RU2195492C2 - Method of pectolytic enzyme preparation preparing - Google Patents

Abstract

FIELD: biotechnology, biochemistry, enzymology. SUBSTANCE: invention allows to obtain pectolytic enzyme preparation free of pectin substances and carbohydrates with yield 57-58% and increased specific activity of polygalacturonase in end product by 6.0-6.2-fold as compared with the parent activity For removal of inert proteins, peptides, pectin substances, carbohydrates and salts cultural fluids from fungal producers of pectinases preparing by the use of beet pectin as substrate are treated by microporous activated carbon, anion- and cation-exchange resins at decreased temperature. Enzyme is isolated from filtrate by means of adsorption in treatment with calcium phosphate gel followed by extraction of gel with phosphate buffer. Extract is stabilized by acidification to pH below 4.5, desalted and concentrated by diafiltration and ultrafiltration and dried by lyophilization. Invention is designated for preparing the purified pectinolytic enzyme preparation. EFFECT: improved method of preparing, high yield of preparation. 2 cl, 2 tbl, 5 ex

Description

Изобретение относится к области биотехнологии, гидролизной промышленности и виноделия и предназначено для получения с высоким выходом пектолитического ферментного препарата, пригодного для исследования структуры растительных пектинов методом ферментативного гидролиза, для переработки и утилизации растительного сырья с целью получения олиго- и моносахаридов, для удаления осадка и осветления лучших сортов вин. The invention relates to the field of biotechnology, hydrolysis industry and winemaking and is intended to produce a high yield of pectolytic enzyme preparation suitable for studying the structure of plant pectins by enzymatic hydrolysis, for processing and utilization of plant materials in order to obtain oligo - and monosaccharides, to remove sediment and clarification the best varieties of wines.

Известен способ очистки ферментов с использованием активированного древесного угля (Остерман Л.А. Хроматография белков и нуклеиновых кислот. М.: Наука, 1985. - С.224). Недостатком данного способа является возможность необратимой адсорбции ферментов, приводящей к уменьшению выхода целевого продукта. A known method of purification of enzymes using activated charcoal (Osterman L.A. Chromatography of proteins and nucleic acids. M: Nauka, 1985. - P.224). The disadvantage of this method is the possibility of irreversible adsorption of enzymes, leading to a decrease in the yield of the target product.

Известен способ очистки ферментов ионообменниками (Скоупс Р. Методы очистки белков. - М.: Мир, 1985. - С.101), недостатком которого является возможность адсорбции ферментов, обусловленная их амфотерными свойствами, что снижает избирательность очистки и приводит к уменьшению выхода целевого продукта. A known method of purification of enzymes by ion exchangers (Scopes R. Methods for protein purification. - M .: Mir, 1985. - P.101), the disadvantage of which is the possibility of adsorption of enzymes due to their amphoteric properties, which reduces the selectivity of purification and reduces the yield of the target product .

Известен способ адсорбционного выделения ферментов с использованием геля фосфата кальция (Диксон М., Уэбб Э. Ферменты. - М.: Мир, 1982. - T.1. - С. 61) (прототип), недостатком которого является низкая степень извлечения фермента и растворимость геля в условиях, способствующих максимальной рН-стабильности пектиназ (рН 3,0 - 4,5), что приводит к существенному увеличению расхода адсорбента. A known method of adsorptive isolation of enzymes using a gel of calcium phosphate (Dixon M., Webb E. Enzymes. - M .: Mir, 1982. - T.1. - S. 61) (prototype), the disadvantage of which is the low degree of extraction of the enzyme and the solubility of the gel under conditions that contribute to the maximum pH stability of pectinases (pH 3.0 - 4.5), which leads to a significant increase in the consumption of adsorbent.

Ни один из приведенных способов не позволяет провести полную очистку и выделение пектиназы с высоким выходом. Способы, близкие к предлагаемому по существу, последовательности проведения операций, по выходу и чистоте целевого продукта, не известны. None of the above methods allows for complete purification and isolation of pectinase in high yield. Methods close to the proposed essentially sequence of operations, the yield and purity of the target product are not known.

