RU2211040C2 - Method for preparative isolation of high density lipoprotein fraction from plasma or serum blood - Google Patents

Abstract

FIELD: medicine, preparative biochemistry. SUBSTANCE: invention relates to methods for isolation of protein fractions, in part, high density lipoprotein (HDLP) fraction from plasma or serum blood and can be used for determination of fractional-component composition of lipoproteins in diagnosis of dyslipoproteinemia. Plasma or serum blood samples are heated at temperature 70-100 C for time providing milk color of samples. Formed protein gel is milled, centrifuged and supernatant containing fraction of HDLP particles is taken off. The most optimal result is obtained if samples of plasma or serum blood are heated at temperature 80-90 C for 2-10 min. Method provides reduction of labor intensity and time of process, it doesn't require the expensive cost equipment and chemically active reagents, it doesn't pollute the final preparative form, it doesn't destroy nativity of HDLP particles and it doesn't distort results of analysis of fractional-component composition of lipoproteins. EFFECT: improved isolation method. 4 cl, 1 tbl, 2 dwg, 2 ex

Description

Изобретение относится к методам препаративного выделения белковых фракций, в частности липопротеинов высокой плотности, из плазмы или сыворотки крови и может быть использовано в медицине для определения фракционно-компонентного состава липопротеинов при диагностике дислипопротеинемий и для других научных и технологических целей. The invention relates to methods for the preparative isolation of protein fractions, in particular high density lipoproteins, from plasma or blood serum and can be used in medicine to determine the fractional component composition of lipoproteins in the diagnosis of dyslipoproteinemia and for other scientific and technological purposes.

Основными маркерами при диагностике нарушений липидного обмена используют суммарный холестерин, триглицериды, холестерин фракции липопротеинов (ЛП) высокой плотности (ЛПВП) и апо-белки ЛП. Однако известно, что сывороточные ЛП крови имеют очень высокую полидисперсность: частицы ЛПВП меньше по размеру липопротеинов низкой плотности (ЛПНП) в 3-4 раза, а липопротеины очень низкой плотности (ЛПОНП) - меньше в 10-12 раз, а их функции существенно отличаются. Кроме того, отдельные фракции ЛП также обладают полидисперсностью и их субфракционный состав также отражает специфику липидного обмена в организме. Поэтому анализ отдельных фракций, в частности ЛПВП, а не одновременно всех фракций ЛП, может существенно повысить информативность анализа фракционно-компонентного состава (ФКС) ЛП различными аналитическими методами и, в частности, методом малоуглового рентгеновского рассеяния (МУРР) [1]. The main markers in the diagnosis of lipid metabolism disorders are total cholesterol, triglycerides, high density lipoprotein (LP) cholesterol (HDL) and LP apo-proteins. However, it is known that serum blood LPs have a very high polydispersity: HDL particles are 3-4 times smaller in size than low-density lipoproteins (LDL), and very low-density lipoproteins (VLDL) are 10-12 times smaller, and their functions differ significantly . In addition, individual LP fractions also have polydispersity and their subfractional composition also reflects the specificity of lipid metabolism in the body. Therefore, the analysis of individual fractions, in particular HDL, and not simultaneously all LP fractions, can significantly increase the information content of the analysis of the fractional component composition (PCF) of LPs by various analytical methods and, in particular, small angle X-ray scattering (SAXS) [1].

В настоящее время наиболее широко распространены три основных способа выделения и очистки липопротеинов отдельных классов сыворотки крови в препаративных количествах: ультрацентрифугирование в солевых растворах, хроматография и осаждение. Электрофорез используется в основном в аналитических целях. Currently, the three most common methods for the isolation and purification of lipoproteins of certain classes of blood serum in preparative amounts are most widely distributed: ultracentrifugation in saline solutions, chromatography, and precipitation. Electrophoresis is used mainly for analytical purposes.

