RU2183213C2

RU2183213C2 - Modified nucleoside-5'-triphosphates as antiviral agents

Info

Publication number: RU2183213C2
Application number: RU96121584/04A
Authority: RU
Inventors: Н.Б. Дяткина; А.А. Арзуманов; Е.А. Широкова; М.В. Ясько; Л.А. Александрова; Л.С. Викторова; Л.Е. Горюнова; Р.Ш. Бибилашвили; А.А. Краевский
Original assignee: ЗАО "Производственно-коммерческая ассоциация АЗТ"
Priority date: 1996-11-05
Filing date: 1996-11-05
Publication date: 2002-06-10
Also published as: WO1998020017A1

Abstract

FIELD: organic chemistry, biochemistry. SUBSTANCE: invention describes novel modified nucleoside-5'-triphosphates of the general formula: R'''-P(= O)OH-CXX''-P(=O)OH-O-P(=O)OH-

-A- B where B means thymine, adenine, uracil or 5-ethyluracil; A has a formula (I)

where R' means H or N₃; R'' means H; or R and R''' in common form a double bond; Z is O or CH₂; R''' means Ph, OAlkyl, OPh, NHPh; X' = X'' and mean Br, F; or X' is H and X'' is Br. New compounds are antiviral agents, in part, they are able to inhibit the reproduction of human immunodeficiency virus in human lymphocyte culture. EFFECT: new compounds indicated above, valuable antiviral properties. 3 tbl

Description

Изобретение относится к области молекулярной биологии и вирусологии, а точнее к новым соединениям, модифицированным по P-α, β, γ и сахарному остаткам нуклеозид-5'-трифосфатам D- и L-рядов. The invention relates to the field of molecular biology and virology, and more specifically to new compounds modified by P-α, β, γ and sugar residues of nucleoside-5'-triphosphates of D- and L-series.

Новые соединения являются терминаторными субстратами обратной транскриптазы вируса иммунодефицита человека (ВИЧ) и ингибиторами репродукции ВИЧ в культуре лимфоцитов человека, а также обладают способностью предохранять от инфицирования здоровые клетки. Кроме того, заявленные соединения являются специфическими ингибиторами вируса гепатита В в культуре гепатоцитов человека, вирусов группы герпеса в различных клеточных культурах, а также обратных транскриптаз ретровирусов, гепаднавирусов и ДНК-полимераз вирусов группы герпеса. The new compounds are terminator substrates of the reverse transcriptase of the human immunodeficiency virus (HIV) and inhibitors of HIV reproduction in a culture of human lymphocytes, and also have the ability to protect healthy cells from infection. In addition, the claimed compounds are specific inhibitors of hepatitis B virus in a culture of human hepatocytes, herpes viruses in various cell cultures, as well as reverse transcriptases of retroviruses, hepatnaviruses and DNA polymerases of herpes viruses.

В настоящее время известны различные соединения, подавляющие репродукцию вируса иммунодефицита человека. Наиболее эффективным из известных соединений является 3'-азидо-3'-дезокситимидин (AZT), находящий применение в медицинской практике (Mitsuya H. et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 1985, 82, 7096-7100; Mitsuya H. , Broder S. , Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 1986, 83, 1911-1915). Молекулярный механизм действия указанного соединения включает диффузию его внутрь клетки, инфицированной ВИЧ. Далее он подвергается трифосфорилированию и специфично блокирует синтез ДНК, катализируемый обратной транскриптазой ВИЧ. Аналогичным образом действуют другие противовирусные нуклеозиды, применяемые в медицинской практике для лечения СПИД: 2',3'-дидезоксицитидин (Mitsuya H., Broder S., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1986, 83, 1911-1915), 2', 3'-дидезоксиинозин (там же), 2',3'-дидезокси-2',3'-дидегидротимидин (Herdewijn P. et al., J. Med. Chem., 1987, 30, 1270-1278; Baba M. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 1987, 142, 128-134) и 2',3'-дидезокси-3'-тиотимидин (Soudeyns H. et al., Antimicrob. Agents Chemother., 1991, 35, 1386-1390). Однако фосфорилирование модифицированных нуклеозидов клеточными ферментами происходит значительно менее эффективно, чем природных нуклеозидов. Процесс превращения нуклеозида в организме человека в соответствующий 5'-трифосфат занимает около 1,5-2 часов. За это время проникший в клетки вирус успевает в форме провирусной ДНК интегрировать в геном человека. Использование в качестве лекарственных препаратов нуклеозид-5'-трифосфатов с немодифицированной трифосфатной частью невозможно из-за их низкой стабильности к действию ферментов гидролиза и вследствие этого низкой способности проникать внутрь клетки. Таким образом, применяемые препараты, даже если они приняты в момент инфицирования, не могут предохранить от заражения ВИЧ. В качестве противовирусного препарата было предложено использовать производные 3'-азидо-3'-дезокситимидина, содержащие модифицированную фосфатную группу в 5'-положении, а именно Н-фосфонат AZT (Н.Б. Тарусова, и др., Мол. Биол. , 1989, 23, 6, 1716-1724; Патент США 5043437). Однако было показано, что в организме это соединение в основном подвергается дефосфорилированию, превращаясь в AZT (Кузнецова Е.В. и др., Мол. Биол., 1995, 29, 2, 415-420). Various compounds are currently known to inhibit the reproduction of the human immunodeficiency virus. The most effective known compound is 3'-azido-3'-deoxythymidine (AZT), which is used in medical practice (H. Mitsuya et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 1985, 82, 7096-7100; Mitsuya H., Broder S., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 1986, 83, 1911-1915). The molecular mechanism of action of this compound includes its diffusion into the cell infected with HIV. Further, it undergoes triphosphorylation and specifically blocks DNA synthesis catalyzed by HIV reverse transcriptase. Other antiviral nucleosides used in medical practice for the treatment of AIDS are similar: 2 ', 3'-dideoxycytidine (Mitsuya H., Broder S., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1986, 83, 1911-1915), 2 ', 3'-dideoxyinosine (ibid.), 2', 3'-dideoxy-2 ', 3'-didehydrothymidine (Herdewijn P. et al., J. Med. Chem., 1987, 30, 1270-1278; Baba M. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 1987, 142, 128-134) and 2 ', 3'-dideoxy-3'-thiothymidine (Soudeyns H. et al., Antimicrob. Agents Chemother. , 1991, 35, 1386-1390). However, phosphorylation of modified nucleosides by cellular enzymes is much less effective than natural nucleosides. The process of converting a nucleoside in the human body into the corresponding 5'-triphosphate takes about 1.5-2 hours. During this time, the virus that has penetrated the cells manages to integrate into the human genome in the form of proviral DNA. The use of nucleoside-5'-triphosphates with unmodified triphosphate moieties as pharmaceuticals is impossible because of their low stability to the action of hydrolysis enzymes and, as a result, their low ability to penetrate into the cell. Thus, the drugs used, even if they were taken at the time of infection, cannot protect against HIV infection. Derivatives of 3'-azido-3'-deoxythymidine containing a modified phosphate group in the 5'-position, namely AZT N-phosphonate (N.B. Tarusova, et al., Mol. Biol., 1989, 23, 6, 1716-1724; U.S. Patent 5043437). However, it was shown that in the body this compound is mainly subjected to dephosphorylation, turning into AZT (Kuznetsova E.V. et al., Mol. Biol., 1995, 29, 2, 415-420).

