RU2183126C2 - Remedy and method for normalizing functional activity of the spinal cord - Google Patents

Abstract

FIELD: medicine; pharmacology. SUBSTANCE: method involves grinding fresh or defrosted spinal cord taken from killed cattle and hydrolyzing the substance with neutral protease. Extract is separated from the cake mass. The target product is cleaned using membrane ultrafiltration method which selectivity is equal to 10-15 kD and evaporating under vacuum action. Pharmaceutical remedy as active ingredient contains the target product in effective quantity as it is produced by the claimed method being in this way low molecular weight animal spinal cord tissue hydrolysate fraction containing amino acid complex in 2.0 to 4.0 mg/ml concentration and peptide complex in 6.0 to 8.0 mg/l concentration. EFFECT: enhanced effectiveness in normalizing spinal cord functions. 4 cl, 1 dwg, 3 tbl

Description

Изобретение относится к производству лекарственных средств, применяемых в медицинской практике, и касается получения препаратов из животного сырья. The invention relates to the production of medicines used in medical practice, and for the production of drugs from animal raw materials.

Нейродегенеративные соматические заболевания спинного мозга (CM), a также его травматическая болезнь, возникающая вследствие повреждения позвоночника, относятся к важнейшим нерешенным проблемам современной медицины. Эти заболевания расцениваются, как одни из самых прогностически неблагоприятных, ввиду тяжести последствий, недостаточной эффективности существующих методов лечения и отсутствия этиотропных лекарственных средств. Neurodegenerative somatic diseases of the spinal cord (CM), as well as its traumatic disease resulting from damage to the spine, are among the most important unsolved problems of modern medicine. These diseases are regarded as one of the most prognostically unfavorable, due to the severity of the consequences, the lack of effectiveness of existing methods of treatment and the absence of etiotropic drugs.

Для лечения как дегенеративных, так и травматической болезни СМ различными авторами было исследовано действие ряда препаратов самых различных фармакологических групп: блокаторов альфа-адренергических рецепторов, стимуляторов и блокаторов бета-адренорецепторов, барбитуратов, антифибринолитических средств, антикоагулянтов, низкомолекулярных декстранов, опиатных антагонистов, тиреотропного гормона, иммунодепрессантов, липидных антиоксидантов, эуфиллина, диметилсульфоксида, нестероидных противовоспалительных препаратов, мышечных релаксантов. Результаты экспериментов, не всегда обнадеживающие, все же позволяют говорить о том, что терапевтический нигилизм в отношении заболеваний СМ не оправдан [1, 2]. For the treatment of both degenerative and traumatic SM diseases, various authors have studied the effects of a number of drugs of various pharmacological groups: alpha-adrenergic receptor blockers, beta-adrenergic receptor blockers and blockers, antifibrinolytic agents, anticoagulants, low molecular weight dextrans, opiate antagonists, typhoid antagonists , immunosuppressants, lipid antioxidants, aminophylline, dimethyl sulfoxide, non-steroidal anti-inflammatory drugs, muscle elaksantov. The experimental results, which are not always encouraging, still allow us to say that therapeutic nihilism in relation to diseases of the SM is not justified [1, 2].

Неоднозначные результаты при лечении неполной травмы СМ в экспериментальных модельных опытах на животных были получены при использовании высоких доз кортикостероида - метилпреднизолона, который увеличивал сохранность нервной ткани и снижал неврологический дефицит [3, 4]. Однако в ряде случаев, особенно при назначении позднее чем через 8 часов после травмы, высокие дозы метилпреднизолона не только оказывались неэффективными, но и вызывали нежелательное влияние на спинно-мозговую ткань, препятствуя нормальному регенераторному процессу [5, 6]. Ambiguous results in the treatment of incomplete trauma of SM in experimental animal model experiments were obtained using high doses of a corticosteroid, methylprednisolone, which increased the preservation of nerve tissue and reduced neurological deficit [3, 4]. However, in some cases, especially when prescribed later than 8 hours after the injury, high doses of methylprednisolone not only proved to be ineffective, but also caused an undesirable effect on the spinal cord tissue, interfering with the normal regenerative process [5, 6].

Таким образом, вопрос о клиническом применении вышеперечисленных групп препаратов остается открытым. На практике же терапевтическое лечение нейродегенеративных соматических заболеваний и травматической болезни СМ, как правило, ограничивается назначением общеукрепляющих и поддерживающих лекарственных средств: витаминов группы В, Е, АТФ, метионина, глутаминовой кислоты и пр. [7]. Thus, the question of the clinical use of the above groups of drugs remains open. In practice, the therapeutic treatment of neurodegenerative somatic diseases and traumatic SM disease, as a rule, is limited to the appointment of restorative and supportive medicines: vitamins of group B, E, ATP, methionine, glutamic acid, etc. [7].

