RU2213974C1 - Method for simultaneous detection of several analytes - Google Patents
Method for simultaneous detection of several analytes Download PDFInfo
- Publication number
- RU2213974C1 RU2213974C1 RU2002108880/14A RU2002108880A RU2213974C1 RU 2213974 C1 RU2213974 C1 RU 2213974C1 RU 2002108880/14 A RU2002108880/14 A RU 2002108880/14A RU 2002108880 A RU2002108880 A RU 2002108880A RU 2213974 C1 RU2213974 C1 RU 2213974C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- analyte
- ligand
- hybrid molecule
- sample
- nucleotides
- Prior art date
Links
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к области медицины, в частности к иммунохимическому анализу, и предназначено для улучшения аналитических и технологических характеристик иммунохимического анализа. The invention relates to medicine, in particular to immunochemical analysis, and is intended to improve the analytical and technological characteristics of immunochemical analysis.
Известен способ обнаружения иммуноглобулинового антитела в пробе, включающий проведение иммуноанализа, причем смешивают лигандный антиген, антитело или гаптен, связанные с биотином или его функциональным производным, антитело, направленное против детектируемого антитела, связанное с парамагнитными частицами, и хемилюминесцентное акридиновое соединение, связанное с авидином, стрептавидином или его функциональным производным, с пробой для образования твердофазного связанного комплекса, проводят магнитное отделение твердой фазы от жидкой фазы, инициирование хемилюминесцентной реакции и анализ отделенной твердой фазы на присутствие хемилюминесцентного комплекса, причем присутствие хемилюминесценции является указанием на присутствие упомянутого антитела в пробе (RU, 2132070, кл. G 01 N 33/533, 1999 г.). A known method for detecting an immunoglobulin antibody in a sample, comprising carrying out an immunoassay, wherein a ligand antigen, an antibody or a hapten associated with biotin or a functional derivative thereof, an antibody directed against a detectable antibody bound to paramagnetic particles and a chemiluminescent acridine compound bound to streptavidin or its functional derivative, with a sample for the formation of a solid-phase bound complex, conduct magnetic separation of the solid phase from phase, initiation of a chemiluminescent reaction and analysis of the separated solid phase for the presence of a chemiluminescent complex, the presence of chemiluminescence being an indication of the presence of the aforementioned antibodies in the sample (RU, 2132070, class G 01 N 33/533, 1999).
Недостатком способа является невозможность одновременного обнаружения большого количества различных комплексов антиген-антитело при параллельном анализе различных веществ в одной реакционной ячейке. The disadvantage of this method is the inability to simultaneously detect a large number of different complexes of antigen-antibody in the parallel analysis of various substances in one reaction cell.
Техническим результатом способа является выявление в ходе одного анализа несколько аналитов при помощи гибридной молекулы. The technical result of the method is the identification during one analysis of several analytes using a hybrid molecule.
Для достижения указанного технического результата в способе одновременного определения нескольких аналитов исследуемый образец контактируют с иммобилизированным на носителе антителом или антигеном, способным связываться с аналитом, после инкубации и промывания вносят сконструированную для каждого определяемого аналита гибридную молекулу, содержащую лигандную часть, способную связываться с аналитом, и полинуклеотидную часть, имеющую зону связывания с комплементарными праймерами, и матричную зону с уникальной последовательностью нуклеотидов, заданной соответственно каждому определяемому аналиту, образовавшийся комплекс, состоящий из гибридной молекулы, аналита и иммобилизированного антитела или антигена промывают и проводят после добавления необходимых компонентов полимеразно-цепную реакцию (ПЦР), полученные амплифицированные продукты ПЦР определяют с помощью гибридизационного анализа, при этом по факту обнаружения уникальной нуклеотидной последовательности судят о присутствии в исследуемом образце определенных аналитов. To achieve the indicated technical result in the method for the simultaneous determination of several analytes, the test sample is contacted with an antibody or antigen capable of binding to the analyte immobilized on the carrier, after incubation and washing, a hybrid molecule designed for each analyte containing the ligand portion capable of binding to the analyte is introduced, and polynucleotide part having a binding zone with complementary primers, and a matrix zone with a unique sequence of nucleotides, assigned respectively to each analyte to be determined, the resulting complex consisting of a hybrid molecule, analyte and immobilized antibody or antigen is washed and carried out after adding the necessary components of the polymerase chain reaction (PCR), the amplified PCR products obtained are determined using hybridization analysis, while the fact that a unique nucleotide sequence is detected is judged by the presence of certain analytes in the test sample.
Причем праймер имеет длину от 10 до 30 нуклеотидов. Moreover, the primer has a length of from 10 to 30 nucleotides.
