RU2215748C2 - Method for preparing recombinant human erythropoietin and prepared erythropoietin, pharmaceutical composition - Google Patents

Abstract

FIELD: biotechnology, medicine, pharmacy. SUBSTANCE: recombinant human erythropoietin is prepared by culturing transformed cells CHO producing recombinant erythropoietin in hollow-fiber bioreactors. Method involves repeated inoculation of bioreactors in 7 days, incubation of cellular culture for 16 h up to density value 2•10⁶ cells/ml and onset of fermentation process by continuous perfusion for up to 60 days followed by collection of supernatant enriched with recombinant erythropoietin and centrifugation of cultural medium. Purification of supernatant and fraction is carried out by affinity and ion-exchange chromatography. Recombinant erythropoietin shows 98% of purity degree, biological activity 160 IU/mg and used in pharmaceutical composition for treatment of anemia. Invention provides preparing recombinant human erythropoietin with high specific activity and elimination from blood and highly effective for therapeutic application. Invention is used for preparing recombinant human erythropoietin. EFFECT: improved preparing method, valuable properties of erythropoietin. 4 cl, 9 dwg, 6 ex

Description

Область техники
Настоящее изобретение относится к способу получения и очистки рекомбинантного эритропоэтина (ЕРО) человека посредством применения половолоконной культуры и очистки с использованием хелатной хроматографии. Более конкретно, изобретение относится к способу получения чистой молекулы с соответствующим типом гликозилирования, связанным с его биологической активностью; биохимической характеристике и фармакокинетическому профилю, обеспечивающим возможность его применения при лечении различных заболеваний, связанных с эритропоэзом.Technical field
The present invention relates to a method for the preparation and purification of recombinant human erythropoietin (EPO) through the use of hollow fiber culture and purification using chelate chromatography. More specifically, the invention relates to a method for producing a pure molecule with an appropriate type of glycosylation associated with its biological activity; biochemical characteristics and pharmacokinetic profile, providing the possibility of its use in the treatment of various diseases associated with erythropoiesis.

Предшествующий уровень техники
Эритропоэтин (ЕРО) представляет собой гликопротеид, который стимулирует эритропоэз в костном мозге и вырабатывается в почках естественным путем. Он главным образом показан для терапевтического применения в качестве средства лечения анемии, и было установлено, что он может очень успешно использоваться при лечении различных заболеваний, таких как конечная стадия почечных заболеваний, онкологические заболевания у больных, получающих химиотерапию, и СПИД. Его лечебное действие заключается в стимуляции деления и дифференцировки скомпрометированных эритроидных предшественников в костном мозге.State of the art
Erythropoietin (EPO) is a glycoprotein that stimulates erythropoiesis in the bone marrow and is produced naturally in the kidneys. It is mainly indicated for therapeutic use as a treatment for anemia, and it has been found that it can be very successfully used in the treatment of various diseases, such as end-stage renal disease, cancer in patients receiving chemotherapy, and AIDS. Its therapeutic effect is to stimulate the division and differentiation of compromised erythroid progenitors in the bone marrow.

До недавнего времени доступность продукта была ограничена ввиду естественных источников и способов экстракции молекулы. Miyake et al. (J. BIO Chem. , N 252, page 5558, 1977) описали способ экстракции ЕРО из мочи больного, страдающего апластической анемией, получив очень хорошие результаты, но недостаточные количества для его клинического применения. Until recently, the availability of the product was limited due to the natural sources and methods of extraction of the molecule. Miyake et al. (J. BIO Chem., N 252, page 5558, 1977) described a method for extracting EPO from the urine of a patient suffering from aplastic anemia, having obtained very good results, but insufficient quantities for its clinical use.

Ранее был описан рекомбинантный эритропоэтин человека, полученный с помощью методов генной инженерии посредством идентификации, клонирования и экспрессии в различных клеточных линиях (патент США 4703008), и было возможно его промышленное производство с использованием технологии рекомбинантной ДНК. Recombinant human erythropoietin obtained by genetic engineering through identification, cloning, and expression in various cell lines (US Pat. No. 4,703,008) was previously described, and it was possible to produce it using recombinant DNA technology.

Эритропоэтин считался одним из наиболее подходящих продуктов в биотехнологической промышленности. Эта молекула представляет собой гликопротеид, состоящий из 165 аминокислот, который имеет молекулярный вес от 32.000 до 40.000 дальтон и вырабатывается клетками млекопитающих, в которые был трансфектирован ген эритропоэтина человека. Продукт содержит идентичную аминокислотную последовательность выделенного естественного эритропоэтина (Davis et al. [Biochem. 26, рад. 2633, 1987]), которая была выявлена посредством исследований кругового дихроизма и спектрофлюориметрии. Erythropoietin was considered one of the most suitable products in the biotechnological industry. This molecule is a 165 amino acid glycoprotein that has a molecular weight of 32,000 to 40,000 daltons and is produced by mammalian cells into which the human erythropoietin gene has been transfected. The product contains the identical amino acid sequence of isolated natural erythropoietin (Davis et al. [Biochem. 26, rad. 2633, 1987]), which was identified through circular dichroism and spectrofluorimetry studies.

Imai et al. (J Biochem, N 107, page 352, 1990) сравнили физико-химические и биологические свойства обеих молекул; рекомбинантной, в надосадочной жидкости клеток яичников китайского хомячка (СНО), и естественной, полученной из мочи пациента, и пришли к выводу, что они обе имеют одинаковые свойства. Imai et al. (J Biochem, N 107, page 352, 1990) compared the physicochemical and biological properties of both molecules; recombinant, in the supernatant of Chinese hamster ovary cells (CHO), and natural, obtained from the patient’s urine, and concluded that they both have the same properties.

На клеточном уровне этот белок действует на рецепторы эритроидных клеток-предшественников как полипептидный гормон, который может также иметь более одного рецепторного участка с различным сродством. С другой стороны, Sawada et al. (J Cell Physiology, N 142, page 219, 1990) исследовали взаимодействие рекомбинантного эритропоэтина, меченного I¹²⁵, в клетках-предшественниках и зрелых эритроцитах. Эти исследования показали его предпочтение первых из них перед последними и отсутствие соединения (менее чем 15%) с последними. Он может также действовать через второй мессенджер или, альтернативно, посредством интернализации молекулы, которая происходит при инкубации при высокой температуре. Другие исследования, связанные с интернализацией (Spivak, Int J Cell Cloning, N 4, page 39, 1986), доказали, что интернализация имела место, используя с этой целью полученный биосинтетическим способом эритропоэтин, меченный S³⁵/цистеином.At the cellular level, this protein acts on the receptors of erythroid progenitor cells as a polypeptide hormone, which may also have more than one receptor site with different affinities. On the other hand, Sawada et al. (J Cell Physiology, N 142, page 219, 1990) investigated the interaction of recombinant erythropoietin labeled with I ¹²⁵ in progenitor cells and mature red blood cells. These studies showed his preference for the former over the latter and the lack of compound (less than 15%) with the latter. It can also act through a second messenger or, alternatively, through the internalization of a molecule that occurs during incubation at high temperature. Other studies related to internalization (Spivak, Int J Cell Cloning, N 4, page 39, 1986) have shown that internalization has occurred using biosynthetic erythropoietin labeled with S ³⁵ / cysteine.

