RU2209665C1 - Method for preparing adsorbent for protein chromatography - Google Patents

Abstract

FIELD: biotechnology, biochemistry, proteins. SUBSTANCE: invention relates to chromatography of proteins and can be used for purification and fractionation of enzymes. Method for preparing hydroxylapatite adsorbent involves the usage of calcium insoluble salts for preparing brushite, for example, calcium carbonate or ortho-phosphate that are treated with excess of sodium (potassium) dihydrogen phosphate or ortho-phosphoric acid at pH = 1.0-4.0 at temperature 100 C. Also, method involves preparing spherical hydroxylapatite particles that includes carrying out stages for preparing brushite and hydroxylapatite in round-bottomed flask rotating at the rate 10-50 rev/min. Method provides reducing number of the process steps and to enhance the yield of coarse-grained fractions of hydroxylapatite. EFFECT: improved preparing method. 5 cl

Description

Изобретение относится к области хроматографии белков, может быть использовано в биотехнологии для очистки и фракционирования ферментов и касается способа получения адсорбента - гидроксиапатита. The invention relates to the field of protein chromatography, can be used in biotechnology for the purification and fractionation of enzymes and relates to a method for producing an adsorbent - hydroxyapatite.

Известен способ получения гидроксиапатита (прототип), включающий стадию получения брушита (СаНР0₄) путем медленного сливания 0,5 М растворов СаСl₂ и Nа₂НРO₄ (по 2 л), фильтрование брушита, его 4-кратную промывку тремя литрами воды, обработку суспензии брушита в 3 л воды 100 мл 40%-ного NaOH при кипячении в течение 1 часа (нагрев 45 мин) при постоянном медленном перемешивании, отделение гидроксиапатита от очень мутного супернатанта фильтрованием, 4-кратную промывку гидроксиапатита тремя литрами воды, 2-кратную обработку 0,01 М фосфатным буфером (рН 6,8) при нагревании до 100^oС и 2-кратную обработку 0,001 М фосфатным буфером (рН 6,8) при кипячении в течение 15 мин (Справочник биохимика: Пер. с англ. /Досон Р., Эллиот Д., Эллиот У., Джонс К. - М.: Мир, 1991. - С. 463).A known method of producing hydroxyapatite (prototype), which includes the step of producing brushite (CaHPO ₄ ) by slowly draining 0.5 M solutions of CaCl ₂ and Na ₂ HPO ₄ (2 l each), filtering brushite, washing it 4 times with three liters of water, processing suspension of brushite in 3 l of water 100 ml of 40% NaOH while boiling for 1 hour (heating 45 min) with constant slow stirring, the separation of hydroxyapatite from the very turbid supernatant by filtration, 4-fold washing of hydroxyapatite with three liters of water, 2-fold treatment 0.01 M phosphate buffer (pH 6.8) at agrevanii to 100 ^o C and 2-fold treatment of 0.001 M phosphate buffer (pH 6.8) at reflux for 15 minutes (Reference biochemist: Translated from English / R. Dawson, D. Elliott, W. Elliott, Jones K.. . - M.: Mir, 1991 .-- S. 463).

Недостатками данного способа является сложность процесса и низкий выход крупнозернистых фракций (50-500 мкм) гидроксиапатита, пригодных для препаративной хроматографии белков. The disadvantages of this method is the complexity of the process and the low yield of coarse fractions (50-500 μm) of hydroxyapatite, suitable for preparative chromatography of proteins.

Задачей настоящего изобретения является сокращение числа стадий процесса и увеличение выхода крупнозернистых фракций гидроксиапатита. Технический результат достигается путем использования для получения брушита нерастворимых солей кальция, например карбоната или фосфата кальция, которые обрабатываются избытком дигидрофосфата натрия (калия) или ортофосфорной кислотой при рН 1,0-4,0 и температуре 100^oС.The objective of the present invention is to reduce the number of process steps and increase the yield of coarse fractions of hydroxyapatite. The technical result is achieved by using insoluble calcium salts, for example, calcium carbonate or phosphate, which are treated with excess sodium dihydrogenphosphate (potassium) or phosphoric acid at pH 1.0-4.0 and a temperature of 100 ^o C. to produce brushite.

Способ осуществляется следующим образом. При использовании карбоната кальция брушит получается по реакции 1:

Выделяющийся углекислый газ вызывает самопроизвольное перемешивание суспензии, что снижает вероятность истирания частиц в результате принудительного перемешивания. Изменение значений рН при обработке СаСО₃ позволяет влиять на фракционный состав гидроксиапатита. Необходимое значение рН среды поддерживается добавлением соляной, азотной или ортофосфорной кислот.The method is as follows. When using calcium carbonate, brushite is obtained by reaction 1:

The emitted carbon dioxide causes spontaneous mixing of the suspension, which reduces the likelihood of abrasion of the particles as a result of forced mixing. The change in pH during the processing of CaCO ₃ allows you to influence the fractional composition of hydroxyapatite. The required pH value is supported by the addition of hydrochloric, nitric or phosphoric acids.