Известно использование ультрацентрифугирования (аналог 2) для выделения и очистки белков. ЛП данным методом можно разделить в соответствии с различиями в их гидратированной плотности. Наиболее широко используется последовательное (серийное) центрифугирование при различных плотностях водного растворителя. Метод основан на процедуре, предложенной Хавелом и соавт. [2], и детально разработан Лингреном [3]. Принцип метода состоит в том, что гидратированная плотность плазмы или сыворотки крови доводится до нижнего предела плотности фракции, которую необходимо выделить, и затем проба центрифугируется при 100000g несколько часов. ЛП, имеющие плотность, меньшую плотности растворителя, флотируют (всплывают) к верхней части пробирки, а другие седиментируют на дно. Осадки встряхивают и их гидратированную плотность доводят до верхнего предела следующей требуемой плотности ЛП фракции. Центрифугирование повторяют вплоть до выделения необходимой фракции в верхней части пробирки (в супернатанте). Фракция ЛПВП выделяется после предварительного отделения фракций ЛПОНП и ЛПНП, и для ее выделения требуется проводить центрифугирование в течение не менее 24-36 часов при скорости ротора 40000-100000g. К достоинствам центрифугирования следует отнести то, что этот способ обладает значительной гибкостью, т.к. дает возможность изолировать и выделить почти любое требуемое количество фракций, которые можно охарактеризовать в пределах двух интервалов плотности водного растворителя. В целом этот способ характеризуется высокой точностью и воспроизводимостью. It is known to use ultracentrifugation (analog 2) for the isolation and purification of proteins. By this method, drugs can be divided according to differences in their hydrated density. The most widely used sequential (serial) centrifugation at various densities of an aqueous solvent. The method is based on the procedure proposed by Havel et al. [2], and developed in detail by Lingren [3]. The principle of the method is that the hydrated density of the plasma or blood serum is brought to the lower limit of the density of the fraction to be isolated, and then the sample is centrifuged at 100000g for several hours. Drugs having a density lower than the solvent density float (float) to the top of the tube, and others sediment to the bottom. The precipitates are shaken and their hydrated density is brought to the upper limit of the next required density of the LP fraction. Centrifugation is repeated until the desired fraction is isolated in the upper part of the tube (in the supernatant). The HDL fraction is separated after preliminary separation of the VLDL and LDL fractions, and centrifugation is required for its isolation for at least 24-36 hours at a rotor speed of 40,000-100,000 g. The advantages of centrifugation include the fact that this method has significant flexibility, because makes it possible to isolate and isolate almost any required number of fractions that can be characterized within two intervals of the density of the aqueous solvent. In general, this method is characterized by high accuracy and reproducibility.

К недостаткам центрифугирования относятся необходимость использования (для обеспечения заданной плотности растворителя) таких солей, как NaCl, CsCl, KBr или NaBr и проведение специальных процедур для их последующего удаления из готовых растворов фракций ЛП с помощью диализа. Кроме того, необходимо использовать высокоскоростные, термостатированные и дорогостоящие ультрацентрифуги типа Beckman (США), а время выделения, например, фракции ЛПВП составляет более 36 часов. The disadvantages of centrifugation include the need to use (to ensure a given solvent density) salts such as NaCl, CsCl, KBr or NaBr and to carry out special procedures for their subsequent removal from ready-made solutions of LP fractions using dialysis. In addition, it is necessary to use high-speed, temperature-controlled and expensive ultracentrifuges of the Beckman type (USA), and the time for isolation, for example, of the HDL fraction is more than 36 hours.

Известен другой метод очистки белков - метод хроматографии (аналог 1) [4] . Его обычно применяют для разделения и очистки всех или отдельных фракций ЛП, полученных другими методами, в частности ультрацентрифугированием либо осаждением. Используется в основном адсорбционная, ионообменная, аффинная и гель-фильтрационная хроматография. Сущность этого способа заключается в пропускании исходной плазмы или сыворотки крови через колонку, наполненную специальным адсорбентом или гелем, по-разному взаимодействующим с разделяемыми белками. В результате прохождения раствора через такую колонку из-за разных скоростей движения фракции молекул выходят не одновременно, а друг за другом, и их можно отбирать в отдельные пробирки. Достоинством этого способа является относительная простота реализации и использование недорогостоящего оборудования. Known for another method of protein purification - chromatography method (analogue 1) [4]. It is usually used for the separation and purification of all or individual fractions of drugs obtained by other methods, in particular ultracentrifugation or sedimentation. Mainly used adsorption, ion exchange, affinity and gel filtration chromatography. The essence of this method is to pass the initial plasma or blood serum through a column filled with a special adsorbent or gel, interacting differently with the shared proteins. As a result of the passage of the solution through such a column, due to different speeds of motion, the fractions of the molecules do not exit simultaneously, but one after another, and they can be taken in separate tubes. The advantage of this method is the relative ease of implementation and the use of low-cost equipment.