Задачей предлагаемого изобретения является разработка нового эффективного способа получения пектолитического ферментного препарата, пригодного для исследования структуры пектиновых полисахаридов из растительного сырья, для использования в гидролизной промышленности и виноделии. The objective of the invention is to develop a new effective method for producing a pectolytic enzyme preparation suitable for studying the structure of pectin polysaccharides from plant materials, for use in the hydrolysis industry and winemaking.

Технический результат состоит в получении ферментного препарата с более высокой полигалактуроназной (ПгА) активностью и степенью очистки от пектиновых веществ при достаточно высоком выходе целевого продукта. Отсутствие пектиновых веществ и углеводов делает возможным его использование для ферментативного гидролиза растительных пектинов в целях изучения их структуры, получения олиго- и моносахаридов, а также в виноделии для осветления лучших сортов вин и удаления винного камня, в состав которого входят пектиновые вещества виноградного сока. The technical result consists in obtaining an enzyme preparation with a higher polygalacturonase (PgA) activity and a degree of purification from pectin substances with a sufficiently high yield of the target product. The absence of pectin substances and carbohydrates makes it possible to use it for enzymatic hydrolysis of plant pectins in order to study their structure, to obtain oligo- and monosaccharides, as well as in winemaking to clarify the best varieties of wines and remove tartar, which includes pectin substances from grape juice.

Технический результат достигается тем, что культуральные жидкости или растворы неочищенных ферментных препаратов обрабатывают микропористым активированным углем преимущественно в слабокислой среде при концентрации угля не более 6 - 7 г/л, после чего фильтрат подвергают обработке анионо- и катионообменными смолами преимущественно при рН 3,5 - 6,5, при этом концентрация смол составляет 70 - 80 г/л. Ферменты выделяют путем адсорбции гелем фосфата кальция при рН около 5,5 - 6,5 с последующей десорбцией ферментов фосфатным буфером при рН приблизительно 7,0. Раствор ферментов стабилизируют подкислением до рН ниже 4,5, обессоливают и концентрируют с помощью диа- и ультрафильтрации и лиофильно высушивают. Все стадии обработки проводят при пониженной температуре. The technical result is achieved by the fact that culture liquids or solutions of crude enzyme preparations are treated with microporous activated carbon mainly in a slightly acidic environment at a coal concentration of not more than 6 - 7 g / l, after which the filtrate is treated with anion and cation exchange resins mainly at pH 3.5 - 6.5, while the concentration of resins is 70 - 80 g / l. Enzymes are isolated by gel adsorption of calcium phosphate at a pH of about 5.5 to 6.5, followed by desorption of the enzymes with phosphate buffer at a pH of about 7.0. The enzyme solution is stabilized by acidification to a pH below 4.5, desalted and concentrated by dia and ultrafiltration and freeze-dried. All processing steps are carried out at a reduced temperature.

В предлагаемом способе для увеличения выхода целевого продукта процесс очистки проводят в условиях, обеспечивающих ее максимальную избирательность в отношении низкомолекулярных и олигомерных примесей. Это достигается использованием микропористого активированного угля с преимущественным развитием микропор в слабокислой среде, что препятствует необратимой адсорбции ферментов. Избирательность ионообменной очистки достигается последовательной обработкой анионообменниками в слабокислой среде и катионообменниками при рН среды, близком к нейтральному. Выделение ферментов с использованием геля фосфата кальция проводят в среде, близкой к нейтральной, что обеспечивает избирательную адсорбцию ферментов со степенью извлечения 92 - 97% при низком расходе адсорбента. In the proposed method, to increase the yield of the target product, the purification process is carried out under conditions that ensure its maximum selectivity with respect to low molecular weight and oligomeric impurities. This is achieved by using microporous activated carbon with the predominant development of micropores in a slightly acidic environment, which prevents the irreversible adsorption of enzymes. The selectivity of ion exchange purification is achieved by sequential treatment with anion exchangers in a slightly acidic medium and cation exchangers at a pH close to neutral. The selection of enzymes using a calcium phosphate gel is carried out in a medium close to neutral, which provides selective adsorption of enzymes with a degree of recovery of 92 - 97% at a low adsorbent consumption.

