KR20040083268A - Human granulocyte-colony stimulating factor conjugate having enhanced stability in blood and process for the preparation thereof - Google Patents

Human granulocyte-colony stimulating factor conjugate having enhanced stability in blood and process for the preparation thereof Download PDF

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KR20040083268A
KR20040083268A KR1020030017867A KR20030017867A KR20040083268A KR 20040083268 A KR20040083268 A KR 20040083268A KR 1020030017867 A KR1020030017867 A KR 1020030017867A KR 20030017867 A KR20030017867 A KR 20030017867A KR 20040083268 A KR20040083268 A KR 20040083268A
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Abstract

PURPOSE: A conjugate of a recombinant human granulocyte-colony stimulating factor(hG-CSF) derivative and a polyethylene glycol(PEG) molecule is provided which has enhanced stability in blood. Also, a process for the preparation thereof by modification with PEG is provided. The conjugate of recombinant hG-CSF derivative and PEG molecule has increased retention time, reduced antigenicity and highly improved biological activity. CONSTITUTION: The conjugate of recombinant human granulocyte-colony stimulating factor(hG-CSF) derivative and polyethylene glycol(PEG) having enhanced stability in blood comprises one molecule of PEG in the amino terminal sequence of the hG-CSF derivative, wherein the PEG is bound to the alpha-amino group of the amino acid at the amino terminal sequence of the recombinant hG-CSF derivative; and PEG has a molecular weight of 2 to 100 kDa, preferably 10 to 40 kDa.

Description

안정성이 증가된 인간 과립구 콜로니 자극인자 융합체 및 이의 제조 방법 {HUMAN GRANULOCYTE-COLONY STIMULATING FACTOR CONJUGATE HAVING ENHANCED STABILITY IN BLOOD AND PROCESS FOR THE PREPARATION THEREOF}HUMAN GRANULOCYTE-COLONY STIMULATING FACTOR CONJUGATE HAVING ENHANCED STABILITY IN BLOOD AND PROCESS FOR THE PREPARATION THEREOF}

본 발명은 인간 과립구 콜로니 자극인자 유도체의 아미노산 서열 중 특정 잔기를 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)로 개질한 인간 과립구 콜로니 자극인자 유도체의 융합체에 관한 것이다.The present invention relates to a fusion of human granulocyte colony stimulator derivatives wherein certain residues in the amino acid sequence of the human granulocyte colony stimulator derivatives are modified with polyethylene glycol (PEG).

콜로니 자극인자 (Colony Stimulating Factor, CSF)는 골수간세포와 백혈구의 분열과 분화를 지시하는 사이토카인으로 과립구 자극인자 (Granulocyte Colony Stimulating Factor, G-CSF)를 포함한 일부 CSF들은 골수 밖에서 세포들의 분열 및 분화를 촉진한다. 정제된 G-CSF는 골수세포로부터 호중구성 과립구 콜로니의 생성을 촉진하고 최종 단계로의 분화를 유도하며 (Nicola et. al.,JBC258(14):9017-9023, 1983), 백혈병 세포주가 스스로 복제 증식하는 것을 억제하는 (Nicola,Leukemia Research, 9(1):35-50, 1985) 당단백질로서 단핵세포, 섬유아세포와 내피세포에서 생성된다. 또한, 사람의 종양 세포주인 CHU-2 세포 (Nomura et al.,EMBO J. 8(5):871-876, 1986)와 방광암 세포 5637 (Welte et al.,Proc. Narl. Acad. Sci. USA82:1526-1530, 1985; Strige et al.,Blood69(5):1508-1523, 1987)의 배양에서 과립구 콜로니 자극 활성을 갖는 물질이 존재함을 확인하였으며, 이로부터 정제된 G-CSF는 분자량이 18,000 내지 19,000 달톤이고, 등전점이 6.1 (당쇄화 정도에 따라 pI 값이 5.5-6.1)임이 밝혀졌다 (Nomura et al.,EMBO J.5(5):871-876, 1986). G-CSF에 의해 생성되는 호중구성 과립구는 10 내지 20 ㎛의 직경으로 백혈구의 70% 이상을 차지하고 있으며 세균의 감염으로부터 포유동물을 보호하는데 중요한 역할을 하지만, 대식세포나 단핵세포에 비해 생존기간이 짧아 골수에 존재하는 다능성 간세포 (pluripotent stem cell)로부터 지속적으로 생성되어야만 한다. G-CSF의 효과는 동물에 투여된 G-CSF의 양에 의해 조절되며, G-CSF의 투여를 중단하면 혈액내의 호중구수는 정상적인 수를 유지하게 된다. 그러나, 수용체를 갖고 있지 않는 적혈구나 단구성세포 및 임파세포에는 변화가 없다. 골수세포나 비장세포에서, 이 수용체는 호중구성 과립구세포로의 진행에 필수적이다. 성숙된 호중구세포도 G-CSF 수용체를 갖고 있어, G-CSF가 성숙한 세포를 활성화시킨다는 것을 제시하고 있다. 세포당 수용체의 수는 약 50 내지 500개이며, 1/2의 최대 증식반응을 일으키는데 요구되는 G-CSF의 농도가 약 10 pM인데 비해 G-CSF의 수용체에 대한 해리상수 (kd)는 약 60 내지 80 pM이므로 이것은 G-CSF에 의한 증식반응이 낮은 수준의 수용체 점유상태 (receptor occupancy)에서 이루어진다는 것을 말해준다. G-CSF는 호중구의 원시 세포뿐만 아니라 성숙 세포에도 영향을 미친다. 즉, G-CSF는 성숙 호중구세포의 생존을 증진시키고 (Begley et al.,Blood68(1):162-166, 1986) 대부분의 사람에서 급성 골수성 백혈병 세포들을 성숙 세포로 분화시키지 않음으로써 호중구를 특이적으로 활성화시킬 수 있다고 보고되고 있다 (Lopez et al.,J. Immunol. 131(6):2983-2988, 1983; Platzer et al.,J. Exp. Med. 162:1788-1801, 1985). 또한, 5-플루오로우라실 (Fluorouracil)과 시클로포스포아미드 (cyclophosphoamide)를 처리하여 호중구 감소증을 유도한 동물에 G-CSF를 투여할 때에도 호중구 세포 생성은 현저하게 증가되었다. 이러한 현상을 토대로 한 임상 실험에서, 화학요법을 받은 악성종양 환자 (Bronchud et al.,Br. J. Cancer56:809-813, 1987; Gabrilove et al.,New England J. Med. 318(22):1414-1422, 1988)와 방사성 동위원소나 시클로포스포아미드와 같은 약제 처리를 한 다음 골수세포 이식을 받은 환자의 (Kodo et al.,Lancet. 2:38-39, 1988) 경우 모두에서 G-CSF의 투여는 약간의 뼈에 통증을 느낄 뿐, 거의 부작용을 일으키지 않고 호중구성 과립구 세포의 증가를 유도하였다. 이는 화학요법이나 골수이식 후에 호중구성 과립구 세포의 정상적인 수준으로의 회복이 지연되면 발생할 수 있는 세균이나, 곰팡이 감염의 위험성을 막는데 도움을 주게된다는 것을 의미하며 G-CSF의 임상적 적용은 호중구 감소증으로 고통을 받는 여러 경우의 환자의 치료에 효과가 있음을 보여준다.Colony Stimulating Factor (CSF) is a cytokine that directs the division and differentiation of bone marrow stem cells and white blood cells. Some CSFs, including Granulocyte Colony Stimulating Factor (G-CSF), divide and differentiate cells outside the bone marrow. To promote. Purified G-CSF promotes the production of neutrophil granulocyte colonies from myeloid cells and induces differentiation to the final stage (Nicola et. Al., JBC 258 (14): 9017-9023, 1983), and leukemia cell lines themselves Glycoprotein that inhibits replication and proliferation (Nicola, Leukemia Research , 9 (1): 35-50, 1985). It is produced in monocytes, fibroblasts and endothelial cells. In addition, human tumor cell lines, CHU-2 cells (Nomura et al., EMBO J. 8 (5): 871-876, 1986) and bladder cancer cells 5637 (Welte et al., Proc. Narl. Acad. Sci. USA 82: 1526-1530, 1985; Strige et al., Blood 69 (5): 1508-1523, 1987) and confirmed the presence of a substance with granulocyte colony-stimulating activity, from which G-CSF was purified. It was found that the molecular weight is 18,000 to 19,000 daltons, and the isoelectric point is 6.1 (pI value is 5.5-6.1 depending on the degree of glycosylation) (Nomura et al., EMBO J .5 (5): 871-876, 1986). Neutrophil granulocytes, produced by G-CSF, occupy more than 70% of leukocytes with a diameter of 10 to 20 µm and play an important role in protecting mammals from bacterial infections, but have a longer survival compared to macrophages or monocytes. It must be short and continuously produced from pluripotent stem cells present in the bone marrow. The effect of G-CSF is controlled by the amount of G-CSF administered to the animal, and stopping the administration of G-CSF maintains the normal number of neutrophils in the blood. However, there is no change in red blood cells, monocytic cells, and lymph cells that do not have a receptor. In myeloid or splenocytes, this receptor is essential for progression to neutrophil granulocytes. Mature neutrophils also have G-CSF receptors, suggesting that G-CSF activates mature cells. The number of receptors per cell ranges from about 50 to 500, and the concentration of G-CSF required to produce a maximal half proliferative response is about 10 pM, whereas the dissociation constant (kd) for the receptor of G-CSF is about 60 Since it is 80 pM, this indicates that the proliferative response by G-CSF occurs at low levels of receptor occupancy. G-CSF affects mature cells as well as primitive cells of neutrophils. In other words, G-CSF promotes the survival of mature neutrophils (Begley et al., Blood 68 (1): 162-166, 1986) and induces neutrophils by not differentiating acute myeloid leukemia cells into mature cells in most humans. It is reported that it can be specifically activated (Lopez et al., J. Immunol . 131 (6): 2983-2988, 1983; Platzer et al., J. Exp. Med . 162: 1788-1801, 1985). . In addition, neutrophil cell production was significantly increased when G-CSF was administered to neutropenia-treated animals treated with 5-fluorouracil and cyclophosphoamide. In clinical trials based on this phenomenon, patients with malignant tumors who received chemotherapy (Bronchud et al., Br. J. Cancer 56: 809-813, 1987; Gabrilove et al., New England J. Med . 318 (22) (1414-1422, 1988) and patients receiving bone marrow cell transplantation following treatment with radioisotopes or cyclophosphoamide (Kodo et al., Lancet . 2: 38-39, 1988). Administration of -CSF only caused some bone pain, leading to an increase in neutrophil granulocyte cells with little side effects. This means that delayed recovery of neutrophil granulocyte cells to normal levels after chemotherapy or bone marrow transplantation may help to prevent the risk of bacterial or fungal infections. Clinical application of G-CSF is associated with neutropenia. It has been shown to be effective in the treatment of patients suffering from pain.