Задача настоящего изобретения состоит в создании нового фармакологического средства, оказывающего нормализующее действие на функции СМ при его дегенеративных изменениях и травматической болезни. The objective of the present invention is to create a new pharmacological agent that has a normalizing effect on the functions of the SM during its degenerative changes and traumatic disease.

Технический результат изобретения заключается в создании нового фармакологического средства из спинно-мозговой ткани убойных сельскохозяйственных животных, нормализующего функциональную активность спинного мозга и способа его получения. The technical result of the invention is to create a new pharmacological agent from the spinal cord tissue of slaughter farm animals, normalizing the functional activity of the spinal cord and the method for its preparation.

Указанный технический результат достигается тем, что впервые разработан препарат для лечения вышеуказанных заболеваний с использованием в качестве сырья спинно-мозговой ткани убойных сельскохозяйственных животных, поэтому прототипа к данному изобретению нет. The specified technical result is achieved by the fact that for the first time a drug was developed for the treatment of the above diseases using slaughter farm animals as the raw material of the spinal cord tissue, therefore there is no prototype for this invention.

На чертеже изображены двигательные нейроны вентролатерального ядра передних рогов спинного мозга крысы (окраска толуидиновым синим по Нисслю; ок. 10, об. 20): а) явления хроматолиза после длительной гипокинезии; б) восстановление хроматофильного вещества Ниссля после применения препарата ПСМ; в) нейроны интактной крысы. The drawing shows the motor neurons of the ventrolateral nucleus of the anterior horns of the rat spinal cord (Nissl toluidine blue; approx. 10, vol. 20): a) chromatolysis after prolonged hypokinesia; b) restoration of the Nissl chromatophilic substance after application of the PSM preparation; c) neurons of an intact rat.

Сущность заявляемого способа получения фармакологического средства состоит в том, что свежий или дефростированный спинной мозг убойного скота измельчают, смешивают с водой в соотношении 1:1 и подвергают гидролизу нейтральной протеазой, взятой из расчета 1,2-1,6 ПЕ/г сырья, в условиях рН-статирования при 7,6±0,2 и температуре 39±1^oС в течение 3-4 ч. По окончании процесса гидролиза высокомолекулярные компоненты отделяют кислотным или спиртовым осаждением, а доочистку целевого продукта осуществляют методом ультрафильтрации на мембранах с селективностью 10-15 кДа с последующим выпариванием под вакуумом на 50% (по объему) и обработкой активированным углем, взятым из расчета 30-40 г/л. Полученный продукт стерилизуют и разливают в ампулы.The essence of the proposed method of obtaining a pharmacological agent is that fresh or defrosted spinal cord of slaughter cattle is crushed, mixed with water in a ratio of 1: 1 and hydrolyzed with a neutral protease, taken from the calculation of 1.2-1.6 PE / g of raw material, statirovaniya pH conditions at 7.6 ± 0.2 and a temperature of 39 ± 1 ^o C for 3-4 hours. After the hydrolysis process high-molecular components are separated by acid or alcohol precipitation, and the desired product after-treatment is carried out by ultrafiltration on membranes with selective of 10-15 kDa, followed by evaporation under vacuum on a 50% (by volume) and treatment with activated charcoal, taken at the rate of 30-40 g / l. The resulting product is sterilized and poured into ampoules.

Целевой продукт (препарат из спинного мозга - ПСМ) представляет собой прозрачную желтоватую жидкость и содержит комплекс биологически активных полипептидов и аминокислот. The target product (preparation from the spinal cord - PSM) is a clear yellowish liquid and contains a complex of biologically active polypeptides and amino acids.

Для более полной характеристики препарата проведено изучение его состава, основных свойств, токсикологической безвредности и специфической биологической активности. For a more complete characterization of the drug, a study was made of its composition, basic properties, toxicological harmlessness and specific biological activity.

Присутствие в препарате аминокислот подтверждается его окрашиванием в сине-фиолетовый цвет при добавлении спиртового раствора нингидрина. The presence of amino acids in the preparation is confirmed by its staining in blue-violet color with the addition of an alcoholic ninhydrin solution.