Соотношение А-Т и G-C нуклеотидов в праймере составляет 1:1. The ratio of AT and G-C nucleotides in the primer is 1: 1.
Матричная зона составляет 30-100 нуклеотидов. The matrix region is 30-100 nucleotides.
Лигандная и нуклеотидная части связаны ковалентно. The ligand and nucleotide moieties are covalently linked.
Лигандная и полинуклеотидная части связаны при помощи авидин-биотина. The ligand and polynucleotide moieties are linked by avidin-biotin.
Гибридизационный анализ проводят с помощью технологии ДНК-чипов. Hybridization analysis is carried out using DNA chip technology.
Гибридизационный анализ проводят с помощью олигонуклеотидных зондов, меченных ферментом или радиоактивно. Hybridization analysis is carried out using oligonucleotide probes labeled with an enzyme or radioactive.
Способ предназначен для определения антигенов и/или антител. The method is intended to determine antigens and / or antibodies.
Определение проводится в сыворотке крови или в любой другой биологической жидкости. The determination is carried out in blood serum or in any other biological fluid.
Для положительного контроля лигандная часть гибридной молекулы подбирается к аналиту, заведомо находящемуся в образце, а для отрицательного контроля лигандная часть подбирается к аналиту, заведомо отсутствующему в образце. For a positive control, the ligand part of the hybrid molecule is selected for the analyte, which is obviously in the sample, and for the negative control, the ligand part is selected for the analyte, which is obviously not in the sample.
Способ иллюстрируется следующим примером. The method is illustrated by the following example.
Принцип метода иммунохимического определения нескольких аналитов с возможностью одновременной постановки положительного и отрицательного внутренних контролей с использованием "гибридной молекулы". The principle of the method of immunochemical determination of several analytes with the possibility of simultaneous formulation of positive and negative internal controls using a "hybrid molecule".
К носителю с иммобилизированными антителами и/или антигенами, способными связываться с различными аналитами, добавляют анализируемый раствор. После первой инкубации и промывки вносят "гибридные молекулы" различных типов. Каждый тип "гибридной молекулы" имеет лигандную часть, способную связываться с каким-то одним из выявляемых данной методикой аналитов. Для положительного контроля лигандная часть "гибридной молекулы" подбирается к такому аналиту, который заведомо должен находиться в образце. Для отрицательного контроля подбирается такая лигандная часть "гибридной молекулы", которая заведомо не может связаться ни с одним из аналитов в исследуемом образце. Каждому типу лигандной части должна соответствовать своя уникальная последовательность нуклеотидов в матричной зоне полинуклеотидной части "гибридной молекулы". После второй инкубации и промывки вносят праймеры и другие компоненты для проведения ПЦР. Уникальная последовательность нуклеотидов матричной зоны каждого вида "гибридной молекулы", вошедшего в состав "сэндвича", многократно копируется. На заключительном этапе проводится выявление уникальной последовательности нуклеотидов при помощи любой разновидности гибридизационного анализа (ДНК-чип) или другим пригодным для этого методом. An assay solution is added to a carrier with immobilized antibodies and / or antigens capable of binding to various analytes. After the first incubation and washing, various types of hybrid molecules are introduced. Each type of “hybrid molecule” has a ligand moiety that can bind to one of the analytes detected by this technique. For positive control, the ligand part of the “hybrid molecule” is selected for such an analyte, which obviously must be in the sample. For the negative control, such a ligand part of the “hybrid molecule” is selected that obviously cannot contact any of the analytes in the test sample. Each type of ligand moiety must have its own unique nucleotide sequence in the template region of the polynucleotide moiety of the “hybrid molecule”. After the second incubation and washing, primers and other components are added for PCR. The unique sequence of nucleotides of the matrix zone of each type of “hybrid molecule” included in the “sandwich” is copied many times. At the final stage, a unique nucleotide sequence is detected using any kind of hybridization analysis (DNA chip) or another method suitable for this.
В качестве примера для иллюстрации работы метода для одновременного выявления нескольких аналитов предлагается тест для определения антител к core, NS3, NS4, NS5 антигенам вируса гепатита С (HCV) в сыворотке крови с положительным и отрицательными внутренними контролями. As an example, to illustrate the work of the method for the simultaneous detection of several analytes, a test is proposed for determining antibodies to hepatitis C virus (HCV) core, NS3, NS4, NS5 antigens in blood serum with positive and negative internal controls.
