RU2601126C2 - Method of producing biologically active peptides - Google Patents

Abstract

FIELD: biotechnology.

SUBSTANCE: invention relates to biotechnology, namely to method of producing recombinant biologically active peptide, based on peptides in mielopid. Disclosed method involves transfection of cells Escherichia coli BL21 (DE3) with plasmid DNA pET30a, carrying gene with sequence ATGGGTCGTGGCTTCTTAGGCTTTCCAACTGGCCGTGGTCTGGTGGTGTATCCATGGGGTCGTGGTCTGGTGTGCTATCCGCAAGGTCGTGGCTTCCGTCCACGCATCATGACTCCAGGCCGCGGCTTTCTGGGCTTCCCGACCACTGGTCGTCTCGTTGTGTACCCGTGGACCGGCCGCCTGGTTTGTTACCCACAGACGGGTCGCTTTCGCCCGCGTATTATGACGCCGTAA, coding recombinant protein, culturing of obtained strain with induction of protein expression by addition of IPTG, lysing including processing cells with ultrasonic disintegrator to produce supernatant, supernatant purification with Q-Sepharose and SP-Sepharose, combining fractions, containing target product.

EFFECT: proposed method can be used during production and application of medicinal substances, based on mixture of biologically active peptides.

1 cl, 5 dwg, 2 tbl, 3 ex

Description

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к способу получения биологически активных пептидов путем экспрессии in vitro в клетках, содержащих генетические конструкции, кодирующие рекомбинантные белки, состоящие из биологически активных пептидов, разделенных сайтами узнавания протеаз (рисунок 1). Биологически активные пептиды представляют собой гормоны, их биологически активные фрагменты и/или продукты протеолиза различных белков организма. Рекомбинантный белок после введения в организм способен гидролизоваться с высвобождением биологически активных пептидов. Предложенный способ позволяет оптимизировать производство и применение лекарственных субстанций на основе смеси различных биологически активных пептидов.The invention relates to the field of biotechnology, in particular, to a method for producing biologically active peptides by in vitro expression in cells containing genetic constructs encoding recombinant proteins consisting of biologically active peptides separated by protease recognition sites (Figure 1). Biologically active peptides are hormones, their biologically active fragments and / or proteolysis products of various body proteins. Recombinant protein after introduction into the body is able to hydrolyze with the release of biologically active peptides. The proposed method allows to optimize the production and use of medicinal substances based on a mixture of various biologically active peptides.

Биологически активные пептиды играют важную роль как медиаторы в огромном количестве регуляторных систем. Одна часть таких пептидов получается классическим путем экспрессии прогормонов с последующим процессингом и секрецией активного компонента - пептида во внеклеточное пространство. Биологические функции таких пептидов хорошо изучены и описаны.Biologically active peptides play an important role as mediators in a huge number of regulatory systems. One part of such peptides is obtained in the classical way by expression of prohormones with subsequent processing and secretion of the active component - the peptide into the extracellular space. The biological functions of such peptides are well understood and described.

В то же время исследования последних десятилетий выявили вторую группу биологически активных пептидов, представляющую собой продукт протеиназного гидролиза белков различных тканей. К настоящему времени хорошо установлены такие биологически активные фрагменты, происходящие из казеина, гемоглобина, основного меилинового белка, глютена, цитохрома, лактоферина, альбумина и некоторых других [A novel system of peptidergic regulation. Karelin AA1, Blishchenko EYu, Ivanov VT. FEBS Lett. 1998 May 22; 428(1-2):7-12].At the same time, studies of recent decades have revealed a second group of biologically active peptides, which is a product of proteinase hydrolysis of proteins of various tissues. To date, such biologically active fragments derived from casein, hemoglobin, basic meylin protein, gluten, cytochrome, lactoferin, albumin and some others have been well established [A novel system of peptidergic regulation. Karelin AA1, Blishchenko EYu, Ivanov VT. FEBS Lett. 1998 May 22; 428 (1-2): 7-12].

Отличительной особенностью таких пептидов является, во-первых, короткая аминокислотная последовательность (не более восьми аминокислот), во-вторых, биологический эффект проявляет смесь нескольких пептидов, выделяемых совместно из одной ткани.A distinctive feature of such peptides is, firstly, a short amino acid sequence (no more than eight amino acids), and secondly, the biological effect is manifested by a mixture of several peptides isolated together from one tissue.