Для определения в препарате пептидных связей в него добавляют биуретовый реактив. Окрашивание раствора в фиолетовый цвет свидетельствует о наличии пептидных связей. To determine peptide bonds in the preparation, a biuret reagent is added to it. Staining the solution with violet color indicates the presence of peptide bonds.

Отсутствие в препарате высокомолекулярных белковых компонентов подтверждается тем, что при добавлении к 1 мл препарата 0,25 мл 20%-ного раствора трихлоруксусной кислоты раствор остается прозрачным. The absence of high molecular weight protein components in the preparation is confirmed by the fact that, when 0.25 ml of a 20% solution of trichloroacetic acid is added to 1 ml of the preparation, the solution remains clear.

Интенсивность окраски препарата не превышает эталон 2 б (ГФ XI, вып. 1, с. 194). The color intensity of the drug does not exceed the standard 2 b (GF XI, issue 1, p. 194).

Препарат имеет плотность 1,020 - 1,040 г/см³ (ГФ XI, вып. 1, с. 24), содержит 6 - 8 мг/мл азота пептидов (ГФ XI, вып. 2, с. 30), 2 - 4 мг/мл аминного азота (определяется потенциометрически) и 4 - 8 мг/мл общего азота (ГФ XI, вып. 1, с. 180). Сухой остаток составляет 5 - 9% (ГФ XI, вып. 1, с. 176).The drug has a density of 1,020 - 1,040 g / cm ³ (GF XI, issue 1, p. 24), contains 6 - 8 mg / ml of nitrogen peptides (GF XI, issue 2, p. 30), 2 - 4 mg / ml of amine nitrogen (determined potentiometrically) and 4-8 mg / ml of total nitrogen (GF XI, issue 1, p. 180). The dry residue is 5 - 9% (GF XI, issue 1, p. 176).

Содержание свободных аминокислот (ГФ XI, вып. 1, с. 110) колеблется в следующих пределах, мг/мл:
L-Аспарагиновая кислота - 2,6±0,3
L-Треонин - 1,4±0,2
L-Серин - 2,4±0,3
L-Глутаминовая кислота - 4,2±0,4
L-Пролин - 2,8±0,3
Глицин - 1,2±0,2
L-Аланин - 2,0±0,2
L-Валин - 1,6±0,3
L-Метионин - 0,6±0,2
L-Изолейцин - 1,2±0,2
L-Лейцин - 2,9±0,3
L-Тирозин - 0,5±0,1
L-Фенилаланин - 1,4±0,2
L-Гистидин - 1,5±0,2
L-Лизин - 2,3±0,3
L-Аргинин - 2,5±0,3
Величина молекулярной массы целевого продукта определяется селективностью ультрафильтрационных мембран, используемых при его получении, и составляет 10-15 кДа.The content of free amino acids (GF XI, issue 1, p. 110) varies in the following ranges, mg / ml:
L-Aspartic Acid - 2.6 ± 0.3
L-Threonine - 1.4 ± 0.2
L-Serine - 2.4 ± 0.3
L-Glutamic acid - 4.2 ± 0.4
L-Proline - 2.8 ± 0.3
Glycine - 1.2 ± 0.2
L-Alanine - 2.0 ± 0.2
L-Valine - 1.6 ± 0.3
L-Methionine - 0.6 ± 0.2
L-Isoleucine - 1.2 ± 0.2
L-Leucine - 2.9 ± 0.3
L-tyrosine - 0.5 ± 0.1
L-Phenylalanine - 1.4 ± 0.2
L-Histidine - 1.5 ± 0.2
L-Lysine - 2.3 ± 0.3
L-Arginine - 2.5 ± 0.3
The molecular weight of the target product is determined by the selectivity of the ultrafiltration membranes used in its preparation, and is 10-15 kDa.

Согласно изобретению фармакологическое средство, нормализующее функциональную активность спинного мозга, содержит в качестве активного начала эффективное количество целевого продукта, полученного указанным способом и представляющего собой низкомолекулярную фракцию гидролизата спинно-мозговой ткани, содержащую комплекс аминокислот и биологически активных пептидов. According to the invention, a pharmacological agent normalizing the functional activity of the spinal cord contains, as an active principle, an effective amount of the target product obtained by this method and which is a low molecular weight fraction of the hydrolyzate of the spinal cord tissue containing a complex of amino acids and biologically active peptides.