К недостаткам этого метода следует отнести трудность отделения ЛП от других белков сыворотки крови, длительность процесса и большое разведение выделенных фракций ЛП. The disadvantages of this method include the difficulty of separating the drug from other serum proteins, the duration of the process and the large dilution of the isolated fractions of the drug.

Наиболее близким техническим решением (прототипом) является способ химического осаждения белков [5], основанный на том, что такие анионы, как сульфированные полисахариды (гепарин, декстрансульфат и др.) в комбинации с некоторыми двухвалентными катионами (Мn²⁺, Со²⁺, Mg²⁺ , Са²⁺ и др.) способны осаждать ЛП при значениях рН, близких к 7, образуя их растворимые комплексы. Сущность этого способа заключается в добавлении к плазме или сыворотке крови растворов гепарина и солей типа MnCl₂ при определенных их концентрациях. Далее эти смеси встряхивают и центрифугируют при 6000g. Фракции ЛПОНП и ЛПНП при этом выпадают в осадок, а надосадочную жидкость, содержащую фракцию ЛПВП, очищают путем диализа против нескольких порций нейтрального буфера в течение 48 часов. К достоинствам этого способа относится простота и доступность реализации и использование только низкоскоростного центрифугирования.The closest technical solution (prototype) is a method of chemical precipitation of proteins [5], based on the fact that such anions as sulfonated polysaccharides (heparin, dextransulfate, etc.) in combination with some divalent cations (Mn ²⁺ , Co ²⁺ , Mg ²⁺ , Ca ²⁺ , etc.) are capable of precipitating drugs at pH close to 7, forming their soluble complexes. The essence of this method is to add to the plasma or serum solutions of heparin and salts of the type MnCl ₂ at certain concentrations. Next, these mixtures are shaken and centrifuged at 6000g. In this case, the VLDL and LDL fractions precipitate and the supernatant containing the HDL fraction is purified by dialysis against several portions of a neutral buffer for 48 hours. The advantages of this method include the simplicity and accessibility of the implementation and the use of only low-speed centrifugation.

Однако у методов химического осаждения имеются и ряд недостатков:
1) сывороточные белки остаются как в осажденных ЛП (преципитате), так и в надосадочной жидкости;
2) трудность и длительность удаления преципитирующих агентов;
3) нарушение нативности ЛП частиц.However, chemical deposition methods have several disadvantages:
1) whey proteins remain both in the precipitated drug (precipitate) and in the supernatant;
2) the difficulty and duration of the removal of precipitating agents;
3) violation of the nativeness of LP particles.

Таким образом, известные методы (аналоги и прототип) выделения фракции ЛП из образцов сывороток крови трудоемки, длительны, требуют использования дорогостоящего оборудования, а также использования химически активных реактивов, что загрязняет конечную препаративную форму и отрицательно сказывается на целостности структур ЛП и искажает результаты анализов ФКС ЛП. Thus, the known methods (analogues and prototype) of isolating the LP fraction from blood serum samples are laborious, time consuming, require the use of expensive equipment, as well as the use of chemically active reagents, which pollutes the final preparative form and negatively affects the integrity of the structures of the LP and distorts the results of FCC analyzes LP.

Техническим результатом предлагаемого изобретения является разработка такого способа препаративного выделения липопротеинов высокой плотности из плазмы или сыворотки крови, который позволил бы устранить недостатки известных аналогов и прототипа. The technical result of the invention is the development of such a method of preparative isolation of high density lipoproteins from plasma or blood serum, which would eliminate the disadvantages of the known analogues and prototype.