재조합 DNA 기술은 G-CSF의 분자적, 유전적 성질을 밝혀주었고 (Clark and Kamen,Science236:1229-1237, 1987) 재조합 G-CSF를 사용하여 생체내와 생체외에서의 기능이 많이 연구되어 왔다. CHU-2 세포와 사람의 방광암 세포 5637에서 mRNA를 분리하여 조제된 cDNA 라이브러리에서 사람 G-CSF 유전자가 클로닝되었다 (Nagata et al.,Nature319:415-418, 1986; Nagata et al.,EMBO J. 5(3):575-581, 1986; Souza et al.,Science232:61-65, 1986). 이들 cDNA로부터 염기서열을 조사한 결과, 아미노산 숫자가 207개와 204개인 두 종류의 mRNA가 확인되었고 이들의 N-말단의 30개의 아미노산은 분비를 위한 전서열이었다. 이 두 G-CSF의 차이점은 N-말단으로부터 35번째 아미노산에 3개의 아미노산 (Val-Ser-Glu)의 유무에기인한다. 따라서, 성숙한 G-CSF 단백질은 174개의 아미노산을 갖거나 177개의 아미노산을 갖게 된다. 174개의 아미노산을 갖는 G-CSF는 177개의 아미노산을 갖는 것보다 20배의 활성을 갖는다. 그러나, 사람의 체내에서 두 종류 모두의 G-CSF가 실제로 발현되는지에 대해서는 아직 알려져 있지 않다. 사람 G-CSF는 N-당쇄화에 대한 아미노산 (Asn-X-Ser/Thr) 서열을 갖고 있지 않으나, 133번째 아미노산인 Thr에 O-당쇄화 부위를 갖고 있다.Recombinant DNA technology has revealed the molecular and genetic properties of G-CSF (Clark and Kamen, Science 236: 1229-1237, 1987) and the use of recombinant G-CSF has been extensively studied in vivo and ex vivo. . Human G-CSF gene was cloned from cDNA library prepared by separating mRNA from CHU-2 cells and human bladder cancer cell 5637 (Nagata et al., Nature 319: 415-418, 1986; Nagata et al., EMBO J). 5 (3): 575-581, 1986; Souza et al., Science 232: 61-65, 1986). As a result of sequencing of these cDNAs, two mRNAs with 207 amino acids and 204 amino acids were identified, and 30 amino acids at the N-terminus were used for secretion. The difference between these two G-CSFs is due to the presence or absence of three amino acids (Val-Ser-Glu) at the 35th amino acid from the N-terminus. Thus, mature G-CSF proteins have 174 amino acids or 177 amino acids. G-CSF with 174 amino acids has 20 times more activity than having 177 amino acids. However, it is not yet known whether both types of G-CSF are actually expressed in the human body. Human G-CSF does not have an amino acid (Asn-X-Ser / Thr) sequence for N-glycosylation, but has an O-glycosylation site at Thr, the 133th amino acid.

종래 G-CSF를 분리, 정제하는 방법으로 세포를 배양하여 그 상층액으로부터 G-CSF를 분리하는 세포 배양법이 이용되어 왔으나, 이 방법으로는 G-CSF가 낮은 농도로만 생산되며, 대량의 배양액으로부터 극미량의 G-CSF를 얻기 위해서는 복잡한 정제공정이 요구되어 왔다. 기존의 생산방법으로서 일본의 쥬가이사는 hG-CSF의 아미노산 서열 및 이를 코딩하는 유전자를 밝혀내었고 (대한민국 특허공고 제91-5624호 및 제92-2312호), 이를 이용하여 hG-CSF 활성을 가진 물질을 유전자 재조합 방법으로 제조하는 방법을 개시하였다 (대한민국 특허공고 제47178호, 제53723호 및 제57582호). 상기 방법들은 hG-CSF 아미노산 서열을 함유하는 게놈 DNA 유전자 또는 cDNA 유전자를 이용하여 포유동물 세포로부터 당쇄화된 hG-CSF 당단백질을 제조하는 방법이다. 상기 발명들에서 제조된 당쇄화된 hG-CSF는 O-글라이코시딕 당쇄 구조를 가지고 있으나, 당은 hG-CSF 활성에는 필수적이지 않은 것으로 알려져 있다 (Lawrence, M. et al.,Science 232:61, 1986). 또한, 포유동물세포를 이용하여 당쇄화된 hG-CSF를 수득하기 위해서는 고가의 배지 및 생산 방법이 요구되고 단점이 있다.Conventionally, a cell culture method of culturing cells and separating G-CSF from the supernatant has been used as a method of isolating and purifying G-CSF, but in this method, G-CSF is produced only at a low concentration, Complex purification processes have been required to obtain trace amounts of G-CSF. As a conventional production method, Japan's Jugai company has identified the amino acid sequence of hG-CSF and the gene encoding it (Korean Patent Publication Nos. 91-5624 and 92-2312), using which the hG-CSF activity was obtained. A method for preparing a substance having a compound by the method of genetic recombination has been disclosed (Korean Patent Publication Nos. 47178, 53723 and 57582). These methods are methods for preparing glycosylated hG-CSF glycoproteins from mammalian cells using genomic DNA genes or cDNA genes containing hG-CSF amino acid sequences. The glycated hG-CSF prepared in the above inventions has an O-glycosidic sugar chain structure, but the sugar is not essential for hG-CSF activity (Lawrence, M. et al., Science 232: 61, 1986). In addition, expensive medium and production methods are required and disadvantages in order to obtain glycated hG-CSF using mammalian cells.

또한, 원핵세포를 이용하여 비당쇄화된 hG-CSF를 수득하는 방법에 있어서는 사용한 대장균의 특성에 따라 개시코돈 위치에 존재하는 ATG 코돈에 의해 아미노 말단 위치에 메티오닌 잔기가 하나 더 첨가된 175개 또는 178개 아미노산으로 구성된 hG-CSF가 만들어지게 되고, 부가된 메티오닌 잔기로 인해 인체에 유해한 면역반응이 유발될 수 있다고 알려져 있다 (유럽 특허공개 제256,843호). 또한, 기존의 방법처럼 대장균을 숙주로 사용하면, 대부분의 hG-CSF는 불용성 물질로 세포질 내에 축적되므로 리폴딩 공정을 거쳐 활성화된 형태로 얻어야 하는데, 이때 역가의 손실이 많게 된다. 그리고, hG-CSF는 5개의 시스테인 잔기를 가지고 있으며 이중 4개는 이황화 (disulfide) 결합에 관여하고 1개의 시스테인 잔기는 자유로운 상태를 가지면서 폴딩의 역가 뿐만 아니라 단백질의 용액내 안정성을 낮춘다는 문제점을 피할 수 없게 된다. 그리고, 포유동물 세포배양을 이용해 얻은 당쇄화된 hG-CSF는 O-글라이코시딕 당쇄구조를 가지고 있으며 당은 비록 hG-CSF 활성에 필수적이진 않지만 고농도에서 응집 (aggregation)을 방지시켜 주는 것으로 알려져 있다. 그러나, 대장균에서 발현된 비당쇄화된 hG-CSF는 낮은 용해도 때문에 고농도시 쉽게 응집되는 문제점도 가지고 있다.In addition, in the method of obtaining unglycosylated hG-CSF using prokaryotic cells, 175 pieces of which one additional methionine residue was added to the amino terminal position by ATG codons present at the initiation codon position depending on the characteristics of E. coli used or It is known that hG-CSF consisting of 178 amino acids is made and that an added methionine residue can cause an immune response harmful to the human body (European Patent Publication No. 256,843). In addition, when E. coli is used as a host as in the conventional method, since most hG-CSF is accumulated in the cytoplasm as an insoluble substance, it must be obtained in an activated form through a refolding process. In addition, hG-CSF has five cysteine residues, four of which are involved in disulfide bonds, and one cysteine residue has a free state, thereby lowering the stability of protein as well as the folding activity. It is inevitable. In addition, glycated hG-CSF obtained using mammalian cell culture has an O-glycosidic sugar chain structure and sugar is known to prevent aggregation at high concentrations, although it is not essential for hG-CSF activity. have. However, the non-glycosylated hG-CSF expressed in E. coli also has a problem of easy aggregation at high concentrations due to low solubility.

최근 유전자 재조합 기술에 의해, 미생물을 숙주로 사용하여 유용단백질을 생산하는 것이 가능하게 되었으며, 주된 것으로 균체내 생산방법과 분비 생산방법을 들 수 있다. 균체내 생산방법은 세포질 내에 목적 단백질을 생산시키는 방법이며, 높은 생산량을 얻게 되는 것이 알려져 있다. 그러나, 세포질 내에 생산 축적한 단백질은 천연형 아미노산 배열의 N-말단에 메티오닌이 부가되며, 다량으로 생산된 재조합 단백질은 통상 불용성 형태로 얻어지게 되어, 추출 조작 후에 천연형과는 다른 고차구조를 형성하기 쉽다. 그 때문에, 균체내 생산방법에 있어서는 단백질의 고차구조를 천연형으로 바꾸기 위한 리폴딩의 공정이 필요하며, 이것은 제조공정에서 번잡한 공정이 추가로 필요함을 의미한다.Recent genetic recombination techniques have made it possible to produce useful proteins using microorganisms as hosts, the main examples of which include intracellular production and secretion production. Intracellular production is a method for producing a target protein in the cytoplasm, it is known that a high yield is obtained. However, the protein produced and accumulated in the cytoplasm is added with methionine at the N-terminus of the natural amino acid sequence, and the recombinant protein produced in large quantities is usually obtained in an insoluble form, forming a higher order structure different from the natural type after the extraction operation. easy to do. Therefore, the intracellular production method requires a step of refolding to change the higher order structure of the protein to a natural form, which means that a complicated process is additionally required in the manufacturing process.