Примером такой смеси пептидов может быть Миелопид, препарат широкого спектра действия. Препарат получают путем экстракции предварительно культивируемых клеток костного мозга свиньи с последующей многоступенчатой очисткой нужной фракции. Выделенная фракция изучена, и структура пептидов определена [патент РФ 2041716].An example of such a mixture of peptides may be Myelopid, a broad-spectrum drug. The drug is obtained by extraction of pre-cultured pig bone marrow cells, followed by multistage purification of the desired fraction. The isolated fraction was studied and the structure of the peptides determined [RF patent 2041716].

Представляется очевидным, что при современном уровне развития техники получение коротких пептидов из тканей и клеток животных является очень затратным и плохо воспроизводимым.It seems obvious that at the current level of technological development, obtaining short peptides from animal tissues and cells is very costly and poorly reproducible.

Современным и перспективным методом получения пептидов является использование генно-инженерных конструкций, несущих необходимы гены, кодирующие целевые пептиды.A modern and promising method for producing peptides is the use of genetic engineering constructs that carry the genes encoding the target peptides.

В патенте РФ 2507212 предлагается способ получения рекомбинантных пептидов с использованием штаммов-продуцентов E.coli. Недостатком предложенного метода является экспрессия каждого пептида отдельно. Во-первых, короткие пептиды можно экспрессировать только в составе слитного белка общей массой не менее 10 кД. При среднем весе целевого пептида менее 1 кД это резко понижает выход продукта и увеличивает его стоимость. Во-вторых, как уже отмечалось, препараты содержат несколько пептидов. Следовательно, необходимо получение нескольких отдельных штаммов-продуцентов, производящих нужное число пептидов. Это еще значительно удорожает производство. В итоге в случае реализации предложенного изобретения цена продукта будет значительно выше смеси пептидов, получаемых традиционным методом из тканей животных.In RF patent 2507212, a method for producing recombinant peptides using E. coli producer strains is provided. The disadvantage of the proposed method is the expression of each peptide separately. First, short peptides can only be expressed as part of a fusion protein with a total mass of at least 10 kD. With an average weight of the target peptide of less than 1 kD, this sharply reduces the yield of the product and increases its cost. Secondly, as already noted, the preparations contain several peptides. Therefore, it is necessary to obtain several separate producer strains producing the desired number of peptides. This still significantly increases the cost of production. As a result, in the case of the implementation of the proposed invention, the price of the product will be significantly higher than the mixture of peptides obtained by the traditional method from animal tissues.

Целью изобретения является создание общего простого воспроизводимого метода получения смеси коротких пептидов, обладающих изученной биологической активностью.The aim of the invention is the creation of a common simple reproducible method for producing a mixture of short peptides with the studied biological activity.

Получен полипептид, представляющий собой чередование коротких активных пептидов из изученной композиции, перемежающихся сайтами узнавания специфических протеаз (рисунок 1). Слитная конструкция с сайтами узнавания протеазами моделирует природную ситуацию, когда пептиды являются продуктами протеиназного гидролиза белков. Это дает возможность высвобождать активные пептиды постепенно, в количествах, достаточных для биологического эффекта без передозировки каждого компонента.A polypeptide was obtained, which is an alternation of short active peptides from the studied composition, interspersed with recognition sites of specific proteases (Figure 1). A fused design with protease recognition sites simulates a natural situation where peptides are products of proteinase hydrolysis of proteins. This makes it possible to release active peptides gradually, in amounts sufficient for a biological effect without overdosing each component.

Для получения рекомбинантного белка, обладающего биологической активностью пептидов, входящих в состав миелопида, и представленного последовательностью

, проводили трансфекцию клеток Escherichia coli BL21 (DE3) плазмидной ДНК рЕТ30а, несущей ген, представленный последовательностью

, кодирующий рекомбинантный белок, культивирование полученного штамма с индукцией экспрессии белка добавлением IPTG, лизирование, включающее обработку клеток ультразвуковым дезинтегратором с получением супернатанта, очистку супернатанта на Q-Sepharose и SP-Sepharose, объединение фракций, содержащих целевой продукт.To obtain a recombinant protein having the biological activity of the peptides that make up the myelopid, and represented by the sequence

, transfected Escherichia coli BL21 (DE3) cells with pET30a plasmid DNA carrying the gene represented by the sequence

encoding a recombinant protein, culturing the obtained strain with induction of protein expression by adding IPTG, lysing, including treatment of cells with an ultrasonic disintegrator to obtain a supernatant, purification of the supernatant on Q-Sepharose and SP-Sepharose, combining fractions containing the target product.