В основу изобретения положена задача создания новых нуклеозид-5'-трифосфатов, которые устойчивы к действию ферментов дефосфорилирования, способны проникать внутрь клетки и обладают избирательной активностью в подавлении биосинтеза ДНК, катализируемого обратной транскриптазой ВИЧ. The basis of the invention is the creation of new nucleoside-5'-triphosphates that are resistant to dephosphorylation enzymes, are able to penetrate into the cell and have selective activity in inhibiting DNA biosynthesis catalyzed by HIV reverse transcriptase.

Задача решена тем, что согласно изобретению заявляются новые соединения - P-α, β, γ модифицированные 2'-дезоксинуклеозид-5'-трифосфаты, общей формулы:

где В=тимин, аденин, урацил или 5-этилурацил

R'=H или N₃;
R''=Н или R' и R'' вместе образуют двойную связь;
Z=O или СН₂;
R'''=Ph, OAlkyl, OPh, NHPh;
X'=X''=Br, F или X'=H, a X''=Br.The problem is solved in that according to the invention, new compounds are claimed - P-α, β, γ modified 2'-deoxynucleoside-5'-triphosphates, of the general formula:

where B = thymine, adenine, uracil or 5-ethyluracil

R '= H or N ₃ ;
R ″ = H or R ′ and R ″ together form a double bond;
Z = O or CH ₂ ;
R '''= Ph, OAlkyl, OPh, NHPh;
X '= X''= Br, F or X' = H, and X '' = Br.

Новые соединения получают путем активации соответствующим образом модифицированного мононуклеотида с помощью N,N'-карбонилдиимидазола и последующей его конденсации с модифицированным трифосфтатом. New compounds are prepared by activating a suitably modified mononucleotide with N, N'-carbonyldiimidazole and then condensing it with a modified triphosphate.

Структура заявленных соединений подтверждена методами УФ-, ЯМР- и массспектрометрии. The structure of the claimed compounds was confirmed by UV, NMR and mass spectrometry.

Пример 1. 5'-(γ-Фениламидо-β, γ-дибромметилендифосфонил-α-фосфонилметил)-5'-дезоксиметил-3'-азидо-3'-дезокситимидин. (Соединение I, В=Thy, R'=N₃, R''=H, Z=O, R'''=NHPh, X'=X''=Br).Example 1. 5 '- (γ-Phenylamido-β, γ-dibromomethylene diphosphonyl-α-phosphonylmethyl) -5'-deoxymethyl-3'-azido-3'-deoxythymidine. (Compound I, B = Thy, R '= N ₃ , R''= H, Z = O, R''' = NHPh, X '= X''= Br).

К раствору 0,5 ммоль 3'-азидо-2',3'-дидезокси-4'-нортимидин-4'-норфосфоната в 10 мл ДМФА прибавляют 162 мг (1 ммоль) N,N'-карбонилдиимдазола, перемешивают 2 часа при 20^oС, приливают 1 мл метанола, оставляют на 30 мин и упаривают досуха, к остатку прибавляют 1 ммоль γ-фениламида дибромметилендифосфоната бистрибутиламмониевой соли, перемешивают 3 час, а при 20^oС, приливают 200 мл воды и наносят на колонку (20•2,5 см) с Toyopeari DEAE (НСО₃ ^-). Элюцию проводят линейным градиентом буфера NH₄HCO₃, рН 7,5 (0->0,4 М, общий объем 600 мл) с УФ-контролем. Фракции с веществом лиофилизуют, остаток растворяют в 1 мл воды и наносят на колонку (20•1,5 см) с LichroPrep RP18. Элюцию проводят водой с УФ-контролем. Раствор, содержащий вещество, лиофилизуют, выход 0,26 ммоль, 52%. УФ-спектр (вода) λ_max266 nm (ε9600), ¹H-ЯМР-спектр (D₂O, δ, м. д.): 7.64 m (2Н, Ph), 7.32 m (3H, arom), 7.60 s (1H, H-6); 6.30 m (1H, Н-1'); 5.52 s (1-H, H-4'); 4.46 m (1-H, H-3'); 3.64 d (2H, j_СH, _P=8.5 Гц,

); 2,44 m (1H, H-2'); 1.92 s (3H, СН₃-Thy); 1.86 d (3H, J_H,P'=17.9Гц, СН₃РО); ³¹P ЯМР спектр (D₂O, d, м.д.):9,58 д (α-P, J_α-β = 33,0 Гц), 8.16 д (γ-P, J_β-γ = 13,85 Гц), 0,10 м (β-P) FAB-масс, m/z: 735 (М⁺+Н), 752 (М⁺+Н+NН₃)
Пример2.5'-(γ-Метил-β, γ-дибромметилендифосфонил-α-фосфонилметил)-5'-дезоксиметил-3'-азидо-3'-дезокситимидин. (Соединение 2, B=Thy, R'=N₃, R''=H, Z=O, R'''=OMe, X'=X''=Br).To a solution of 0.5 mmol of 3'-azido-2 ', 3'-dideoxy-4'-nortimidine-4'-norphosphonate in 10 ml of DMF was added 162 mg (1 mmol) of N, N'-carbonyldiimidazole, stirred for 2 hours at 20 ^o С, poured 1 ml of methanol, left for 30 min and evaporated to dryness, 1 mmol of bistributylammonium salt dibromomethylene diphosphonate γ-phenylamide was added to the residue, stirred for 3 hours, and at 20 ^o С, 200 ml of water were added and applied to a column (20 • 2.5 cm) with Toyopeari DEAE (HCO ₃ ^- ). The elution is carried out by a linear gradient gradient of NH ₄ HCO ₃ buffer, pH 7.5 (0-> 0.4 M, total volume 600 ml) with UV control. Fractions with the substance are lyophilized, the residue is dissolved in 1 ml of water and applied to a column (20 • 1.5 cm) with LichroPrep RP18. Elution is carried out with water with UV control. The solution containing the substance is lyophilized, yield 0.26 mmol, 52%. UV spectrum (water) λ _max 266 nm (ε9600), ¹ H-NMR spectrum (D ₂ O, δ, ppm): 7.64 m (2H, Ph), 7.32 m (3H, arom), 7.60 s (1H, H-6); 6.30 m (1H, H-1 '); 5.52 s (1-H, H-4 '); 4.46 m (1-H, H-3 '); 3.64 d (2H, j _CH , _P = 8.5 Hz,

); 2.44 m (1H, H-2 '); 1.92 s (3H, CH ₃ -Thy); 1.86 d (3H, J _{H, P '} = 17.9Hz, CH ₃ PO); ³¹ P NMR spectrum (D ₂ O, d, ppm): 9.58 d (α-P, J _α-β = 33.0 Hz), 8.16 d (γ-P, J _β-γ = 13 , 85 Hz), 0.10 m (β-P) FAB-mass, m / z: 735 (M ⁺ + H), 752 (M ⁺ + H + NH ₃ )
Example 2.5 '- (γ-Methyl-β, γ-dibromomethylene diphosphonyl-α-phosphonylmethyl) -5'-deoxymethyl-3'-azido-3'-deoxythymidine. (Compound 2, B = Thy, R '= N ₃ , R''= H, Z = O, R''' = OMe, X '= X''= Br).