Для достижения высокого выхода целевого продукта процесс очистки и выделения ферментов реализуют в условиях, обеспечивающих их максимально возможную рН-стабильность, которая наблюдается в слабокислой среде при пониженной температуре. Это достигается тем, что наиболее длительные стадии диа- и ультрафильтрации, а также обработки активированным углем и анионообменником проводятся при рН не выше 4,5. Снижение рН-стабильности при рН 5,5 - 7,0 в случае кратковременных обработок катионообменником и гелем фосфата кальция компенсируется стабилизацией раствора ферментов подкислением до рН ниже 4,5 сразу после их десорбции фосфатным буфером. To achieve a high yield of the target product, the process of purification and isolation of enzymes is carried out under conditions ensuring their maximum possible pH stability, which is observed in a slightly acidic medium at a low temperature. This is achieved by the fact that the longest stages of dia- and ultrafiltration, as well as treatment with activated carbon and an anion exchanger, are carried out at pH no higher than 4.5. The decrease in pH stability at pH 5.5 - 7.0 in the case of short-term treatments with a cation exchanger and calcium phosphate gel is compensated by stabilization of the enzyme solution by acidification to a pH below 4.5 immediately after their desorption with phosphate buffer.

Предлагаемая последовательность обработок является оптимальной, т.к. учитывает отрицательное влияние ионной силы раствора на эффективность адсорбционных и ионообменных процессов и приводит лишь к незначительному ее увеличению в ходе обработок, предшествующих диафильтрации. The proposed sequence of treatments is optimal, because takes into account the negative effect of the ionic strength of the solution on the efficiency of adsorption and ion-exchange processes and leads only to its insignificant increase during treatments preceding diafiltration.

В примерах 1-4 приведены экспериментальные данные, подтверждающие эффективность использования каждого этапа предлагаемого способа для очистки и выделения пектиназ в сравнении с существующими аналогами. В примере 5 приведены экспериментальные данные по использованию способа для выделения и очистки пектиназ. Examples 1-4 show experimental data confirming the effectiveness of using each step of the proposed method for the purification and isolation of pectinases in comparison with existing analogues. Example 5 shows experimental data on the use of the method for the isolation and purification of pectinases.

Способ опробован на примере культуральных жидкостей от грибковых продуцентов пектиназ: Aspergillus foetidus и Aspergillus niger, а также на ферментном препарате Пектофоетидин ГЗх, выпускаемом промышленностью. The method was tested on the example of culture fluids from fungal producers of pectinases: Aspergillus foetidus and Aspergillus niger, as well as on the enzyme preparation Pectofoetidin GZh, manufactured by the industry.

Пример 1. По 1000 мл культуральной жидкости от продуцента пектиназ A. Foetidus с содержанием сухих веществ около 10 г/л обрабатывают микропористым активированным углем СКТ, а также углями БАУ-А и ОУ-А с высоким развитием мезопор в слабокислой среде, концентрации угля в суспензии 7 г/л и температуре 4^oС. Степень очистки определяют по снижению цветности раствора, которую оценивают по его оптической плотности при длине волны 320 нм. После фильтрования получают частично очищенные ферментные препараты со следующими характеристиками: степень очистки для угля СКТ - 61,0%, БАУ-А - 78,5%, ОУ-А - 93,1%; потери полигалактуроназной активности (ПгА) для СКТ - 1,6%, БАУ-А - 24,5%, ОУ-А - 81,3%; удельная ПгА (ед/мг белка) составляет для необработанного раствора 80,3, после обработки углем СКТ - 86,4, БАУ-А - 92,0, ОУ-А - 22,1. Использование микропористого угля в указанных условиях позволяет провести более избирательную обработку ферментного препарата со степенью очистки 61% и выходом фермента - 98,4%.Example 1. 1000 ml of culture fluid from the producer of pectinases A. Foetidus with a solids content of about 10 g / l is treated with microporous activated carbon SKT, as well as coals BAU-A and OU-A with a high development of mesopores in a slightly acidic environment, the concentration of coal in a suspension of 7 g / l and a temperature of 4 ^o C. The degree of purification is determined by reducing the color of the solution, which is estimated by its optical density at a wavelength of 320 nm. After filtering, partially purified enzyme preparations are obtained with the following characteristics: the degree of purification for coal SKT - 61.0%, BAU-A - 78.5%, OU-A - 93.1%; loss of polygalacturonase activity (PgA) for SKT - 1.6%, BAU-A - 24.5%, OS-A - 81.3%; specific PgA (u / mg protein) is 80.3 for the untreated solution, after processing with coal SKT - 86.4, BAU-A - 92.0, OU-A - 22.1. The use of microporous coal under these conditions allows a more selective treatment of the enzyme preparation with a purification degree of 61% and an enzyme yield of 98.4%.

