CN104611422A

CN104611422A - 一种检测大肠杆菌耐氟喹诺酮类gyrA、parC基因点突变方法

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Publication number: CN104611422A
Application number: CN201510009782.XA
Authority: CN
Inventors: 王红宁; 邓春朋; 张安云; 雷昌伟; 杨鑫; 徐昌文; 管仲斌; 刘必慧; 张冬冬
Original assignee: Sichuan University
Current assignee: Sichuan University
Priority date: 2015-01-09
Filing date: 2015-01-09
Publication date: 2015-05-13

Abstract

本发明涉及了一种检测大肠杆菌耐氟喹诺酮类gyrA、parC基因点突变方法，属于基因突变检测技术领域。该方法包括以下步骤：（1）提取待测Escherichia coli基因组DNA；（2）以E.coli ATCC25922的靶基因序列为模板，分别设计合成覆盖gyrA（Ser codon83和Asp codon87）和parC（Ser codon80Glu codon84）的荧光标记探针gyrP和parP，及引物；（3）待测菌株DNA样品的PCR扩增和探针熔解曲线绘制，加入热稳定且缺乏5’核酸酶活性的DNA聚合酶避免探针水解，以E.coli ATCC25922为对照；（4）判读是否发生点突变。本发明采用荧光探针，特异性强，可在2h内完成检测。

Description

一种检测大肠杆菌耐氟喹诺酮类gyrA、parC基因点突变方法

技术领域

一种检测大肠杆菌耐氟喹诺酮类gyrA、parC基因点突变方法。

背景技术

氟喹诺酮类抗菌药物是一类人工合成的广谱抗菌药物。在大肠杆菌中主要作用靶位是DNA促旋酶，也作用于拓扑异构酶Ⅳ。其中任一种酶受到抑制都将使细菌生长被抑制，而导致细菌死亡。

随着氟喹诺酮类药物的广泛使用，导致细菌快速产生耐药。研究表明，细菌对氟喹诺酮类药物的耐药机制主要有4种：1、氟喹诺酮类药物作用的靶酶或靶位点发生改变；2、外排泵等使氟喹诺酮类药物在细胞体内积累浓度的减少；3、质粒介导的耐药；4、修饰酶基因（aac(6 ’ )Ib-cr）突变，对氟喹诺酮类药物进行修饰，从而降低细菌对药物的敏感性。其中，因gyrA、parC基因上特定位点突变引起氨基酸替换而导致细菌对氟喹诺酮类药物作用的靶酶或靶位点发生改变是产生耐药的主要机制。只要检出gyrA、parC基因上特定位点突变，就能知道其耐药情况。所以本发明建立大肠杆菌耐氟喹诺酮类gyrA、parC基因特定位点突变的检测方法，对快速检测致病性大肠杆菌耐药性和常在大肠杆菌作为耐药指示菌对氟喹诺酮类是否耐药及其传播情况有重要意义。

致病性大肠杆菌是引起人类和动物疾病感染，包括肠和败血症感染的一个常见原因。同时常在的大肠杆菌在耐药传播中起重要作用，通常作为耐药指示菌。在氟喹诺酮类药物耐药菌研究中，大肠杆菌是耐药最严重的菌种之一。在细菌gyrA、parC基因的特定位点发生点突变后，导致GyrA和ParC亚基上的相应区域发生氨基酸替换，这个区域与氟喹诺酮类药物耐药密切相关，被称为氟喹诺酮类耐药决定区。氟喹诺酮类药物耐药决定区的氨基酸替换导致氟喹诺酮类药物耐药性的产生。这个区域发生在酶的DNA结合表面上，对于大肠杆菌，包含DNA促旋酶的51位到106位氨基酸间的区域，其中主要突变是83位和87位氨基酸密码子的核苷酸替换。而大肠杆菌parC基因上的突变总是伴随gyrA基因上的突变而出现，其中主要突变是80和84位氨基酸密码子的核苷酸替换。大肠杆菌中最常见的gyrA基因上的突变是83位丝氨酸密码子的核苷酸替换。其次是87位的天冬氨酸密码子的核苷酸替换，并且导致氟喹诺酮类药物的较高程度耐药。然而，parC基因上的突变在高耐药菌株的形成中扮演重要作用，其中80位氨基酸密码子的突变是频率最高的，其次是84位氨基酸的突变。因此，大肠杆菌gyrA（Ser codon 83 和 Asp codon 87）的核苷酸点突变，及parC（Ser codon 80 和Glu codon 84）的核苷酸点突变是导致氟喹诺酮类耐药的主要位点突变。