한편, 분비 생산방법에서는 목적하는 재조합 단백질을 N-말단에 분비서열이 부가된 융합 단백질의 형태로 생산한다. 상기 융합 단백질이 세포질막을 투과할 때, 분비서열은 대장균 내의 효소에 의해 프로세싱되어 절단되고 천연형 형태로 목적 단백질이 분비된다. 분비 생산방법에서는 아미노산 배열 및 고차구조가 모두 천연형과 동일한 단백질을 얻을 수 있으므로 균체내 생산방법보다 유리하다. 그러나, 분비 생산방법은 균체내 생산방법에 비해서 막투과 및 프로세싱의 과정이 필요하기 때문에 생산량이 낮다. 특히, 포유류 유래의 단백질을 원핵생물을 사용해서 분비 생산하면, 원핵생물 유래의 단백질을 분비 생산시킨 경우에 비해 생산 효율이 매우 낮은 것으로 알려져 있으므로, 보다 뛰어난 분비 생산방법이 요망된다.On the other hand, in the production method of secretion, the recombinant protein of interest is produced in the form of a fusion protein with a secretory sequence added to the N-terminus. When the fusion protein penetrates the cytoplasmic membrane, the secretion sequences are processed and cleaved by enzymes in Escherichia coli and the target protein is secreted in its natural form. In the production method of secretion, both the amino acid sequence and the higher order structure can obtain the same protein as the natural type, which is advantageous over the cell production method. However, the secretory production method is low in production because it requires a membrane permeation and processing process compared to the intracellular production method. Particularly, when a mammalian-derived protein is secreted and produced using a prokaryote, it is known that the production efficiency is very low compared to the case where a prokaryotic-derived protein is produced. Thus, a more excellent production method is required.

최근, 미생물의 단백질 분비에 관여하는 여러 인자들이 알려지고, 이를 이용해서 단백질을 효율 좋게 분비 생산하는 방법의 연구가 진행되고 있다. 그 하나로 분비서열에 대한 연구를 들 수 있다. 미생물이 단백질을 분비하는 데는, 상술한 바와 같이 세포질 내에서 합성된 융합단백질이 세포질막을 투과한 후 프로세싱에 의한 정확한 절단이 필요하다. 분비서열에 있어, N-말단의 정전하 영역의 양전하 부위와 중앙부 소수영역의 수가 중요한 것이 알려졌고, 이를 이용하는 연구도 진행되고 있다. 우타카 등은 바실러스 브레비스 (Bacillus brevis)를 숙주로 사용하는분비생산에 있어서, 바실러스 브레비스의 중간 외막 단백질의 분비서열 중 N-말단 부위에 염기성 아미노산인 아르기닌 (Arg)을 부가하고, 또한 중앙 부위에 소수성 아미노산인 루이신 (Leu)을 부가하는 유도체를 제조하여 분비효율을 높였다고 보고한 바 있다 (일본 특허공개 제평7-51072호). 그러나, 이 분비서열의 유도체에 대한 보편적인 지도원리는 없고, 시행착오에 의해 바람직한 배열을 발견해야만 하는 어려움이 있다. 따라서, 미생물을 이용하여 아미노 말단에 메티오닌 잔기가 부가되지 않은 가용성 hG-CSF를 대량으로 얻을 수 있는 방법이 요구되고 있다.Recently, various factors related to protein secretion of microorganisms are known, and researches on how to efficiently secrete proteins using them are being conducted. One example is the study of secretion sequences. As described above, microorganisms secrete proteins require precise cleavage by processing after the fusion protein synthesized in the cytoplasm has penetrated the cytoplasmic membrane. In the secretion sequence, it is known that the number of positive charge regions and central minority regions of the N-terminal static charge region is important, and studies using the same have been conducted. Utaka et al., In the production of secretion using Bacillus brevis as a host, adds basic amino acid arginine (Arg) to the N-terminal part of the secretion sequence of the middle outer membrane protein of Bacillus brevis, It has been reported to increase the secretion efficiency by preparing a derivative to which hydrophobic amino acid leucine (Leu) is added (Japanese Patent Laid-Open No. 7-51072). However, there is no universal guiding principle for derivatives of this secretion sequence, and there is a difficulty in finding a preferred arrangement by trial and error. Therefore, there is a need for a method for obtaining a large amount of soluble hG-CSF in which a methionine residue is not added at the amino terminus using a microorganism.

이에 본 발명자들은 상기 문제점을 해결하고자 예의 연구한 결과, 대장균 (E. coli)의 분비 단백질인 열안정성 엔테로톡신 Ⅱ의 분비서열을 변화시켜 높은 발현률을 나타내는 새로운 분비서열을 제조하였고 (한국 특허출원 제98-38061호), 이를 이용하여 천연형 hG-CSF를 얻을 수 있음을 알게 되었다. 즉, 대장균의 열안정성 엔테로톡신 Ⅱ의 변형된 분비서열 다음에 엔테로톡신 유전자 대신 hG-CSF 유전자를 연결시킨 유전자를 포함하는 발현 벡터를 제조하고 이를 이용하여 대장균을 형질전환시킴으로써 미생물의 분비 시스템을 이용하여 생물학적 활성을 갖는 천연형 hG-CSF를 발현시켰다. 그러나, 상당 부분의 hG-CSF는 페리플라즘 보다 세포질 내에 축적되었고, 프로세싱으로 진행되지 않은 상태로 남아 있었다. 이로부터 본 발명자들이 개발한 대장균의 열안정성 엔테로톡신 Ⅱ의 변형 분비서열을 사용하여도 hG-CSF의 발현량은 매우 증가하지만 세포내 생산과 비슷한 양상으로 발현됨을 확인할 수 있었다. 이러한 사실을 바탕으로, 본 발명자들은 hG-CSF의 일부 아미노산 잔기, 특히 17번째 시스테인 잔기를 다른 아미노산 잔기로 치환하여 제조된 hG-CSF 유도체의 유전자를 분비서열과 연결하여 발현시킬 경우 아미노 말단에 메티오닌 잔기가 부가되지 않은 형태로 페리플라즘으로 대량생산할 수 있음을 발견하고 이를 특허 출원한 바 있다 (한국 특허등록 제356140호).Accordingly, the present inventors made a thorough study to solve the above problems, and produced a new secretion sequence showing a high expression rate by changing the secretion sequence of the thermostable enterotoxin Ⅱ secretion protein of E. coli (Korean Patent Application No. 98-38061), it was found that the natural hG-CSF can be obtained. In other words, after the modified secretion sequence of E. coli thermostable enterotoxin II, an expression vector comprising a gene linked to the hG-CSF gene instead of the enterotoxin gene was prepared and transformed into E. coli to utilize the secretion system of the microorganism. To express a native type hG-CSF with biological activity. However, a significant portion of hG-CSF accumulated in the cytoplasm rather than periplasm and remained unprocessed. From this, even when the modified secretion sequence of the thermostable enterotoxin II of E. coli was developed, it was confirmed that the expression level of hG-CSF was greatly increased but expressed in a manner similar to intracellular production. Based on this fact, the present inventors have found that methionine at the amino terminus when expressing the gene of the hG-CSF derivative prepared by substituting some amino acid residues of the hG-CSF, in particular the 17th cysteine residue, with other amino acid residues in connection with the secretion sequence. It has been found and patented that it can be mass-produced with periplasm in the form of no residue added (Korean Patent Registration No. 356140).

한편, 단백질 의약품의 생체내 사용시 문제점으로 지적되는 것은 그것의 생체내 반감기가 극히 짧아 치료학적 효과를 나타내기 힘들며, 효과를 나타내기 위해서는 지속적으로 반복투여를 해야한다는데 있다. 따라서, 단백질의 생체내 반감기를 증가시켜 투여 횟수를 줄임으로써 치료학적 효과를 높이며 환자의 삶의 질을 높이기 위해 여러 단백질 제형화 연구와 화학변형이 연구되어 왔다. 그중 생체내 잔류기간을 증가시키기 위해 단백질과 PEG와 같은 합성 고분자와 결합시키는 방법이 시도되고 있다. 단백질 의약품을 합성 고분자와 결합시켜 단백질 분자의 표면 특성을 변화시키면 물 또는 유기용매에 대한 용해도를 증가시킬 수 있다. 또한, 이를 통해 생체 적합성을 증가시켜 면역 반응성을 감소시킬 수 있고, 생체 내에서의 안정성이 증가되며, 장관 시스템, 신장, 비장 또는 간에 의한 소실 (clearance)이 보다 천천히 이루어질 수 있다. 단백질의 분자량이 작을 경우 장관 시스템 또는 신장에서 여과되어 소실되는데 PEG와 같은 고분자를 결합시키면 이를 방지하게 된다 (Knauf, M. J. et al,J. Biol. Chem.263:15064, 1988). 따라서, 단백질 의약품에 고분자를 수식하는 것은 용액 내에서 단백질 분자의 안정성을 증가시킬 수 있다. 또한, 단백질의 내인성 (intrinsic) 표면 특성을 효과적으로 보호할 수 있어 비특이적 단백질 흡착을 방지할 수 있다. 이에 생물학적으로 활성이 있는 펩타이드 또는 단백질에 PEG를 결합시켜 체내 반감기를 연장하고 용해도를 증가시키며체내에서의 면역 반응을 감소시키는 효과에 대한 연구가 진행되었으며, 이는 미국 특허 제4,179,337호 (1996년 존속기간 만료)에서 처음 보고된 바 있다. 그 후 아데노신 디아미내이즈의 폴리에틸렌 글리콜화된 제형은 심한 복합 면역부전증을 치료하는데 효과가 있으며, 폴리에틸렌 글리콜화된 과산화물 불균화효소 (superoxide dismutase)는 머리 손상 치료용으로 임상에서 실험되고 있다. 폴리에틸렌 글리콜화된 알파 인터페론은 간염 치료를 위해 롯슈 (Roche)와 쉐링 (Schering)에서 각각 PEG-인트론 (Intron)과 페가시스 (Pegasys)란 상품명으로 출시되어 판매되고 있다. 그러나, 단백질과 PEG가 결합되었을 때 상기와 같은 장점으로 인하여 부작용이 많이 감소하는 것은 사실이지만, 동시에 PEG와 결합한 후에는 그 단백질이 활성에 필요한 부위가 PEG에 의해 가려져 생체 활성도가 무척 감소한다는 단점을 나타낸다.On the other hand, it is pointed out as a problem in the use of protein drugs in vivo, its short half-life in vivo is difficult to show a therapeutic effect, and in order to show the effect, it must be continuously repeated administration. Therefore, various protein formulation studies and chemical modifications have been studied to increase the therapeutic half-life and increase the quality of life of patients by increasing the in vivo half-life of proteins. Among them, a method of combining proteins and synthetic polymers such as PEG has been attempted to increase the duration of in vivo. Combining protein drugs with synthetic polymers to alter the surface properties of protein molecules can increase their solubility in water or organic solvents. It can also increase biocompatibility to reduce immune responsiveness, increase stability in vivo, and allow slower clearance by the intestinal system, kidney, spleen or liver. If the molecular weight of the protein is small, it is lost by filtration in the intestinal system or kidneys, and it is prevented by binding a polymer such as PEG (Knauf, MJ et al, J. Biol. Chem. 263: 15064, 1988). Thus, modifying polymers in protein pharmaceuticals can increase the stability of protein molecules in solution. In addition, it is possible to effectively protect the intrinsic surface properties of the protein to prevent non-specific protein adsorption. Research has been conducted on the effects of PEG binding to biologically active peptides or proteins to prolong half-life in the body, increase solubility, and reduce the immune response in the body, US Patent No. 4,179,337 (Duration 1996) Expiration) was first reported. Later, polyethylene glycolated formulations of adenosine diazamises are effective in treating severe complex immunodeficiency, and polyethylene glycolated superoxide dismutase has been clinically tested for the treatment of hair damage. Polyethylene glycolated alpha interferon is marketed under the trade names PEG-Intron and Pegasis from Roche and Schering for the treatment of hepatitis. However, it is true that the side effects are reduced due to the above advantages when the protein and PEG are combined, but at the same time, after the binding with PEG, the site required for the protein activity is blocked by PEG, which greatly reduces the bioactivity. Indicates.