Биологическая активность белков, а также другие родственные свойства зависят от их структуры (аминокислотная последовательность и посттрансляционные модификации), и именно в этой молекуле было обнаружено, что устранение углеводов (N-гликозилирование), присутствующих в положениях Asn 28, Asn 38 и Asn 83, полностью устраняет биологическую активность in vivo, но не биологическую активность in vitro. Это можно объяснить тем обстоятельством, что дегликозилированная молекула быстро выводится организмом через рецепторы, присутствующие в печени. The biological activity of proteins, as well as other related properties, depend on their structure (amino acid sequence and post-translational modifications), and it was in this molecule that it was found that elimination of carbohydrates (N-glycosylation) present at positions Asn 28, Asn 38 and Asn 83, completely eliminates in vivo biological activity, but not in vitro biological activity. This can be explained by the fact that a deglycosylated molecule is rapidly excreted by the body through receptors present in the liver.

Этот феномен можно воспроизвести, если молекула обработана специфичными экзогликозидазами сиаловой кислоты, что свидетельствует об основной роли, которую играют эти углеводы. С другой стороны, наблюдалось, что углеводы, присутствующие в положении Ser 128 (0-гликозилирование), не имеют отношения к поддержанию биологической активности молекулы in vivo. Препараты высоко очищенного ЕРО составлены из смеси различных гликоформ, которые могут разделяться с помощью изоэлектрического фокусирования и хроматографического фокусирования (WO N 91-05867). This phenomenon can be reproduced if the molecule is treated with specific exoglycosidases of sialic acid, which indicates the main role that these carbohydrates play. On the other hand, it was observed that the carbohydrates present at the Ser 128 position (0-glycosylation) are not related to maintaining the biological activity of the molecule in vivo. Highly purified EPO preparations are composed of a mixture of various glycoforms that can be separated by isoelectric focusing and chromatographic focusing (WO N 91-05867).

В отношении способов очистки, разработанных для нативных гормонов, а также для рекомбинантных гормонов, предшествующий уровень техники показывает, что было описано несколько способов. Среди них один относится к жидкостной хроматографии с обращенной фазой (патент США 1577195), недостатком которого является дороговизна и возможность использования только в лабораторном масштабе. With regard to purification methods developed for native hormones, as well as for recombinant hormones, the prior art shows that several methods have been described. Among them, one relates to reverse phase liquid chromatography (US Pat. No. 1,577,195), the disadvantage of which is the high cost and the ability to be used only on a laboratory scale.

Другие описанные способы очистки включают смолы, связанные с лектинами, для связывания молекулы ЕРО (заявка на патент ЕР 359463; Rudzki et al., Hematologica, vol. 63, page 4, 1978) и даже несмотря на то, что уровень полученной специфической активности молекулы был очень высоким, он определялся только с помощью методик in vitro, и поэтому нельзя установить, может ли этот способ использоваться для отделения активных изоформ от неактивных изоформ для биологической активности in vivo. Other described purification methods include lectin-related resins for binding the EPO molecule (patent application EP 359463; Rudzki et al., Hematologica, vol. 63, page 4, 1978) and even though the level of specific activity of the molecule obtained is was very high, it was determined only using in vitro methods, and therefore it cannot be established whether this method can be used to separate active isoforms from inactive isoforms for in vivo biological activity.

Несколько исследований, проведенных McDougall et al. (Contrib Nephrol, N 76, page 112, 1991), подтвердили, что после внутривенного введения объем распределения эритропоэтина приблизительно соответствует объему плазмы. Концентрация в плазме проявляет моноэкспотенциальное снижение с периодом полувыведения, составляющим 4,5 ч. Several studies by McDougall et al. (Contrib Nephrol, N 76, page 112, 1991), confirmed that after intravenous administration, the volume of distribution of erythropoietin approximately corresponds to the volume of plasma. The plasma concentration exhibits a monoexpotential decrease with a half-life of 4.5 hours.

Доступность эритропоэтина в диализной жидкости при внутрибрюшинном введении составила 3/8%, но при инъекции препарата в "сухую" брюшную полость наблюдалась тенденция к ее увеличению. При подкожной инъекции максимальная сывороточная концентрация через 18 ч составляла 5-10% такой же дозировки, введенной внутривенно. Тем не менее, аналогичные результаты получены при увеличении концентрации гематокрита 0,2х10⁶ клеток/мл.The availability of erythropoietin in dialysis fluid with intraperitoneal administration was 3/8%, but when the drug was injected into the “dry” abdominal cavity, there was a tendency to increase it. With subcutaneous injection, the maximum serum concentration after 18 hours was 5-10% of the same dosage administered intravenously. Nevertheless, similar results were obtained with an increase in the hematocrit concentration of 0.2x10 ⁶ cells / ml.

Различные фармакокинетические исследования, проведенные с эритропоэтином, показали следующую характерную особенность: фармакокинетические свойства ЕРО у различных групп (здоровые добровольцы, пациенты с хроническими почечными заболеваниями и новорожденные) одинаковы. Various pharmacokinetic studies conducted with erythropoietin showed the following characteristic feature: the pharmacokinetic properties of EPO in the different groups (healthy volunteers, patients with chronic renal disease and newborns) are the same.

При различных способах введения ЕРО: внутривенном (в/в), подкожном (п/к) и внутрибрюшинном (в/б) и у здоровых лиц, и у больных, были выявлены различия исследуемых показателей. После в/в введения наблюдается значительное возрастание концентрации в плазме, однако в течение следующих 48 ч она снижается ниже исходных величин концентрации эндогенного ЕРО. После п/к введения, ввиду более медленного всасывания и выведения, сначала уровень в плазме низкий, однако через 24 ч величины выше, чем после в/в введения (Diana, F. Drugs, N 38, page 863, 1989; Jensen, J.D. Drug. Invest. N 8, page 278, 1994). With various methods of administering EPO: intravenous (iv), subcutaneous (s / c) and intraperitoneal (iv), in healthy individuals and in patients, differences in the studied parameters were revealed. After iv administration, a significant increase in plasma concentration is observed, however, over the next 48 hours it decreases below the initial values of the concentration of endogenous EPO. After sc administration, due to the slower absorption and excretion, the plasma level is initially low, but after 24 hours the values are higher than after iv administration (Diana, F. Drugs, N 38, page 863, 1989; Jensen, JD Drug. Invest. N 8, page 278, 1994).

Эритропоэтин быстро распределяется по плазматическим компартментам, и средний объем распределения составляет от 3,3 до 5,5% веса тела. Основная часть молекул захватывается печенью и почками, хотя специфический захват происходит главным образом на уровне костного мозга. Кривая выведения из плазмы имеет двухфазный характер, но при высоких дозах кривая оказывается монофазной, вероятно, потому, что при высоких дозах имеет место феномен маскировки фазы распределения. Период полувыведения (T-_1/2 Бета) составляет от 2 до 11 ч (Hans, N. Contrib. Nephrol./N 76, page 108, 1989).Erythropoietin is rapidly distributed in plasma compartments, and the average volume of distribution is from 3.3 to 5.5% of body weight. Most of the molecules are captured by the liver and kidneys, although specific capture occurs mainly at the bone marrow level. The plasma elimination curve has a two-phase character, but at high doses the curve turns out to be monophasic, probably because at high doses the distribution phase masking phenomenon occurs. The half-life (T- _1/2 Beta) is from 2 to 11 hours (Hans, N. Contrib. Nephrol./N 76, page 108, 1989).