Указанная задача решается тем, что в способе препаративного выделения фракции липопротеинов высокой плотности из плазмы или сыворотки крови, включающем подготовку образцов плазмы или сыворотки крови, воздействие на них фактором, приводящим к разделению липопротеинов на фракции с последующим низкоскоростным центрифугированием образцов плазмы или сыворотки и отбором целевой надосадочной фракции липопротеинов высокой плотности, согласно изобретению в качестве воздействующего фактора используют нагревание образцов плазмы или сыворотки крови при температуре +70-100^oС в течение времени, достаточного для приобретения образцами молочного цвета и образования белкового геля, причем перед низкоскоростным центрифугированием белковый гель плазмы или сыворотки крови измельчают.This problem is solved in that in a method for the preparative isolation of a fraction of high density lipoproteins from plasma or blood serum, which includes the preparation of plasma or blood serum samples, exposure to them by a factor leading to the separation of lipoproteins into fractions, followed by low-speed centrifugation of plasma or serum samples and selection of the target the supernatant fraction of high density lipoproteins, according to the invention, the heating of plasma samples or serum ki blood at + 70-100 ^o C for a time sufficient for the acquisition of samples and the formation of milky protein gel, and by low speed centrifugation before plasma protein gel or blood serum milled.

Наиболее оптимальный результат достигается, когда образцы плазмы или сыворотки крови нагревают при температуре 80-90^oС в течение 2-10 минут.The most optimal result is achieved when plasma or serum samples are heated at a temperature of 80-90 ^o C for 2-10 minutes.

Причем большим температурам соответствуют меньшие времена прогрева образцов плазмы или сыворотки крови. Moreover, higher temperatures correspond to shorter heating times for plasma or blood serum samples.

В основе разработки нового способа выделения фракции ЛПВП из цельных сывороток крови использовался только физический фактор воздействия на сыворотки, а именно воздействие на плазму или сыворотку крови повышенной температуры. Известно, что при температурах выше 60^oС все простые белки денатурируются, а при 70^oС и выше образуют плотный гель. Термическое воздействие на сыворотку крови приводит к тому, что сывороточные белки переходят в нерастворимое состояние, в котором их можно измельчить и осадить на низкоскоростной центрифуге. Но оказалось, что после такой процедуры в надосадочной жидкости остается одна из фракций ЛП, а именно ЛПВП. Этот эффект был проверен многократно на разных образцах плазм и сывороток крови методом МУРР и подтвержден в параллельных анализах методом электрофореза в Институте биохимии СО РАМН. Термофильность ЛПВП связана, по-видимому, с защитной ролью липидных компонентов по отношению к апо-белкам ЛП - самому уязвимому к воздействию повышенной температуры компоненту ЛП. Именно эти термофильные свойства частиц ЛПВП и были использованы при разработке нового препаративного способа выделения этой фракции ЛП из плазм и сывороток крови без использования химических реактивов. При разработке нового способа оптимизированы значения температуры и времени воздействия на образцы сывороток крови с целью полного выделения частиц ЛПВП без примесей других фракций ЛП, проведены сравнительные анализы по определению ФКС ЛП в исходных сыворотках и в образцах, выделяемых предлагаемым способом и способом-прототипом с целью получения оценок определения чистоты и полноты выделения фракции ЛПВП. Кроме того, получены оценки изменений в структурах и субфракционном составе ЛПВП после процедур осаждения и термического воздействия, а также сохранения их функциональных свойств.The basis for the development of a new method for the isolation of HDL fractions from whole blood serums was used only the physical effect factor on the serum, namely the effect on the plasma or blood serum of elevated temperature. It is known that at temperatures above 60 ^o With all simple proteins are denatured, and at 70 ^o With and above form a dense gel. Thermal action on blood serum leads to the fact that whey proteins become insoluble, in which they can be crushed and precipitated in a low-speed centrifuge. But it turned out that after such a procedure, one of the LP fractions, namely HDL, remains in the supernatant. This effect has been tested many times on different samples of plasma and blood serum by the SAXS method and is confirmed in parallel analyzes by electrophoresis at the Institute of Biochemistry SB RAMS. The thermophilicity of HDL is apparently associated with the protective role of lipid components in relation to LP apo-proteins - the most vulnerable component of LP. It is these thermophilic properties of HDL particles that were used in the development of a new preparative method for isolating this fraction of LP from plasma and blood serum without using chemical reagents. When developing a new method, the values of temperature and time of exposure to blood serum samples were optimized in order to completely isolate HDL particles without impurities of other LP fractions, comparative analyzes were performed to determine the PCF of PL in the initial sera and in samples isolated by the proposed method and prototype method in order to obtain assessments of the purity and completeness of the selection of the HDL fraction. In addition, estimates of changes in the structures and subfractional composition of HDL after deposition and thermal treatment procedures, as well as the preservation of their functional properties, were obtained.