Техническим результатом заявленного изобретения является повышение эффективности профилактики и лечения путем повышения биологической активности рекомбинатного белка, на основе пептидов, входящих в состав миелопида, при этом биологически активные пептиды в составе рекомбинантного белка разделены сайтами узнавания протеаз, что дает возможность высвобождать активные пептиды постепенно. Кроме того, использование протяженного полипептида позволяет избегать применения чужеродного белка как компонента слитной конструкции, что повышает выход целевых пептидов. Заявленный рекомбинантный (протяженный полипептид) с представленной последовательностью и содержащий одновременно все короткие пептиды позволяет использовать в качестве источника субстанции единичный штамм-продуцент, что технологически более выгодно. Использование заявленной плазмиды обеспечивает эффективный синтез заявленного рекомбинантного белка.The technical result of the claimed invention is to increase the effectiveness of prevention and treatment by increasing the biological activity of the recombinant protein based on the peptides that make up the myelopid, while the biologically active peptides in the recombinant protein are separated by protease recognition sites, which makes it possible to release active peptides gradually. In addition, the use of an extended polypeptide avoids the use of a foreign protein as a component of a fusion construct, which increases the yield of target peptides. The claimed recombinant (extended polypeptide) with the presented sequence and containing simultaneously all short peptides allows the use of a single producer strain, which is technologically more advantageous. The use of the claimed plasmid provides efficient synthesis of the claimed recombinant protein.

Краткое описание чертежейBrief Description of the Drawings

Рисунок 1. Схема рекомбинантных белков. П1, П2 и т.д. - биологические пептиды C1, С2 и т.д. - сайты узнавания протеаз. Причем i≥3, биологически активные пептиды могут как различаться, так и быть идентичны, сайты узнавания протеаз также могут различаться и быть идентичны.Figure 1. Scheme of recombinant proteins. P1, P2, etc. - biological peptides C1, C2, etc. - protease recognition sites. Moreover, i≥3, biologically active peptides can both be different and identical, protease recognition sites can also be different and identical.

Рисунок 2. Аминокислотная последовательность заявленного рекомбинантного белка на основе пептидов.Figure 2. Amino acid sequence of the claimed recombinant protein based on peptides.

Рисунок 3. Нуклеотидная последовательность гена, кодирующего рекомбинантный белок на основе пептидов, входящих в состав Миелопида.Figure 3. The nucleotide sequence of the gene encoding the recombinant protein based on the peptides that make up Myelopid.

Рисунок 4. Хроматографический профиль прохождения рекомбинантного белка на основе пептидов, входящих в состав Миелопида через SP-Sepharose. Мажорный пик соответствует выходу рекомбинантного белка.Figure 4. Chromatographic profile of the passage of a recombinant protein based on the peptides that make up Myelopid through SP-Sepharose. The major peak corresponds to the yield of the recombinant protein.

Рисунок 5. Хроматографический профиль элюции рекомбинантного белка на основе пептидов, входящих в состав Миелопида с аналитической колонки Kromasil 300-5С18.Figure 5. Chromatographic profile of elution of a recombinant protein based on the peptides that make up Myelopid from a Kromasil 300-5C18 analytical column.

Изобретение иллюстрируют примеры.The invention is illustrated by examples.

ПРИМЕР 1. Получение рекомбинантного белка на основе пептидов, входящих в состав миелопидаEXAMPLE 1. Obtaining a recombinant protein based on the peptides that make up the myelopid

Аминокислотная последовательность рекомбинантного белка представлена на рисунке 2.The amino acid sequence of the recombinant protein is shown in Figure 2.

Для получения рекомбинантного белка была создана генетическая конструкция на основе плазмиды рЕТ30а, которая содержит ген, кодирующий данный рекомбинантный белок. Последовательность гена представлена на рисунке 3.To obtain a recombinant protein, a genetic construct was created based on the pET30a plasmid, which contains the gene encoding this recombinant protein. The gene sequence is shown in Figure 3.