При использовании фосфата кальция брушит получается по реакциям 2 и 3 при рН 1,0-2,0, который устанавливается добавлением соляной, азотной или ортофосфорной кислот:
Ca₃(PO₄)₂+NaH₂PO₄+HCl-->3CaHPO₄+NaCl; (2)
Ca₃(PO₄)₂+H₃PO₄-->3CaHPO₄. (3)
Образование брушита происходит на поверхности твердых частиц карбоната и фосфата кальция, что способствует получению более крупных фракций брушита. В дальнейшем брушит отфильтровывают, промывают на фильтре 2 литрами воды и обрабатывают при кипячении гидроксидом натрия (калия). В целях получения сферических частиц гидроксиапатита стадии получения брушита и гидроксиапатита проводят во вращающейся со скоростью 10-50 оборотов в минуту круглодонной колбе, расположенной в бане под углом 0-60 градусов.When using calcium phosphate, brushite is obtained by reactions 2 and 3 at a pH of 1.0–2.0, which is established by the addition of hydrochloric, nitric, or phosphoric acids:
Ca ₃ (PO ₄ ) ₂ + NaH ₂ PO ₄ + HCl -> 3CaHPO ₄ + NaCl; (2)
Ca ₃ (PO ₄ ) ₂ + H ₃ PO ₄ -> 3CaHPO ₄ . (3)
The formation of brushite occurs on the surface of solid particles of calcium carbonate and phosphate, which contributes to the production of larger fractions of brushite. Subsequently, brushite is filtered off, washed on the filter with 2 liters of water and treated with sodium hydroxide (potassium) while boiling. In order to obtain spherical particles of hydroxyapatite, the stages of production of brushite and hydroxyapatite are carried out in a round-bottom flask rotating at a speed of 10-50 revolutions per minute, located in the bath at an angle of 0-60 degrees.

Пример 1. К 100 г СаСО₃ приливают 1 л 2 М раствора NaH₂PO₄ с рН около 4,0 и помещают суспензию в кипящую водяную баню. Для поддержания рН 4,0 в суспензию периодически добавляют 75%-ную ортофосфорную, соляную или азотную кислоту. После прекращения выделения пузырьков СО₂ суспензию нейтрализуют до рН 6,8-7,2 добавлением 50%-ного NaOH и дают остыть до комнатной температуры. Брушит отфильтровывают, промывают на фильтре 2 л воды и суспендируют в 500 мл воды, после чего добавляют 100 мл 50%-ного NaOH и помещают в кипящую водяную баню, периодически перемешивая суспензию. По истечении 2-х часов гидроксиапатит отфильтровывают и промывают на фильтре водой до нейтральной реакции фильтрата.Example 1. To 100 g of CaCO _{3 is} added 1 L of a 2 M NaH ₂ PO ₄ solution with a pH of about 4.0 and the suspension is placed in a boiling water bath. To maintain a pH of 4.0, 75% phosphoric, hydrochloric or nitric acid is periodically added to the suspension. After the evolution of CO ₂ bubbles ceased, the suspension was neutralized to a pH of 6.8-7.2 by the addition of 50% NaOH and allowed to cool to room temperature. Brushite is filtered off, washed with 2 L of water on a filter and suspended in 500 ml of water, after which 100 ml of 50% NaOH are added and placed in a boiling water bath, stirring the suspension periodically. After 2 hours, hydroxyapatite is filtered off and washed on the filter with water until the filtrate is neutral.

Пример 2. Аналогично примеру 1, добавляя кислоту до рН 3,0. Example 2. Analogously to example 1, adding acid to a pH of 3.0.

Пример 3. Аналогично примеру 1, добавляя кислоту до рН 2,0. Example 3. Analogously to example 1, adding acid to a pH of 2.0.

Пример 4. Аналогично примеру 1, добавляя кислоту до рН 1,0. Example 4. Analogously to example 1, adding acid to a pH of 1.0.