На фиг. 1 приведены диаграммы фракционного состава ЛП от исходного образца плазмы крови (а), от выделенной способом-прототипом (б) и предлагаемым способом (в) фракции ЛПВП из того же исходного образца. На фиг.2 приведены диаграммы фракционного состава ЛП от исходного образца сыворотки крови (а), от выделенной способом-прототипом (б) и новым способом фракции ЛПВП (в) из того же исходного образца. In FIG. 1 shows diagrams of the fractional composition of the drug from the initial blood plasma sample (a), from the isolated prototype method (b) and the proposed method (c) of the HDL fraction from the same initial sample. Figure 2 shows diagrams of the fractional composition of the drug from the initial blood serum sample (a), from the selected prototype method (b) and the new method of the HDL fraction (c) from the same source sample.

Пример 1. Технология препаративного выделения фракции лидопротеинов высокой плотности из плазмы крови. Example 1. The technology of preparative separation of the fraction of high density lidoproteins from blood plasma.

Использовали образец плазмы крови здорового человека в объеме 0,5 мл. Пациент: женщина, 36 лет, общий холестерин - 178,0 мг/дл, холестерин ЛПВП - 58,4 мг/дл, общие триглицериды - 122,2 мг/дл. A healthy human plasma sample was used in a volume of 0.5 ml. Patient: woman, 36 years old, total cholesterol - 178.0 mg / dl, HDL cholesterol - 58.4 mg / dl, total triglycerides - 122.2 mg / dl.

Образец помещали в стандартную пробирку диаметром 5 мм и длиной 50 мм. Пробирку с образцом плазмы крови помещали вертикально в сосуд с водой, предварительно прогретой до 90^oС, погрузив в воду до верхнего уровня жидкости образца в пробирке. Прогрев проводили в течение 5 минут, в результате чего жидкость в пробирке приобрела молочный цвет, после чего пробирку вынимали из сосуда с водой и после охлаждения в течение 1 минуты при комнатной температуре разрушали образовавшийся жесткий белковый гель с помощью узкого шпателя. Далее пробирку помещали в низкоскоростную центрифугу Т-51 (Германия) и центрифугировали в течение 3 минут при 5000g. Надосадочную жидкость (целевой продукт, содержащий фракцию частиц ЛПВП), образовавшуюся в результате центрифугирования, отбирали в отдельную пробирку и проводили ее анализ по определению ФКС ЛП с помощью метода МУРР [1]. Общее время препаративного выделения фракции липопротеинов высокой плотности из плазмы крови предлагаемым способом составило 9 минут.The sample was placed in a standard tube with a diameter of 5 mm and a length of 50 mm. A test tube with a blood plasma sample was placed vertically in a vessel with water preheated to 90 ^o C, immersed in water to the upper level of the sample liquid in the test tube. Warming was carried out for 5 minutes, as a result of which the liquid in the test tube became milky, after which the test tube was removed from the vessel with water and after cooling for 1 minute at room temperature, the formed hard protein gel was destroyed using a narrow spatula. The tube was then placed in a T-51 low speed centrifuge (Germany) and centrifuged for 3 minutes at 5000g. The supernatant (the target product containing the fraction of HDL particles) formed as a result of centrifugation was taken into a separate tube and its analysis was carried out to determine the PCF of the LP using the SAXS method [1]. The total time of preparative isolation of the fraction of high density lipoproteins from blood plasma by the proposed method was 9 minutes.

Для получения оценки эффективности нового способа проводили выделение фракции ЛПВП от того же образца способом-прототипом [5], используя осаждение фракций ЛПНП и ЛПОНП гепарином и MnCl₂. Для проведения процедур осаждения использовали 0,5 мл от того же образца плазмы крови.To obtain an estimate of the effectiveness of the new method, the HDL fraction was isolated from the same sample by the prototype method [5], using the precipitation of the LDL and VLDL fractions with heparin and MnCl ₂ . For the deposition procedures used 0.5 ml from the same sample of blood plasma.