Плазмидой трансфецировались клетки E.coli штамма BL21(DE3). После трансфекции клетки пересевали в культуральную колбу с бульоном LB и канамицином 25 мкг/мл. Культура выращивалась на шейкере при 280 об/мин при температуре 37°С до достижения оптической плотности значения OD585=0,8E. Индукция экспрессии белка проводилась добавлением IPTG до концентрации 1 mM. Культура дополнительно культивировалась 4 часа, далее клетки осаждались центрифугированием при 5000g. Осадок клеток лизировали в 8 М мочевине и обрабатывали на ультразвуковом дезинтеграторе. Лизат клеток центрифугировали при 20000g 2 часа. Супернатант фильтровали через колонку с Q-Sepharose. Фракцию, не связавшуюся с данным сорбентом, хроматографировали на SP-Sepharose в градиенте NaCl (стартовый буфер: 20 mM TrisHCl рН 6.8, 20 mM NaCl, итоговый буфер 20 mM TrisHCl рН6.8, 400 mM NaCl). Хроматографический профиль представлен на рисунке 4. Фракции, содержащие целевой продукт, объединяли и диализовали в 0,9% NaCl. Чистоту продукта анализировали методом ВЭЖХ (рисунок 5).Plasmid transfected cells of E. coli strain BL21 (DE3). After transfection, the cells were subcultured into a culture flask with LB broth and kanamycin 25 μg / ml. The culture was grown on a shaker at 280 rpm at 37 ° C until the optical density reached OD585 = 0.8E. Protein expression was induced by adding IPTG to a concentration of 1 mM. The culture was additionally cultured for 4 hours, then the cells were precipitated by centrifugation at 5000 g. Cell pellet was lysed in 8 M urea and processed on an ultrasonic disintegrator. The cell lysate was centrifuged at 20,000 g for 2 hours. The supernatant was filtered through a Q-Sepharose column. The fraction that did not bind to this sorbent was chromatographed on SP-Sepharose in a NaCl gradient (start buffer: 20 mM TrisHCl pH 6.8, 20 mM NaCl, final buffer 20 mM TrisHCl pH6.8, 400 mM NaCl). The chromatographic profile is shown in Figure 4. Fractions containing the target product were combined and dialyzed in 0.9% NaCl. Product purity was analyzed by HPLC (Figure 5).

ПРИМЕР 2. Влияние рекомбинантного белка на количество клеток, продуцирующих антитела, в лимфатических узлах иммунизированных животныхEXAMPLE 2. The effect of recombinant protein on the number of cells producing antibodies in the lymph nodes of immunized animals

15 мышей-самок, гибридов первого поколения (CBA×C57BL), весом 20-22 г иммунизировали 5% взвесью эритроцитов барана в физиологическом растворе, подкожно по 0,1 мл в подушечки задних конечностей. Через 14 дней после первой иммунизации была проведена повторная иммунизация той же дозой и тем же способом. На 4-е сутки после второй иммунизации мышей разделили на 3 группы по 5 особей в группе. Первой группе (контрольной) вводили подкожно в подушечки задних лап по 0,1 мл физиологического раствора; второй группе вводили по 0,1 мл физиологического раствора, содержащего 1,5 мкг коммерческого препарата миелопид, и третьей группе - по 0,1 мл физиологического раствора, содержащего 1,5 мкг рекомбинантного белка. Через сутки все мыши были забиты и у них были удалены подколенные лимфоузлы. Лимфоузлы гомогенизировали и в полученной клеточной суспензии определяли методом Ерне количество клеток, продуцирующих антитело класса IgG к эритроцитам барана. Коэффициент стимуляции (К) антителообразования рассчитывали как отношение количества зон гемолиза в опытных чашках к количеству зон гемолиза в контрольных. Достоверность разницы между экспериментальными группами оценивали по t-критерию Стьюдента. Полученные результаты представлены в Таблице 1.15 female mice, first-generation hybrids (CBA × C57BL), weighing 20-22 g, were immunized with 5% suspension of sheep erythrocytes in physiological saline, 0.1 ml subcutaneously in the hind limb pads. 14 days after the first immunization was re-immunized with the same dose and in the same way. On the 4th day after the second immunization, mice were divided into 3 groups of 5 animals per group. The first group (control) was injected subcutaneously in the pads of the hind legs in 0.1 ml of physiological saline; the second group was injected with 0.1 ml of physiological saline containing 1.5 μg of the commercial preparation myelopid, and the third group - 0.1 ml of physiological saline containing 1.5 μg of recombinant protein. After 24 hours, all the mice were blocked and their popliteal lymph nodes were removed. Lymph nodes were homogenized and the number of cells producing an IgG antibody against sheep erythrocytes was determined in the obtained cell suspension by the method of Erne. The stimulation coefficient (K) of antibody formation was calculated as the ratio of the number of hemolysis zones in the test cups to the number of hemolysis zones in the control. The significance of the difference between the experimental groups was evaluated by student t-test. The results obtained are presented in Table 1.