Синтез проводят по методике примера 1 исходя из 5'-фосфонилметил-5'-дезоксиметил-3'-азидо-3'-дезокситимидина и бис(трибутиламмонийной) соли метилового эфира дибромметилендифосфоновой кислоты. Выход 0,34 ммоль, 68%. УФ-спектр (вода) λ_max268 nm (ε9600), ¹H -ЯМР-спектр (D₂O, δ, м.д.): 7.60 м (1H, H-6); 6.30 м (1H, Н-1'); 5.60 м (1-H, H-4'); 4.38 м (1H, H-3'); 3.64 д (2H, J_CH, _P= 8.5 Hz,

); 3.36 (3H, ОМе); 2.39 м (1H, H-3'); 1.92 с (3H, Me), . ³¹P ЯМР спектр (D₂O, δ, м.д.): 10,87 д (α-P, J_α-β = 35,0 Гц), 8,46 д (γ-P, J_β-γ = 14,95 Гц), -0,12 м (β-P). FAB-масс, m/z: 679 (М⁺+1).The synthesis is carried out according to the method of example 1 based on 5'-phosphonylmethyl-5'-deoxymethyl-3'-azido-3'-deoxythymidine and the bis (tributylammonium) salt of dibromomethylene diphosphonic acid methyl ester. Yield 0.34 mmol, 68%. UV spectrum (water) λ _max 268 nm (ε9600), ¹ H-NMR spectrum (D ₂ O, δ, ppm): 7.60 m (1H, H-6); 6.30 m (1H, H-1 '); 5.60 m (1-H, H-4 '); 4.38 m (1H, H-3 '); 3.64 d (2H, J _CH , _P = 8.5 Hz,

); 3.36 (3H, OMe); 2.39 m (1H, H-3 '); 1.92 s (3H, Me),. ³¹ P NMR spectrum (D ₂ O, δ, ppm): 10.87 d (α-P, J _α-β = 35.0 Hz), 8.46 d (γ-P, J _β-γ = 14.95 Hz), -0.12 m (β-P). FAB mass, m / z: 679 (M ⁺ +1).

Пример3.5'-(γ-Фенил-β, γ-дибромметилендифосфонил-α-фосфонилметил)-5'-дезоксиметил-3'-азидо-3'-дезокситимидин (Соединение 3, B=Thy, R'=H, R''=H, Z= O, R'''=OPh, X'=X''=Br). Example 3.5 '- (γ-Phenyl-β, γ-dibromomethylene diphosphonyl-α-phosphonylmethyl) -5'-deoxymethyl-3'-azido-3'-deoxythymidine (Compound 3, B = Thy, R' = H, R ' '= H, Z = O, R' '' = OPh, X '= X' '= Br).

Синтез проводят по методике примера 1 исходя из 5'-фосфонилметил-5'-дезоксиметил-3'-азидо-3'-дезокситимидина и бис(трибутиламмонийной) соли фенилового эфира дибромметилендифосфоновой кислоты. Выход 0.34 ммоль, 68%. УФ-спектр (вода) λ_max268 nm (ε9600), ¹H-ЯМР-спектр (D₂O, δ, м.д.): 7.68 m (2H, Ph), 7.32 m (3H, Ph), 7.60 с (1Н, Н-6); 6.30 м (1H, Н-1'); 5.46 м (1-H, H-4'); 4.60 м (1-H, Н-3'); 3.91 д (2H, J_CH,P=8,5 Гц,

); 2.28 м (1H, Н-2'); 1.94 с (3H, СН₃). ³¹P ЯМР спектр (D₂O, δ, м.д.): 11,67 д (α-P, J_α-β = 33,56 Гц), 8,43 д (γ-P, J_β-γ = 14,08 Гц), 0,05 м (β-P) FAB-масс, m/z: 741 (М⁺+Н), 758 (M⁺+H+NH₃).The synthesis is carried out according to the method of example 1 based on 5'-phosphonylmethyl-5'-deoxymethyl-3'-azido-3'-deoxythymidine and the bis (tributylammonium) salt of phenyl ether dibromomethylene diphosphonic acid. Yield 0.34 mmol, 68%. UV spectrum (water) λ _max 268 nm (ε9600), ¹ H-NMR spectrum (D ₂ O, δ, ppm): 7.68 m (2H, Ph), 7.32 m (3H, Ph), 7.60 s (1H, H-6); 6.30 m (1H, H-1 '); 5.46 m (1-H, H-4 '); 4.60 m (1-H, H-3 '); 3.91 d (2H, J _{CH, P} = 8.5 Hz,

); 2.28 m (1H, H-2 '); 1.94 s (3H, CH ₃ ). ³¹ P NMR spectrum (D ₂ O, δ, ppm): 11.67 d (α-P, J _α-β = 33.56 Hz), 8.43 d (γ-P, J _β-γ = 14.08 Hz), 0.05 m (β-P) FAB-masses, m / z: 741 (M ⁺ + H), 758 (M ⁺ + H + NH ₃ ).

Пример4.5'-(γ-Фенил-β, γ-дибромметилендифосфонил-α-фосфонилметил)-5'-дезоксиметил-3'-азидо-2', 3'-дидезоксиуридин (Соединение 4, B=Ura, R'=N₃, R''= H, Z=O, R'''=OPh, X'=X''=Br).Example 4.5 '- (γ-Phenyl-β, γ-dibromomethylene diphosphonyl-α-phosphonylmethyl) -5'-deoxymethyl-3'-azido-2', 3'-dideoxyuridine (Compound 4, B = Ura, R '= N ₃ , R`` = H, Z = O, R '''= OPh, X' = X '' = Br).

Синтез проводят по методике примера 1 исходя из 5'-фосфонилметил-5'-дезоксиметил-3'-азидо-2', 3'-дидезоксиуридина и бис(трибутиламмонийной) соли фенилового эфира дибромметилендифосфоновой кислоты. Выход 0.34 ммоль, 68%. УФ-спектр (вода) λ_max268 nm (ε9600), ¹H-ЯМР-спектр (D₂O, δ, м.д.): 7.60 д (1H, J= 8 Гц, Н-6); 7.68 м (2H, arom); 7.32 м (3H, Ph); 6.22 м (1H, Н-1'); 5.80 д (1H, J=8 Гц, Н-5); 5.28 м (1H, H-4'); 4.50 м (1-H, Н-3'); 3.64 д (2H, j_CH,P= 8.5 Гц,