- Рекомбинантные антигены HCV, соответствующие участкам белков, кодируемых структурной (core), и неструктурной (NS3, NS4, NS5) областями генома HCV, а также антитела к иммуноглобулинам человека (для положительного внутреннего контроля) сорбируются на поверхности 96-луночных полистироловых планшетов. Для этого в каждую лунку вносят по 0,2 мл раствора рекомбинантных антигенов HCV и иммуноглобулинов человека в оптимальной концентрации в 0,01 М К-фосфатном буфере (рН 7,4) с 0,1М NaCl. Накрывают крышкой и инкубируют при температуре +4oС. Затем лунки промывают 4 раза раствором фосфатного буфера, содержащим 0,5% твин-20 или тритон-100.- Recombinant HCV antigens corresponding to regions of proteins encoded by structural (core) and non-structural (NS3, NS4, NS5) regions of the HCV genome, as well as antibodies to human immunoglobulins (for positive internal control) are adsorbed on the surface of 96-well polystyrene plates. For this, 0.2 ml of a solution of recombinant HCV antigens and human immunoglobulins in optimal concentration in 0.01 M K-phosphate buffer (pH 7.4) with 0.1 M NaCl is added to each well. Cover and incubate at a temperature of + 4 o C. Then the wells are washed 4 times with a solution of phosphate buffer containing 0.5% tween-20 or triton-100.
- Получение "гибридной молекулы". В данном тесте участвуют шесть различных видов "гибридных молекул". В качестве лигандной части используются core, NS3, NS4,NS5 рекомбинантные антигены HCV, антитела к иммуноглобулинам человека (для положительного внутреннего контроля). Для отрицательного внутреннего контроля в качестве лигандной части может быть использован любой инертный белок, например бычий сывороточный альбумин (БСА). Полинуклеотидные части представляют собой одноцепочную ДНК длиной 130 нуклеотидов и имеют по две зоны связывания с праймерами ПЦР длиной 20 нуклеотидов, идентичные для всех типов "гибридных молекул", которые ограничивают собой матричную зону. Последовательность нуклеотидов матричной зоны уникальна для каждого вида "гибридной молекулы". - Obtaining a "hybrid molecule". Six different types of “hybrid molecules” are involved in this test. As the ligand part, core, NS3, NS4, NS5 recombinant HCV antigens, antibodies to human immunoglobulins are used (for positive internal control). For negative internal control, any inert protein, such as bovine serum albumin (BSA), can be used as the ligand portion. The polynucleotide portions are single-stranded DNA with a length of 130 nucleotides and each have two binding zones with PCR primers of 20 nucleotides in length, identical for all types of "hybrid molecules" that limit the matrix region. The nucleotide sequence of the template zone is unique to each type of “hybrid molecule”.
Конъюгирование лигандной и полинуклеотидной части. Для ковалентной сшивки лигандной (рекомбинантные антигены HCV, антитела к иммуноглобулинам человека) и полинуклеотидной частей "гибридной молекулы", к 5'-концу полинуклеотидной цепочки присоединяют аминогруппу, с которой затем в ходе химической реакции связывается лиганд. Данный метод детально описан в работе Chu В. С. F., Orgel L., (1985), DNA, 4, 327. Conjugation of the ligand and polynucleotide part. For covalent cross-linking of the ligand (recombinant HCV antigens, antibodies to human immunoglobulins) and the polynucleotide parts of the “hybrid molecule”, an amino group is attached to the 5'-end of the polynucleotide chain, to which the ligand then binds during the chemical reaction. This method is described in detail in the work of Chu B.C. F., Orgel L., (1985), DNA, 4, 327.
Для нековалентного связывания частей "гибридной молекулы" при помощи авидин-биотина производят биотинилирование полинуклеотидной цепочки ДНК, а авидин конъюгируют с лигандами. Смешивая полученные реагенты, получают "гибридную молекулу". For non-covalent binding of parts of the "hybrid molecule" using avidin-biotin, biotinylation of the polynucleotide DNA chain is performed, and avidin is conjugated with ligands. By mixing the resulting reagents, a "hybrid molecule" is obtained.
Для биотинилирования полинуклеотидной цепочки ДНК можно использовать 3'-концевое присоединение биотина при помощи терминальной дезоксинуклеотидилтрансферазы (TdT), методика описана в книге "Молекулярная клиническая диагностика. Методы.", Херрингтон, Макги, М., Мир, 1999 г. To biotinylate a polynucleotide DNA strand, you can use the 3'-terminal attachment of biotin using terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT), the procedure is described in the book "Molecular Clinical Diagnostics. Methods.", Herrington, McGee, M., Mir, 1999.