Во время проведения исследований заявляемого фармакологического средства на экспериментальных моделях in vivo были обнаружены новые терапевтические эффекты, такие как способность нормализовывать метаболизм в двигательных нейронах спинного мозга при дегенеративных изменениях, вызванных длительной гипокинезией, восстанавливать функции СМ, нарушенные в результате гемисекции, а также купировать судорожный синдром. During studies of the claimed pharmacological agent in experimental in vivo models, new therapeutic effects were discovered, such as the ability to normalize metabolism in the motor neurons of the spinal cord during degenerative changes caused by prolonged hypokinesia, to restore the functions of SM, disturbed as a result of hemisection, as well as to stop convulsive syndrome .

Согласно изобретению способ нормализации функциональной активности спинного мозга достигается посредством введения терапевтически эффективного количества фармакологического средства, представляющего собой целевой продукт, полученный указанным способом. Фармакологическое средство целесообразно применять в суточной дозе от 0,1 до 0,25 мл на 1 кг массы тела в течение 10 дней. According to the invention, a method for normalizing the functional activity of the spinal cord is achieved by administering a therapeutically effective amount of a pharmacological agent, which is the target product obtained by this method. It is advisable to use a pharmacological agent in a daily dose of 0.1 to 0.25 ml per 1 kg of body weight for 10 days.

Изобретение иллюстрируется примерами конкретного выполнения способа получения фармакологического средства из животного сырья (примеры 1, 2) и испытания биологической активности продукта, получаемого заявляемым способом (примеры 3, 4, 5). The invention is illustrated by examples of specific performance of the method of obtaining a pharmacological agent from animal raw materials (examples 1, 2) and testing the biological activity of the product obtained by the claimed method (examples 3, 4, 5).

Пример 1. 30 кг свежего спинного мозга крупного рогатого скота измельчают электромясорубкой, заливают 30 л дистиллированной воды и гомогенизируют с помощью роторно-пульсационного аппарата. Гомогенат помещают в реактор, нагревают до 39±1^oС, устанавливают рН 7,6±0,1 раствором NaOH и при постоянном перемешивании электромешалкой добавляют фермент террилитин (ФС 42-3270-96) из расчета 1,2-1,4 ПЕ/г сырья. Гидролиз проводят в течение 3-4 ч при перемешивании.Example 1. 30 kg of fresh cattle spinal cord are grinded with an electric meat grinder, 30 l of distilled water are poured and homogenized using a rotary pulsation apparatus. The homogenate is placed in a reactor, heated to 39 ± 1 ^° C, pH 7.6 ± 0.1 is adjusted with a NaOH solution, and the terrilithin enzyme (FS 42-3270-96) is added at a rate of 1.2-1.4 PE / g of raw material. Hydrolysis is carried out for 3-4 hours with stirring.

По окончании процесса гидролиза субстрат подкисляют соляной кислотой до рН 5,0±0,1, прогревают при 98,0±0,5^oС в течение 30-40 мин и фильтруют горячим через миткаль.At the end of the hydrolysis process, the substrate is acidified with hydrochloric acid to pH 5.0 ± 0.1, heated at 98.0 ± 0.5 ^o C for 30-40 minutes and filtered hot through calico.

Осветленный гидролизат охлаждают до комнатной температуры и подвергают баромембранному разделению в тангенциальном потоке на ультрафильтрационных мембранах с селективностью 10-15 кДа. Полученный пермеат (около 30 л) выпаривают под вакуумом до объема, составляющего 50% от исходного (15 л), обрабатывают в течение 10 мин активированным углем, взятым из расчета 40-60 г/л, фильтруют через полотняный фильтр, стерилизуют и готовят лекарственную форму. Выход целевого продукта составляет 0,5 л/кг сырья. The clarified hydrolyzate is cooled to room temperature and subjected to baromembrane separation in a tangential flow on ultrafiltration membranes with a selectivity of 10-15 kDa. The obtained permeate (about 30 L) is evaporated under vacuum to a volume of 50% of the initial (15 L), treated with activated carbon, taken at a rate of 40-60 g / l for 10 minutes, filtered through a linen filter, sterilized and a medicinal product is prepared form. The yield of the target product is 0.5 l / kg of raw material.

Пример 2. 30 кг дефростированного спинного мозга свиней измельчают и подвергают гидролизу бактилином (ТУ 9381-001-04863057-97) по примеру 1. Example 2. 30 kg of defrosted spinal cord of pigs is crushed and subjected to hydrolysis with bactlin (TU 9381-001-04863057-97) according to example 1.