); 2.22 м (1H, Н-2');. ³¹Р ЯМР спектр (D₂O, δ, м.д.): 9,24 д (α-P, J_α-β = 30,19 Гц), 8,86 д (γ-P, J_β-γ = 13,87 Гц), 0,23 м (β-P) FAB-масс, m/z: 728 (M⁺+H).The synthesis is carried out according to the method of example 1 starting from 5'-phosphonylmethyl-5'-deoxymethyl-3'-azido-2 ', 3'-dideoxyuridine and the bis (tributylammonium) salt of dibromomethylene diphosphonic acid phenyl ester. Yield 0.34 mmol, 68%. UV spectrum (water) λ _max 268 nm (ε9600), ¹ H-NMR spectrum (D ₂ O, δ, ppm): 7.60 d (1H, J = 8 Hz, H-6); 7.68 m (2H, arom); 7.32 m (3H, Ph); 6.22 m (1H, H-1 '); 5.80 d (1H, J = 8 Hz, H-5); 5.28 m (1H, H-4 '); 4.50 m (1-H, H-3 '); 3.64 d (2H, j _{CH, P} = 8.5 Hz,

); 2.22 m (1H, H-2 ') ;. ³¹ P NMR spectrum (D ₂ O, δ, ppm): 9.24 d (α-P, J _α-β = 30.19 Hz), 8.86 d (γ-P, J _β-γ = 13.87 Hz), 0.23 m (β-P) FAB-mass, m / z: 728 (M ⁺ + H).

Пример5.5'-(γ-Фенил-β, γ-дибромметилендифосфонил-α-фосфонилметил)-5'-дезоксиметил-3'-азидо-2',3'-дидезокси-5-этилуридин (Соединение 5, В=5-этилурацил, R'=N₃, R''=H, Z=O, R'''=OPh, X'=X''=Br).Example 5.5 '- (γ-Phenyl-β, γ-dibromomethylene diphosphonyl-α-phosphonylmethyl) -5'-deoxymethyl-3'-azido-2', 3'-dideoxy-5-ethyluridine (Compound 5, B = 5- ethyluracil, R '= N ₃ , R''= H, Z = O, R''' = OPh, X '= X''= Br).

Синтез проводят по методике примера 1 исходя из 5'-фосфонилметил-5'-дезоксиметил-3'-азидо-2', 3'-дидезокси-5-этилиуридина и бис-(трибутил-аммонийной) соли фенилового эфира дибромметилендифосфоновой кислоты. Выход 38%. УФ-спектр (вода) λ_max272 nm (ε12400). ¹H-ЯМР-спектр (D₂O, δ, м.д.): 7.72 д (1Н, J=7.5 Гц, Н-6); 7.68 м (2Н, arom), 7.32 м (3Н, Ph), 6.23 м (1Н, Н-1'); 5.68 д (1Н, J=7.5 Гц, Н-5); 5.50 м (1-Н, Н-4') 4.46 м (1-Н, Н-3'); 2,55 м (2Н, СH₂-СН₃), 2.42 м (1Н, Н-2'), 1.37 м (3Н, СН₂-СH₃). ³¹P ЯМР спектр (D₂O, δ, м.д.): 12,34 д (α-P, J_α-β = 36,5 Гц), 9,13 д (γ-P, J_β-γ = 14,15 Гц), 0,05 м (β-P) FAB-масс, m/z: 749 (М⁺+Н).The synthesis is carried out according to the method of example 1 starting from 5'-phosphonylmethyl-5'-deoxymethyl-3'-azido-2 ', 3'-dideoxy-5-ethyluridine and the bis (tributyl-ammonium) salt of phenyl ether dibromomethylene diphosphonic acid. Yield 38%. UV spectrum (water) λ _max 272 nm (ε12400). ¹ H-NMR spectrum (D ₂ O, δ, ppm): 7.72 d (1H, J = 7.5 Hz, H-6); 7.68 m (2H, arom), 7.32 m (3H, Ph), 6.23 m (1H, H-1 '); 5.68 d (1H, J = 7.5 Hz, H-5); 5.50 m (1-H, H-4 '); 4.46 m (1-H, H-3'); 2.55 m (2H, CH ₂ -CH ₃ ), 2.42 m (1H, H-2 '), 1.37 m (3H, CH ₂ -CH ₃ ). ³¹ P NMR spectrum (D ₂ O, δ, ppm): 12.34 d (α-P, J _α-β = 36.5 Hz), 9.13 d (γ-P, J _β-γ = 14.15 Hz), 0.05 m (β-P) FAB-masses, m / z: 749 (M ⁺ + H).

Пример6.5'-(γ-Фенил-β, γ-дибромметилендифосфонил-α-фосфонилметил)-5'-дезоксиметил-2', 3'-дидезоксиаденозин (Соединение 6, B= Ade, R'=R''=H, Z=O, R'''=PhO, X'=X''=Br). Example 6.5 '- (γ-Phenyl-β, γ-dibromomethylene diphosphonyl-α-phosphonylmethyl) -5'-deoxymethyl-2', 3'-dideoxyadenosine (Compound 6, B = Ade, R '= R' '= H, Z = O, R '' '= PhO, X' = X '' = Br).

Синтез проводят по методике примера 1 исходя из N-защищенного 5'-фосфонилметил-5'-дезоксиметил-2', 3'-дидезоксиаденозина и бис(трибутилам-монийной) соли фенилового эфира дибромметилендифосфоновой кислоты. Выход 0,32 ммол, 64%. УФ-спектр (вода) λ_max260 nm (ε15000), ¹Н-ЯМР-спектр (D₂O, δ, м.д.): 8.30 с (1Н, Н-2); 8.09 с (1Н, Н-8); 7.68 m (2Н, arom), 7.32 m (3Н, Ph), 6.33 м (1Н, Н-1'); 5,36 м (1Н, Н-4'); 3.56 д (2Н, J=9,0 Гц, CH₂-P), 2,6-2,3 (4Н, Н-3', Н-2'). ³¹Р ЯМР спектр (D₂О, δ, м.д.): 11,82 д (α-P, J_α-β = 34,5 Гц), 8.59 д (γ-P, J_β-γ = 13,90 Гц), -0.11 м (β-P) FAB-масс, m/z: 707 (М⁺+Н), 724 (M⁺+H+NH₃).The synthesis is carried out according to the method of example 1 based on the N-protected 5'-phosphonylmethyl-5'-deoxymethyl-2 ', 3'-dideoxyadenosine and the bis (tributylammonium) phenyl ether salt of dibromomethylene diphosphonic acid. Yield 0.32 mmol, 64%. UV spectrum (water) λ _max 260 nm (ε15000), ¹ H-NMR spectrum (D ₂ O, δ, ppm): 8.30 s (1H, H-2); 8.09 s (1H, H-8); 7.68 m (2H, arom), 7.32 m (3H, Ph), 6.33 m (1H, H-1 '); 5.36 m (1H, H-4 '); 3.56 d (2H, J = 9.0 Hz, CH ₂ -P), 2.6-2.3 (4H, H-3 ', H-2'). ³¹ P NMR spectrum (D ₂ O, δ, ppm): 11.82 d (α-P, J _α-β = 34.5 Hz), 8.59 d (γ-P, J _β-γ = 13 , 90 Hz), -0.11 m (β-P) FAB-masses, m / z: 707 (M ⁺ + H), 724 (M ⁺ + H + NH ₃ ).

