракциях, собранных с помощью коллектора определяли иммуноферментным методом. Концентрация белка составляла (0,35±0,05) мг/мл, биологическая активность альфа-2 интерферона (1,7±0,2)×10⁷ МЕ/мл. Удельная активность препарата 5,5×10⁷ МЕ/мг белка. Элюат содержал 1,20х10¹⁰ ME. Выход по биологической активности на данной стадии 82,5%.A 0.7 L protein solution containing alpha-2 interferon was applied to a 0.15 L Spherocell-QAE sorbent column at a rate of 0.2 L / hr. The column was washed with a Tris-acetate 0.05 M buffer solution (pH 8.0) with a volume of 0.1 L, then impurity proteins were washed with 1.0 L of the same buffer solution with the addition of 0.05 M NaCI. Interferon was eluted with 0.8 L of 0.1 M sodium acetate buffer at pH 5.0. The alpha-2 interferon content in the fractions collected by the collector was determined by the enzyme immunoassay. The protein concentration was (0.35 ± 0.05) mg / ml, the biological activity of alpha-2 interferon (1.7 ± 0.2) × 10 ⁷ IU / ml. The specific activity of the drug is 5.5 × 10 ⁷ IU / mg protein. The eluate contained 1.20x10 ¹⁰ ME. The yield of biological activity at this stage is 82.5%.

Полученный раствор доводили до рН (5,0±0,1) 50% уксусной кислотой и разбавляли 0,05 М натрий-ацетатным буферным раствором. Удельная электропроводность составила (0,29±0,02) мСм/см при температуре (5±2)°С. Подготовленный таким образом раствор белка наносили на колонку с сорбентом Сфероцелл ЛП-М со скоростью 0,1 л/ч, промывали 0,3 л вышеуказанного буферного раствора, а затем элюировали интерферон с помощью линейного градиента концентрации хлористого натрия, создаваемой с помощью градиентного смесителя Ультроград Элюат фракционировали с помощью коллектора фракций и измеряли концентрацию общего белка и альфа-2 интерферона. Концентрация белка в объединенных фракциях (0,45±0,02) мг/мл. Объем раствора 0,1 л. Общее содержание альфа-2 интерферона (8,6±0,2)×10⁹ ME. Удельная активность - е (7,5±0,2)×10⁷ МЕ/мг. Выход на данной стадии 73%.The resulting solution was adjusted to pH (5.0 ± 0.1) with 50% acetic acid and diluted with 0.05 M sodium acetate buffer solution. The electrical conductivity was (0.29 ± 0.02) mS / cm at a temperature of (5 ± 2) ° C. The protein solution prepared in this way was applied onto a column with the Sferocell LP-M sorbent at a rate of 0.1 L / h, washed with 0.3 L of the above buffer solution, and then interferon was eluted using a linear gradient of sodium chloride concentration created using an Ultrograd gradient mixer The eluate was fractionated using a fraction collector and the concentration of total protein and interferon alpha-2 was measured. The protein concentration in the combined fractions (0.45 ± 0.02) mg / ml The volume of the solution is 0.1 l. The total alpha-2 interferon content (8.6 ± 0.2) × 10 ⁹ ME. The specific activity is e (7.5 ± 0.2) × 10 ⁷ IU / mg. The yield at this stage is 73%.