传统检测基因点突变的普通PCR和测序方法，费时，操作繁杂，成本高，因此为了快速简便地检测耐氟喹诺酮类药物大肠杆菌gyrA、parC基因点突变，有必要建立一种简便快速，准确性高，特异性强的分子生物学检测方法。

近年来，基于real-time PCR平台的方法被广泛用到耐药基因的点突变检测中，例如荧光共振能量转移探针（Fluorescence Resonance Energy Transfer, FRET）法和高分辨率熔解度曲线分析技术（High Resolution Melting ，HRM）等。虽然这些方法用于检测点突变都具有灵敏、准确和特异性好等特点，但在实际检测中，仍存在一些不足。例如FRET法局限于LightCycler (Roche) real-time PCR仪；HRM技术也对real-time PCR仪的温控***要求很高。

双重标记探针熔解度曲线分析是在荧光定量PCR基础上通过双重荧光标记探针和热稳定且不具有5’核酸酶活性的DNA聚合酶配合使用，进而对探针与靶核苷酸序列的熔解曲线变化进行分析的一种新兴技术。双标记探针熔解度曲线分析技术基于存在序列变化的靶基因片段间微弱Tm值差异，通过双重荧光标记探针与存在序列变化的靶DNA片段的熔解曲线Tm的差异值（△Tm）进行突变检测。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种快速简便，准确性高，特异性强，对荧光PCR仪器要求低，可用于快速检测大肠杆菌耐氟喹诺酮类gyrA、parC基因点突变的方法。

本发明所提供的检测大肠杆菌耐氟喹诺酮类gyrA、parC基因点突变的方法，是一种快速检测由于氟喹诺酮类耐药决定区主要点突变引起对喹诺酮类抗生素耐药的大肠杆菌gyrA、parC基因点突变的分子生物学方法，具体是检测大肠杆菌耐氟喹诺酮类gyrA（Ser codon 83 和 Asp codon 87）基因的核苷酸碱基点突变，及parC（Ser codon 80 和Glu codon 84）基因的核苷酸碱基点突变的方法，包括以下步骤：（1）提取待测E.coli基因组DNA；（2）以野生型标准菌E.coliATCC25922为模板，分别设计合成覆盖gyrA（Ser codon 83 和 Asp codon 87）和parC（Ser codon 80 和Glu codon 84）的双重荧光标记探针gyrP和parP，及引物；（3）用所述探针及引物对待测DNA样品进行PCR扩增和探针熔解曲线分析程序，加入热稳定且缺乏5’核酸酶活性的DNA聚合酶避免探针水解，以E.coliATCC25922为对照；（4）是否发生突变判读：目标位点序列相同的DNA样品间的探针熔解曲线Tm的差异值在0.5℃内，将待测DNA样品的相应探针熔解曲线Tm值与野生型标准菌株的Tm值进行比较，若差异值（△Tm）大于0.5℃，则目标位点发生了点突变，若差异值小于0.5℃，则没有发生点突变。

所述探针熔解曲线分析的双重荧光标记探针gyrP和parP都分别包含一个荧光报告基团和荧光淬灭基团，即在探针gyrP的5’端连接HEX荧光集团，在3′端连接BHQ2荧光淬灭基团，在探针parP的5’端连接FAM荧光集团，在3′端连接BHQ2荧光淬灭基团；所述探针gyrP被分别在其8位和13位碱基位置，及探针ParP被分别在其3位、4位、18位和19位碱基位置引入了具有简并性的次黄嘌呤碱基（I），排除非目标位点突变的影响；所述探针gyrP和parP的Tm值均高于相应引物的退火温度5～10℃；所述探针gyrP包括25个核苷酸，覆盖了gyrA基因编码Gly 81到Ile 89的核苷酸序列，检测gyrA（Ser codon 83 和 Asp codon 87）点突变，是SEQ ID No.5所示的单链DNA；所述探针ParP包括29个核苷酸，覆盖了parC基因编码His77位到Met86位的核苷酸序列，检测parC（Ser codon 80 和Glu codon 84）点突变，是SEQ ID No.6所示的单链DNA。