Пример7.5'-(γ-Фенил-β, γ-дифторметилендифосфонил-α-фосфонилметил)-5'-дезоксиметил-2',3'-дидезокситимидин (Соединение 7, B=Thy, R'=R''=H, Z=O, R'''= PhO, X'=X''=F). Example 7.5 '- (γ-Phenyl-β, γ-difluoromethylene diphosphonyl-α-phosphonylmethyl) -5'-deoxymethyl-2', 3'-dideoxythymidine (Compound 7, B = Thy, R '= R' '= H, Z = O, R '' '= PhO, X' = X '' = F).

Синтез проводят по методике примера 1 исходя из 5'-фосфонилметил-5'-дезоксиметил-2', 3'-дидезокситимидина и бис(трибутиламмонийной) соли фенилового эфира дифторметилендифосфоновой кислоты. Выход 0,16 ммол, 32%. УФ-спектр (вода) λ_max268 nm (ε9600). ¹H-ЯМР-спектр (D₂O, δ, м.д.): 7.62 м (2Н, arom), 7.56 м (1Н, Н-6),
7.32 м (3Н, Ph), 6.04 т (1Н, J=6.5 Гц, Н-1'); 6.24 м (1-Н, Н-1'); 5.18 м (1H, Н-4'); 3.64 д (2Н, J=9,0 Гц, CH₂-P), 2.6-2.2 м (4Н, Н-3', Н-2'); 1.98 с (3Н,

). ³¹P ЯМР спектр (D₂O, δ, м.д.): 12,08 д (α-P, J_α-β = 34,5 Гц), 6,26 д (γ-P, J_β-γ = 13,86 Гц), -1,81 м (β-P). FAB-масс, m/z: 572 (М⁺+Н), 589 (M⁺+H+NH₃).The synthesis is carried out according to the method of example 1 based on 5'-phosphonylmethyl-5'-deoxymethyl-2 ', 3'-dideoxythymidine and the bis (tributylammonium) salt of difluoromethylene diphosphonic acid phenyl ester. Yield 0.16 mmol, 32%. UV spectrum (water) λ _max 268 nm (ε9600). ¹ H-NMR spectrum (D ₂ O, δ, ppm): 7.62 m (2H, arom), 7.56 m (1H, H-6),
7.32 m (3H, Ph), 6.04 t (1H, J = 6.5 Hz, H-1 '); 6.24 m (1-H, H-1 '); 5.18 m (1H, H-4 '); 3.64 d (2H, J = 9.0 Hz, CH ₂ -P), 2.6-2.2 m (4H, H-3 ', H-2'); 1.98 s (3H,

) ³¹ P NMR spectrum (D ₂ O, δ, ppm): 12.08 d (α-P, J _α-β = 34.5 Hz), 6.26 d (γ-P, J _β-γ = 13.86 Hz), -1.81 m (β-P). FAB mass, m / z: 572 (M ⁺ + H), 589 (M ⁺ + H + NH ₃ ).

Пример 8. 2',3'-Дидезокси-4'-нор-4'-(γ-фенилβ, γ-дибромметилендифосфонил-α-фосфонилметил-L-карбоаденозин (Соединение 8, B=Ade, R'=R''=H, Z=CH₂, R'''=Ph, X'=X''=Br).Example 8. 2 ', 3'-Dideoxy-4'-nor-4' - (γ-phenylβ, γ-dibromomethylene diphosphonyl-α-phosphonylmethyl-L-carboadenosine (Compound 8, B = Ade, R '= R''= H, Z = CH ₂ , R '''= Ph, X' = X '' = Br).

Синтез проводят по методике примера 1. Выход 0,33 ммоль, 66%. УФ-спектр (вода) λ_max268 nm (ε14600), ¹H ЯМР-спектр (D₂O, δ, м.д.): 8.59 с (1Н, Н-2); 8.30 с (1Н, Н-8); 7.82 м (2Н, arom), 7.32 m (3Н, Ph), 4.95 т (1Н, J=6.5 Гц, Н-1'); 3.58 д (2Н, J=8,5 Гц, СН₂-Р), 2.8-2.5 м (3Н, Н-3', H-5′α); 2.3-2.1 м (2Н, Н-2'); 1.92 м (1Н, H-5′β). ³¹Р-ЯМР-спектр (D₂O, δ, м.д.): 11.82 д (α-P, J_α-β = 32,25 Гц); 0.26 м (β-P, Гц); 7.80 д (γ-P, J_β-γ = 15,18 Гц). FAB-масс, m/z: 576 (М⁺+Н).The synthesis is carried out according to the method of example 1. Yield 0.33 mmol, 66%. UV spectrum (water) λ _max 268 nm (ε14600), ¹ H NMR spectrum (D ₂ O, δ, ppm): 8.59 s (1H, H-2); 8.30 s (1H, H-8); 7.82 m (2H, arom), 7.32 m (3H, Ph), 4.95 t (1H, J = 6.5 Hz, H-1 '); 3.58 d (2H, J = 8.5 Hz, CH ₂ -P), 2.8-2.5 m (3H, H-3 ', H-5′α); 2.3-2.1 m (2H, H-2 '); 1.92 m (1H, H-5′β). ³¹ P-NMR spectrum (D ₂ O, δ, ppm): 11.82 d (α-P, J _α-β = 32.25 Hz); 0.26 m (β-P, Hz); 7.80 d (γ-P, J _β-γ = 15.18 Hz). FAB mass, m / z: 576 (M ⁺ + H).

Пример9.4'-(γ-Фенил-β, γ-дибромметилендифосфонил-α-метиленфосфонил)-2',3'-дидезокси-2',3'-дидегидро-4'-нор-L-карбоаденозин (Соединение 9, B=Ade, R' и R'' образуют двойную связь, Z=CH₂, R'''=OPh, X'=X''=Br).Example 9.4 '- (γ-Phenyl-β, γ-dibromomethylene diphosphonyl-α-methylenephosphonyl) -2', 3'-dideoxy-2 ', 3'-didehydro-4'-nor-L-carboadenosine (Compound 9, B = Ade, R 'and R''form a double bond, Z = CH ₂ , R''' = OPh, X '= X''= Br).

Синтез проводят по методике, аналогичной методике примера 1, исходя из 2',3'-дидезокси-2',3'-дидегидро-4'-нор-L-карбоаденозин-4'--α--метиленфосфоната и дибромметилендифосфоната бис(трибутиламмониевой) соли. Выход 58%. The synthesis is carried out according to a method similar to that of example 1, starting from 2 ', 3'-dideoxy-2', 3'-didehydro-4'-nor-L-carboadenosine-4 '- α-methylene phosphonate and dibromomethylene diphosphonate bis (tributylammonium ) salt. Yield 58%.