Пример 2. 1000 мл культуральной жидкости по примеру 1 с удельной ПгА 80,3 ед/мг белка обрабатывают анионообменной смолой, например, Амберлит CG-400, при рН 3,5 - 4,0, концентрации смолы в суспензии 80 г/л и температуре 4^oС. Полученный фильтрат имеет следующие характеристики: степень очистки - 66,0 - 67,5%, потери активности - 8,0 - 9,1%, удельная ПгА - 112,4 - 120,6 ед/мг белка. Аналогичная обработка при рН 6.0 позволяет получить ферментный препарат со степенью очистки 78,3% при снижении ПгА на 17,3%, с удельной ПгА - 130,7 ед/мг белка.Example 2. 1000 ml of the culture fluid of example 1 with a specific PHA of 80.3 u / mg protein is treated with an anion exchange resin, for example, Amberlite CG-400, at pH 3.5 - 4.0, the concentration of the resin in suspension 80 g / l and temperature 4 ^o C. The obtained filtrate has the following characteristics: degree of purification - 66.0 - 67.5%, loss of activity - 8.0 - 9.1%, specific PHA - 112.4 - 120.6 u / mg protein. A similar treatment at pH 6.0 allows one to obtain an enzyme preparation with a purification degree of 78.3% with a decrease in PGA by 17.3%, with a specific PGA of 130.7 units / mg protein.

Пример 3. 1000 мл культуральной жидкости по примеру 1 с удельной ПгА 80,3 ед/мг белка обрабатывают катионообменной смолой, например, Амберлит CG-120, при рН 6 концентрации смолы в суспензии 80,0 г/л и температуре 4^oС. Полученный фильтрат имеет следующие характеристики: степень очистки - 35,5%, потери активности - 6,2%, удельная ПгА - 101,1 ед/мг белка. Аналогичная обработка при рН 4.0 позволяет получить препарат со степенью очистки 50,0% при снижении ПгА на 92,0%, с удельной ПгА 20,7 ед/мг белка.Example 3. 1000 ml of the culture fluid of example 1 with a specific PHA of 80.3 u / mg of protein is treated with a cation exchange resin, for example, Amberlite CG-120, at a pH of 6, the concentration of the resin in suspension is 80.0 g / l and a temperature of 4 ^o C. The obtained filtrate has the following characteristics: degree of purification - 35.5%, loss of activity - 6.2%, specific PHA - 101.1 u / mg protein. A similar treatment at pH 4.0 allows you to get a drug with a degree of purification of 50.0% with a decrease in PHA by 92.0%, with a specific PHA of 20.7 units / mg protein.

Пример 4. (по прототипу) 1000 мл культуральной жидкости по примеру 1 с удельной ПгА 80,3 ед/мг белка обрабатывают гелем фосфата кальция при рН 6, концентрации геля в суспензии 60 г/л по сухому веществу и температуре 4^oС. После фильтрования и промывки геля на фильтре дистиллированной водой с рН 6 проводят десорбцию ферментов 0,2 М фосфатным буфером с рН 7 двумя порциями по 200 мл, после чего объединенный раствор ферментов стабилизируют подкисленном до рН ниже 4,5. Получают концентрированный раствор ферментов со следующими характеристиками: степень извлечения фермента - 96,7%, степень очистки - 60,0%, удельная ПгА - 371,6 ед/мг белка. Аналогичная обработка при рН 5 и 7 позволяет достичь степени извлечения фермента 81 и 83%, степени очистки - 55 и 60% и удельной ПгА растворов 329,1 и 242,3 ед/мг белка соответственно.Example 4. (according to the prototype) 1000 ml of the culture fluid of example 1 with a specific PHA of 80.3 u / mg protein is treated with calcium phosphate gel at pH 6, the concentration of the gel in suspension is 60 g / l on dry matter and a temperature of 4 ^o C. After filtering and washing the gel on the filter with distilled water with a pH of 6, the enzymes are desorbed with 0.2 M phosphate buffer with pH 7 in two 200 ml portions, after which the combined enzyme solution is stabilized acidified to a pH below 4.5. Get a concentrated enzyme solution with the following characteristics: the degree of extraction of the enzyme - 96.7%, the degree of purification - 60.0%, specific PHA - 371.6 u / mg protein. A similar treatment at pH 5 and 7 allows the degree of extraction of the enzyme to be achieved at 81 and 83%, the degree of purification at 55 and 60% and the specific PHA of solutions of 329.1 and 242.3 u / mg protein, respectively.