所述探针gyrP和parP中的次黄嘌呤核苷酸（I）在SEQ ID No.5和SEQ ID No.6中用n表示。

所述探针熔解曲线分析包括两个单重的PCR扩增，所述两个单重的PCR扩增采用的扩增引物满足如下条件：扩增gyrA基因的目的DNA片段长度为50-150bp且包括大肠杆菌gyrA（Ser codon 83 和 Asp codon 87）的核苷酸序列，扩增parC基因的目的DNA片段长度为50-150bp且包括大肠杆菌parC（Ser codon 80 和Glu codon 84）的核苷酸序列。

在本发明的一个具体实施方式中，所述两条双重荧光标记探针gyrP和parP分别与扩增的gyrA和parC靶基因序列杂交，并在两个单重PCR探针熔解曲线分析中分别产生两个熔解图谱；所述两条双重荧光标记寡核苷酸探针与热稳定且缺乏5’核酸酶活性的DNA聚合酶配合使用。

在本发明的一个具体实施方式中，所述两个单重的PCR扩增采用的扩增引物分别是gyrA-FR和parC-FR，均由上游引物和下游引物组成；所述gyrA-FR上游引物是SEQ ID No.1所示的单链DNA，所述gyrA-FR下游引物是SEQ ID No.2所示的单链DNA；所述parC-FR上游引物是SEQ ID No.3所示的单链DNA，所述parC-FR下游引物是SEQ ID No.4所示的单链DNA。

上述方法中，所述两个单重的PCR探针熔解曲线分析中，均采用每15微升PCR反应体系中含有1.5微升10XPCR扩增缓冲液，1.5mM镁离子缓冲液，0.2mM dNTP混合液，0.02μM所述上游引物，0.4μM所述下游引物，0.3μM探针，1mM甜菜碱，所述模板50ng，其余为水。所述PCR扩增缓冲液、镁离子缓冲液、dNTP混合液和水均来自Platinum® GenoTYPE Tsp DNA Polymerase Reagents。

所述Platinum® GenoTYPE Tsp DNA Polymerase Reagents为invitrogen公司试剂，货号为11448-024。

上述方法中，所述两个单重的PCR扩增用的两对引物的退火条件均为53℃退火30s。

在本发明的一个具体实施方式中，所述两个单重的PCR扩增中采用的反应温度程序均如下：先94℃预变性2min；先进行如下10个循环：94℃变性30s，53℃退火30s，72℃延伸1min；再进行如下25个循环：89℃变性30s，53℃退火30s，72℃延伸1min。

在本发明的一个具体实施方式中，所述探针熔解曲线分析采用CFX96实时荧光定量PCR***，两个单重的PCR熔解曲线分析的熔解程序均为先进行94℃变性1min，然后从40℃或45℃开始绘制熔解曲线，每0.5℃收集一次荧光，设置收集FAM或HEX荧光信号的荧光检测通道，到75℃结束。

上述方法中涉及的一种检测耐氟喹诺酮类药物大肠杆菌gyrA（Ser codon 83 和 Asp codon 87）、parC（Ser codon 80 和Glu codon 84）点突变的两对引物gyrA-FR和parC-FR，及两条探针gyrP和parP也属于本发明的保护范围。

本发明的优点及有益效果：

1、本发明的方法与传统的测序方法相比，更为快速简便，可以在2h内完成检测；

2、相比一些其他的方法，如HRM技术、FRET法局限于一定的荧光PCR仪器，本发明采用了特异性地双重标记荧光探针gyrP和parP，可在普通荧光PCR仪器上进行，成本低，更有利于方法的普及；