Из полученных данных видно, что коэффициент стимуляции - миелопид/контроль составляет (36,4/25,2)=1,44, а коэффициент стимуляции - рекомбинантный белок/контроль составляет (92,4/25,2)=3,67.From the obtained data it is seen that the stimulation coefficient - myelopid / control is (36.4 / 25.2) = 1.44, and the stimulation coefficient - recombinant protein / control is (92.4 / 25.2) = 3.67.

Таким образом, введение экспериментальным животным полученного рекомбинантного белка заявленным способом приводит к значительно более выраженной стимуляции антителообразования (К=3,3), т.е. обеспечивая синергетический эффект действия входящих в него миелопептидов, чем после введения миелопида (К=1,45), что подтверждает повышение биологической активности полученного рекомбинантного белка, содержащего комплекс миелопептидов.Thus, the introduction of experimental animals obtained recombinant protein of the claimed method leads to a significantly more pronounced stimulation of antibody formation (K = 3.3), i.e. providing a synergistic effect of the myelopeptides included in it than after the introduction of myelopid (K = 1.45), which confirms the increase in the biological activity of the obtained recombinant protein containing a complex of myelopeptides.

ПРИМЕР 3. Изучение способности рекомбинантного белка восстанавливать гуморальный иммунный ответ при вторичном иммунодефицитном состоянииEXAMPLE 3. The study of the ability of a recombinant protein to restore the humoral immune response in a secondary immunodeficiency state

10 мышам-самкам, гибридам первого поколения (CBA×C57BL), весом 18-20 г вводили внутрибрюшинно циклофосфамид в дозе 200 мг/кг в физиологическом растворе. 5 мышам вводили физиологический раствор. На следующие сутки всех 15 животных иммунизировали 5% взвесью эритроцитов барана в физиологическом растворе подкожно по 0,1 мл в подушечки задних конечностей. На 2-е и 3-й сутки после иммунизации 5 животным из группы, которая получала циклофосфамид, внутримышечно вводили по 1,5 мкг рекомбинантного белка в 0,1 мл физиологического раствора. На 4 сутки после иммунизации эритроцитами барана все мыши были забиты и у них были удалены подколенные лимфоузлы. Лимфоузлы гомогенизировали и в полученной клеточной суспензии определяли методом Ерне количество клеток, продуцирующих антитело класса IgM к эритроцитам барана. Достоверность разницы между экспериментальными группами оценивали по t-критерию Стьюдента. Полученные результаты представлены в Таблице 2.10 female mice, first-generation hybrids (CBA × C57BL), weighing 18-20 g, were injected intraperitoneally with cyclophosphamide at a dose of 200 mg / kg in physiological saline. 5 mice were injected with saline. On the next day, all 15 animals were immunized with a 5% suspension of sheep erythrocytes in physiological saline, 0.1 ml subcutaneously in the hind limb pads. On the 2nd and 3rd day after immunization, 5 animals from the group that received cyclophosphamide were injected intramuscularly with 1.5 μg of recombinant protein in 0.1 ml of physiological saline. On the 4th day after immunization with sheep erythrocytes, all mice were clogged and popliteal lymph nodes were removed. Lymph nodes were homogenized and the number of cells producing an IgM antibody against sheep erythrocytes was determined in the resulting cell suspension by the method of Erne. The significance of the difference between the experimental groups was evaluated by student t-test. The results obtained are presented in Table 2.