Из диаграммы, приведенной на фиг.1а, в, видно, что фракция ЛПВП полностью соответствует исходному спектру ЛПВП (эффективность выделения - 97,8%), а другие ЛП практически отсутствуют, т.к. их доля составляет менее 1%. Как видно из фиг. 1б, ФКС ЛП от образца, приготовленного способом-прототипом, также почти не содержит других ЛП, кроме ЛПВП, и хотя количественно ЛПВП почти соответствуют исходной плазме крови (эффективность выделения - 95,3%), но субфракционный спектр ЛПВП существенно отличается от спектра исходной плазмы. From the diagram shown in figa, it is seen that the HDL fraction is fully consistent with the initial spectrum of HDL (allocation efficiency - 97.8%), and other drugs are practically absent, because their share is less than 1%. As can be seen from FIG. 1b, the FCC of an LP from a sample prepared by the prototype method also almost does not contain other drugs except HDL, and although HDL quantitatively almost corresponds to the initial blood plasma (allocation efficiency is 95.3%), the subfraction spectrum of HDL differs significantly from the spectrum of the initial plasma.

Пример 2. Технология препаративного выделения фракции липопротеинов высокой плотности из сыворотки крови. Example 2. The technology of preparative isolation of the fraction of high density lipoproteins from blood serum.

Использовали образец сыворотки крови здорового человека в объеме 0,5 мл. Пациент: мужчина, 49 лет, общий холестерин - 169,0 мг/дл, холестерин ЛПВП - 51,9 мг/дл, общие триглицериды - 129,5 мг/дл. Used a sample of blood serum of a healthy person in a volume of 0.5 ml. Patient: male, 49 years old, total cholesterol - 169.0 mg / dl, HDL cholesterol - 51.9 mg / dl, total triglycerides - 129.5 mg / dl.

Процедура всех операций по выделению фракции ЛПВП из образца сыворотки крови предлагаемым способом и способом-прототипом, а также анализ ФКС ЛП полностью соответствовал примеру 1, только использовали образец крови другого человека и вместо плазмы - сыворотку. Общее время препаративного выделения предлагаемым способом фракции ЛПВП из образца сыворотки крови составило 8 минут. The procedure for all operations to isolate the HDL fraction from a blood serum sample by the proposed method and the prototype method, as well as the analysis of FCC LP completely corresponded to example 1, only a blood sample of another person was used and instead of plasma, serum. The total time of preparative isolation by the proposed method of HDL fraction from a blood serum sample was 8 minutes.

Из диаграммы, приведенной на фиг.2а, в, как и примере 1, видно, что фракция ЛПВП хорошо соответствует исходному спектру ЛПВП (эффективность выделения - 97,2%), а другие ЛП практически отсутствуют. ФКС ЛП (фиг.26) от образца, приготовленного способом-прототипом, также почти не содержит других ЛП, кроме ЛПВП (эффективность выделения - 94,1%), но субфракционный спектр ЛПВП как и в примере 1 также существенно отличается от спектра ЛПВП исходной сыворотки. From the diagram shown in figa, in, as in example 1, it is seen that the HDL fraction corresponds well to the initial HDL spectrum (allocation efficiency - 97.2%), and other drugs are practically absent. FCC LP (Fig. 26) from the sample prepared by the prototype method also almost does not contain other drugs except HDL (allocation efficiency is 94.1%), but the subfraction spectrum of HDL as in Example 1 also differs significantly from the initial HDL spectrum serum.

Эффекты смещения спектров субфракций ЛПВП от образцов, выделенных методом-прототипом, можно объяснить тем, что в результате взаимодействия частиц ЛПВП с MnCl₂ происходит изменение их размеров в сторону увеличения примерно на 10-15% [5].The effects of the shift of the spectra of HDL subfractions from the samples isolated by the prototype method can be explained by the fact that as a result of the interaction of HDL particles with MnCl ₂ , their sizes change by upward by about 10-15% [5].