По окончании процесса гидролиза субстрат прогревают при 98,0±0,5^oС в течение 30-40 мин, охлаждают до комнатной температуры и добавляют к нему 150 л этилового спирта. Смесь инкубируют в течение 2 ч и удаляют выпавший осадок. Надосадочную жидкость выпаривают под вакуумом до конечного объема 15 л, обрабатывают активированным углем по примеру 1, фильтруют, стерилизуют и готовят лекарственную форму. Выход целевого продукта составляет 0,5 л/кг сырья.At the end of the hydrolysis process, the substrate is heated at 98.0 ± 0.5 ^o C for 30-40 minutes, cooled to room temperature and 150 l of ethyl alcohol are added to it. The mixture was incubated for 2 hours and the precipitate was removed. The supernatant is evaporated under vacuum to a final volume of 15 L, treated with activated carbon according to Example 1, filtered, sterilized and a dosage form is prepared. The yield of the target product is 0.5 l / kg of raw material.

Исследование токсикологической безвредности препарата проводили в соответствии с "Методическими рекомендациями по изучению общетоксического действия фармакологических средств", утвержденными МЗ РФ 29.12.97 [8]. При определении параметров острой токсичности объектами исследования служили лекарственная форма ПСМ, полученная заявляемым способом, а также субстанция препарата, получаемая путем его лиофильного высушивания. Субстанцию ПСМ растворяли ex tempore в воде для инъекций в необходимой концентрации. The study of the toxicological harmlessness of the drug was carried out in accordance with the "Methodological recommendations for the study of the general toxic effects of pharmacological agents", approved by the Ministry of Health of the Russian Federation on December 29, 1997 [8]. When determining the parameters of acute toxicity, the objects of the study were the PSM dosage form obtained by the claimed method, as well as the substance of the drug obtained by freeze drying. The PSM substance was dissolved ex tempore in water for injection in the required concentration.

Установлено, что при однократном подкожном, внутримышечном и внутрибрюшинном введении лекарственной формы ПСМ белым беспородным крысам массой тела 180-200 г в максимально допустимых объемах, составляющих 10, 5 и 5 мл соответственно, гибели и симптомов отравления животных не наблюдалось, а их физиологические показатели и коэффициенты внутренних органов не отличались от контрольных. It was found that with a single subcutaneous, intramuscular and intraperitoneal administration of the PSM dosage form to white outbred rats weighing 180-200 g in the maximum allowable volumes of 10, 5 and 5 ml, respectively, there were no deaths and symptoms of poisoning of the animals, and their physiological parameters and coefficients of internal organs did not differ from control ones.

LD₅₀ субстанции ПСМ по методу Литчфилда-Уилкоксона [9] при однократном внутримышечном введении белым аутбредным мышам массой 18-20 г составила 1240 (1401-1097) мг/кг (в перерасчете на жидкий препарат - 177 мл/кг), что в 700-1700 раз превышает предполагаемую суточную терапевтическую дозу.The LD _{50 of the} PSM substance according to the Litchfield-Wilcoxon method [9] with a single intramuscular injection of white outbred mice weighing 18-20 g was 1240 (1401-1097) mg / kg (in terms of liquid preparation - 177 ml / kg), which is 700 -1700 times the estimated daily therapeutic dose.

Хроническую токсичность ПСМ изучали на белых аутбредных крысах обоего пола в течение 4 недель. Препарат вводили внутримышечно в 2 дозах - терапевтической и 1/10 DL₅₀. Контрольная группа крыс получала адекватно внутримышечно воду для инъекций.Chronic toxicity of PSM was studied in white outbred rats of both sexes for 4 weeks. The drug was administered intramuscularly in 2 doses - therapeutic and 1/10 DL ₅₀ . The control group of rats received adequately intramuscularly water for injection.

Перед началом опыта и в конце оценивали общее состояние животных, определяли массу тела, состав и свойства периферической крови, функции сердечно-сосудистой и центральной нервной систем, печени, почек, надпочечников. На 28-й день опыта животных умерщвляли одномоментной декапитацией и определяли весовые коэффициенты внутренних органов. Для гистологического изучения от всех опытных и контрольных животных брали головной и спинной мозг, сердце, легкие, печень, почки, селезенку, тимус, поджелудочную железу, надпочечники, лимфоузлы различной локализации и области инокуляции препарата. Before the start of the experiment and at the end, the general condition of the animals was evaluated, body weight, composition and properties of peripheral blood, the functions of the cardiovascular and central nervous systems, liver, kidneys, and adrenal glands were determined. On the 28th day of the experiment, the animals were euthanized by simultaneous decapitation and the weights of the internal organs were determined. For histological examination, all experimental and control animals were taken of the brain and spinal cord, heart, lungs, liver, kidneys, spleen, thymus, pancreas, adrenal glands, lymph nodes of different localization and the area of inoculation of the drug.