Эритропоэтин был впервые очищен из мочи пациентов с апластической анемией, но выделение с мочой представляет лишь небольшую часть общего выведения. Менее 10% эритропоэтина выделяется в неизмененном виде, и сниженная почечная функция лишь в небольшой степени воздействует на скорость выведения. Erythropoietin was first cleared from the urine of patients with aplastic anemia, but urinary excretion represents only a small fraction of the total excretion. Less than 10% of erythropoietin is excreted unchanged, and reduced renal function only slightly affects the rate of excretion.

Фармакокинетические исследования показали очень значительное возрастание скорости клиренса десиалированной формы. При удалении терминальных остатков сиаловой кислоты гликопротеиды с галактозным терминальным концом распознаются в гепатоцитах. После интернализации эндоцитозом десиалированная форма гликопротеида переваривается лизосомами. Тем не менее, имеется часть десиалированного эритропоэтина, которая уклоняется от печеночного клиренса, вероятно, ввиду отложения углеводных групп. Pharmacokinetic studies have shown a very significant increase in the clearance rate of the desialized form. When terminal sialic acid residues are removed, glycoproteins with a terminal end galactose are recognized in hepatocytes. After internalization by endocytosis, the desialized form of the glycoprotein is digested by lysosomes. However, there is a portion of desialylated erythropoietin that evades hepatic clearance, probably due to the deposition of carbohydrate groups.

Сиалированная форма молекулы покидает сосудистый компартмент без взаимодействия с эндотелиальными клетками, и этот факт еще не получил объяснения. Эта ситуация предполагала две альтернативы: содержание сиаловой кислоты синтезируемого in vivo гормона слишком мало или недостаточно время экспозиции рецептора, причем обе ситуации способствуют транспорту к клеткам-мишеням (Leonard I.Z,., Ed. Marcel Dekker, NY, USA, 1990). The sialylated form of the molecule leaves the vascular compartment without interacting with endothelial cells, and this fact has not yet been explained. This situation suggested two alternatives: the sialic acid content of the hormone synthesized in vivo is too short or the exposure time of the receptor is short, and both situations facilitate transport to the target cells (Leonard I.Z., Ed. Marcel Dekker, NY, USA, 1990).

Новизна настоящего изобретения состоит в предоставлении способа получения и очистки рекомбинантного эритропоэтина человека (ЕРО) с помощью методик половолоконной культуры и хелатной хроматографии. Молекула, полученная в результате этого способа, характеризуется высокой специфической активностью, а также биологическими и фармакокинетическими свойствами, которые делают эту молекулу терапевтическим средством, отличающимся более высоким выведением из крови, объемом распределения, а также временем пребывания в периферическом компартменте, чем любые другие молекулы, описанные ранее, и поэтому она очень эффективна для терапевтического применения. The novelty of the present invention is to provide a method for the preparation and purification of recombinant human erythropoietin (EPO) using methods of hollow fiber culture and chelate chromatography. The molecule obtained as a result of this method is characterized by high specific activity, as well as biological and pharmacokinetic properties, which make this molecule a therapeutic agent, characterized by a higher excretion from the blood, the volume of distribution, and also the residence time in the peripheral compartment than any other molecules, described previously, and therefore it is very effective for therapeutic use.

а) Клеточная культура и ферментация для получения ЕРО
Рекомбинантый ЕРО получен методом генной инженерии и экспрессирован в клетках яичника китайских хомячков (СНО). Его получают с помощью трансформации плазмидами pKG-Xho-EPO-HIND, содержащими ген эритропоэтина человека, и pSV2 DHFR, клонированными в клетках CHO-DHFR.a) Cell culture and fermentation to obtain EPO
Recombinant EPO was obtained by genetic engineering and expressed in Chinese hamster ovary (CHO) cells. It is obtained by transformation with plasmids pKG-Xho-EPO-HIND containing the human erythropoietin gene and pSV2 DHFR cloned in CHO-DHFR cells.

Конечным продуктом является линия клеток, которая вырабатывает 10⁷ единиц ЕРО на 1 л культуры за 24 ч. Клетки растут в среде DMEM-F12 с добавлением 5% бычьей эмбриональной сыворотки, 26 мМ бикарбоната натрия, 15 мМ Hepes, 6 мМ глутамина, 1 мМ пирувата натрия и 10^-5 М 2-меркаптоэтанола.The final product is a cell line that produces 10 ⁷ units of EPO per 1 liter of culture in 24 hours. Cells grow in DMEM-F12 medium supplemented with 5% bovine fetal serum, 26 mM sodium bicarbonate, 15 mM Hepes, 6 mM glutamine, 1 mM sodium pyruvate and 10 ^-5 M 2-mercaptoethanol.

При наличии в культуре якорной подложки клетки этой линии морфологически удлинены, достигая своей максимальной длины после достижения слияния. В свою очередь, в суспензии они морфологически закруглены. If there is an anchor substrate in the culture, the cells of this line are morphologically elongated, reaching their maximum length after fusion is achieved. In turn, in suspension they are morphologically rounded.

Инокуляция в колбы производится в концентрации, которая обеспечивает хорошее прикрепление и пролиферацию клеток. Время удвоения составляет приблизительно 16 ч. Культуру получают в Т-образных колбах или во вращающихся колбах. Inoculation into flasks is carried out in a concentration that ensures good cell attachment and proliferation. The doubling time is approximately 16 hours. The culture is obtained in T-shaped flasks or in rotating flasks.

Концентрация экспрессируемой молекулы в стационарной культуре
По данным определения с помощью набора для иммуноферментного анализа, на 7-й день линия в стационарной культуре вырабатывала ЕРО в концентрации от 12 мкг/мл до 15 мкг/мл.The concentration of the expressed molecule in stationary culture
According to the determination using an enzyme-linked immunosorbent assay kit, on day 7, the line in a stationary culture produced EPO at a concentration of 12 μg / ml to 15 μg / ml.

Получение инокулята
Питательной средой, используемой для получения инокулята, может быть DMEM-F12 или другая эквивалентная среда, содержащая 5% бычью эмбриональную сыворотку с добавлением 26 мМ бикарбоната натрия, 15 мМ Hepes, 6 мМ глутамина, 1 мМ пирувата натрия и 10^-5 М 2-меркаптоэтанола.Inoculum Preparation
The culture medium used to prepare the inoculum may be DMEM-F12 or other equivalent medium containing 5% bovine fetal serum supplemented with 26 mM sodium bicarbonate, 15 mM Hepes, 6 mM glutamine, 1 mM sodium pyruvate and 10 ^-5 M 2- mercaptoethanol.