В предварительных опытах с помощью иммуноферментного анализа (ИФА) было показано, что выделенные предлагаемым способом ЛПВП "узнаются" антителами к апо-А1 практически так же, как ЛПВП исходной плазмы, а выделенные способом-прототипом ЛПВП "узнавались" антителами только после предварительного диализа надосадочной жидкости против буфера, не содержащего МnСl₂ и гепарина. Это указывает на сохранение функциональных свойств частиц ЛПВП после процедур выделения предлагаемым способом.In preliminary experiments using enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), it was shown that the HDLP isolated by the proposed method are "recognized" by antibodies to apo-A1 almost the same as the HDL of the initial plasma, and the HDLP isolated by the prototype method were "recognized" by the antibodies only after preliminary dialysis of the supernatant liquids against a buffer that does not contain MnCl ₂ and heparin. This indicates the preservation of the functional properties of HDL particles after the isolation procedures of the proposed method.

Таким образом, в примерах 1-2 показана высокая чистота и эффективность предлагаемого способа выделения фракции ЛПВП из образцов плазмы и сыворотки крови. Общее время процедуры выделения ЛПВП предлагаемым способом в 4-5 раз меньше, чем у способа-прототипа (без учета процедур диализа и гель-фильтрации), при этом не используются химические реагенты типа MnCl₂ и гепарина, а выделенная фракция ЛПВП абсолютно не содержит сывороточных белков-глобулинов и почти не содержит других ЛП, кроме частиц ЛПВП. При учете же процедур диализа и гель-фильтрации (для удаления МnСl₂ и гепарина) в способе-прототипе общее временя выделения ЛПВП предлагаемым способом в 200 раз меньше, чем у прототипа.Thus, in examples 1-2, the high purity and effectiveness of the proposed method for isolating HDL fractions from plasma and serum samples is shown. The total time of the procedure for the isolation of HDL by the proposed method is 4-5 times less than that of the prototype method (excluding dialysis and gel filtration procedures), while chemical reagents such as MnCl ₂ and heparin are not used, and the isolated HDL fraction does not contain any serum globulin proteins and contains almost no other drugs except HDL particles. When taking into account the dialysis and gel filtration procedures (to remove MnCl ₂ and heparin) in the prototype method, the total time for HDL allocation by the proposed method is 200 times less than that of the prototype.

В результате экспериментальных исследований получены оптимальные значения температур (70-95^oС) и времени термического воздействия (1-5 минут) - до появления визуальных признаков (молочный цвет) денатурации белков на образцы плазм и сывороток крови заданного объема, при которых фракция ЛПВП выделяется полностью и без примесей сывороточных глобулинов и других ЛП (см. таблицу). Отработаны все основные этапы выделения ЛПВП, включая процедуры прогрева сыворотки, измельчения геля, центрифугирования и отбора очищенной фракции ЛПВП.As a result of experimental studies, optimal temperatures (70-95 ^o C) and thermal exposure time (1-5 minutes) were obtained - until visual signs (milk color) of protein denaturation on plasma and blood serum samples of a given volume appear at which the HDL fraction is excreted completely and without impurities of serum globulins and other drugs (see table). All the main stages of HDL isolation, including the procedures for heating the serum, gel grinding, centrifugation, and selection of the purified HDL fraction, have been worked out.

Сравнительные анализы ФКС ЛП методом МУРР показали, что субфракционный состав ЛПВП после термического воздействия остается почти без изменений в отличие от химического осаждения, после которого происходят существенные изменения в размерах ЛП в сторону их повышения (на 10-15%). Это связано, по-видимому, с большим денатурирующим воздействием солей Mn на нативные структуры ЛП, чем в случае кратковременного воздействия на них повышенной температуры. Общее время выделения новым способом ЛПВП из плазм и сывороток крови не превышает 10 минут, что существенно быстрее, чем выделение методом осаждения. Выделенная предлагаемым способом фракция ЛПВП абсолютно не содержит других сывороточных белков, кроме следового количества фракции ЛПНП (менее 1%). Определение ФКС в ЛПВП и в цельных сыворотках крови проводилось методом МУРР. Comparative analyzes of PCF of the drug by the SAXS method showed that the subfraction composition of HDL after thermal exposure remains almost unchanged in contrast to chemical deposition, after which there are significant changes in the size of the drug in the direction of their increase (by 10-15%). This is apparently associated with a greater denaturing effect of Mn salts on native PL structures than in the case of short-term exposure to elevated temperature. The total time of isolation of HDL from plasma and blood serum by a new method does not exceed 10 minutes, which is significantly faster than the isolation by precipitation. Highlighted by the proposed method, the HDL fraction does not contain any other whey proteins, except for the trace amount of the LDL fraction (less than 1%). The determination of FCC in HDL and in whole blood serum was carried out by the method of SAXS.