3、本发明可为快速检测致病性大肠杆菌和常在大肠杆菌作为耐药指示菌的耐药性及其传播情况提供有力的技术手段。

附图说明

图1为E.coli氟喹诺酮类耐药基因gyrA（Ser codon 83）的不同点突变和对照型的熔解图谱。

图2为E.coli氟喹诺酮类耐药基因gyrA（Ser codon 83 和 Asp codon 87）的不同点突变和对照型的熔解图谱。

图3为E.coli氟喹诺酮类耐药基因parC（Ser codon 80）的不同点突变和对照型的熔解图谱。

图4为E.coli氟喹诺酮类耐药基因parC（Ser codon 80 和Glu codon 84）的不同点突变和对照型的熔解图谱。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中所用的野生型标准菌株为大肠杆菌ATCC25922（American Type Culture Collection（简称ATCC）菌种）。

本实施例中采用Bio-Rad CFX实时荧光定量PCR***进行两个单重的荧光定量PCR探针熔解曲线分析，建立检测大肠杆菌耐氟喹诺酮类gyrA（Ser codon 83 和 Asp codon 87）的核苷酸序列，及parC（Ser codon 80 和Glu codon 84）的核苷酸序列是否发生点突变的方法。

实施例1：待测大肠杆菌和标准菌株E.coliATCC25922的基因组DNA提取

采用常规的细菌基因组DNA提取方法，或者细菌基因组DNA提取商品试剂盒（商品编号：SK8225，Sangon Biotech）提取待测大肠杆菌和标准菌株大肠杆菌ATCC25922的基因组DNA，最终得到的DNA样品的浓度大约在150ng/μL。

实施例2：两个单重PCR扩增的特异引物对设计

采用引物设计软件primer premier 6，以野生型标准菌株E.coli ATCC25922的gyrA基因和parC基因为模板分别设计两个单重PCR扩增的引物，设计扩增包含gyrA（Ser codon 83 和 Asp codon 87）的核苷酸序列在内的多对引物，以及包含parC（Ser codon 80 和Glu codon 84）的核苷酸序列在内的多对引物，经过对每一对引物进行验证，结果得到特异PCR引物对gyrA-FR（上游引物为SEQ ID No.1所示的单链DNA，下游引物为SEQ ID No.2所示的单链DNA）和parC-FR（上游引物为SEQ ID No.3所示的单链DNA，下游引物为SEQ ID No.4所示的单链DNA）。

引物委托专业公司合成，且为PAGE纯化。实验验证结果表明，gyrA-FR对野生型标准菌株E.coli ATCC25922，及待测大肠杆菌的gyrA基因进行PCR扩增得到的目的片段长度均为110bp，且均包含gyrA（Ser codon 83 和 Asp codon 87）的核苷酸序列；parC-FR对野生型标准菌株E.coli ATCC25922，及待测大肠杆菌的parC基因进行PCR扩增得到的目的片段长度均为93bp，且均包含parC（Sercodon 80 和Glu codon 84）的核苷酸序列。说明gyrA-FR和parC-FR对大肠杆菌具有特异性。

实施例3：双重荧光标记探针gyrP和parP的的设计

采用探针设计软件Xpression primer 3.1设计双重荧光标记探针gyrP（为SEQ ID No.5所示）和parP（为SEQ ID No.6所示）的核苷酸序列，并将设计的探针委托专业公司修饰合成，通过HPLC纯化。

探针的具体设计为：在荧光标记探针gyrP的5’端连接HEX荧光集团，在3′端连接BHQ2荧光淬灭基因；在荧光标记探针ParP的5’端连接FAM荧光集团，在3′端连接BHQ2荧光淬灭基因；探针gyrP包括25个核苷酸，覆盖了gyrA基因编码Gly 81到Ile 89的核苷酸序列，用于检测gyrA（Ser codon 83 和 Asp codon 87）的碱基点突变；探针ParP包括29个核苷酸，覆盖了parC基因编码His77位到Met86位的核苷酸序列，用于检测parC（Ser codon 80 和Glu codon84）的碱基点突变；探针gyrP被分别在其8位和13位碱基位置，及探针ParP被分别在其3位、4位、18位和19位碱基位置引入具有简并性的次黄嘌呤碱基（I），排除非目标位点突变的影响；所设计的双重荧光探针gyrP和parP的Tm值分别为63℃和64.5℃，均高于相应引物的退火温度5～10℃。