Для получения инокулята размораживают ампулу из WCB, которая содержит от 8 до 10х10⁶ клеток. Проводят инокуляцию колб размером 175 см² при концентрации приблизительно 0,2х10⁶ клеток/мл, а также 4 ячейки в качестве контролей размороженного инокулята в концентрации 2х10⁵ клеток/мл в 1 мл конечного объема, затем определяют жизнеспособность, которая должна быть выше 80%.To obtain an inoculum, the ampoule from the WCB, which contains from 8 to 10x10 ⁶ cells, is thawed. Inoculate flasks with a size of 175 cm ² at a concentration of approximately 0.2x10 ⁶ cells / ml, as well as 4 cells as controls of the thawed inoculum at a concentration of 2x10 ⁵ cells / ml in 1 ml of the final volume, then determine the viability, which should be above 80% .

На 7-й день удаляют надосадочную жидкость и с помощью иммуноферментного анализа определяют концентрацию ЕРО. On the 7th day, the supernatant is removed and the concentration of EPO is determined by enzyme immunoassay.

Инокулят для ферментера составляет приблизительно 1000-1500х10⁶ клеток, которые получают из колб, инокулированных после размораживания. Проводят пересев в колбы размером 175 см², а затем переносят во вращающиеся колбы. Кроме того, в момент инокуляции клетки из одного и того же размороженного инокулята повторно высевают для получения повторной инокуляции тем же количеством клеток через 7 дней после проведения первой инокуляции. Это дает всего от 2000 до 3000х10⁶ клеток на 1 ферментер.The inoculum for the fermenter is approximately 1000-1500x10 ⁶ cells, which are obtained from flasks inoculated after thawing. Reseeding is carried out in flasks measuring 175 cm ² and then transferred to rotating flasks. In addition, at the time of inoculation, cells from the same thawed inoculum are re-plated to obtain re-inoculation with the same number of cells 7 days after the first inoculation. This gives a total of 2,000 to 3,000 x 10 ⁶ cells per fermenter.

Время удвоения количества клеток составляет приблизительно 16 ч, и культуры достигают нормальной плотности в экспоненциальной фазе, составляющей 2х10⁶ клеток на 1 мл в стационарной стадии.The time for doubling the number of cells is approximately 16 hours, and the cultures reach a normal density in the exponential phase of 2x10 ⁶ cells per 1 ml in the stationary stage.

Процесс ферментации
Культивирование можно проводить в биореакторах Acusyst-Jr или Р3Х. В случае Р3Х он состоит из картриджей полых волокон, расположенных рядами, в которые по их экстракапиллярному пространству подается среда DMEM-F12, содержащая 5% бычью эмбриональную сыворотку, а через внутрикапиллярное пространство подается основная среда без сыворотки.Fermentation process
Cultivation can be carried out in Acusyst-Jr or PXX bioreactors. In the case of PXX, it consists of hollow fiber cartridges arranged in rows, into which DMEM-F12 medium containing 5% bovine fetal serum is fed through their extracapillary space, and the main medium without serum is fed through the intracapillary space.

Клетки инокулируют в экстракапиллярном пространстве картриджа, где создаются условия для роста. После повторной инокуляции через день проводят сбор среды из экстракапиллярного пространства, обогащенной ЕРО. Cells are inoculated in the extracapillary space of the cartridge where growth conditions are created. After repeated inoculation, the medium is collected every other day from the extracapillary space enriched in EPO.

Для обеспечения качества молекулы выращивание культур завершали в период от 45 до 60 дней после цикла. To ensure the quality of the molecule, the cultivation of crops was completed in the period from 45 to 60 days after the cycle.

Для того, чтобы знать характер цикла и подобрать показатели, следует проводить определения, которые должны сохранять соответствие со следующими величинами:
Аммоний - <2 мМ
Глутамин - >2 мМ
Лактат - <3 мМ
Глюкоза - >5 мМ
Во время цикла берут образцы для выявления микробного загрязнения собранных из культуры клеток. Для оценки концентрации ЕРО методом ELISA из каждой культуры клеток берут образцы.In order to know the nature of the cycle and select indicators, it is necessary to carry out definitions that should remain consistent with the following values:
Ammonium - <2 mm
Glutamine -> 2 mM
Lactate - <3 mm
Glucose -> 5 mM
During the cycle, samples are taken to detect microbial contamination of cells collected from the culture. Samples were taken from each cell culture to estimate EPO concentration by ELISA.

b) Очистка эритропоэтина
Этот способ позволяет производить очистку ЕРО в основном в два хроматографических этапа из высококомплексного материала при наличии большого количества белковых примесей ввиду того, что надосадочная жидкость клеточной культуры содержит 5% бычью эмбриональную сыворотку. Для выделения соответствующих изоформ проводится дополнительный этап.b) Purification of erythropoietin
This method allows purification of EPO mainly in two chromatographic steps from a high complex material in the presence of a large amount of protein impurities due to the fact that the supernatant of the cell culture contains 5% bovine fetal serum. An additional step is carried out to isolate the corresponding isoforms.

I этап: Аффинная хроматография в синей сефарозе
Предварительно колонку синей сефарозы уравновешивают связывающим буфером; 20 мМ Tris-HCl, 1% Tween-20 при рН 7,3-7,5. Надосадочную жидкость наносят непосредственно на колонку синей сефарозы в концентрации 0,2-0,3 мг/мл ЕРО/1 мл геля. Затем проводят этап промывания 20 мМ Tris-HCl, 1% Tween-20, 400 мМ NaCl, pH 7,3-7,5, и ЕРО элюируют с помощью промывания 20 мМ Tris-HCl, 2,5 М NaCl, pH 7,5.Stage I: Affinity Chromatography in Blue Sepharose
Preliminarily, the column of blue Sepharose is equilibrated with binding buffer; 20 mM Tris-HCl, 1% Tween-20 at pH 7.3-7.5. The supernatant is applied directly to a blue Sepharose column at a concentration of 0.2-0.3 mg / ml EPO / 1 ml gel. Then, the washing step is carried out with 20 mM Tris-HCl, 1% Tween-20, 400 mM NaCl, pH 7.3-7.5, and EPO is eluted by washing with 20 mM Tris-HCl, 2.5 M NaCl, pH 7, 5.

Этот этап позволяет удалить бычью эмбриональную сыворотку, присутствующую в надосадочной жидкости, а также другие белковые примеси, которые содержатся в более низкой пропорции. Бычий сывороточный альбумин не удерживается в колонке и вымывается в не связывающейся фракции, тогда как этап промывания способствует выведению других примесей. Фракция, не обладающая биологической активностью, удаляется посредством количественного определения in vivo, которое позволяет сделать вывод, что изоформы, присутствующие в этой фракции, имеют низкое содержание сиаловой кислоты и поэтому низкий уровень биологической активности in vivo. This stage allows you to remove bovine fetal serum present in the supernatant, as well as other protein impurities, which are contained in a lower proportion. Bovine serum albumin is not retained in the column and is washed in the non-binding fraction, while the washing step helps to remove other impurities. A fraction that does not have biological activity is removed by in vivo quantification, which suggests that the isoforms present in this fraction have a low sialic acid content and therefore a low level of in vivo biological activity.