Материалы
5 х ТdТ-буфер: 5 мМ СоСl2, 700 мМ какодилат натрия, 0,5 мМ ДТТ, 150 мМ трис-НСl, рН 6,8
Вio-11dUТР: 0,4 ммоль
Полинуклеотид (до 1мкг)
TdT: 50 ЕД/мкл
Методика
В помещенную в лед микроцентрифужную пробирку вносят следующие реактивы:
5 х TdT-бyфep 10 мкл
Полинуклеотид 10 мкл (1мкг)
Bio-11dUTP 1,75 мкл
TdT 1 мкл (50 EД)
Вода 27,25 мкл
Перемешивают реактивы и быстро центрифугируют в микроцентрифуге при 12000 g. Инкубируют при 37 г в течение 2 ч.Materials
5 x TdT buffer: 5 mM CoCl 2 , 700 mM sodium cacodylate, 0.5 mM DTT, 150 mM Tris-HCl, pH 6.8
Bio-11dUT: 0.4 mmol
Polynucleotide (up to 1 μg)
TdT: 50 U / μl
Methodology
The following reagents are added to the microcentrifuge tube placed on ice:
5 x TdT buffer 10 μl
Polynucleotide 10 μl (1 μg)
Bio-11dUTP 1.75 μl
TdT 1 μl (50 ED)
Water 27.25 μl
The reagents are mixed and quickly centrifuged in a microcentrifuge at 12,000 g. Incubated at 37 g for 2 hours.
Доводят объем с полинуклеотидом до 100 мкл и очищают зонд центрифугированием на колонке. Полученный gолинуклеотид содержит на 3'-конце до трех остатков биотина. The polynucleotide volume was adjusted to 100 μl and the probe was purified by centrifugation on a column. The resulting golinucleotide contains up to three biotin residues at the 3'-end.
Методика проведения иммунохимического анализа:
- В лунки планшета вносят анализируемые сыворотки. Инкубируют при температуре 37 oC в течение 30 мин. В том случае, если в анализируемых сыворотках имеются искомые антитела, образуется комплекс: твердая фаза - рекомбинантные антигены HCV-антитела.Immunochemical analysis procedure:
- In the wells of the tablet make the analyzed serum. Incubated at a temperature of 37 o C for 30 minutes In the event that the desired antibodies are present in the analyzed sera, a complex is formed: the solid phase is the recombinant antigens of the HCV antibody.
- Первая промывка. Пятикратно промывают лунки фосфатным буфером с твином-20 или тритоном-100. - First flushing. The wells are washed five times with phosphate buffer with Tween-20 or Triton-100.
- В лунки планшета вносят по 100 мкл фосфатно-солевого буфера, содержащего шесть различных видов "гибридных молекул". Инкубируют при температуре 37 oC в течение 30 мин. Образуется комплекс: твердая фаза - рекомбинантные антигены HCV или антитела против человеческого иммуноглобулина (положительный внутренний контроль) - антитела, содержащиеся в анализируемом образце - соответствующий тип "гибридной молекулы"
- Вторая промывка. Пятикратно промывают лунки планшета фосфатным буфером с твином-20 или тритоном-100 для удаления гибридных молекул, не связавшихся с поверхностью лунки.- 100 μl of phosphate-buffered saline containing six different kinds of “hybrid molecules” are added to the wells of the plate. Incubated at a temperature of 37 o C for 30 minutes The complex is formed: solid phase - recombinant HCV antigens or antibodies against human immunoglobulin (positive internal control) - antibodies contained in the analyzed sample - the corresponding type of "hybrid molecule"
- Second flushing. Five times the wells of the plate are washed with phosphate buffer with Tween-20 or Triton-100 to remove hybrid molecules that are not bound to the surface of the well.
- Проведение ПЦР. В лунки вносят компоненты, необходимые для проведения ПЦР: буферный раствор, содержащий 20 мМ Трис-HCl, рН 8,4, 50 мМ КСl, 3,5 мМ MgCl2, 0,01% раствор желатина, праймеры 0,5 пмоль/л, ДНК-полимераза Taq 0.025 ед./мкл, по 0,2 мМ dATP, dGTP, dCTP, dTTP (для всех компонентов реакционной смеси указаны конечные концентрации), 50 мкл. минерального масла. Планшет помещают в термоциклер и проводят 20-25 циклов амплификации. Каждый цикл включает: денатурацию - 95 oC 1мин., отжиг - 55 oC 30 с, элонгацию - 72 oC 30 с.- Carrying out PCR. The components necessary for PCR are added to the wells: a buffer solution containing 20 mM Tris-HCl, pH 8.4, 50 mM KCl, 3.5 mM MgCl 2 , 0.01% gelatin solution, primers 0.5 pmol / L , Taq DNA polymerase 0.025 units / μl, 0.2 mM dATP, dGTP, dCTP, dTTP (final concentrations are indicated for all components of the reaction mixture), 50 μl. mineral oil. The tablet is placed in a thermal cycler and spend 20-25 amplification cycles. Each cycle includes: denaturation - 95 o C 1 min., Annealing - 55 o C 30 s, elongation - 72 o C 30 s.