Таким образом, введение экспериментальным животным со вторичными иммунодефицитами полученного рекомбинантного белка заявленным способом приводит к восстановлению гуморального иммунного ответа. Таким образом, полученный рекомбинантный слитый полипептид обладает биологической активностью входящих в состав пептидов, что дает возможность его использования для профилактики и лечения ВИД.Thus, the introduction of experimental animals with secondary immunodeficiencies obtained recombinant protein of the claimed method leads to the restoration of the humoral immune response. Thus, the resulting recombinant fusion polypeptide has the biological activity of the peptides that make it possible to use it for the prevention and treatment of VID.

В связи с вышеизложенным, использование синтезированной плазмиды обеспечивает эффективный синтез заявленного рекомбинантного белка с биологической активностью. Получение рекомбинантного белка на основе пептидов, входящих в состав миелопида с представленной последовательностью, позволяет не только сохранить функциональную активность входящих в его пептидов, но и повысить его биологическую активность. Поскольку после введения в организм рекомбинантный белок способен гидролизоваться по сайтам узнавания специфических протеаз с высвобождением входящих в него коротких миелопептидов, что дает возможность высвобождать активные пептиды постепенно и обеспечивает синергетический эффект при иммунизации (как отмечено в вышеуказанном примере).In connection with the foregoing, the use of a synthesized plasmid provides efficient synthesis of the claimed recombinant protein with biological activity. Obtaining a recombinant protein based on the peptides that make up the myelopid with the presented sequence allows not only to preserve the functional activity of its peptides, but also to increase its biological activity. Since, after introduction into the body, the recombinant protein is able to hydrolyze at the recognition sites of specific proteases with the release of short myelopeptides included in it, which makes it possible to release active peptides gradually and provides a synergistic effect during immunization (as noted in the above example).

Claims (1)

Способ получения рекомбинантного белка, обладающего биологической активностью пептидов, входящих в состав миелопида, и представленного последовательностью
MFLGFPTGRGLVVYPWGRGLVCYPQGRGFRPRIMTPGRGFLGFPTTGRLVVYPWTGRLVCYPQTGRFRPRIMTP, включающий трансфекцию клеток Escherichia coli BL21 (DE3) плазмидной ДНК рЕТ30а, несущей ген, представленный последовательностью ATGGGTCGTGGCTTCTTAGGCTTTCCAACTGGCCGTGGTCTGGTGGTGTATCCATGGGGTCGTGGTCTGGTGTGCTATCCGCAAGGTCGTGGCTTCCGTCCACGCATCATGACTCCAGGCCGCGGCTTTCTGGGCTTCCCGACCACTGGTCGTCTCGTTGTGTACCCGTGGACCGGCCGCCTGGTTTGTTACCCACAGACGGGTCGCTTTCGCCCGCGTATTATGACGCCGTAA, кодирующий рекомбинантный белок, культивирование полученного штамма с индукцией экспрессии белка добавлением IPTG, лизирование, включающее обработку клеток ультразвуковым дезинтегратором с получением супернатанта, очистку супернатанта на Q-Sepharose и SP-Sepharose, объединение фракций, содержащих целевой продукт. A method of obtaining a recombinant protein having the biological activity of the peptides that make up the myelopid, and represented by the sequence
MFLGFPTGRGLVVYPWGRGLVCYPQGRGFRPRIMTPGRGFLGFPTTGRLVVYPWTGRLVCYPQTGRFRPRIMTP, comprising transfecting cells Escherichia coli BL21 (DE3) with plasmid DNA rET30a carrying the gene represented ATGGGTCGTGGCTTCTTAGGCTTTCCAACTGGCCGTGGTCTGGTGGTGTATCCATGGGGTCGTGGTCTGGTGTGCTATCCGCAAGGTCGTGGCTTCCGTCCACGCATCATGACTCCAGGCCGCGGCTTTCTGGGCTTCCCGACCACTGGTCGTCTCGTTGTGTACCCGTGGACCGGCCGCCTGGTTTGTTACCCACAGACGGGTCGCTTTCGCCCGCGTATTATGACGCCGTAA sequence encoding a recombinant protein, culturing the resulting strain with protein expression induction by addition of IPTG, lysing comprising treating the cells by ultrasonic disintegrator to obtain a supernatant, the supernatant purification on Q-Sepharose and SP-Sepharose, the combination of fractions containing the target product.

Images