II этап: Хроматография по сродству с металлом
Хроматография по сродству с металлом обычно включает модификацию первичной последовательности подвергаемого очистке белка путем вставки последовательности полинуклеотидов, которая кодирует аминокислоту гистидин (полигистидин). Эта последовательность ответственна за взаимодействие с иммобилизованным металлическим комплексом на колонке. Эта процедура проводится для получения достаточного разделения между интересующим белком (который обладает возросшим сродством к гелю ввиду модификации) и примесями. В настоящем изобретении этап модификации белка устраняется, поскольку в этом конкретном образце и в особых используемых хроматографических условиях достигается дифференциальное элюирование между интересующей молекулой и примесями.Stage II: Affinity Chromatography
Affinity metal chromatography typically involves modifying the primary sequence of a protein to be purified by inserting a polynucleotide sequence that encodes the amino acid histidine (polyhistidine). This sequence is responsible for interacting with the immobilized metal complex on the column. This procedure is carried out to obtain a sufficient separation between the protein of interest (which has an increased affinity for the gel due to modification) and impurities. In the present invention, the protein modification step is eliminated because differential elution between the molecule of interest and impurities is achieved in this particular sample and in the particular chromatographic conditions used.

Этот хроматографический этап выполняют с Cu²⁺ в качестве иона металла. Колонку загружают этим ионом в присутствии дистиллированной воды в соответствии со следующей процедурой: промывание геля тремя-четырьмя объемами колонки дистиллированной воды; этап активации колонки выполняют двумя-тремя объемами колонки 0,1 М раствора CuSО₄; и гель снова промывают пятью объемами колонки дистиллированной воды. Колонку считают активированной, когда проводимость сигнала достигает высокой величины и остается стабильной. Ни при каких условиях используемый объем дистиллированной воды не должен быть меньше 5 объемов колонки.This chromatographic step is performed with Cu ²⁺ as a metal ion. The column is charged with this ion in the presence of distilled water in accordance with the following procedure: washing the gel with three to four volumes of a column of distilled water; the column activation step is performed by two to three column volumes of a 0.1 M CuSO ₄ solution; and the gel is again washed with five volumes of a column of distilled water. The column is considered activated when the signal conductivity reaches a high value and remains stable. Under no circumstances should the volume of distilled water used be less than 5 column volumes.

После этого этапа колонку уравновешивают 20 мМ Na₂HPO₄, 500 мМ NaCl при рН 7,1-7,3. Образец наносят со скоростью 30 см/ч-60 см/ч. После окончания нанесения колонку промывают 20 мМ Na₂HPО₄, 500 мМ NaCl при рН 7,1-7,3. ЕРО окончательно элюируют 20 мМ Na₂HPO₄, 500 мМ NaCl при рН 3,8-4,2. Металл удаляют из колонки с помощью промывания 50 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты, 500 мМ NaCl, а затем 500 мМ NaCl.After this step, the column is equilibrated with 20 mM Na ₂ HPO ₄ , 500 mM NaCl at pH 7.1-7.3. The sample is applied at a speed of 30 cm / h-60 cm / h. After the application is completed, the column is washed with 20 mM Na ₂ HPO ₄ , 500 mM NaCl at pH 7.1-7.3. EPO finally elute with 20 mM Na ₂ HPO ₄ , 500 mM NaCl at pH 3.8-4.2. The metal was removed from the column by washing with 50 mM ethylenediaminetetraacetic acid, 500 mM NaCl, and then 500 mM NaCl.

Этим этапом достигается удаление примеси белков, еще присутствующей после первого хроматографического этапа. Даже если все белки, присутствующие в образце, очевидно связаны с колонкой, между ЕРО и примесью белков достигается дифференциальное избирательное элюирование, поскольку примеси удерживаются больше, чем ЕРО. This step achieves the removal of protein impurities still present after the first chromatographic step. Even if all the proteins present in the sample are obviously bound to the column, differential selective elution is achieved between EPO and the protein impurity, since the impurities are retained more than EPO.

На этом хроматографическом этапе ЕРО свободен от посторонних примесей и представляет собой смесь гликоформ с различным содержанием сиаловой кислоты. At this chromatographic step, EPO is free of impurities and is a mixture of glycoforms with different sialic acid contents.

III этап: Ионообменная хроматография на SP-Сефарозе
На этом этапе достигается разделение изоформ, присутствующих в образце, на две фракции. Не связывающаяся фракция состоит из кислых изоформ с более высоким содержанием сиаловой кислоты, а другая фракция состоит из основных изоформ с более низким содержанием сиаловой кислоты.Stage III: Ion-exchange chromatography on SP-Sepharose
At this stage, separation of the isoforms present in the sample into two fractions is achieved. The non-binding fraction consists of acidic isoforms with a higher sialic acid content, and the other fraction consists of basic isoforms with a lower sialic acid content.

Образец наносят на колонку, предварительно уравновешенную в связывающем буфере 20 мМ Tris-HCl при рН 6,35-6,5. Не связывающуюся фракцию собирают как только начинает возрастать сигнал оптической плотности. Эта фракция содержит более кислые изоформы ЕРО, которые представляют собой подходящие виды. Основную фракцию элюируют с помощью регенерации 3М NaCl. The sample is applied to a column pre-equilibrated in 20 mM Tris-HCl binding buffer at pH 6.35-6.5. The non-binding fraction is collected as soon as the optical density signal begins to increase. This fraction contains more acidic isoforms of EPO, which are suitable species. The main fraction was eluted using 3M NaCl regeneration.

Проведенный процесс очистки показан ниже:
Этап Твердый хроматографический носитель
Очистка Быстрый поток через синюю сефарозу 6
Очистка Быстрый поток через хелатобразующую сефарозу
Захват ионов Быстрый поток через хелатобразующую сефарозу
Очистка Быстрый поток через сефарозу SP
Примеры:
Пример 1. Культура клеток и ферментация для получения ЕРО
Рекомбинантный ЕРО получают с использованием методов генной инженерии, и он экспрессируется в клетках яичников китайского хомячка (СНО) путем трансформации плазмидами pKG-Xho-EPO-Hind, содержащими ген эритропоэтина человека, и pSV2 DHFR, клонированными в клетках CHO-DHFR.The cleaning process performed is shown below:
Stage Solid Chromatographic Carrier
Purification Fast flow through blue Sepharose 6
Purification Fast flow through chelating sepharose
Ion capture Fast flow through chelating sepharose
Purification Fast flow through Sepharose SP
Examples:
Example 1. Cell culture and fermentation to obtain EPO
Recombinant EPO is obtained using genetic engineering methods and is expressed in Chinese hamster ovary (CHO) cells by transformation with pKG-Xho-EPO-Hind plasmids containing the human erythropoietin gene and pSV2 DHFR cloned in CHO-DHFR cells.

Конечный продукт представлял собой клеточную линию, которая вырабатывала 10⁷ единиц ЕРО на 1 л культуры за 24 ч. Клетки растут в среде DMEM-F12 с добавлением 5% бычьей эмбриональной сыворотки, 26 мМ бикарбоната натрия, 15 мМ Hepes, 6 мМ глутамина, 1 мМ пирувата натрия и 10^-5 М 2-меркаптоэтанола.The final product was a cell line that produced 10 ⁷ units of EPO per 1 liter of culture in 24 hours. Cells were grown in DMEM-F12 supplemented with 5% bovine fetal serum, 26 mM sodium bicarbonate, 15 mM Hepes, 6 mM glutamine, 1 mM sodium pyruvate and 10 ^-5 M 2-mercaptoethanol.