- На заключительном этапе проводится гибридизационный анализ продуктов ПЦР. Наличие в реакционной ячейке нуклеотидной последовательности соответствующей "гибридной молекуле" с антителами к иммуноглобулинам человека в качестве лигандной части (положительный контроль) свидетельствует о правильном проведении анализа (наличие образца в лунке, отсутствие веществ, ингибирующих иммунную реакцию, ПЦР и т.д.). Отсутствие в реакционной ячейке нуклеотидной последовательности, соответствующей "гибридной молекуле" с БСА в качестве лигандной части, свидетельствует об отсутствии неспецифической сорбции "гибридных молекул" на твердой фазе. Обнаружение полинуклеотидных последовательностей, соответствующих "гибридным молекулам" с core, NS3, NS4, NS5 антигенами в качестве лигандной части, свидетельствует о наличии антител к данным антигенам HCV в анализируемом образце сыворотки. - At the final stage, a hybridization analysis of PCR products is carried out. The presence in the reaction cell of the nucleotide sequence of the corresponding "hybrid molecule" with antibodies to human immunoglobulins as the ligand part (positive control) indicates the correct analysis (the presence of a sample in the well, the absence of substances that inhibit the immune response, PCR, etc.). The absence in the reaction cell of a nucleotide sequence corresponding to a “hybrid molecule” with BSA as the ligand part indicates the absence of nonspecific sorption of “hybrid molecules” on the solid phase. Detection of polynucleotide sequences corresponding to “hybrid molecules” with core, NS3, NS4, NS5 antigens as the ligand portion indicates the presence of antibodies to these HCV antigens in the analyzed serum sample.
Предпочтительней гибридизационный анализ проводить с использованием технологии ДНК-чипов, что позволяет анализировать большое количество образцов с минимальными затратами времени и реактивов. Однако возможно использование и традиционных вариантов гибридизационного анализа. В качестве примера предлагается методика гибридизационного анализа в 96-луночном полистироловом планшете. It is preferable to conduct hybridization analysis using DNA chip technology, which allows you to analyze a large number of samples with minimal time and reagents. However, it is possible to use traditional variants of hybridization analysis. As an example, a hybridization assay technique is proposed in a 96-well polystyrene plate.
- На поверхность лунок 96-луночного планшета раздельно сорбируются одноцепочные ДНК, с последовательностью нуклеотидов, комплиментарной одной из шести матричных зон "гибридных молекул". - Single-stranded DNA, with a nucleotide sequence complementary to one of the six matrix zones of “hybrid molecules”, is separately sorbed onto the surface of the wells of a 96-well plate.
- Материал с продуктами ПЦР из реакционной ячейки переносится в каждую из шести лунок планшета. - Material with PCR products from the reaction cell is transferred to each of the six wells of the plate.
- Во все лунки планшета вносятся олигонуклеотидные зонды, комплиментарные зоне связывания с праймерами полинуклеотидной части "гибридной молекулы", меченные ферментом. - Oligonucleotide probes complementary to the binding zone with the primers of the polynucleotide portion of the “hybrid molecule” labeled with the enzyme are introduced into all wells of the plate.
- Планшет инкубируют. В случае наличия в анализируемом материале комплиментарных последовательностей ДНК происходит гибридизация матричной зоны полинуклеотидной части "гибридной молекулы" с ДНК, сорбированной на поверхности лунок. В свою очередь зона связывания с праймерами полинуклеотидной части "гибридной молекулы" гибридизируется с олигонуклеотидными зондами, меченными ферментом. - The tablet is incubated. In the case of the presence of complementary DNA sequences in the analyzed material, the matrix zone of the polynucleotide part of the “hybrid molecule” is hybridized with the DNA sorbed on the surface of the wells. In turn, the binding zone with primers of the polynucleotide portion of the “hybrid molecule” hybridizes with oligonucleotide probes labeled with the enzyme.
- Лунки планшета промывают для удаления несвязавшихся зондов. - The wells of the plate are washed to remove unbound probes.
- Вносят раствор хромогенного субстрата. По тому, в каких лунках произошло развитие окраски, судят матричные зоны каких типов "гибридных молекул" амплифицировались в ходе ПЦР. - Make a solution of a chromogenic substrate. By the fact in which wells color development occurred, the matrix zones of which types of "hybrid molecules" were amplified by PCR were judged.