현재까지 많이 쓰이고 있는 PEG는 단백질 표면의 하나 이상의 자유 라이신 (lysine) 잔기와 공유결합을 하여 PEG가 단백질의 표면에 부착되는데, 이때 단백질의 표면 중 단백질의 활성과 직접적으로 관계가 있는 부위가 PEG와 결합하면 그 활성이 감소하게 된다. 또한, PEG와 라이신 잔기의 결합은 대개 무작위적으로 일어나므로 많은 종류의 PEG화된 단백질 결합체들이 혼합물로 존재하게 되고, 결과적으로 원하는 결합체를 순수하게 분리하는 과정이 복잡하고 어려워진다. 예를 들어, 유럽 특허공개 제EP 0401384호는 폴리에틸렌 글리콜 분자가 부가된 G-CSF의 제조를 위한 물질 및 방법에 관하여 기술하고 있고, 유럽 특허공개 제EP 0335423호는 인체 과립구 군체 자극 인자 활성도를 가지는 변형된 폴리펩티드에 관하여 기술하고 있다. 그러나, 상기에서 언급한 발명에는 폴리에틸렌 글리콜 분자가 예측 가능한 특정 잔기에 결합하지 않으며, PEG가 라이신 잔기와 같은 단백질 내부에 위치해 있는 어떠한 반응기나 N-말단에 비선택적으로 결합하여 결과적으로 불균질한 집단이 생성된다. 예를 들어, 5개의 반응 라이신 잔기를 갖는 단백질 분자는 PEG와 반응시 어떤 것은 6개의 PEG 성분을 가지고, 어떤 것은 5개, 어떤 것은 4개, 어떤 것은 3개, 어떤 것은 2개, 어떤 것은 1개 및 0개의 PEG 성분을 가질 수도 있다. 또한, 몇 개의 PEG 성분을 갖는 분자 중에서, PEG 성분은 상이한 분자상의 동일 위치에 부가되지 않을 수도 있다. 이로 인해 PEG가 결합된 단백질의 생물학적 활성도와 약물동력학이 명확하게 예측될 수 없으며, 랏 (lot)과 랏의 단백질의 치료학적 효과가 다양하여 투여량을 정확히 결정할 수 없다는 문제점이 있다. 단백질의 특정 부위만을 PEG와 결합시키기 위해 미국 특허 제5,766,897호 및 국제 특허공개공보 제WO 00/42175호는 인간 성장 호르몬과 PEG를 결합시킴에 있어서 PEG가 인간 성장 호르몬의 활성부위와 반응하는 것을 피하기 위하여 PEG-말레이미드를 사용하여 PEG가 시스테인과 선택적으로 반응하도록 하였다. 그러나, 이러한 종류의 PEG를 사용하려면 인간 성장 호르몬에 이황화 결합에 관여하지 않은 자유 시스테인 잔기가 있어야 되지만 인간 성장 호르몬에 존재하는 4개의 시스테인 잔기는 모두 이황화 결합에 참여하고 있으므로 인간 성장 호르몬에 인위적으로 시스테인 잔기가 삽입된 인간 성장 호르몬 유도체를 사용하여 페길레이션 (pegylation) 반응을 수행하였다. 그러나, 이러한 방법은 페길레이션 반응에 사용한 단백질이 천연형이 아니며, 또한 자유 시스테인이 존재하는 단백질을 발현시키고 정제하는 과정이 통상적으로 용이하지 않기 때문에 원료 물질을 수득하기가 어렵다는 문제점이 있다. 1999년 12월5일에 공개된 유럽 특허 제0733067호는 G-CSF의 N-말단에 선택적으로 PEG를 결합시켜 균질한 G-CSF 조성물을 제조하는 방법을 기술하고 있다. PEG 분자의 선택적 결합에 의해 PEG의 장점을 살릴 수 있으나, 이때 사용한 G-CSF는 천연형이 아니며 대장균에서 봉입체 상태로 제조한 결과로 인해 첫 번째 아미노산은 메티오닌이 부과된 형태이다. 앞서 언급한 것처럼 부가된 메티오닌 잔기로 인해 인체에 유해한 면역반응이 유발될 수 있으며 봉입체 상태로 세포질 내에 축적되므로 리폴딩 공정을 거쳐 활성화된 형태로 얻어야 하는데, 이때 역가의 손실이 많아진다. 또한, 대장균에서 봉입체 상태로 제조한 G-CSF는 이황화 결합에 참여하지 않는 시스테인 잔기로 인해 단백질의 생산 수율 및 단백질의 용액내 안정성을 낮춘다는 문제점을 피할 수 없게 된다. 이에 본 발명자들은 상기 문제점을 극복하기 위해 천연형처럼 첫 번째 아미노산에 메티오닌이 부가되지 않고 자유 시스테인 잔기를 치환한 G-CSF를 제조하였으며, 이 물질에 하나의 PEG 분자를 아미노 말단에 결합시켜 치료적 효과를 극대화시킨 융합체를 제조 및 분리하여 본 발명을 완성하였다.PEG, which is widely used to date, covalently bonds with one or more free lysine residues on the surface of the protein, so that PEG is attached to the surface of the protein. When bound, their activity is reduced. In addition, the binding of PEG and lysine residues usually occurs randomly, so that many kinds of PEGylated protein binders exist in a mixture, resulting in a complicated and difficult process of purely separating the desired binder. For example, European Patent Publication No. EP 0401384 describes materials and methods for the preparation of G-CSF added with polyethylene glycol molecules, and European Patent Publication No. EP 0335423 has human granulocyte colony stimulating factor activity. Modified polypeptides are described. However, in the above-mentioned invention, the polyethylene glycol molecule does not bind to certain predictable residues, and PEG is non-selectively bound to any reactor or N-terminus located inside a protein such as a lysine residue, resulting in a heterogeneous population. Is generated. For example, a protein molecule with five reactive lysine residues, when reacted with PEG, has six PEG components, some five, some four, some three, some two, and one And may have 0 and 0 PEG components. In addition, among molecules having several PEG components, the PEG component may not be added at the same position on different molecules. As a result, the biological activity and pharmacokinetics of the PEG-binding protein cannot be clearly predicted, and there is a problem in that the dosage can not be accurately determined because the therapeutic effects of the lot and the protein of the lot vary. US Pat. No. 5,766,897 and WO 00/42175, which bind only PEG to specific sites of the protein, avoid the reaction of PEG with the active site of human growth hormone in binding PEG with human growth hormone. PEG-maleimide was used to allow PEG to selectively react with cysteine. However, this type of PEG requires free cysteine residues in human growth hormone that are not involved in disulfide bonds, but since all four cysteine residues in human growth hormones participate in disulfide bonds, they are artificially present in human growth hormone. Pegylation reactions were performed using residue-inserted human growth hormone derivatives. However, this method has a problem that it is difficult to obtain a raw material because the protein used in the PEGylation reaction is not a natural form and the process of expressing and purifying a protein in which free cysteine is present is not usually easy. European Patent No. 0733067, published December 5, 1999, describes a process for the production of homogeneous G-CSF compositions by selectively binding PEG to the N-terminus of G-CSF. Selective binding of PEG molecules can take advantage of PEG, but the G-CSF used at this time is not native and is the result of the production of the inclusion body in Escherichia coli, resulting in the first amino acid methionine-imposed form. As mentioned above, the added methionine residue may cause an immune response harmful to the human body and accumulate in the cytoplasm in the inclusion body state, so it must be obtained in an activated form through a refolding process. In addition, G-CSF prepared in the inclusion body in Escherichia coli cannot avoid the problem of lowering protein production yield and protein stability in solution due to cysteine residues that do not participate in disulfide bonds. In order to overcome the above problems, the present inventors prepared a G-CSF in which a free cysteine residue was substituted without adding methionine to the first amino acid, as in the natural form, and a single PEG molecule was attached to the amino terminal for therapeutic treatment. The present invention was completed by preparing and separating a fusion maximizing effect.

본 발명의 목적은 자유 시스테인 잔기를 다른 아미노산 잔기로 치환하여 용액내 안정성을 높인 G-CSF 유도체의 특정 부위, 구체적으로는 아미노 말단에 PEG 한 분자를 선택적으로 개질하여 생물학적 활성 저하를 최소화시키면서 G-CSF의 안정성 및 체내 잔류 시간을 증가시켜 생체내 활성이 지속되도록 하는 G-CSF 유도체의 PEG 융합체를 제공하는 것이다.An object of the present invention is to selectively modify a specific site of a G-CSF derivative having a high stability in solution by substituting a free cysteine residue with another amino acid residue, specifically, a molecule of PEG at an amino terminus, thereby minimizing a decrease in biological activity. It is to provide a PEG fusion of G-CSF derivatives to increase the stability of the CSF and the retention time in the body to sustain the activity in vivo.

도 1은 본 발명에 따라 제조된 40 kDa 및 20 kDa 모노-PEG-인간 과립구 콜로니 자극인자 유도체 융합체의 SDS-PAGE 젤 사진이고, 1 is an SDS-PAGE gel photograph of a 40 kDa and 20 kDa mono-PEG-human granulocyte colony stimulator derivative fusion prepared according to the present invention,

도 2는 본 발명에 따라 제조된 40 kDa 및 20 kDa 모노-PEG-인간 과립구 콜로니 자극인자 유도체 융합체의 크기 배제 크로마토그래피의 피크를 나타낸 것이고, 2 shows the peaks of size exclusion chromatography of 40 kDa and 20 kDa mono-PEG-human granulocyte colony stimulator derivative fusions prepared according to the present invention,

도 3은 본 발명에 따라 제조된 40 kDa 및 20 kDa 모노-PEG-인간 과립구 콜로니 자극인자 유도체 융합체의 펩티드 지도 (B)를 비수식 인간 과립구 콜로니 자극인자의 펩티드 지도 (A)와 비교한 것이고, FIG. 3 compares the peptide map (B) of the 40 kDa and 20 kDa mono-PEG-human granulocyte colony stimulator derivative fusions prepared according to the invention with the peptide map (A) of the non-modified human granulocyte colony stimulator,

도 4는 본 발명에 따라 제조된 40 kDa 및 20 kDa 모노-PEG-인간 과립구 콜로니 자극인자 유도체 융합체의 시험관내 활성을 측정한 것이고, 4 is a measurement of the in vitro activity of 40 kDa and 20 kDa mono-PEG-human granulocyte colony stimulator derivative fusions prepared according to the present invention,

도 5는 본 발명에 따라 제조된 40 kDa 모노 PEG-인간 과립구 콜로니 자극인자 유도체 융합체의 혈중 반감기를 확인하기 위한 약물동력학 그래프이다. 5 is a pharmacokinetic graph for identifying blood half-life of 40 kDa mono PEG-human granulocyte colony stimulator derivative fusions prepared according to the present invention.