УФ-спектр (вода) λ_max262 nm (ε14200). ¹H ЯМР-спектр (D₂O, δ, м.д.): 8.18 с (1Н, Н-2); 8.16 с (1Н, Н-8); 7.68 м (2Н, Ph), 7.32 м (3Н, Ph), 6.13 м (1-Н, Н-3'); 5.92 м (1Н, Н-2'); 5.39 м (1Н, Н-1'); 4.66 с (1Н, Н-4'); 3.61 д (2Н, J=9,0 Гц, СН₂-Р), 2.92 м(1Н, H-5′α); 1.96 м (1Н, H-5′β). ³¹P ЯМР-спектр (D₂O, δ, м. д. ): 11.6 д (α-P, J_α-β = 35,10 Гц); 0.29 м (β-P); 10.7 д (γ-P, J_β-γ = 16,3 Гц), FAB-масс, m/z: 582 (М⁺+Н).UV spectrum (water) λ _max 262 nm (ε14200). ¹ H NMR Spectrum (D ₂ O, δ, ppm): 8.18 s (1H, H-2); 8.16 s (1H, H-8); 7.68 m (2H, Ph), 7.32 m (3H, Ph), 6.13 m (1-H, H-3 '); 5.92 m (1H, H-2 '); 5.39 m (1H, H-1 '); 4.66 s (1H, H-4 '); 3.61 d (2H, J = 9.0 Hz, CH ₂ -P), 2.92 m (1H, H-5′α); 1.96 m (1H, H-5′β). ³¹ P NMR spectrum (D ₂ O, δ, ppm): 11.6 d (α-P, J _α-β = 35.10 Hz); 0.29 m (β-P); 10.7 d (γ-P, J _β-γ = 16.3 Hz), FAB-mass, m / z: 582 (M ⁺ + H).

Пример 10. 2',3'-Дидезокси-2',3'-дидегидро-4'-(γ-фениламино-β, γ-дифтор-метилендифосфонил-α-метиленфосфонил)-4'-норкарбоаденозин (Соединение 10, B= Ade, R' и R'' образуют двойную связь, Z=CH₂, R'''=NHPh, X'=X''=F).Example 10.2 ', 3'-Dideoxy-2', 3'-didehydro-4 '- (γ-phenylamino-β, γ-difluoro-methylenediphosphonyl-α-methylenephosphonyl) -4'-norkarboadenosine (Compound 10, B = Ade, R 'and R''form a double bond, Z = CH ₂ , R''' = NHPh, X '= X''= F).

Синтез проводят по методике, аналогичной примеру 1, исходя из 2',3'-дидезокси-2',3'-дидегидро-4'-норкарбоаденозин-4'-α-метиленфосфоната и дифторметилендифофоната бистрибутиламмониевой соли. Выход 26%. The synthesis is carried out according to a procedure analogous to example 1, starting from 2 ', 3'-dideoxy-2', 3'-didehydro-4'-norkarboadenosine-4'-α-methylene phosphonate and bistributylammonium salt difluoromethylene diphosphonate. Yield 26%.

УФ-спектр (вода) λ_max260 nm (ε14100). ¹H ЯМР-спектр (D₂O, δ, м.д.): 8.18 с (1Н, Н-2); 8.16 с (1H, Н-8); 7.68 м (2Н, Ph), 7.32 м (3Н, Ph), 6.24 м (1-Н, Н-3'); 5.99 m (1Н, Н-2'); 5.46 м (1Н, Н-1'); 4.66 с (1Н, Н-4'); 3.74 д (2Н, J_CH,P=8.5 Гц,

), 2.86 i (1H, H-5′α); 1.90 м (1H, H-5′β). ³¹P-ЯMP-cпeктp (D₂O, δ, м.д.): 12,97 д (α-P, J_α-β = 33,5 Гц), 6,80 д (γ-P, J_β-γ = 13,32 Гц), -0,71 м (β-P) FAB-масс, т/z: 598 (М⁺+Н).UV spectrum (water) λ _max 260 nm (ε14100). ¹ H NMR Spectrum (D ₂ O, δ, ppm): 8.18 s (1H, H-2); 8.16 s (1H, H-8); 7.68 m (2H, Ph), 7.32 m (3H, Ph), 6.24 m (1-H, H-3 '); 5.99 m (1H, H-2 '); 5.46 m (1H, H-1 '); 4.66 s (1H, H-4 '); 3.74 d (2H, J _{CH, P} = 8.5 Hz,

), 2.86 i (1H, H-5′α); 1.90 m (1H, H-5′β). ³¹ P-NMR spectrum (D ₂ O, δ, ppm): 12.97 d (α-P, J _α-β = 33.5 Hz), 6.80 d (γ-P, J _{β -γ} = 13.32 Hz), -0.71 m (β-P) FAB-masses, t / z: 598 (M ⁺ + H).

Пример11.2',3'-Дидeзoкcи-4'(γ-фeнил-β, γ-бpoммeтилeндифocфoнил-α-мeтилeн-фосфонил)-4'-нортимидин (Соединение 11, B=Thy, R'=R''=H, Z=O, R'''=PhO, X'= H, X''=Br). Example 11.2 ', 3'-Dideoxy-4' (γ-phenyl-β, γ-bromomethylenediphosphonyl-α-methylene-phosphonyl) -4'-nortimidine (Compound 11, B = Thy, R '= R' '= H , Z = O, R '' '= PhO, X' = H, X '' = Br).

Синтез проводят по аналогичной примеру 1 методике из 2',3'-дидезокси-4'-нортимидин-4'-α-метиленфосфоната и бис(трибутил-аммонийной) соли фенилфосфонилбромметиленфосфоната. Выход 0,16 ммол, 32%. УФ-спектр (вода) λ_max268 нм (ε9600), ¹H-ЯМР-спектр (D₂O, δ, м.д.): 7.68 м (2Н, аrom), 7.32 м (3Н, Ph), 7.14 с (1H, Н-6); 6.14 т (1H, J=6.5 Гц, Н-1'); 5.56 м (1H, Н-4'); 3.57 д (2Н, j_CH,P=8.5 Гц,

); 2.7-2.2 м (4Н, Н-2', Н-3'); 1.95 с (3Н,

). ³¹P-ЯMP-cпeктp (D₂O, δ, м.д.): 11,84 д (α-P, J_α-β = 35,0 Гц), 9,13 д (γ-P, J_β-γ = 13,55 Гц), 0,05 м (β-P). FAB-масс, m/z: 644 (М⁺+Н), 661 (M⁺+H+NH₃).The synthesis is carried out according to a similar procedure to Example 1 from 2 ', 3'-dideoxy-4'-nortimidin-4'-α-methylene phosphonate and the bis (tributyl ammonium) salt of the phenylphosphonyl bromomethylene phosphonate. Yield 0.16 mmol, 32%. UV spectrum (water) λ _max 268 nm (ε9600), ¹ H-NMR spectrum (D ₂ O, δ, ppm): 7.68 m (2Н, arom), 7.32 m (3Н, Ph), 7.14 s (1H, H-6); 6.14 t (1H, J = 6.5 Hz, H-1 '); 5.56 m (1H, H-4 '); 3.57 d (2H, j _{CH, P} = 8.5 Hz,

); 2.7-2.2 m (4H, H-2 ', H-3'); 1.95 s (3H,

) ³¹ P-NMR spectrum (D ₂ O, δ, ppm): 11.84 d (α-P, J _α-β = 35.0 Hz), 9.13 d (γ-P, J _{β -γ} = 13.55 Hz), 0.05 m (β-P). FAB mass, m / z: 644 (M ⁺ + H), 661 (M ⁺ + H + NH ₃ ).