Полученный 3 раствор объемом 0,1 л концентрировали до (5,0±0,2) мл с помощью ячейки для ультрафильтрации, используя мембрану Amicon YM-3. Подготовленный таким образом образец наносили на колонку с сорбентом Сефадекс G-100, уравновешенную фосфатно-солевым буфером со скоростью 0,025 л/ч. Объем фракций составляет 10,0 мл. Полученные после хроматографии фракции проверяли на содержание альфа-2 интерферона иммуноферментным методом и объединяя фракции, содержащие основной пик альфа-2 интерферона. Объем полученного раствора составил 30,2 мл. Концентрация общего белка, определенная методом Лоури, (0,90±0,02) мг/мл. Общее содержание альфа-2 интерферона в растворе 5,5×10⁹ ME. Удельная активность полученного препарата альфа-2 интерферона 2,3×10⁸ МЕ/мг. Выход по альфа-2 интерферону на данной стадии составляет 90,2%. Полученный продукт стерилизовали и расфасовывали. Общий выход препарата 35,8%, в том числе на стадии очистки 51%.The resulting 3-liter 0.1-liter solution was concentrated to (5.0 ± 0.2) ml using an ultrafiltration cell using an Amicon YM-3 membrane. The thus prepared sample was applied to a Sephadex G-100 column with a sorbent balanced with phosphate-buffered saline at a rate of 0.025 l / h. The volume of fractions is 10.0 ml. The fractions obtained after chromatography were checked for the content of alpha-2 interferon by enzyme immunoassay and combining fractions containing the main peak of alpha-2 interferon. The volume of the resulting solution was 30.2 ml. The concentration of total protein determined by the Lowry method, (0.90 ± 0.02) mg / ml The total content of alpha-2 interferon in a solution of 5.5 × 10 ⁹ ME. The specific activity of the resulting preparation of alpha-2 interferon 2.3 × 10 ⁸ IU / mg The yield of alpha-2 interferon at this stage is 90.2%. The resulting product was sterilized and packaged. The total yield of the drug is 35.8%, including 51% at the purification stage.

Claims (1)

Способ получения человеческого интерферона, включающий в себя культивирование клеток микроорганизмов Pseudomonas putida, лизис клеток буферным раствором, обработку клеток полиэтиленимином, отделение нуклеиновых кислот, высаливание белков серно-кислым аммонием, трехстадийную хроматографию, включающую очистку целевого продукта на гидрофобном сорбенте и анионите, концентрирование методами ультрафильтрации и гель-фильтрацию на Сефадексе G-100, отличающийся тем, что лизис клеток осуществляют одновременно с их баллистической дезинтеграцией, а на первой стадии хроматографии очистку проводят на катионгидрофобном сорбенте Солоза КГ при рН 7,0-7,2, с элюцией интерферона 0,05 М трис- буферным раствором с рН 10,1-10,3; вторую стадию хроматографии проводят на анионите Сфероцелл-QAE с промывкой колонки 0,05М трис-ацетатным буферным раствором при рН 8,0 и отмывкой примесных белков 0,05М трис-ацетатным буферным раствором, содержащим дополнительно 0,05 М NaCl, осуществляя элюцию интерферона 0,1 М натрий-ацетатным буферным раствором при рН 5,0; третью стадию хроматографии осуществляют на гидрофобном сорбенте Сфероцелл ЛП-М с элюированием интерферона линейным градиентом концентрации хлористого натрия.A method for producing human interferon, which includes culturing cells of Pseudomonas putida microorganisms, lysing cells with a buffer solution, treating cells with polyethyleneimine, separating nucleic acids, salting out proteins with ammonium sulfate, three-step chromatography, including purification of the target product on a hydrophobic sorbent and anion exchange resin, concentration using ultrafiltration methods and gel filtration on Sephadex G-100, characterized in that the lysis of the cells is carried out simultaneously with their ballistic disintegration, and ervoy step chromatography purification is carried out on a sorbent kationgidrofobnom Soloza kg at pH 7.0-7.2, eluting the interferon with 0.05 M tris buffer solution of pH 10,1-10,3; the second stage of chromatography is carried out on Spherocell-QAE anion exchange resin with column washing with a 0.05 M Tris-acetate buffer solution at pH 8.0 and washing of impurity proteins with a 0.05 M Tris-acetate buffer solution containing an additional 0.05 M NaCl, eluting interferon 0 , 1 M sodium acetate buffer solution at pH 5.0; the third stage of chromatography is carried out on a hydrophobic sorbent Spherocell LP-M with elution of interferon with a linear gradient of sodium chloride concentration.