Для обеспечения достаточного прикрепления и пролиферации клеток готовят культуру в колбе в соответствующей концентрации. Время удвоения составило 16 ч. Культуру получают в Т-образных колбах, затем во вращающихся колбах. На 7-й день линия в стационарной культуре вырабатывала эритропоэтин в концентрации 20 мкг/мл. To ensure sufficient attachment and proliferation of cells, a culture is prepared in a flask in an appropriate concentration. The doubling time was 16 hours. The culture was obtained in T-shaped flasks, then in rotating flasks. On the 7th day, the line in a stationary culture produced erythropoietin at a concentration of 20 μg / ml.

Получение инокулята
Питательной средой, используемой для получения инокулята, была DMEM-F12, содержащая 5% бычью эмбриональную сыворотку с добавлением 26 мМ бикарбоната натрия, 15 мМ Hepes, 6 мМ глутамина, 1 мМ пирувата натрия и 10^-5 М 2-меркаптоэтанола.Inoculum Preparation
The culture medium used to prepare the inoculum was DMEM-F12 containing 5% bovine fetal serum supplemented with 26 mM sodium bicarbonate, 15 mM Hepes, 6 mM glutamine, 1 mM sodium pyruvate and 10 ^-5 M 2-mercaptoethanol.

Для получения инокулята размораживают ампулу, содержащую 10х10⁶ клеток. Проводят посев в колбы размером 175 см² при концентрации 0,2х10⁶ клеток/мл. В качестве контролей засевают 4 ячейки в концентрации 2х10⁵ клеток/мл в 1 мл конечного объема; в результате жизнеспособность превысила 80%.To obtain an inoculum, an ampoule containing 10x10 ⁶ cells is thawed. Sow in flasks measuring 175 cm ² at a concentration of 0.2 x 10 ⁶ cells / ml. As controls, 4 cells are seeded at a concentration of 2x10 ⁵ cells / ml in 1 ml of the final volume; as a result, vitality exceeded 80%.

На 7-й день из этих ячеек собирают надосадочную жидкость. Концентрацию ЕРО определяют методом ELISA, и она в результате превысила 70% величины исходного раствора, содержащего размороженное содержимое ампулы. On day 7, supernatant was collected from these cells. The concentration of EPO is determined by the ELISA method, and as a result it exceeded 70% of the value of the initial solution containing the thawed contents of the ampoule.

Количество клеток, полученных из засеянных колб и использованное для инокуляции ферментера, при размораживании составило 1500х10⁶. Их сначала пересевают в колбы размером 175 см², а затем переносят во вращающиеся колбы. Кроме того, в момент инокуляции клетки из одного и того же размороженного инокулята повторно высевают для получения повторной инокуляции тем же количеством клеток через 7 дней после проведения первой инокуляции. Это дает всего 3000х10⁶ клеток на 1 ферментер.The number of cells obtained from seeded flasks and used to inoculate the fermenter during defrosting was 1500 × 10 ⁶ . They are first replanted into flasks measuring 175 cm ² and then transferred to rotating flasks. In addition, at the time of inoculation, cells from the same thawed inoculum are re-plated to obtain re-inoculation with the same number of cells 7 days after the first inoculation. This gives a total of 3,000 x 10 ⁶ cells per fermenter.

Процесс ферментации
Ферментацию проводят в биореакторе Acusyst-Jr., в который по его экстракапиллярному пространству подается среда DMEM-F12, содержащая 5% бычью эмбриональную сыворотку, и через внутрикапиллярное пространство подается основная среда без сыворотки. Клетки инокулируют в экстракапиллярном пространстве картриджа, где создаются условия для роста. После повторной инокуляции через день проводят сбор среды из экстракапиллярного пространства, обогащенной эритропоэтином.Fermentation process
Fermentation is carried out in an Acusyst-Jr. Bioreactor, into which DMEM-F12 medium containing 5% bovine fetal serum is fed through its extracapillary space, and the main medium without serum is fed through the intracapillary space. Cells are inoculated in the extracapillary space of the cartridge where growth conditions are created. After repeated inoculation, the medium is collected every other day from the extracapillary space enriched in erythropoietin.

Циклы в целом составляли 45 дней. The cycles were 45 days in total.

Пример 2. Очистка эритропоэтина
I этап: Аффинная хроматография в синей сефарозе
Предварительно колонку синей сефарозы уравновешивают связывающим буфером: 20 мМ Tris-HCl, 1% Tween-20 при рН 7,5. Надосадочную жидкость наносят непосредственно на колонку синей сефарозы в концентрации 0,2 мг/мл ЕРО/1 мл геля. Затем проводят этап промывания 20 мМ Tris-HCl, 1% Tween-20, 400 мМ NaCl, рН 7,5, и ЕРО элюируют в объеме 10 мл со временем удерживания 20 мин путем промывания 20 мМ Tris-HCl, 1% Tween-20 2,5 М NaCl, pH 7,5. Использовали скорость 60 см/ч, и элюируемую фракцию собирают до тех пор, пока величина оптической плотности не достигнет исходного уровня, и проводят дальнейшую обработку.Example 2. Purification of erythropoietin
Stage I: Affinity Chromatography in Blue Sepharose
Preliminarily, the blue Sepharose column was equilibrated with binding buffer: 20 mM Tris-HCl, 1% Tween-20 at pH 7.5. The supernatant is applied directly to a blue Sepharose column at a concentration of 0.2 mg / ml EPO / 1 ml gel. Then, the washing step is carried out with 20 mM Tris-HCl, 1% Tween-20, 400 mM NaCl, pH 7.5, and EPO is eluted in a volume of 10 ml with a retention time of 20 minutes by washing with 20 mM Tris-HCl, 1% Tween-20 2.5 M NaCl, pH 7.5. A speed of 60 cm / h was used, and the eluted fraction was collected until the optical density reached the initial level, and further processing was carried out.

Полученные на этой стадии результаты представлены на фиг.1. The results obtained at this stage are presented in figure 1.

II этап: Хроматография по сродству с металлом
Колонку загружают ионом Сu²⁺ в присутствии дистиллированной воды в соответствии со следующей процедурой: гель промывают тремя объемами колонки дистиллированной воды; затем колонку загружают двумя объемами колонки 0,1 М раствора CuSO₄ и снова промывают пятью объемами колонки дистиллированной воды.Stage II: Affinity Chromatography
The column is loaded with Cu ^{2+ ion} in the presence of distilled water in accordance with the following procedure: the gel is washed with three volumes of a column of distilled water; then the column is loaded with two column volumes of a 0.1 M CuSO ₄ solution and washed again with five column volumes of distilled water.