Пример 5. 1000 мл культуральной жидкости по примеру 1 при 4^oС обрабатывают микропористым активированным углем аналогично примеру 1, анионообменной смолой Амберлит CG-400 при рН 4 и катионообменной смолой Амберлит CG-120 при рН 6, используя по 80 г смолы. Регулируют рН раствора 0,1 М гидроксидом натрия. Из частично очищенного раствора выделяют ферменты гелем фосфата кальция аналогично примеру 4. Стабилизированный раствор ферментов обессоливают диафильтрацией при непрерывном добавлении 2 л 0,01 - 0,20 М ацетатного буфера с рН ниже 4,5 на половолоконном модуле с пределом пропускания около 15 кДа и концентрируют до 100 мл на том же модуле в режиме ультрафильтрации. Очищенный концентрированный раствор ферментов высушивают лиофильно. Результаты приведены в таблице 1. Выход целевого продукта по полигалактуроназной активности составляет 57,2%, по белку - 9,3% от их исходного содержания в культуральной жидкости.Example 5. 1000 ml of the culture fluid of Example 1 at 4 ^{° C. is} treated with microporous activated carbon, as in Example 1, with Amberlite CG-400 anion exchange resin at pH 4 and Amberlite CG-120 cation exchange resin at pH 6 using 80 g of resin. Adjust the pH of the solution with 0.1 M sodium hydroxide. Enzymes are isolated from a partially purified solution using calcium phosphate gel analogously to Example 4. A stabilized enzyme solution is desalted by diafiltration with continuous addition of 2 L of 0.01 - 0.20 M acetate buffer with a pH below 4.5 on a hollow fiber module with a transmission limit of about 15 kDa and is concentrated up to 100 ml on the same module in ultrafiltration mode. The purified concentrated enzyme solution is freeze-dried. The results are shown in table 1. The yield of the target product for polygalacturonase activity is 57.2%, for protein - 9.3% of their initial content in the culture fluid.

Предлагаемое изобретение позволяет получить ферментный препарат, превосходящий по чистоте и удельной полигалактуроназной активности известные аналоги. В таблице 2 приведена характеристика целевого продукта в сравнении с известными образцами пектиназы. The present invention allows to obtain an enzyme preparation that is superior in purity and specific polygalacturonase activity to known analogues. Table 2 shows the characteristics of the target product in comparison with known samples of pectinase.

Claims (2)

1. Способ получения пектолитического ферментного препарата, включающий обработку культуральной жидкости или раствора неочищенного ферментного препарата микропористым активированным углем в слабокислой среде, анионообменной смолой при рН 3,5-4,0 и катионообменной смолой при рН 6, адсорбционное выделение ферментов гелем фосфата кальция, десорбцию ферментов 0,2-0,4 М фосфатным буфером, стабилизацию полученного экстракта подкислением до рН ниже 4,5, обессоливание и концентрирование диа- и ультрафильтрацией и лиофильную сушку. 1. A method of producing a pectolytic enzyme preparation, comprising treating a culture fluid or a solution of a crude enzyme preparation with microporous activated carbon in a slightly acidic medium, an anion exchange resin at pH 3.5-4.0 and a cation exchange resin at pH 6, adsorption of enzymes by calcium phosphate gel, desorption enzymes 0.2-0.4 M phosphate buffer, stabilization of the obtained extract by acidification to a pH below 4.5, desalination and concentration by dia and ultrafiltration and freeze drying. 2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что обработку культуральной жидкости микропористым активированным углем проводят при концентрации угля не более 6-7 г/л. 2. The method according to p. 1, characterized in that the treatment of the culture fluid with microporous activated carbon is carried out at a coal concentration of not more than 6-7 g / L.

Images