상기 목적에 따라, 본 발명에서는 자유 시스테인 잔기를 다른 아미노산 잔기로 치환하여 용액내 안정성을 높인 G-CSF 유도체 (이후 'HM10411'이라고 약칭함)의 아미노 말단에 수용성 PEG 분자 하나를 선택적으로 수식시킨 PEG-G-CSF 유도체의 융합체를 제공한다.In accordance with the above object, in the present invention, PEG which selectively modifies one water-soluble PEG molecule at the amino terminal of G-CSF derivative (hereinafter abbreviated as 'HM10411') having enhanced stability in solution by substituting free cysteine residues with other amino acid residues Provided are fusions of -G-CSF derivatives.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail.

본 발명은 현재 치료용 단백질로 널리 사용되고 있는 인간 G-CSF의 안정성을 증가시킨 유도체인 HM10411을 PEG로 개질한 융합체 및 그의 제조방법에 관한 것이다. 특히, 호중구 생성을 자극하도록 G-CSF가 수용체와의 결합에 필요하지 않는 N-말단 (Hill et, al.,PNAS90:5167, 1993)을 선택적으로 PEG로 개질한 균질한 단백질 융합체 및 그의 제조방법에 관한 것이다.The present invention relates to a fusion modified PEG with HM10411, a derivative which increases the stability of human G-CSF, which is widely used as a therapeutic protein, and a method for producing the same. In particular, homogeneous protein fusions with PEG-modified N-terminus (Hill et, al., PNAS 90: 5167, 1993), in which G-CSF is not required for binding to receptors to stimulate neutrophil production, and their preparation It is about a method.

본 발명에 유용한 인간 G-CSF 유도체는 포유동물로부터 추출되거나, 화학적으로 합성될 수 있다. 또한, 유전자 재조합 기법을 이용하여 G-CSF 유도체를 코딩하는 DNA로 형질전환된 원핵 또는 진핵생물로부터 수득할 수도 있는데, 숙주로서 대장균 (예를 들어,E. coli) 또는 효모 (예를 들어,S. cerevisias) 및 포유동물 세포 (예를 들어, 중국 햄스터 난소세포, 원숭이 세포)를 포함한다. 사용한 숙주에 따라, G-CSF 유도체 발현산물은 포유동물 또는 다른 진핵 탄수화물과 글리코실화될 수 있거나, 비-글리코실화될 수 있다. 또한, 원핵생물에서 발현시킬 경우에는 G-CSF 유도체 발현산물은 초기 메티오닌 아미노산 잔기를 포함 (위치 -1)할 수있다.Human G-CSF derivatives useful in the present invention can be extracted from mammals or chemically synthesized. It may also be obtained from prokaryotic or eukaryotic transformed with DNA encoding G-CSF derivatives using genetic recombination techniques, such as E. coli (e.g. E. coli ) or yeast (e.g. S cerevisias ) and mammalian cells (eg, Chinese hamster ovary cells, monkey cells). Depending on the host used, G-CSF derivative expression products can be glycosylated with mammals or other eukaryotic carbohydrates, or non-glycosylated. In addition, when expressed in prokaryotes, the G-CSF derivative expression product may comprise an initial methionine amino acid residue (position-1).

본 발명의 바람직한 실시예에서는 천연형 G-CSF의 17번째 시스테인 잔기가 세린으로 치환된 재조합 인간 과립구 콜로니 자극인자 유도체 HM10411를 대한민국 특허등록 제356140호에 기재된 방법에 따라 제조하여 사용하였다.In a preferred embodiment of the present invention, recombinant human granulocyte colony stimulator derivative HM10411 in which the seventeenth cysteine residue of native G-CSF is substituted with serine was prepared and used according to the method described in Korean Patent No. 356140.

본 발명에 사용되는 PEG 중합체 분자는 수용성 PEG 중합체 중에서 선택될 수 있으며, 통상적으로 PEG 중합체로 단백질을 화학적으로 수식할 때 PEG의 활성화기에 따라 라이신 잔기의 ε-아미노기, 시스테인 잔기 또는 히스티딘 잔기에 결합할 수 있다. 그러나, 이들 활성화기를 갖는 PEG 중합체들을 이용하면 G-CSF 유도체에 1개 이상의 PEG 분자가 결합하게 된다. 이렇게 여러 부위에 결합한 PEG 분자들은 G-CSF 유도체 및 이의 수용체의 결합을 구조적으로 방해하여 그 활성을 상실할 수 있다.The PEG polymer molecules used in the present invention may be selected from water soluble PEG polymers, and typically will bind to the ε-amino group, cysteine residue or histidine residue of the lysine residue depending on the activator of the PEG when chemically modifying the protein with the PEG polymer. Can be. However, the use of PEG polymers with these activators allows one or more PEG molecules to bind to the G-CSF derivative. These PEG molecules bound to various sites can structurally interfere with the binding of G-CSF derivatives and their receptors and lose their activity.

그러므로, 한 분자의 G-CSF 유도체에 한 분자의 PEG만 결합하도록 하기 위해 선택되는 본 발명의 PEG 중합체는 생리적 환경과 같은 수성 환경에서 침전되지 않도록 수성이어야 하며 G-CSF 유도체의 아미노 말단의 α-아미노기에 특이적으로 결합할 수 있도록 단일 반응 알데히드기를 가져야 한다. 이때, 아미노 말단의 아미노산은 트레오닌 (Threonine)인 것이 바람직하다. 또한, PEG 중합체의 분자량은 제한되지 않으나, 2 내지 100 kDa이 바람직하고, 10 내지 40 kDa이 특히 바람직하다. PEG는 분지되거나 분지되지 않을 수 있다.Therefore, the PEG polymer of the present invention selected to bind only one molecule of PEG to one molecule of G-CSF derivative must be aqueous so as not to precipitate in an aqueous environment, such as a physiological environment, and the α- of the amino terminus of the G-CSF derivative It must have a single reaction aldehyde group so as to specifically bind to an amino group. At this time, the amino terminal of the amino terminal is preferably threonine (Threonine). In addition, the molecular weight of the PEG polymer is not limited, but is preferably 2 to 100 kDa, particularly preferably 10 to 40 kDa. PEG may or may not be branched.

PEG를 G-CSF 유도체와 결합시키기 위해 환원제의 존재하에서 G-CSF 유도체와 알콕시-PEG-알데히드를 반응시키는 페길레이션 반응을 수행한다. 바람직하게는,알콕시-PEG-알데히드가 메톡시-PEG-알데히드이고, 환원제는 NaCNBH3이다. 페길레이션 반응을 수행한 후 SDS-PAGE를 통해 PEG와 G-CSF 유도체가 결합했는지 여부를 확인할 수 있다.A PEGylation reaction is performed in which the G-CSF derivative and the alkoxy-PEG-aldehyde are reacted in the presence of a reducing agent to bind the PEG to the G-CSF derivative. Preferably, the alkoxy-PEG-aldehyde is methoxy-PEG-aldehyde and the reducing agent is NaCNBH 3 . After the PEGylation reaction, PEG and G-CSF derivatives can be identified through SDS-PAGE.

그런 다음, 모노-PEG-G-CSF 유도체 융합체를 수득하기 위해, 먼저 양이온 교환 크로마토그래피를 이용하여 겉보기 전하의 차이로 아미노 말단에 모노-PEG-G-CSF 유도체 및 이와 동일한 겉보기 전하를 가지는 것을 분리해 낸다.Then, in order to obtain a mono-PEG-G-CSF derivative fusion, a cation exchange chromatography was first used to isolate the mono-PEG-G-CSF derivative and the same apparent charge at the amino terminus by the difference in the apparent charge. Do it.

상기의 양이온 교환 크로마토그래피를 통해 분리된 것을 크기 배제 크로마토그래피를 이용하여 폴리-PEG-G-CSF 유도체 융합체로부터 모노-PEG-G-CSF 유도체 융합체만을 분리한다.Only those mono-PEG-G-CSF derivative fusions are separated from the poly-PEG-G-CSF derivative fusions by separation using the above cation exchange chromatography using size exclusion chromatography.

모노-PEG-G-CSF 유도체 융합체에서 PEG가 G-CSF 유도체의 아미노 말단에 특이적으로 결합했는지를 확인하기 위해 펩타이드 지도를 작성하여 공지 (Journal of chromatography A, 808:121, 1998;Analytical Biochemistry, 122:348, 1982; 및Biotechnology and Applied Biochemistry, 10:326, 1988)된 G-CSF 유도체의 펩타이드 지도의 피크 패턴과 비교하여 PEG의 위치를 확인한다. 즉, PEG가 결합된 경우에는 프로테아제에 의해 절단된 단백질의 HPLC 피크 패턴은 비유도 G-CSF 유도체를 동일한 프로테아제로 절단한 경우와는 다르다. 이러한 차이는 프로테아제 절단체 중 어느 한 곳에 PEG가 결합함에 기인한 것이며 그 피크 패턴의 차이를 보면 PEG의 결합 여부와 결합 위치를 확인할 수 있다. 프로테아제는 트립신 (trypsin), 서브틸리신 (subtilisin) 또는 엔도프로테인아제 글루-시 (endoproteinase Glu-C)를 이용할 수 있으며, 엔도프로테인아제 글루-시 (endoproteinase Glu-C)가 바람직하다.To determine whether PEG specifically binds to the amino terminus of a G-CSF derivative in a mono-PEG-G-CSF derivative fusion, a peptide map was prepared ( Journal of chromatography A , 808: 121, 1998; Analytical Biochemistry , 122: 348, 1982; and Biotechnology and Applied Biochemistry , 10: 326, 1988) to determine the position of PEG as compared to the peak pattern of peptide maps of G-CSF derivatives. In other words, when PEG is bound, the HPLC peak pattern of the protein cleaved by the protease is different from that when the non-induced G-CSF derivative is cleaved with the same protease. This difference is due to the binding of PEG to any one of the protease cleavage, and the difference in the peak pattern can confirm whether the PEG is bound and the binding position. Proteases may be trypsin, subtilisin or endoproteinase Glu-C, with endoproteinase Glu-C being preferred.