验证实验结果表明，在两个单重的PCR探针熔解曲线分析中，野生型标准菌株E.coli ATCC25922与探针gyrP的熔解曲线Tm值为63℃，待测大肠杆菌与探针gyrP的熔解曲线Tm值均小于62.5℃；野生型标准菌株E.coli ATCC25922与探针ParP的熔解曲线Tm值为64.5℃，待测大肠杆菌与探针gyrP的熔解曲线Tm值均小于64℃。说明双重荧光探针gyrP和parP特异性好，且均能很好地检测相应目标位点突变。

实施例4：两个单重PCR反应体系组成及优化

按下表（表1）配制PCR反应液体系，每次实验都必须设置阴性对照和以野生型（E.coliATCC25922）为阳性对照，且待测DNA样品、阴性对照和阳性对照三者的体系中，除模板不同外，其它均相同。配制完成后混匀，并经离心后上机。两个单重PCR反应体系中仅是探针和引物不同，其它均相同。

表1 PCR体系各成分组成

实施例5：PCR扩增反应和探针熔解曲线程序设定

在两个单重PCR中，扩增反应程序相同，但探针熔解曲线程序中的荧光渠道设置不同，应分别根据相应探针的荧光集团类型来设置FAM或HEX荧光渠道。将PCR八联管放入Bio-Rad CFX荧光定量PCR***开始扩增，当PCR扩增反应程序运行结束后，用其配套软件进行探针熔解度曲线分析。具体程序如下如表2。

表2 PCR反应和探针熔解曲线程序

实施例6：是否发生点突变结果判定

在两个单重PCR的探针熔解度曲线分析中，根据待测大肠杆菌与野生型标准菌株（E.coliATCC25922）各自相应的探针熔解度曲线Tm的差异值（△Tm）来确定目标位点是否发生点突变，结果表明：目标位点序列相同的DNA样品的探针熔解曲线Tm的差异值在0.5℃内，如果在扩增gyrA的单重PCR探针熔解度曲线分析中，△Tm>0.5℃, 则发生了目标位点gyrA（Ser codon 83 和 Asp codon 87）点突变；如果在扩增parC的单重PCR探针熔解度曲线分析中，△Tm>0.5℃, 则发生了目标位点parC（Ser codon 80 和Glu codon 84）点突变；否则，没有发生目标位点点突变。可见附图。将本发明应用于检测未知突变的大肠杆菌，所得结果和测序结果完全一致，准确率为100%。

SEQUENCE LISTING

<110> 四川大学

<120> 一种检测大肠杆菌耐氟喹诺酮类gyrA、parC基因点突变方法

<130> 2010

<160> 6

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 大肠杆菌种（Escherichia coli）

<400> 1

tcgttggtga cgtaatcg 18

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 大肠杆菌种（Escherichia coli）

<400> 2

accgtctacc agcatataac 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 大肠杆菌种（Escherichia coli）

<400> 3

gtgacgtact gggtaaatac 20

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> 大肠杆菌种（Escherichia coli）

<400> 4

gcggataacg gtaagagaa 19

<210> 5

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (8)..(8)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (13)..(13)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 5

tgactcgncg gtntatgaca cgatc 25

<210> 6

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (3)..(4)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (18)..(19)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 6

acnncgatag cgcctgtnnt gaagcgatg 29

Claims

1.一种检测大肠杆菌耐氟喹诺酮类gyrA（Ser codon 83 和 Asp codon 87）、parC（Ser codon 80 和Glu codon 84）点突变的方法，包括以下步骤：（1）提取待测Escherichia coli基因组DNA；（2）以野生型标准菌E.coliATCC25922为模板，分别设计合成覆盖gyrA（Ser codon 83 和 Asp codon 87）和parC（Ser codon 80 和Glu codon 84）的双重荧光标记探针gyrP和parP，及引物；（3）用所述探针及引物对待测DNA样品进行PCR扩增和探针熔解曲线分析程序，加入热稳定且缺乏5’核酸酶活性的DNA聚合酶避免探针水解，以E.coliATCC25922为对照；（4）是否发生突变判读：目标位点序列相同的DNA样品间的探针熔解曲线Tm的差异值在0.5℃内，将待测DNA样品的相应探针熔解曲线Tm值与野生型标准菌株的Tm值进行比较，若差异值（△Tm）大于0.5℃，则目标位点发生了点突变，若差异值小于0.5℃，则没有发生点突变；