В качестве примера, иллюстрирующего работу метода для одновременного определения антител и антигенов, предлагается тест для определения антител к вирусу иммунодефицита человека (ВИЧ) 1 и 2 типов, антигена ВИЧ-1, HBsAg и антител к HCV. As an example, illustrating the operation of the method for the simultaneous determination of antibodies and antigens, a test is proposed to determine antibodies to human immunodeficiency virus (HIV) types 1 and 2, HIV-1 antigen, HBsAg and antibodies to HCV.
- Получение носителя с иммобилизированными антителами и антигенами. Вирусный белок gp160 ВИЧ-1, синтетический пептид ANT70 ВИЧ-1 группы 0, синтетический пептид gp36 env ВИЧ-2, моноклональные антитела мыши к антигену р24 ВИЧ-1, поликлональные антитела к HBsAg, рекомбинантные антигены HCV, соответствующие участкам белков, кодируемых структурной (core) и неструктурной (NS3, NS4, NS5) областями геномавируса гепатита С, а также антитела к иммуноглобулинам человека (для положительного внутреннего контроля) сорбируются на поверхности 96-луночного полистиролового планшета. - Getting media with immobilized antibodies and antigens. HIV-1 gp160 viral protein, HIV-1 group 0 synthetic ANT70 peptide, HIV-2 synthetic gp36 env peptide, mouse monoclonal antibodies to HIV-1 p24 antigen, polyclonal antibodies to HBsAg, recombinant HCV antigens corresponding to regions of proteins encoded by structural ( core) and non-structural (NS3, NS4, NS5) regions of hepatitis C genomavirus, as well as antibodies to human immunoglobulins (for positive internal control) are adsorbed on the surface of a 96-well polystyrene plate.
- Получение "гибридной молекулы". В качестве лигандной части используются вирусный белок gp160 ВИЧ-1, синтетический пептид ANT70 ВИЧ-1 группы 0, синтетический пептид gp36 env ВИЧ-2, моноклональные антитела мыши к антигену р24 ВИЧ-1, поликлональные антитела к HBsAg, рекомбинантные антигены HCV, соответствующие участкам белков, кодируемых структурной (core), и неструктурной (NS3, NS4, NS5) областями геномавируса гепатита С, антитела к иммуноглобулинам человека (для положительного внутреннего контроля), бычий сывороточный альбумин (для отрицательного внутреннего контроля). Полинуклеотидные части представляют собой одноцепочную ДНК длиной 130 нуклеотидов и имеют по две зоны связывания с праймерамии ПЦР длиной 20 нуклеотидов, идентичные для всех типов "гибридных молекул", которые ограничивают собой матричную зону. Последовательность нуклеотидов матричной зоны уникальна для каждого типа "гибридной молекулы". Конъюгирование лигандной и полинуклеотидной частей происходит аналогично тому, как это было описано в предыдущем примере. - Obtaining a "hybrid molecule". As the ligand part, the viral protein gp160 HIV-1, the synthetic peptide ANT70 HIV-1 of group 0, the synthetic peptide gp36 env HIV-2, the monoclonal antibodies of the mouse to the p24 HIV-1 antigen, the polyclonal antibodies to HBsAg, the recombinant HCV antigens corresponding to the sites are used proteins encoded by structural (core) and non-structural (NS3, NS4, NS5) regions of the hepatitis C genomavirus, antibodies to human immunoglobulins (for positive internal control), bovine serum albumin (for negative internal control). The polynucleotide portions are single-stranded DNAs with a length of 130 nucleotides and each have two binding zones with PCR primers of 20 nucleotides in length, identical for all types of "hybrid molecules" that limit the matrix region. The nucleotide sequence of the template zone is unique to each type of “hybrid molecule”. Conjugation of the ligand and polynucleotide moieties occurs in a similar manner to that described in the previous example.
Методика проведения иммунохимического анализа:
- В лунки планшета вносят по 100 мкм анализируемых сывороток и по 100 мкл фосфатно-солевого буфера, содержащего все типы "гибридных молекул". Инкубируют 1 ч при температуре 37oC. В случае присутствия в образце аналита образуется комплекс: твердая фаза - сорбированные антигены или антитела - аналит - соответствующий тип "гибридной молекулы".Immunochemical analysis procedure:
- 100 μm of the analyzed sera and 100 μl of phosphate-saline buffer containing all types of "hybrid molecules" are added to the wells of the plate. Incubated for 1 h at a temperature of 37 o C. If the analyte is present in the sample, a complex is formed: solid phase — adsorbed antigens or antibodies — analyte — the corresponding type of “hybrid molecule”.