После этого этапа колонку уравновешивают 20 мМ Na_zHPO₄, 500 мМ NaCl при pH 7,2. После предварительного уравновешивания образец наносят в тот же буфер. ЕРО окончательно элюируют со временем удерживания 20 мин с помощью 20 мМ Na₂HPO₄, 500 мМ NaCl при pH 3,5 в объеме 10 мл.After this step, the column is equilibrated with 20 mM Na _z HPO ₄ , 500 mM NaCl at pH 7.2. After preliminary balancing, the sample is applied to the same buffer. EPO was finally eluted with a retention time of 20 minutes with 20 mM Na ₂ HPO ₄ , 500 mM NaCl at pH 3.5 in a volume of 10 ml.

Полученные на этом этапе результаты показаны на фиг.2. The results obtained at this stage are shown in figure 2.

III этап: ионообменная хроматография на SP-Сефарозе
На этом этапе достигается разделение изоформ, присутствующих в образце, на две фракции: щелочную и кислую.Stage III: ion exchange chromatography on SP-Sepharose
At this stage, separation of the isoforms present in the sample into two fractions is achieved: alkaline and acidic.

Образец наносят на колонку, предварительно уравновешенную связывающим буфером 20 мМ Tris-HCl при pH 6,35. Пик поглощения не связывающейся фракции собирают, элюируя объемом 5 мл со временем удерживания 10 мин. Таким образом собирают кислую фракцию, которая содержит активные изоформы ЕРО. The sample is applied to a column pre-equilibrated with 20 mM Tris-HCl binding buffer at pH 6.35. The absorption peak of the non-binding fraction was collected eluting with a volume of 5 ml with a retention time of 10 minutes. In this way, an acid fraction is collected which contains the active isoforms of EPO.

Пример 3. Характеристика молекулы эритропоэтина, полученной описанным способом
a) Биологическая активность, или сила, ЕРО
Использованный метод (Cotes et al., Nature 191, 1961) позволяет оценить активность препарата путем определения включения радиоактивного железа (Fe⁵⁹) в клетки крови трансформированных мышей с полицитемией в условиях воздействия сниженного атмосферного давления.Example 3. Characterization of the erythropoietin molecule obtained by the described method
a) Biological activity, or strength, EPO
The method used (Cotes et al., Nature 191, 1961) allows us to evaluate the activity of the drug by determining the incorporation of radioactive iron (Fe ⁵⁹ ) into the blood cells of transformed mice with polycythemia under conditions of reduced atmospheric pressure.

Эта методика обеспечивает возможность оценки активности эритропоэтина, полученного с помощью ранее описанной системы очистки. This technique provides the ability to evaluate the activity of erythropoietin obtained using the previously described purification system.

b) Анализ R-HuEPO с помощью вестерн-блоттинга
Препарат ЕРО идентифицировали как положительный с помощью методики вестерн-блоттинга, когда его получали в результате положительной реакции, при молекулярном весе 34 кДа, с помощью специфического моноклонального антитела против ЕРО.b) Western blot analysis of R-HuEPO
EPO was identified as positive using Western blotting when it was obtained as a result of a positive reaction, with a molecular weight of 34 kDa, using a specific monoclonal antibody against EPO.

Полученные на этом этапе результаты показаны на фиг.4. The results obtained at this stage are shown in figure 4.

с) Анализ чистоты с помощью жидкостной хроматографии быстрого разрешения или с обращенной фазой
В трех препаратах, полученных с помощью описанного способа, чистота молекулы составила 99,9%. На фиг. 5 хроматографический профиль показывает степень чистоты ЕРО, полученного с помощью обоих способов.c) Purity analysis by flash or reverse phase liquid chromatography
In three preparations obtained using the described method, the purity of the molecule was 99.9%. In FIG. 5, the chromatographic profile shows the purity of EPO obtained using both methods.

d) Определение типа изоформы с помощью изоэлектрического фокусирования
Эти данные подтверждают способность описанного способа разделять неактивные и активные изоформы в щелочной фракции и в кислой фракции. Тип изоэлектрического фокусирования показан на фиг.6.d) Determination of the type of isoform using isoelectric focusing
These data confirm the ability of the described method to separate inactive and active isoforms in the alkaline fraction and in the acidic fraction. The type of isoelectric focusing is shown in Fig.6.

e) Содержание сиаловой кислоты. e) Sialic acid content.

Содержание сиаловой кислоты в полученных препаратах выражено следующим образом в молях сиаловой кислоты на моль белка: 13,40 молей/моль, 13,42 моля/моль, 15,30 молей/моль. The sialic acid content in the resulting preparations is expressed as follows in moles of sialic acid per mole of protein: 13.40 moles / mol, 13.42 moles / mol, 15.30 moles / mol.

Пример 4. Фармакокинетическая характеристика эритропоэтина
Фармакокинетическое поведение рекомбинантного эритропоэтина человека изучают у пациентов с хронической почечной недостаточностью. Оценивают сывороточную концентрацию молекулы в следующие периоды времени: 0, 0,25, 0,75, 1, 2, 3, 4, 6, 8, 12, 16 и 24 ч. При использовании анализа компартментализации экспоненциальная модель соответствовала фармакокинетическому профилю каждого индивидуума.Example 4. Pharmacokinetic characteristics of erythropoietin
The pharmacokinetic behavior of recombinant human erythropoietin is studied in patients with chronic renal failure. The serum concentration of the molecule is evaluated in the following time periods: 0, 0.25, 0.75, 1, 2, 3, 4, 6, 8, 12, 16, and 24 hours. When using the compartmentalization analysis, the exponential model corresponded to the pharmacokinetic profile of each individual.

Получают двухкомпартментную модель и определяют следующие фармакокинетические показатели: период полужизни альфа и бета (t_1/2α, t_1/2β), площадь под кривой (AUC), площадь под кривой в первый момент против кривой динамики (AUMC), клиренс (Сl), объем распределения центрального компартмента (Vc), стационарный объем распределения (Vss) и среднюю продолжительность присутствия (MRT).A two-compartment model is obtained and the following pharmacokinetic parameters are determined: half-life of alpha and beta (t _1/2 α, t _1/2 β), area under the curve (AUC), area under the curve at the first moment against the dynamics curve (AUMC), clearance ( Cl), the distribution volume of the central compartment (Vc), the stationary distribution volume (Vss) and the average duration of presence (MRT).

Средние величины фармакокинетических показателей были следующие:
t_1/2α: - 1,87 ч
t_1/2β - 15,4 ч
AUC: - 8262/82 мкг•ч/л
AUMC: - 146953,2 мкг•ч/л
Cl: - 0,36 л/ч
Vc: - 3,05 л
Vss: - 6,45 л
MRT: - 9/37 ч
На фиг.7 показан пример фармакокинетического профиля.The average pharmacokinetic values were as follows:
t _1/2 α: - 1.87 h
t _1/2 β - 15.4 h
AUC: - 8262/82 mcg • h / l
AUMC: - 146,953.2 mcg • h / l
Cl: - 0.36 l / h
Vc: - 3.05 L
Vss: - 6.45 L
MRT: - 9/37 h
7 shows an example of a pharmacokinetic profile.