所述探针熔解曲线分析的双重荧光标记探针gyrP和parP都分别包含一个荧光报告基团和荧光淬灭基团，即在探针gyrP的5’端连接HEX荧光集团，在3′端连接BHQ2荧光淬灭基团，在探针parP的5’端连接FAM荧光集团，在3′端连接BHQ2荧光淬灭基团；所述探针gyrP被分别在其8位和13位碱基位置，及探针ParP被分别在其3位、4位、18位和19位碱基位置引入了具有简并性的次黄嘌呤碱基（I），排除非目标位点突变的影响；所述探针gyrP和parP的Tm值均高于相应引物的退火温度5～10℃；所述探针gyrP包括25个核苷酸，覆盖了gyrA基因编码Gly 81到Ile 89的核苷酸序列，检测gyrA（Ser codon 83 和 Asp codon 87）点突变，是SEQ ID No.5所示的单链DNA；所述探针ParP包括29个核苷酸，覆盖了parC基因编码His77位到Met86位的核苷酸序列，检测parC（Ser codon 80 和Glu codon 84）点突变，是SEQ ID No.6所示的单链DNA；

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述两条双重荧光标记探针gyrP和parP分别与扩增的gyrA和parC靶基因序列杂交，并在两个单重PCR探针熔解曲线分析中分别产生两个熔解图谱。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述两个单重的PCR扩增采用的扩增引物分别是gyrA-FR和parC-FR，均由上游引物和下游引物组成；所述gyrA-FR上游引物是SEQ ID No.1所示的单链DNA，所述gyrA-FR下游引物是SEQ ID No.2所示的单链DNA；所述parC-FR上游引物是SEQ ID No.3所示的单链DNA，所述parC-FR下游引物是SEQ ID No.4所示的单链DNA。

4.根据权利要求1至3所述的方法，其特征在于：所述两个单重的PCR探针熔解曲线分析中均采用每15微升PCR反应体系，含有1.5微升10XPCR扩增缓冲液，1.5mM镁离子缓冲液，0.2mM dNTP混合液，0.02μM所述上游引物，0.4μM所述下游引物，0.3μM探针，1mM甜菜碱，所述模板50ng，其余为水；所述PCR扩增缓冲液、镁离子缓冲液、dNTP混合液和水均来自Platinum® GenoTYPE Tsp DNA Polymerase Reagents。

5.根据权利要求1至4所述的方法，其特征在于：所述两个单重的PCR扩增用的两对引物的退火条件均为53℃退火30s。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述两个单重的PCR扩增中采用的反应温度程序均如下：先94℃预变性2min；然后进行如下10个循环：94℃变性30s，53℃退火30s，72℃延伸1min；再进行如下20个循环：89℃变性30s，53℃退火30s，72℃延伸1min；最后72℃延伸5min。

7.根据权利要求1至6中任一所述的方法，其特征在于：所述两个单重PCR熔解曲线分析程序均为先94℃变性1min，然后从40℃或45℃开始绘制熔解曲线，每0.5℃收集一次荧光，设置收集FAM或HEX信号的荧光检测通道，到75℃结束。

8.检测大肠杆菌耐氟喹诺酮类gyrA（Ser codon 83 和 Asp codon 87）、parC（Ser codon 80 和Glu codon 84）点突变的引物gyrA-FR，是由SEQ ID No.1所示的单链DNA和SEQ ID No.2所示的单链DNA组成的一个引物对；parC-FR是由SEQ ID No.3所示的单链DNA和SEQ ID No.4所示的单链DNA组成的一个引物对。

9.根据权利要求1至8所述的方法，其特征在于：所述扩增引物为权利要求1或8所述的gyrA-FR和parC-FR，所述探针熔解度曲线的双重荧光标记探针为权利要求1所述的gyrP和parP。