Источники информации
1. Патент РФ 2099693, МПК G 01 N 21/20, опубл. 1995 г.Sources of information
1. RF patent 2099693, IPC G 01 N 21/20, publ. 1995 year

2. Havel R. J., Eder H., Bragdon J. The distribution and chemical composition of ultracentrifugally separated lipoproteins in human serum. //J. Clin. Invest. 1955. V.34. 7. P.1345-1353. 2. Havel R. J., Eder H., Bragdon J. The distribution and chemical composition of ultracentrifugally separated lipoproteins in human serum. // J. Clin. Invest. 1955. V.34. 7. P.1345-1353.

3. Lindgren F.T. Analysis of lipids and lipoproteins (Perkins E.G., ed. ). //American oil Chemists Soc., Champaign, SL., USA. 1975. P.204-223. 3. Lindgren F.T. Analysis of lipids and lipoproteins (Perkins E.G., ed.). // American oil Chemists Soc., Champaign, SL., USA. 1975. P. 204-223.

4. Холодова Ю. Д., Чаяло П.П. Липопротеины крови. Киев: Наукова думка. 1990. С. 26-33. 4. Kholodova Yu. D., Chayalo P.P. Blood lipoproteins. Kiev: Naukova Dumka. 1990.S. 26-33.

5. Холодова Ю. Д., Чаяло П.П. Липопротеины крови. Киев: Наукова думка. 1990. С. 22-26. 5. Kholodova Yu. D., Chayalo P.P. Blood lipoproteins. Kiev: Naukova Dumka. 1990.S. 22-26.

Claims (4)

1. Способ препаративного выделения фракции липопротеинов высокой плотности из плазмы или сыворотки крови, включающий подготовку образцов плазмы или сыворотки крови, воздействие на них фактором, приводящим к разделению липопротеинов на фракции с последующим низкоскоростным центрифугированием образцов плазмы или сыворотки и отбором целевой надосадочной фракции липопротеинов высокой плотности, отличающийся тем, что в качестве воздействующего фактора используют нагревание образцов плазмы или сыворотки крови при температуре 70-100^oС в течение времени, достаточного для приобретения образцами молочного цвета и образования белкового геля, причем перед низкоскоростным центрифугированием белковый гель плазмы или сыворотки крови измельчают.1. A method for preparative isolation of a high density lipoprotein fraction from plasma or blood serum, comprising preparing plasma or blood serum samples, exposing them to a factor leading to the separation of lipoproteins into fractions, followed by low-speed centrifugation of plasma or serum samples and selection of a target supernatant high density lipoprotein fraction , characterized in that as the influencing factor use the heating of plasma or blood serum samples at a temperature of 70-100 ^o In those sufficient time for the acquisition of samples of a milky color and the formation of a protein gel, and before low-speed centrifugation, the protein gel of plasma or blood serum is crushed. 2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что образцы плазмы или сыворотки крови нагревают при температуре 80-90^oС.2. The method according to p. 1, characterized in that the plasma or serum samples are heated at a temperature of 80-90 ^o C. 3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что образцы плазмы или сыворотки крови нагревают в течение 2-10 мин. 3. The method according to p. 1, characterized in that the plasma or serum samples are heated for 2-10 minutes 4. Способ по п. 1, отличающийся тем, что большим температурам, указанным в п. 2 диапазоне, соответствуют меньшие времена прогрева, указанным в п. 3 диапазоне, образцов плазмы или сыворотки крови. 4. The method according to p. 1, characterized in that the higher temperatures indicated in p. 2 range correspond to shorter heating times indicated in p. 3 range of plasma or serum samples.

Images