본 발명에서 기술한 모노-PEG-G-CSF 유도체의 생물학적 활성을 측정하기 위해 여러 문헌 (Baldwin et al.,Acta Endocrinologica., 119:326, 1988; Clark et al.,J. Biol. Chem., 271(36):21969, 1996; 및 Bozzola et al.,J. endocrinol. Invest., 21:768, 1998)에 공지된 방법을 수행할 수 있다. 그 결과, 본 발명에 따라 제조된 인간 과립구 콜로니 자극인자 유도체의 PEG 결합체는 생체내에서 잔류 시간의 증가 및 항원성의 감소 등의 효과를 지니는 동시에 생물학적 활성을 높은 수준으로 유지할 수 있음을 확인하였다.In order to determine the biological activity of the mono-PEG-G-CSF derivatives described in this invention (Baldwin et al., Acta Endocrinologica. , 119: 326, 1988; Clark et al., J. Biol. Chem. , 271 (36): 21969, 1996; and Bozzola et al., J. endocrinol. Invest. , 21: 768, 1998). As a result, it was confirmed that the PEG conjugate of the human granulocyte colony stimulator derivative prepared according to the present invention can maintain biological activity at a high level while increasing the retention time and decreasing antigenicity in vivo.

이하 본 발명을 하기 실시예에 의해 상세히 설명하고자 하나, 하기 실시예는 본 발명을 구체적으로 예시하기 의한 것일 뿐 본 발명의 범위를 제한하는 것은 아니다.Hereinafter, the present invention will be described in detail with reference to the following examples, but the following examples are not intended to limit the scope of the present invention only by exemplifying the present invention in detail.

<실시예 1> 재조합 인간 과립구 콜로니 자극인자 유도체의 제조Example 1 Preparation of Recombinant Human Granulocyte Colony Stimulator Derivatives

재조합 인간 과립구 콜로니 자극인자 유도체 HM10411은 대한민국 특허등록 제356140호에 기재된 방법에 따라 제조하였다. 본 발명에 사용된 인간 과립구 콜로니 자극인자 유도체는 천연형 G-CSF의 17번째 시스테인 잔기가 세린으로 치환된 형태이다.Recombinant human granulocyte colony stimulator derivative HM10411 was prepared according to the method described in Korean Patent No. 356140. The human granulocyte colony stimulator derivative used in the present invention is a form in which the 17th cysteine residue of the native G-CSF is substituted with serine.

<실시예 2> 아미노 말단에 PEG가 개질된 인간 과립구 콜로니 자극인자 유도체의제조Example 2 Preparation of Human Granulocyte Colony Stimulator Derivatives with PEG Modified at the Amino Terminal

100 mM 인산칼륨 완충용액 (pH 6.0)에 HM10411 5 ㎎을 넣어 최종 부피 5 ㎖가 되도록 3개를 준비한 후, 평균 분자량이 각각 20 kDa과 40 kDa인 활성화된 메톡시-PEG-알데히드 (Shearwater사, 미국)를 HM10411:메톡시-PEG-알데히드의 몰비가 1:4가 되도록 상기 용액에 각각 첨가하였다. 상기 반응용액에 환원제인 NaCNBH3(Sigma사, 미국)를 최종 20 mM이 되도록 첨가한 후, 4℃에서 18시간 동안 서서히 교반시키면서 반응시켰다. HM10411과 반응하지 않은 PEG를 불활성화시키기 위해 에탄올아민을 최종농도가 50 mM이 되도록 첨가하였다.5 mg of HM10411 was added to 100 mM potassium phosphate buffer (pH 6.0) to prepare a final volume of 5 ml, and then activated methoxy-PEG-aldehyde having an average molecular weight of 20 kDa and 40 kDa, respectively (Shearwater, USA) were added to the above solutions so that the molar ratio of HM10411: methoxy-PEG-aldehyde was 1: 4. NaCNBH 3 (Sigma, USA), a reducing agent, was added to the reaction solution to a final 20 mM, followed by agitation at 4 ° C. for 18 hours. Ethanolamine was added to a final concentration of 50 mM to inactivate PEG that did not react with HM10411.

반응하지 않은 PEG를 분리하기 위해 세파덱스 G-25 컬럼 (Pharmacia사)을 이용하였다. 먼저 2 CV (column volume)의 10 mM Tris-HCl (pH 7.5) 완충용액으로 컬럼을 평형화시킨 후 반응 혼합물을 점적하였다. 파장 260 ㎚의 자외부 흡광계를 이용하여 검출하였는데, 이때 동일한 완충용액으로 용출하면 크기가 더 큰 PEG로 수식된 HM10411이 먼저 용출되어 나오고 반응하지 않은 PEG는 나중에 용출되는 원리를 이용하여 이를 제거하였다.Sephadex G-25 column (Pharmacia) was used to separate unreacted PEG. The column was first equilibrated with 2 CV (column volume) 10 mM Tris-HCl (pH 7.5) buffer and then the reaction mixture was added dropwise. When detected using an ultraviolet absorber with a wavelength of 260 nm, HM10411 modified with a larger PEG was eluted first when eluted with the same buffer solution, and unreacted PEG was removed using the principle of eluting later. .

<실시예 3> 모노-PEG-인간 과립구 콜로니 자극인자 유도체의 융합체 분리Example 3 Fusion of Mono-PEG-Human Granulocyte Colony Stimulator Derivatives

상기 실시예 2로부터 얻은 용출용액으로부터 PEG로 수식된 HM10411을 더욱 순수하게 분리, 정제하기 위해 하기와 같은 실험을 수행하였다.The following experiment was performed to further isolate and purify HM10411 modified with PEG from the eluate obtained in Example 2.

먼저, 3 ㎖의 폴리왁스 엘피 (PolyWAX LP, Polywax Inc., 미국) 컬럼을 10mM Tris-HCl (pH 7.5) 완충용액으로 평형화시켰다. PEG화된 반응 혼합물을 1 ㎖/분의 유속으로 컬럼상에 부하시킨 후, 5 CV, 즉 15 ㎖의 평형 완충용액으로 세척하였다. 10 CV (30 ㎖)의 1 M NaCl 완충용액을 용출용액으로 사용하고, 30분 동안 0에서 100%까지 자동 농도구배 방법을 사용한 염 농도구배 방법을 이용하여, 트리-, 디-, 모노-PEG-HM10411 순서로 용출시켰다.First, 3 ml PolyWAX LP (PolyWAX LP, Polywax Inc., USA) column was equilibrated with 10 mM Tris-HCl (pH 7.5) buffer. The PEGylated reaction mixture was loaded onto the column at a flow rate of 1 mL / min and then washed with 5 CV, ie 15 mL of equilibration buffer. Tri-, di-, mono-PEG using 10 CV (30 mL) 1 M NaCl buffer as eluent and using salt concentration gradient method with automatic concentration gradient method from 0 to 100% for 30 minutes Eluted in the order -HM10411.

더욱 순수한 모노-PEG HM10411을 분리하기 위해 상기에서 수득한 모노-PEG-HM10411 융합체 용출 분획을 가지고 크기 배제 크로마토그래피를 수행하였다. 10 mM 인산나트륨 완충용액 (pH 7.0)으로 평형화시킨 슈퍼덱스 200 (Superdex 200, Pharmacia사)에 상기 용출액을 농축하여 점적하였으며, 동일한 완충 용액으로 용출하였다. 유속은 1 ㎖/분으로 흘려주었다. 트리- 및 디-PEG-HM10411은 모노-PEG-인간 성장 호르몬보다 용출 시간이 상대적으로 빠르므로 이를 제거하여 순수한 모노-PEG-HM10411만을 수득하였다.Size exclusion chromatography was performed with the mono-PEG-HM10411 fusion eluting fraction obtained above to separate the more pure mono-PEG HM10411. The eluate was concentrated and concentrated in Superdex 200 (Superdex 200, Pharmacia) equilibrated with 10 mM sodium phosphate buffer (pH 7.0) and eluted with the same buffer solution. The flow rate was flowed at 1 ml / min. Since tri- and di-PEG-HM10411 had a relatively faster elution time than mono-PEG-human growth hormone, it was removed to obtain only pure mono-PEG-HM10411.

모노-PEG-HM10411 융합체의 농도 및 순도는 쿠마시 (Coomassie)-염색 SDS-PAGE 젤 및 크기 배제 크로마토그래피 (고압 액체 크로마토그래피)를 사용하여 측정하였고, 비어-람버트 (Beer-Lambert) 법칙에 따라 280 ㎚에서 단백질 농도를 측정하였다 (Bollag et al.,Protein MethodsChapter 3, press in Wiley-Liss). 20 kDa 모노-PEG-HM10411 융합체와 40 kDa 모노-PEG-HM10411 융합체 각각의 겉보기 분자량은 약 50 kDa과 120 kDa이었다.Concentration and purity of the mono-PEG-HM10411 fusions were measured using Coomassie-stained SDS-PAGE gel and size exclusion chromatography (high pressure liquid chromatography), in accordance with Beer-Lambert's law. Protein concentration was measured at 280 nm accordingly (Bollag et al., Protein Methods Chapter 3, press in Wiley-Liss). The apparent molecular weights of each of the 20 kDa mono-PEG-HM10411 fusion and the 40 kDa mono-PEG-HM10411 fusion were about 50 kDa and 120 kDa.

도 1은 20 kDa과 40 kDa 모노-PEG-HM10411 융합체의 SDS-PAGE 젤 사진이다. 젤은 Bio-Rad사에서 구입한 15% 크라이테리온 젤 (criterion gel)을 사용하였다.레인 1은 분자량 표준 단백질 (Invitron사, 벤치마커, 아래쪽 밴드부터 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 160, 및 220 kDa) 3.0 ㎍이며, 레인 2는 비수식된 HM10411 10 ㎍, 레인 3과 4는 각각 40 kDa 모노-PEG화된 HM10411 융합체 10 ㎍과 20 kDa 모노-PEG화된 HM10411 융합체 10 ㎍이다.도 1에 나타난 바와 같이, HM10411에 PEG가 수식되어 크기가 커짐을 알 수 있고, 또한 모노-PEG-HM10411 이외의 단백질은 포함되지 않은 단일 밴드로 나타나므로 상기에서 분리 정제된 것이 매우 높은 순도임을 확인하였다. 1 is an SDS-PAGE gel photograph of 20 kDa and 40 kDa mono-PEG-HM10411 fusions. The gel was used as a 15% criterion gel purchased from Bio-Rad. Lane 1 is the molecular weight standard protein (Invitron, benchmark, 15, 20, 25, 30, 40, 50 from the bottom band) , 60, 70, 80, 90, 100, 120, 160, and 220 kDa) 3.0 μg, lane 2 with 10 μg unmodified HM10411, lanes 3 and 4 with 10 μg 40 kDa mono-PEGylated HM10411 fusion, respectively. 10 μg of a 20 kDa mono-PEGylated HM10411 fusion. As shown in Figure 1 , PEG is modified in HM10411 it can be seen that the size is increased, and since the protein other than mono-PEG-HM10411 appears as a single band does not contain, it was confirmed that the purified purified from the above is very high purity It was.