Изучение ингибирования биосинтеза ДНК заявляемыми соединениями при катализе реакции ДНК-полимеразами проводили с использованием обратной транскриптазы ВИЧ [К. Ф. 2.7.7.49], а также концевой дезоксинуклеотидилтрансферазы из тимуса теленка [К.Ф. 2.7.7.31] ("Amersham"), ДНК-полимеразы α, β и ε из плаценты человека. Одноцепочечную ДНК фага М13тр10 выделяли из культуральной жидкости реципиентного штамма Е. coli K12XL1. Для ДНК-полимераз α, β, ε и обратной транскриптазы ВИЧ использовали одноцепочечную ДНК фага М13mp10 в качестве матрицы и в качестве праймера синтетический 2'-дезокситетрадекануклеотид (структура рабочей части комплекса показана на фиг. 1). Для концевой дезоксинуклеотидилтрансферазы использовали тот же праймер, но без матрицы. The study of the inhibition of DNA biosynthesis by the claimed compounds in the catalysis of the reaction with DNA polymerases was carried out using HIV reverse transcriptase [K. F. 2.7.7.49], as well as terminal deoxynucleotidyl transferase from the calf thymus [K.F. 2.7.7.31] ("Amersham"), DNA polymerases of α, β and ε from human placenta. Single-stranded DNA of phage M13tp10 was isolated from the culture fluid of the recipient strain of E. coli K12XL1. For DNA polymerases α, β, ε and HIV reverse transcriptase, single-stranded DNA of phage M13mp10 was used as a template and as a primer, synthetic 2'-deoxytetradecanucleotide (the structure of the working part of the complex is shown in Fig. 1). For terminal deoxynucleotidyl transferase, the same primer was used, but without template.

Праймерный тетрадекануклеотид метили по 5'-положению с помощью

(уд. акт. 1500 Ки/ммоль, "Радиоизотоп") при катализе полинуклеотидкиназой фага Т4 ("Amersham").Primer tetradecanucleotide was labeled at the 5'-position using

(specific act. 1500 Ci / mmol, "Radioisotope") during catalysis by polynucleotide kinase of phage T4 ("Amersham").

Условия реакции выбирали в зависимости от свойств соответствующей ДНК-полимеразы (обратной транскриптазы). Reaction conditions were selected depending on the properties of the corresponding DNA polymerase (reverse transcriptase).

Одноцепочечную ДНК фага М13тр10 (0,5 мкМ) гибридизовали с праймером, меченым ³²P до 5'-концу (0,75 мкМ) в следующих буферах: 10 мМ Трис-НСl (рН 8,2), 5 мМ MgCl₂, 40 мМ КСl, 1 мМ дитиотреитол (в случае обратной транскриптазы), 100 мМ какодилат натрия (рН 7,2), 10 мМ MgCl₂, 1 мМ CaCl₂ и 1 мМ дитиотреитол (в случае концевой дезоксинуклеотидилтрансферазы), 10 мМ Трис-НСl (рН 7,4), 6 мМ MgCl₂ и 0,4 мМ дитиотреит (в случае ДНК-полимераз а и е), 10 мМ Трис-НСl (рН 8,5), 6 мМ MgCl₂ и 0,4 мМ дитиотреитол (в случае ДНК-полимеразы β).Single-stranded phage M13tr10 DNA (0.5 μM) was hybridized with a ³² P labeled primer to the 5 ′ end (0.75 μM) in the following buffers: 10 mM Tris-Hcl (pH 8.2), 5 mM MgCl ₂ , 40 mM KCl, 1 mM dithiothreitol (in the case of reverse transcriptase), 100 mM sodium cacodylate (pH 7.2), 10 mM MgCl ₂ , 1 mM CaCl ₂ and 1 mM dithiothreitol (in the case of terminal deoxynucleotidyl transferase), 10 mM Tris-Hcl ( pH 7.4), 6 mM MgCl ₂ and 0.4 mM dithiothreitol (in the case of DNA polymerases a and e), 10 mM Tris-Hcl (pH 8.5), 6 mM MgCl ₂ and 0.4 mM dithiothreitol ( in the case of DNA polymerase β).

Исследование ингибиторных свойств соединений в бесклеточной системе с индивидуальным ферментом проводили в 6 мкл инкубационой смеси, содержащей 0,01 мкМ меченого праймер-матричного комплекса (фиг.1), исследуемое соединение, соответствующие природные 2'-дезоксинуклеозид-5'-трифосфаты и фермент (1 ед. акт. ДНК-полимераз α, ε и β, 2 единицы активности обратной транскриптазы или 3 ед. акт. концевой дезоксинуклеотидилтрансферазы) в соответствующем буфере (см. выше). Реакцию начинали добавлением фермента и проводили в течение 20 мин при 37^oС. Для остановки реакции добавляли 3 мкл деионизованного формамида, содержащего 20 мкМ EDTA, 0,1%-ный бромфеноловый синий и 0,1%-ный ксиленцианол. Продукты реакции разделяли электрофорезом в 20%-ном денатурирующем ПААГ. Полученные гели подвергали радиоавтографии, используя рентгеновскую пленку Kodak XRP-5. Просчитывали радиоактивность соответствующих полос на геле и определяли концентрацию ингибитора, дающую 50% ингибирование элонгации цепи. Далее рассчитывалось соотношение этой концентрации к концентрации природного субстрата. Для сравнения использовали 3'-азидо-2', 3'-дидезокситимидин-5'-трифосфат (AZTTP). Результаты приведены в таблице 1.The study of the inhibitory properties of the compounds in a cell-free system with an individual enzyme was carried out in 6 μl of the incubation mixture containing 0.01 μM labeled primer-matrix complex (Fig. 1), the test compound, the corresponding natural 2'-deoxynucleoside-5'-triphosphates and the enzyme ( 1 unit of active DNA polymerases α, ε and β, 2 units of reverse transcriptase activity or 3 units of terminal deoxynucleotidyl transferase activity) in the appropriate buffer (see above). The reaction was started by adding the enzyme and carried out for 20 minutes at 37 ^° C. To stop the reaction, 3 μl of deionized formamide containing 20 μM EDTA, 0.1% bromophenol blue and 0.1% xylencyanol were added. The reaction products were separated by electrophoresis in 20% denaturing PAAG. The resulting gels were subjected to radioautography using a Kodak XRP-5 X-ray film. The radioactivity of the corresponding bands on the gel was calculated and the concentration of the inhibitor giving 50% inhibition of chain elongation was determined. Next, the ratio of this concentration to the concentration of the natural substrate was calculated. For comparison, 3'-azido-2 ', 3'-dideoxythymidine-5'-triphosphate (AZTTP) was used. The results are shown in table 1.

Как видно из табл. 1, все соединения обладают высокой активностью в подавлении синтеза ДНК при катализе обратной транскриптазой ВИЧ, но не влияют на синтез ДНК при катализе ДНК-полимеразами человека даже при концентрациях в 25-100 раз более высоких. Они несколько превосходят в этом отношении хорошо известный ингибитор этого фермента AZTTP. As can be seen from the table. 1, all compounds are highly active in suppressing DNA synthesis during catalysis by HIV reverse transcriptase, but do not affect DNA synthesis during catalysis by human DNA polymerases even at concentrations 25-100 times higher. They are somewhat superior in this respect to the well-known inhibitor of this enzyme AZTTP.