Пример 5. Фармацевтическая композиция, содержащая эритропоэтин
Была получена фармацевтическая композиция для лечения анемии, которая содержит рекомбинантный эритропоэтин человека в количестве 4000 ME на 1 мл и в качестве наполнителя 2,5 мг альбумина человека, 5,8 мг цитрата натрия, 0,069 мг лимонной кислоты и 1 мл воды для инъекций.Example 5. Pharmaceutical composition containing erythropoietin
A pharmaceutical composition for the treatment of anemia was obtained that contains 4000 IU recombinant human erythropoietin per ml and 2.5 mg human albumin, 5.8 mg sodium citrate, 0.069 mg citric acid and 1 ml of water for injection as a filler.

Пример 6. Оценка терапевтической эффективности композиции, содержащей эритропоэтин
Эффективность рекомбинантного эритропоэтина человека оценивали у 23 пациентов, и в пределах 13 нед. лечения получили возрастание величин гематокрита с 24 до 33%. Во время клинического испытания у 100% пациентов анемия была устранена без гемотрансфузии (фиг.8а и 8b). Средняя использованная доза составила 60,8 МЕ/кг.Example 6. Evaluation of the therapeutic efficacy of a composition containing erythropoietin
The effectiveness of recombinant human erythropoietin was evaluated in 23 patients, and within 13 weeks. treatment received an increase in hematocrit from 24 to 33%. During a clinical trial, in 100% of patients, anemia was resolved without blood transfusion (Figs. 8a and 8b). The average dose used was 60.8 IU / kg.

Краткое описание чертежей
Фиг.1 - Профиль аффинной хроматографии рекомбинантного эритропоэтина человека в сефарозе Cibacron Blue.Brief Description of the Drawings
Figure 1 - Profile affinity chromatography of recombinant human erythropoietin in Cibacron Blue Sepharose.

Фиг.2 - Профиль аффинной хроматографии эритропоэтина в хелатах металлов. Figure 2 - Profile affinity chromatography of erythropoietin in metal chelates.

Фиг.3 - Профиль ионообменной хроматографии эритропоэтина в сефарозе SP. Figure 3 - Profile of ion-exchange chromatography of erythropoietin in Sepharose SP.

Фиг. 4 - Образец иммунологического распознавания рекомбинантного эритропоэтина человека с помощью вестерн-блоттинга. FIG. 4 - Sample of immunological recognition of recombinant human erythropoietin using Western blotting.

Фиг.5 - Хроматограмма определения чистоты. Figure 5 - Chromatogram for determining purity.

Фиг.6 - Образец изоэлектрического фокусирования. 6 - Sample isoelectric focusing.

Фиг.7 - Фармакокинетический профиль пациента. 7 - Pharmacokinetic profile of the patient.

Фиг.8 - Клинические результаты терапевтического действия эритропоэтина:
a) возрастание величин гематокрита;
b) показатель трансфузий до и после лечения эритропоэтином.Fig - Clinical results of the therapeutic effect of erythropoietin:
a) an increase in hematocrit values;
b) transfusion rate before and after erythropoietin treatment.

Claims (3)

1. Способ получения рекомбинантного эритропоэтина человека из трансформированных клеток СНО, вырабатывающих указанный рекомбинантный эритропоэтин человека, отличающийся следующими этапами: a) культивированием трансформированных клеток СНО, вырабатывающих рекомбинантный эритропоэтин человека, в половолоконных биореакторах с использованием концентрации инокулята в диапазоне 1000-1500•10⁶ клеток в 200 мл, из культуры предварительно выращенных клеток, а затем культивированных в роллерных колбах; b) повторной инокуляцией биореакторов с использованием такого же исходного количества клеток через 7 дней после первой инокуляции; c) инкубацией клеточной культуры, полученной в соответствии с этапом (b), в течение 16 ч, пока в экспоненциальной фазе не будет достигнута нормальная плотность 2•10⁶ клеток/мл в стационарной культуре, и началом процесса ферментации путем непрерывной перфузии вплоть до 60 дней; d) сбором через день надосадочной жидкости, обогащенной рекомбинантным эритропоэтином человека, с культуры, полученной на стадии (с), до достижения полного цикла 45-60 дней клеточной культуры, затем центрифугированием культуральной среды при 1000 об/мин в течение 10 мин при 4^oС; е) очисткой супернатанта, полученного на стадии (d), с помощью аффинной хроматографии на колонке с синей сефарозой при быстром потоке, до концентрации 0,2-0,3 мг ЕРО/мл; f) очисткой фракции, полученной на стадии (е), с помощью аффинной хроматографии на колонке с хелатом металла при использовании иона Сu²⁺; g) очисткой фракции, полученной на стадии (f), с помощью ионообменной хроматографии на колонке SP-сефарозы с использованием 20 мМ буфера Tris-HCl с рН 6,35-6,5.1. A method for producing recombinant human erythropoietin from transformed CHO cells producing the indicated recombinant human erythropoietin, characterized in the following steps: a) culturing the transformed CHO cells producing human recombinant erythropoietin in hollow fiber bioreactors using an inoculum concentration in the range of 1000-1500 x 10 ⁶ in 200 ml, from a culture of pre-grown cells, and then cultured in roller flasks; b) re-inoculation of the bioreactors using the same initial number of cells 7 days after the first inoculation; c) incubating the cell culture obtained in accordance with step (b) for 16 hours until a normal density of 2 x 10 ⁶ cells / ml in a stationary culture is reached in the exponential phase, and the fermentation process begins by continuous perfusion up to 60 days; d) collecting every other day the supernatant enriched with recombinant human erythropoietin from the culture obtained in step (c) until a complete cycle of 45-60 days of cell culture is reached, then centrifuging the culture medium at 1000 rpm for 10 min at 4 ^o FROM; e) purification of the supernatant obtained in stage (d), using affinity chromatography on a column of blue Sepharose in fast flow, to a concentration of 0.2-0.3 mg EPO / ml; f) purification of the fraction obtained in step (e) using affinity chromatography on a metal chelate column using Cu ^{2+ ion} ; g) purification of the fraction obtained in step (f) using ion exchange chromatography on an SP-Sepharose column using 20 mM Tris-HCl buffer, pH 6.35-6.5. 2. Рекомбинантный эритропоэтин человека, отличающийся тем, что он получен способом по п. 1, имеет 98%-ую степень чистоты, обладает биологической активностью в 160 МЕ/мг, имеет активные изоформы в диапазоне рН 3-4, и имеет клиренс 0,36 л/ч, распределительный объем менее 6,45 л и среднее время удерживания более 9,37 ч. 2. Recombinant human erythropoietin, characterized in that it is obtained by the method according to claim 1, has a 98% degree of purity, has a biological activity of 160 IU / mg, has active isoforms in the pH range 3-4, and has a clearance of 0, 36 l / h, distribution volume less than 6.45 l and an average retention time of more than 9.37 hours. 3. Фармацевтическая композиция для лечения анемии, включающая в себя эритропоэтин человека и соответствующий наполнитель, отличающаяся тем, что содержит рекомбинантный эритропоэтин человека по п. 2 в концентрации 12-15 мкг/мл. 3. A pharmaceutical composition for treating anemia, comprising human erythropoietin and an appropriate excipient, characterized in that it contains the recombinant human erythropoietin according to claim 2 at a concentration of 12-15 μg / ml.

Images