Пример 5. К 100 г Са₃(PO₄)₂ приливают 350 мл 2 М раствора NaH₂PO₄, устанавливают рН 1,0-2,0 суспензии добавлением 75%-ной ортофосфорной, соляной или азотной кислоты и помещают суспензию в кипящую водяную баню. Процесс ведут при периодическом перемешивании суспензии до достижения ею рН в пределах 3,5-4,0. Брушит отфильтровывают, промывают на фильтре водой до слабокислой реакции фильтрата и обрабатывают его щелочью аналогично примеру 1.Example 5. 350 ml of a 2 M NaH ₂ PO ₄ solution are added to 100 g of Ca ₃ (PO ₄ ) ₂ , the pH of the suspension is adjusted to 1.0-2.0 by adding 75% phosphoric, hydrochloric or nitric acid and the suspension is placed in boiling water water bath. The process is carried out with periodic stirring of the suspension until it reaches a pH in the range of 3.5-4.0. Brushite is filtered off, washed on the filter with water until the filtrate is slightly acidic and treated with alkali in the same manner as in Example 1.

Пример 6. К 100 г Са₃(РO₄)₂ приливают 350 мл 1 М раствора Н₃РO₄, помещают суспензию в кипящую водяную баню и выдерживают ее при периодическом перемешивании, пока не установится рН среды в пределах 2,5-3,5. Суспензию нейтрализуют до рН 6,8-7,2 добавлением 50%-ного NaOH и дают медленно остыть до комнатной температуры. Брушит отфильтровывают, промывают на фильтре 2 л воды и обрабатывают щелочью аналогично примеру 1.Example 6. To 100 g of Ca ₃ (PO ₄ ) _2, 350 ml of a 1 M solution of H ₃ PO ₄ are poured, the suspension is placed in a boiling water bath and maintained with periodic stirring until the pH of the medium reaches 2.5-3, 5. The suspension is neutralized to a pH of 6.8-7.2 by the addition of 50% NaOH and allowed to cool slowly to room temperature. Brushite is filtered off, washed on the filter with 2 L of water and treated with alkali as in Example 1.

Пример 7. Стадии получения брушита и гидроксиапатита проводят аналогично примерам 1-6 во вращающейся со скоростью 10-50 оборотов в минуту круглодонной колбе, расположенной в бане под углом 0-60 градусов. Example 7. The stage of obtaining brushite and hydroxyapatite is carried out analogously to examples 1-6 in a round-bottom flask rotating at a speed of 10-50 revolutions per minute, located in the bath at an angle of 0-60 degrees.

Фракционный состав гидроксиапатита по примерам 1-7 приведен в таблице. The fractional composition of hydroxyapatite in examples 1-7 are shown in the table.

Таким образом, предлагаемый способ позволяет сократить число стадий процесса получения гидроксиапатита и увеличить выход крупнозернистых фракций целевого продукта по сравнению со способом-прототипом. Thus, the proposed method allows to reduce the number of stages of the process of producing hydroxyapatite and increase the yield of coarse fractions of the target product in comparison with the prototype method.

Claims (5)

1. Способ получения адсорбента для хроматографии белков, предусматривающий получение брушита и его обработку щелочью при 100^oС для образования гидроксиапатита, отличающийся тем, что брушит получают из нерастворимой соли кальция путем обработки ее избытком дигидрофосфата натрия (калия) при температуре 100^oС в среде с рН 1,0-4,0, регулируя его добавками ортофосфорной, соляной или азотной кислот, с последующей нейтрализацией суспензий раствором щелочи до рН 6,8-7,2.1. A method of producing an adsorbent for protein chromatography, providing for the preparation of brushite and its treatment with alkali at 100 ^° C to form hydroxyapatite, characterized in that brushite is obtained from an insoluble calcium salt by treating it with excess sodium dihydrogen phosphate (potassium) at a temperature of 100 ^° C in a medium with a pH of 1.0-4.0, adjusting it with phosphoric, hydrochloric or nitric acids, followed by neutralization of the suspensions with an alkali solution to a pH of 6.8-7.2. 2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что в качестве нерастворимой соли кальция используют карбонат кальция. 2. The method according to p. 1, characterized in that as an insoluble salt of calcium using calcium carbonate. 3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что в качестве нерастворимой соли кальция используют ортофосфат кальция. 3. The method according to p. 1, characterized in that as an insoluble salt of calcium using calcium orthophosphate. 4. Способ по п. 3, отличающийся тем, что обработку ортофосфата кальция ведут 1 М ортофосфорной кислотой при 100^oС и рН 1,0-2,0.4. The method according to p. 3, characterized in that the processing of calcium orthophosphate is 1 M orthophosphoric acid at 100 ^o C and a pH of 1.0-2.0. 5. Способ по пп. 1-4, отличающийся тем, что стадии получения брушита и гидроксиапатита проводят во вращающейся со скоростью 10-50 об. мин круглодонной колбе, расположенной в бане под углом 0-60^o.5. The method according to PP. 1-4, characterized in that the stage of obtaining brushite and hydroxyapatite is carried out in a rotating at a speed of 10-50 vol. min round-bottom flask located in the bath at an angle of 0-60 ^o .

Images