- Промывка. Промывают лунки планшета фосфатным буфером с твином-20 или тритоном-100 восемь раз. - Flushing. Wash the plate wells with phosphate buffer with Tween-20 or Triton-100 eight times.
- Проведение ПЦР. В лунки вносят компоненты, необходимые для проведения ПЦР: буферный раствор, содержащий 20 мМ Трис-HCl, рН 8,4, 50 мМ КСl, 3,5 мМ MgCl2, 0,01% раствор желатина, праймеры 0,5 пмоль/л, ДНК-полимераза Taq 0.025 ед. /мкл, по 0,2 мМ dATP, dGTP, dCTP, dTTP (для всех компонентов реакционной смеси указаны конечные концентрации), 50 мкл минерального масла. Планшет помещают в термоциклер и проводят 20-25 циклов амплификации. Каждый цикл включает: денатурацию - 95 oC 1 мин, отжиг - 55oC 30 с, элонгацию - 72 oC 30 с.- Carrying out PCR. The components necessary for PCR are added to the wells: a buffer solution containing 20 mM Tris-HCl, pH 8.4, 50 mM KCl, 3.5 mM MgCl 2 , 0.01% gelatin solution, primers 0.5 pmol / L , Taq DNA polymerase 0.025 units. / μl, 0.2 mM dATP, dGTP, dCTP, dTTP (final concentrations are indicated for all components of the reaction mixture), 50 μl of mineral oil. The tablet is placed in a thermal cycler and spend 20-25 amplification cycles. Each cycle includes: denaturation - 95 o C 1 min, annealing - 55 o C 30 s, elongation - 72 o C 30 s.
- На заключительном этапе проводится гибридизационный анализ продуктов ПЦР. Факт обнаружения нуклеотидной последовательности, присущей определенному типу "гибридной молекулы" является свидетельством наличия данного аналита в образце. - At the final stage, a hybridization analysis of PCR products is carried out. The fact that a nucleotide sequence is inherent in a particular type of “hybrid molecule” is detected is evidence of the presence of this analyte in the sample.
В качестве примера, иллюстрирующего работу метода для одновременного выявления аналитов в биологических жидкостях, предлагается тест для определения следующих лекарственных и наркотических веществ в моче: опиаты, амфетамин, барбитурат, метадон, метаболиты бензодиазепина, пропоксифен, метаболиты кокаина, фенциклидин, каннабио-иды, метаквалон. As an example, illustrating the work of the method for the simultaneous detection of analytes in biological fluids, we propose a test to determine the following drugs and drugs in the urine: opiates, amphetamine, barbiturate, methadone, benzodiazepine metabolites, propoxyphene, ***e metabolites, phencyclidine, cannabioids, methaqualonone .
- Антитела к определяемым в тесте лекарственным и наркотическим соединениям сорбируются на поверхности 96-луночного полистиролового планшета. - Antibodies to the drug and drug compounds determined in the test are adsorbed on the surface of a 96-well polystyrene plate.
- Получение "гибридной молекулы". В качестве лигандной части также используются антитела к определяемым лекарственным и наркотическим веществам. Полинуклеотидные части представляют собой одноцепочную ДНК длиной 130 нуклеотидов и имеют по две зоны связывания с праймерами и ПЦР длиной 20 нуклеотидов, идентичные для всех типов "гибридных молекул", которые ограничивают собой матричную зону. Последовательность нуклеотидов матричной зоны уникальна для каждого типа "гибридной молекулы". Конъюгирование лигандной и полинуклеотидной частей происходит аналогично тому, как это было описано в предыдущих примерах. - Obtaining a "hybrid molecule". Antibodies to detectable drugs and narcotic substances are also used as the ligand part. The polynucleotide portions are single-stranded DNA with a length of 130 nucleotides and each have two binding zones with primers and a PCR of 20 nucleotides in length, identical for all types of "hybrid molecules" that limit the matrix region. The nucleotide sequence of the template zone is unique to each type of “hybrid molecule”. The conjugation of the ligand and polynucleotide parts occurs in the same way as described in the previous examples.
Методика проведения иммунохимического анализа:
- В лунки вносят образец. Инкубируют при комнатной температуре 10 мин. В случае, если в образце есть искомые вещества, образуется комплекс: твердая фаза - сорбированные антитела - аналит - "гибридная молекула".Immunochemical analysis procedure:
- A sample is added to the wells. Incubate at room temperature for 10 minutes. If the sample contains the required substances, a complex is formed: solid phase - sorbed antibodies - analyte - "hybrid molecule".