Определение противовирусной активности проводили на клетках фибробластов мыши, инфицированных вирусным конструктом, содержащим обратную транскриптазу вируса лейкемии мышей Молони (Mo-MLV) (Шевелев Л.Я. др., Мол.биол., 1995, 29, N 5, 1114-1123). Determination of antiviral activity was carried out on mouse fibroblast cells infected with a viral construct containing reverse transcriptase of Moloni mouse leukemia virus (Mo-MLV) (Shevelev L.Ya. et al. Mol.biol., 1995, 29, N 5, 1114-1123) .

Фибробласты крысы линии Ratl рассеивали на 4-луночные плашки Libro (Flow) 1:10. Через 2 суток клетки заражали вирусом pSG1, собранным со свежего монослоя клеток упаковщиков РАЗ17 и разведенным свежей средой в соотношении 1:10. Исследуемые соединения в 10-кратных серийных разведениях добавляли в культуральную среду в момент заражения. Через 1 сутки среду меняли на свежую и еще через 1 сутки фиксировали, окрашивали Xgal и подсчитывали количество колоний, окрашенных в голубой цвет и, следовательно, экспрессирующих β-галактозидазу E. coli, кодируемую вирусом pSG1 (Шевелев Л.Я. др., Мол. биол. , 1995, 29, N 5, 1114-1123). Результаты выражали в % зараженных клеток в присутствии исследуемого соединения по отношению к контролю в отсутствие этого соединения. Каждая точка является средней из 3 параллельных измерений в 2 независимых экспериментах. Стандартные отклонения не превышают 20%. Для сравнения использовали азидотимидин (AZT). Ratl rat fibroblasts were scattered onto 4-well Libro (Flow) 1:10 plates. After 2 days, cells were infected with pSG1 virus, collected from a fresh monolayer of cells of packers RAZ17 and diluted with fresh medium in a ratio of 1:10. Test compounds in 10-fold serial dilutions were added to the culture medium at the time of infection. After 1 day, the medium was changed to fresh and after another 1 day it was fixed, stained with Xgal and the number of colonies stained in blue and, therefore, expressing β-galactosidase E. coli encoded by pSG1 virus was counted (Shevelev L.Ya. et al., Mol Biol., 1995, 29, N 5, 1114-1123). The results were expressed as% of infected cells in the presence of the test compound relative to the control in the absence of this compound. Each point is the average of 3 parallel measurements in 2 independent experiments. Standard deviations do not exceed 20%. For comparison, azidothymidine (AZT) was used.

В таблице 2 показаны результаты подавления вируса, выраженные в концентрациях исследуемого соединения, подавляющих вирус на 50 и 90%. Table 2 shows the results of the suppression of the virus, expressed in concentrations of the test compounds, inhibiting the virus by 50 and 90%.

Как видно из таблицы 2, антивирусная активность всех соединений соизмерима с таковой для азидотимидина (AZT)
Скорость дефосфорилирования синтезированных соединений в сыворотке крови человека определяли, добавляя по 2,5 мкл 10 мМ растворов всех синтезированных соединений к 47,5 мкл 100% фетальной сыворотки человека. Растворы инкубировали при 37^oС и через 2,5, 5, 10, 20, 30, 40, 60, мин, 2, 3, 4, 5, 8, 12, час, 2, 4, 7, и 14 суток, прибавляли по 50 мкл воды и 230 мкл метанола, встряхивали и оставляли на 30 мин при -20^oС. Образцы центрифугировали 10 мин при 12000 об/мин, супернатанты концентрировали до 100 мкл и анализировали ВЭЖХ на колонке Nucleosil 120C18 (4•150 мм, 5 мкм) линейным градиентом метанола от 0 до 35% в 0,05 М КН₂РO₄-буфере за 25 мин, скорость потока 0,5 мл/мин. Для сравнения использовали 3'-азидо-2',3'-дидезокситимидин-5'-фосфат и природные субстраты dTTP и dATP.As can be seen from table 2, the antiviral activity of all compounds is comparable with that for azidothymidine (AZT)
The dephosphorylation rate of the synthesized compounds in human serum was determined by adding 2.5 μl of 10 mm solutions of all synthesized compounds to 47.5 μl of 100% fetal human serum. The solutions were incubated at 37 ^o C and after 2.5, 5, 10, 20, 30, 40, 60, min, 2, 3, 4, 5, 8, 12, hour, 2, 4, 7, and 14 days, 50 μl of water and 230 μl of methanol were added, shaken and left for 30 min at -20 ^o С. The samples were centrifuged for 10 min at 12000 rpm, the supernatants were concentrated to 100 μl and analyzed by HPLC on a Nucleosil 120C18 column (4 × 150 mm, 5 μm) a linear gradient of methanol from 0 to 35% in 0.05 M KN ₂ PO ₄ buffer for 25 min, flow rate 0.5 ml / min. For comparison, 3'-azido-2 ', 3'-dideoxythymidine-5'-phosphate and the natural substrates dTTP and dATP were used.

В таблице 3 представлены данные по скорости гидролиза заявляемых соединений в неразбавленной плазме крови человека, характеризующие их стабильность в этих условиях. Кроме того, даны времена удерживания соединений на твердой фазе при ВЭЖХ, что отражает степень их гидрофобности. Table 3 presents data on the rate of hydrolysis of the claimed compounds in undiluted human blood plasma, characterizing their stability under these conditions. In addition, the retention times of the compounds on the solid phase are given by HPLC, which reflects the degree of their hydrophobicity.

Из таблицы 3 видно, что время гидролиза половинного количества соединений 1-8 примерно в 2000 раз больше, чем для природных субстратов dTTP и dATP, а также AZTTP. При этом их гидрофобность, пропорциональная времени удерживания при ТСХ, значительно увеличивается, что облегчает их диффузию в клетки. From table 3 it is seen that the hydrolysis time of half the amount of compounds 1-8 is approximately 2000 times longer than for the natural substrates dTTP and dATP, as well as AZTTP. Moreover, their hydrophobicity, proportional to the retention time during TLC, significantly increases, which facilitates their diffusion into cells.

Claims

Модифицированные нуклеозид-5 -трифосфаты общей формулы

где В= тимин, аденин, урацил или 5-этилурацил;

R' - Н или N₃;
R'' - Н или R' и R'' вместе образуют двойную связь;
Z - O или CH₂;
R'''= Ph, OАlkyl, OPh, NHPh;
X'= X''= Br, F; или Х'= H, a X''= Br
как антивирусные агенты.Modified nucleoside 5-triphosphates of the general formula

where B = thymine, adenine, uracil or 5-ethyluracil;

R 'is H or N ₃ ;
R ″ —H or R ′ and R ″ together form a double bond;
Z is O or CH ₂ ;
R '''= Ph, OAlkyl, OPh, NHPh;
X '= X''= Br, F; or X '= H, a X''= Br
as antivirus agents.