도 2는 각 시료의 크기 배제 크로마토그램 분석결과를 나타낸 것이다. HPLC 기기 (휴렛팩커드 HP1101)를 이용하여 100 mM 인산나트륨 (pH 6.9) 및 20% 에탄올의 혼합물로 구성된 완충용액으로 분석 컬럼 (바이오셉 SEC-S3000, 피노메덱스사)을 평형화시킨 후, 동일한 완충용액을 0.6 ㎖/분의 속도로 흘려주며 흡광도 214 ㎚에서 신호를 관찰한 것이다. 비수식 HM10411, 20 kDa 모노-PEG-HM10411, 40 kDa 모노-PEG-HM10411의 리텐션 (retention) 시간은 각각 11.832분, 10.184분 및 9.694분으로 용출되었다. 또한, PEG로 수식된 HM10411을 함유하는 피크는 단일 피크를 가지며 이는 PEG-HM10411의 분리된 분획들이 상당히 높은 순도를 가짐을 확인할 수 있다. Figure 2 shows the results of size exclusion chromatogram analysis of each sample. The HPLC column (Hewlett-Packard HP1101) was used to equilibrate the analytical column (Biocep SEC-S3000, Pinomedex) with a buffer consisting of a mixture of 100 mM sodium phosphate (pH 6.9) and 20% ethanol, and then the same buffer was The signal was observed at absorbance 214 nm flowing at a rate of 0.6 ml / min. The retention times of non-formula HM10411, 20 kDa mono-PEG-HM10411, 40 kDa mono-PEG-HM10411 were eluted at 11.832, 10.184, and 9.694 minutes, respectively. In addition, the peak containing PEG modified with HM10411 has a single peak, which can be seen that the separated fractions of PEG-HM10411 have significantly higher purity.

<실시예 4> 펩티드 지도화Example 4 Peptide Mapping

상기 실시예 3에서 제조된 40 kDa 모노-PEG-HM10411 융합체의 PEG 결합 부위가 아미노 말단임을 확인하기 위해 비수식 HM10411 및 40 kDa 모노-PEG화된HM10411 융합체의 펩티드 지도를 작성한 후 피크를 비교하였다. HM10411의 펩티드 지도의 피크는 여러 문헌에서 자세하게 기술되어 있는 G-CSF의 펩티드 지도 피크를 참조하였다 (Herman, et al.,Pharm. Biotechnol. 9:303, 1996; Clogston, et al.,Analytical Biochemistry202:376, 1992). 상기 실시예에서 제조된 40 kDa 모노-PEG-HM10411 및 비수식 HM10411을 탈염 컬럼 (desalting column, Pharmacia biotch)을 사용하여 0.1 M 암모니움 아세테이트 (pH 8.3) 완충용액 치환 후 농도가 0.25 ㎎/㎖이 되도록 준비하였다. 글루-시 (endoproteinase glu-C, 로슈) 단백질 분해효소를 증류수에 녹인 후 10 ㎍을 위에서 준비한 단백질 시료에 첨가하였다. 37℃ 항온조에서 19시간 동안 반응시켜 각각의 단백질을 절단하였다. 단백질 절단물을 바이닥 (Vydac) 238TP54 C4 컬럼 (4.6×250 ㎜, 5 ㎛ 입자 크기, 300 Å 소공 크기)에 주입하고. 0.1% 트리플루오로아세트산 내의 아세토니트릴 선형 기울기를 사용한 HPLC에 의해 펩티드 지도화하였다.To confirm that the PEG binding site of the 40 kDa mono-PEG-HM10411 fusion prepared in Example 3 was amino-terminated, peptide maps of the non-formula HM10411 and 40 kDa mono-PEGylated HM10411 fusions were prepared and the peaks were compared. Peaks in the peptide map of HM10411 refer to peptide map peaks of G-CSF, which are described in detail in several documents (Herman, et al., Pharm. Biotechnol . 9: 303, 1996; Clogston, et al., Analytical Biochemistry 202). : 376, 1992). The 40 kDa mono-PEG-HM10411 and the non-formula HM10411 prepared in the above Example were replaced with 0.1 M ammonium acetate (pH 8.3) buffer using a desalting column (Pharmacia biotch), and the concentration was 0.25 mg / ml. It was prepared as possible. After endoproteinase glu-C (Roche) protease was dissolved in distilled water, 10 μg was added to the protein samples prepared above. Each protein was cleaved by reacting for 19 hours in a 37 ℃ thermostat. Protein cleavage was injected into a Vydac 238TP54 C4 column (4.6 × 250 mm, 5 μm particle size, 300 μs pore size). Peptide mapping was by HPLC using acetonitrile linear slope in 0.1% trifluoroacetic acid.

HM10411은 글루-시에 절단될 수 있는 부위가 7개가 존재하므로 이론적으로 8개의 피크가 형성될 수 있으나, 실제로 모든 부위에서 글루-시에 의한 절단이 일어나지는 않으며 컬럼의 해상도의 차이에 의해 모든 피크가 형성되지 않는다. 그러나, 아미노 말단을 포함하는 피크는 여러 문헌에서 잘 정의되어 (Herman, et al.,Pharm. Biotechnol.9:303, 1996) 있고, 글루-시로 절단한 후 생성되는 각각의 피크를 분취 후 그 펩타이드의 아미노산 서열을 결정하여 그 차이를 확인할 수 있었다.Since HM10411 has 7 sites that can be cleaved in glue-sea, theoretically 8 peaks can be formed, but in fact, all the sites are not cleaved by glue-sea and all peaks due to the difference in column resolution. Is not formed. However, peaks containing amino termini are well defined in several literatures (Herman, et al., Pharm. Biotechnol. 9: 303, 1996), and each peptide produced after cleavage with glu-sy is collected after its peptide. The difference was determined by determining the amino acid sequence of.

도 3에서 보는 바와 같이, 비수식 HM10411의 펩티드 지도상의 28분경에 용출되는 피크 (T1)가 모노-PEG-HM10411 융합체의 펩티드 지도에는 존재하지 않음을 알 수 있다. T1 피크는 HM10411의 아미노 말단에 해당하는 피크인데, 이는 시료가 컬럼을 통과할 때 그 피크의 용출 시간이 변화했기 때문이며 이러한 결과는 HM10411의 아미노 말단에 PEG 분자가 결합했음을 의미한다.As shown in FIG. 3 , it can be seen that the peak (T1) eluting at about 28 minutes on the peptide map of non-formula HM10411 does not exist in the peptide map of the mono-PEG-HM10411 fusion. The T1 peak corresponds to the amino terminus of HM10411, which is due to the change in elution time of the peak as the sample passes through the column, indicating that PEG molecules bound to the amino terminus of HM10411.

<실험예 1> 시험관내 활성 측정Experimental Example 1 In Vitro Activity Measurement

상기 실시예 3에서 제조한 아미노 말단 40K-모노-PEG-HM10411의 시험관내 활성도를 기 시판중인 대장균 유래 G-CSF 필그라스팀 (met-G-CSF, Filgrastim, Amgen사)과 대장균 유래 G-CSF의 N-말단에 20 kDa 크기의 PEG를 결합시킨 뉴라스타 (20K-N-met-G-CSF, Neulasta, Amgen사)와 비교 측정하기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다.In vitro activity of the amino terminal 40K-mono-PEG-HM10411 prepared in Example 3 is commercially available from E. coli-derived G-CSF filgrastim (met-G-CSF, Filgrastim, Amgen) and E. coli-derived G-CSF In order to compare and measure the neurastar (20K-N-met-G-CSF, Neulasta, Amgen Co., Ltd.) having a 20 kDa-size PEG bound to the N-terminus of the following, the following experiment was performed.

인간 골수 기원의 세포주인 HL-60 (ATCC CCL-240, Promyelocytic leukemia patient/36 yr old Caucasian female)을 10%의 소 태아 혈청을 포함하는 RPMI1640 배지에서 배양하다가, 세포의 숫자를 약 2.2×105세포/㎖이 되도록 조정한 후, DMSO (dimethylsulfoxide, culture grade/SIGMA)를 최종 1.25% (v/v)가 되도록 첨가하였다. 위의 세포주를 96 웰 플레이트 (Corning/low evaporation 96 well plate)에 90 ㎕씩 넣어서 웰당 세포가 약 2×104개가 되도록 한 후, 5% CO2가 공급되는 37℃ 배양기에서 약 48시간 동안 배양하였다.Human bone marrow-derived cell line HL-60 (ATCC CCL-240, Promyelocytic leukemia patient / 36 yr old Caucasian female) was cultured in RPMI1640 medium containing 10% fetal bovine serum, and the number of cells was approximately 2.2 × 10 5. After adjusting to cells / ml, DMSO (dimethylsulfoxide, culture grade / SIGMA) was added to a final 1.25% (v / v). 90 μl of the above cell line was placed in a 96 well plate (Corning / low evaporation 96 well plate) to obtain about 2 × 10 4 cells per well, followed by incubation for about 48 hours in a 37 ° C. incubator supplied with 5% CO 2. It was.

알엔디 (R & D systems)사의 G-CSF ELISA (Enzyme Linked ImmunosorbentAssay) 키트를 이용하여 농도가 결정되어진 아미노 말단 모노-PEG-HM10411, 대장균 유래 G-CSF 필그라스팀 (met-G-CSF)과 뉴라스타 (20K-N-met-G-CSF)를 동일한 농도가 되도록 적정한 비율로 각각을 RPMI 1640으로 희석하여 최종 농도가 500 ng/㎖이 되도록 희석하였고, 이를 다시 두배씩 연속적으로 RPMI 1640으로 10회씩 희석하였다.Amino-terminated mono-PEG-HM10411, E. coli-derived G-CSF Filgrastim (met-G-CSF) and neura, determined using R-D Systems' G-CSF ELISA (Enzyme Linked ImmunosorbentAssay) kit Stars (20K-N-met-G-CSF) were diluted to RPMI 1640, each at an appropriate ratio to the same concentration, to a final concentration of 500 ng / ml, which was then repeated twice in succession with RPMI 1640. Diluted.

이렇게 만들어진 시료를 배양 중인 HL-60 세포주의 각 웰에 10 ㎕씩 가하여, 최종 농도가 50 ng/㎖로부터 연속적으로 반감되도록 하였다. 위에서 제조한 단백질 시료들을 처리한 세포주는 37℃ 배양기에서 48시간을 다시 배양하였다.10 μl of each sample was added to each well of the HL-60 cell line in culture, so that the final concentration was halved continuously from 50 ng / ml. Cell lines treated with the protein samples prepared above were incubated again for 48 hours in a 37 ℃ incubator.