- Лунки промывают фосфатно-солевым буфером пять раз. - The wells are washed with phosphate-buffered saline five times.
- После добавления всех необходимых компонентов проводят ПЦР, так как это было описано в предыдущих примерах. - After adding all the necessary components, PCR is carried out, as it was described in the previous examples.
- Проводят анализ гибридизационный продуктов ПЦР. Выявление уникальной нуклеотидной последовательности матричной части "гибридной молекулы" будет свидетельствовать о наличии аналита в образце. - Carry out a hybridization analysis of PCR products. Identification of the unique nucleotide sequence of the matrix part of the “hybrid molecule” will indicate the presence of an analyte in the sample.
Вообще определение продуктов ПЦР можно проводить не только при помощи гибридизационного анализа. Например, если уникальность матричной зоны задавать как последовательностью нуклеотидов, так и их количеством, то для идентификации продуктов ПЦР можно использовать масс-спектрометрию. In general, the determination of PCR products can be carried out not only using hybridization analysis. For example, if the uniqueness of the matrix zone is set by both the sequence of nucleotides and their quantity, then mass spectrometry can be used to identify PCR products.
Claims (9)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2002108880/14A RU2213974C1 (en) | 2002-04-09 | 2002-04-09 | Method for simultaneous detection of several analytes |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2002108880/14A RU2213974C1 (en) | 2002-04-09 | 2002-04-09 | Method for simultaneous detection of several analytes |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2213974C1 true RU2213974C1 (en) | 2003-10-10 |
| RU2002108880A RU2002108880A (en) | 2003-11-27 |
Family
ID=31989002
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2002108880/14A RU2213974C1 (en) | 2002-04-09 | 2002-04-09 | Method for simultaneous detection of several analytes |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2213974C1 (en) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2559581C2 (en) * | 2009-03-12 | 2015-08-10 | Сименс Хелткеа Дайагностикс Инк. | Immunologic research with application of non-dispersible chemiluminiscent reagents |
-
2002
- 2002-04-09 RU RU2002108880/14A patent/RU2213974C1/en not_active IP Right Cessation
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2559581C2 (en) * | 2009-03-12 | 2015-08-10 | Сименс Хелткеа Дайагностикс Инк. | Immunologic research with application of non-dispersible chemiluminiscent reagents |
| US9347947B2 (en) | 2009-03-12 | 2016-05-24 | Siemens Healthcare Diagnostics Inc. | Immunoassays employing non-particulate chemiluminescent reagent |
| US9720004B2 (en) | 2009-03-12 | 2017-08-01 | Siemens Healthcare Diagnostics Inc. | Immunoassays employing non-particulate chemiluminescent reagent |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP4091113B2 (en) | Immunoassay and kit with two reagents that crosslink when attached to an analyte | |
| US6511809B2 (en) | Method for the detection of an analyte by means of a nucleic acid reporter | |
| FI94429B (en) | Method for the determination of nucleic acids and of the reagent combination and reagent packaging useful in the process | |
| US5989813A (en) | Detection of amplified nucleic acid sequences using bifunctional haptenization and dyed microparticles | |
| AU783644B2 (en) | Methods and kits for proximity probing | |
| JP3034304B2 (en) | Protein-nucleic acid probe and immunoassay using the same | |
| Self et al. | Advances in immunoassay technology | |
| WO2003078966A2 (en) | Signal amplification by hybrid capture | |
| WO1999032884A1 (en) | Assay apparatus | |
| JPH0333656A (en) | Nucleic acid measuring method | |
| JP2006129866A (en) | Method for detecting test substance using nucleic acid probe | |
| US20020110846A1 (en) | Amplified array analysis method and system | |
| RU2213974C1 (en) | Method for simultaneous detection of several analytes | |
| EP0799421B1 (en) | Differential timing method for detecting multiple analytes in a test sample | |
| US5871906A (en) | Method for detection of amplified nucleic acid products and related diagnostic assays | |
| US8153367B2 (en) | Amplified array analysis system | |
| US20050239078A1 (en) | Sequence tag microarray and method for detection of multiple proteins through DNA methods | |
| RU2002108880A (en) | Method for the simultaneous determination of several analytes | |
| JP2002116207A (en) | High-sensitivity measuring method and kit used for it | |
| WO2002053768A2 (en) | Dna rapid immune detection methods and apparatus | |
| Corsini et al. | DIAGNOSTIC TECHNIQUES | |
| EP0672176A1 (en) | A method for amplifying and detecting a target nucleic acid sequence of hiv-1 | |
| WO1999028503A1 (en) | Methods of detecting polynucleotide analytes |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20040410 |