배양후 세포주의 증가 정도를 알아보기 위하여, 프로메가 (PROMEGA)사의 CellTiter96TM(Cat. No. G4100)을 이용하여, 증가한 세포주의 숫자를 670 ㎚ 파장에서의 흡광도로 결정하여 분석을 완료하였다.In order to determine the degree of increase of the cell line after the culture, using PROTIGA CellTiter96 TM (Cat. No. G4100), the number of increased cell lines was determined by absorbance at 670 nm wavelength to complete the analysis.

도 4는 시험관내 활성 실험 결과를 나타낸 것이다.도 4에 나타낸 바와 같이, 실험에 사용한 모든 시료는 G-CSF 감수성 세포의 성장을 촉진시키는 것으로 보아 모두 활성이 있는 것으로 나타났다. 4 shows the results of in vitro activity experiments. As shown in FIG . 4 , all the samples used in the experiment were found to promote the growth of G-CSF-sensitive cells, all of which were shown to be active.

하기표 1에서 보는 바와 같이, PEG에 의해 수식된 HM10411은 그 활성도가 PEG를 결합시키지 않은 met-G-CSF나 HM10411에 비해 활성이 떨어짐을 알 수 있었다. 20 kDa 크기의 PEG를 결합시킨 20K-N-HM10411 단백질은 실험 대조군인 필그라스팀의 N-말단에 20 kDa PEG가 결합된 단백질인 뉴라스타 (Neulasta, Amgen)와 비슷한 활성을 보이는 것으로 나타났으며 40 kDa 크기의 PEG를 결합시킨 40K-N-HM10411 단백질은 20 kDa 크기의 PEG를 결합시킨 단백질들 보다 활성이 떨어짐을 알 수 있었다. 이러한 실험을 통해 G-CSF에 결합된 PEG의 크기가 클수록 그 활성도가 점차 떨어짐을 알 수 있고 이는 G-CSF가 목적 세포의 막에 존재하는 수용체와의 결합할 때 PEG가 구조적, 공간적으로 방해를 하는 것으로 예상되며, 이는 결합된 PEG의 크기가 클수록 그 방해 효과는 더 커지는 것으로 사료된다.As shown in Table 1 below, HM10411 modified by PEG was found to be less active than met-G-CSF or HM10411 whose activity is not PEG-bound. The 20K-N-HM10411 protein bound to 20 kDa PEG showed similar activity to Neulasta (Amgen), a protein with 20 kDa PEG at the N-terminus of Filgrastim, an experimental control. The 40K-N-HM10411 protein bound to 40 kDa PEG was found to be less active than the protein bound to 20 kDa PEG. These experiments show that the larger the size of the PEG bound to G-CSF, the lower its activity. This suggests that PEG is structurally and spatially obstructed when G-CSF binds to receptors on the membrane of the cell of interest. It is expected that the larger the size of the bound PEG, the greater the interference effect.

단백질 시료Protein sample ED50 (ng/㎖)ED50 (ng / ml) % 비율% ratio met-G-CSFmet-G-CSF 0.300.30 100 %100% HM10411HM10411 0.420.42 100 %100% 20K-N-met-G-CSF20K-N-met-G-CSF 1.11.1 27 %27% 20K-N-HM1041120K-N-HM10411 1.121.12 30 %30% 40K-N-HM1041140K-N-HM10411 3.13.1 10 %10%

<실험예 2> 약물동력학 측정Experimental Example 2 Pharmacokinetic Measurement

상기 실시예 3에서 제조한 아미노 말단 40K-모노-PEG-HM10411의 혈청 (serum)내 약물동력학을 측정하기 위하여 하기와 같은 실험을 실시하였다.In order to measure the pharmacokinetics in the serum of the amino terminal 40K-mono-PEG-HM10411 prepared in Example 3 was performed as follows.

각 군당 3마리의 SD 랫트 (Male Sprague Dawly Rat, 7주령, 평균 200-250 g)에게 필그라스팀 및 HM10411 (대조군)과 상기 실시예에서 제조한 아미노 말단 모노-PEG-HM10411 융합체 및 뉴라스타 (시험군)를 100 ㎍/㎏이 되도록 피하주사한 후, 대조군은 0.5, 1, 2, 4, 6, 12, 24, 30 및 48시간 후에 채혈하였고, 시험군은 주사 후 1, 6, 12, 24, 30, 48 및 72시간 후에 채혈하였다. 혈액시료는 헤파린을 함유하는 튜브에 모아서 응고를 방지하였고, 에펜도르프 고속 마이크로 원심분리기에서 5분간 원심분리하여 세포를 제거하였다. 혈장 내 융합 단백질 양은 각 생리활성 단백질 항체를 이용한 ELISA 방법으로 측정하였다.Three SD rats (Male Sprague Dawly Rat, 7 weeks old, average 200-250 g) in each group were shown to have filgrastim and HM10411 (control) and the amino terminal mono-PEG-HM10411 fusions and neurastars prepared in the above examples. Test group) was subcutaneously injected to 100 μg / kg, and the control group was bled 0.5, 1, 2, 4, 6, 12, 24, 30 and 48 hours, and the test group was 1, 6, 12, Blood was collected after 24, 30, 48 and 72 hours. Blood samples were collected in a tube containing heparin to prevent coagulation and cells were removed by centrifugation for 5 minutes in an Eppendorf high speed micro centrifuge. The amount of fusion protein in plasma was measured by ELISA method using each bioactive protein antibody.

그 결과, 각 시험군과 대조군의 혈중 반감기는 하기표 2와 같았다.As a result, the blood half-life of each test group and control group was as shown in Table 2 below.

필그라스팀Philgrass Tim HM10411HM10411 뉴라스타Neurastar 40K-N-HM1041140K-N-HM10411 혈중반감기 (T1/2, hr)Blood half-life (T1 / 2, hr) 3.643.64 4.814.81 5.905.90 8.988.98

상기표 2와도 5의 약물동력학 그래프에 나타난 바와 같이, 본 발명의 HM10411이 met-G-CSF보다 혈중 안정성 측면에서 우수함을 알 수 있다. 더욱이 각각의 단백질에 PEG를 결합한 단백질들의 경우, 40K-N-HM10411은 필그라스팀에 비해 2.5배 이상 증가한 혈중 반감기를 나타내었으며, 20 kDa 크기의 PEG가 결합된 뉴라스타 보다는 약 50% 이상 증가한 혈중 반감기를 나타내었다. 활성을 지닌 단백질이 치료학적 효과를 나타낼 때 혈중 반감기의 증가는 단백질의 안정성 측면과 단백질의 활성이 오래 지속되어 환자에게 투여시 투여 횟수를 줄여줄 수 있다. 이러한 결과는 천연형의 G-CSF에 단일 PEG 분자를 결합시켰을 때보다 본 발명의 HM10411에 PEG를 결합한 것이 단백질의 안정성 측면에서 더 우월함을 나타내는 것이며, 또한 40 kDa 크기의 PEG가 결합되는 것이 20 kDa 크기의 PEG가 결합되었을 때 보다 생체 내에서 단백질의 활성을 지속적으로 유지하게 하여 단백질의 치료학적 측면을 극적으로 변화시킬 수 있음을 나타내는 것이다.As shown in Table 2 and the pharmacokinetic graph of FIG. 5 , it can be seen that HM10411 of the present invention is superior in terms of blood stability than met-G-CSF. Moreover, for PEG-binding proteins, 40K-N-HM10411 showed a blood half-life of more than 2.5-fold greater than that of filgrastim, and about 50% more than that of 20 kDa PEG-linked neurons. Half-life is shown. Increased half-life in the blood when the active protein has a therapeutic effect may reduce the frequency of administration when administered to the patient due to the long-term stability of the protein and its activity. These results indicate that PEG binding to HM10411 of the present invention is superior to that of natural G-CSF in combination with a single PEG molecule, and that 40 kDa PEG is bound to 20 kDa. It suggests that the therapeutic aspect of the protein can be dramatically changed by maintaining the protein's activity in vivo more continuously than when PEG of size is bound.

상기에서 전술한 바와 같이, 인간 과립구 콜로니 자극인자 유도체의 PEG 융합체는 인간 과립구 콜로니 자극인자 유도체의 아미노 말단에 한 분자의 폴리에틸렌 글리콜이 결합된 것으로서, 생체 내에서의 잔류 시간 증가, 항원성의 감소 및 높은 수준의 생물학적 활성을 유지하는 효과를 나타낸다.As described above, the PEG fusion of the human granulocyte colony stimulator derivative is a molecule of polyethylene glycol bound to the amino terminus of the human granulocyte colony stimulator derivative, which increases the residence time in vivo, decreases antigenicity and Exhibits the effect of maintaining levels of biological activity.

Claims (6)

재조합 인간 과립구 콜로니 자극인자 유도체의 아미노 말단에 한 분자의 폴리에틸렌 글리콜 (polyethylene glycol, PEG)이 결합된 PEG-인간 과립구 콜로니 자극인자 유도체의 융합체.A fusion of PEG-human granulocyte colony stimulator derivatives having one molecule of polyethylene glycol (PEG) bound to the amino terminus of a recombinant human granulocyte colony stimulator derivative. 제 1항에 있어서,The method of claim 1, 재조합 인간 과립구 콜로니 자극인자 유도체는 천연형 인간 과립구 콜로니 자극인자와 동일한 단백질 서열을 가지나 17번째 시스테인이 세린으로 치환된 것을 특징으로 하는 융합체.The recombinant human granulocyte colony stimulator derivative has a protein sequence identical to that of the natural human granulocyte colony stimulator, but is characterized in that the seventeenth cysteine is substituted with serine. 제 1항에 있어서,The method of claim 1, 아미노 말단의 아미노산이 트레오닌 (Threonine)인 것을 특징으로 하는 융합체.Fusion, characterized in that the amino terminal of the amino terminal is threonine (Threonine). 제 1항에 있어서,The method of claim 1, 재조합 인간 과립구 콜로니 자극인자 유도체의 아미노 말단 아미노산의 α-아미노기에 PEG가 결합되는 것을 특징으로 하는 융합체.And a PEG is bonded to the α-amino group of the amino terminal amino acid of the recombinant human granulocyte colony stimulator derivative. 제 1항에 있어서,The method of claim 1, PEG가 2 내지 100 kDa의 분자량을 갖는 것을 특징으로 하는 융합체.Fusion, characterized in that PEG has a molecular weight of 2 to 100 kDa. 제 5항에 있어서,The method of claim 5, PEG가 10 내지 40 kDa의 분자량을 가지는 것을 특징으로 하는 융합체.Fusion, characterized in that PEG has a molecular weight of 10 to 40 kDa.
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