Проведенными исследованиями установлено, что ПСМ в обеих дозах (терапевтической и 1/10 DL₅₀) не оказывает влияния на общее состояние животных, их массу тела, поведенческие реакции, а также функции изучаемых органов и систем. Гистологическое изучение внутренних органов животных также не выявило существенных изменений. Дополнительно выявлено отсутствие у исследуемого препарата кумулятивных и аллергизирующих свойств, а также кожно-резорбтивного, эмбриотоксического и тератогенного действия.Studies have shown that PSM in both doses (therapeutic and 1/10 DL ₅₀ ) does not affect the general condition of animals, their body weight, behavioral reactions, as well as the functions of the studied organs and systems. Histological examination of the internal organs of animals also did not reveal significant changes. Additionally, the absence of cumulative and allergenic properties, as well as skin-resorptive, embryotoxic and teratogenic effects, was revealed in the studied preparation.

Таким образом, заявляемое средство при длительном введении животным не обладает токсическим действием, препятствующим его применению в качестве лекарственного средства. Thus, the claimed drug with prolonged administration to animals does not have a toxic effect that impedes its use as a medicine.

Для изучения биологической активности препарата использовали экспериментальные модели, позволяющие оценить способность ПСМ нормализовывать метаболизм в двигательных нейронах спинного мозга при дегенеративных изменениях, вызванных длительной гипокинезией (пример 3), восстанавливать функции спинного мозга, нарушенные в результате спинно-мозговой травмы, моделируемой гемисекцией спинного мозга (пример 4), а также оказывать противосудорожное действие путем модуляции медиаторных систем нервных клеток (пример 5). To study the biological activity of the drug, experimental models were used to evaluate the ability of PSM to normalize metabolism in motor neurons of the spinal cord during degenerative changes caused by prolonged hypokinesia (example 3), to restore the functions of the spinal cord impaired as a result of a spinal cord injury modeled by hemisection of the spinal cord ( example 4), and also have an anticonvulsant effect by modulating the mediator systems of nerve cells (example 5).

Пример 3. В первой модели опытов in vivo изучена возможность коррекции препаратом ПСМ дегенеративных метаболических нарушений в нейронах спинного мозга при длительной гипокинезии. Эксперимент проводили на белых беспородных крысах массой тела 180-200 г. Условия вынужденной гипокинезии создавали в камерах малого объема в течение 60 дней [10]. ПСМ вводили ежедневно внутримышечно в дозе 0,25 мл/кг. По окончании эксперимента животных умерщвляли одномоментной декапитацией. Кусочки спинного мозга на уровне L₂-L₄ извлекали и фиксировали в жидком азоте, а часть материала после фиксации в формалине заливали в парафин и окрашивали по Нисслю. Уровни активности основных окислительно-восстановительных ферментов - сукцинатдегидрогеназы (СДГ), НАД-диафоразы (НАД-Д) и лактатдегидрогеназы (ЛДГ), являющихся наиболее информативными показателями функционального состояния ткани [11], выявляли на криостатных срезах толщиной 10 мкм. Количественную оценку результатов гистохимических реакций проводили цитоспектрофотометрическим методом [12]. Оптическую плотность измеряли в 40 случайно выбранных нейронах вентролатерального ядра передних рогов спинного мозга.Example 3. In the first model of in vivo experiments, the possibility of PSM correction of degenerative metabolic disorders in spinal cord neurons with prolonged hypokinesia was studied. The experiment was carried out on white outbred rats weighing 180-200 g. The conditions of forced hypokinesia were created in small chambers for 60 days [10]. PSM was administered daily intramuscularly at a dose of 0.25 ml / kg. At the end of the experiment, the animals were killed by simultaneous decapitation. Pieces of the spinal cord at the L ₂ -L ₄ level were removed and fixed in liquid nitrogen, and part of the material, after fixing in formalin, was poured into paraffin and stained according to Nissl. The activity levels of the main redox enzymes — succinate dehydrogenase (LDH), NAD-diaphorase (NAD-D) and lactate dehydrogenase (LDH), which are the most informative indicators of the functional state of the tissue [11], were detected on cryostat sections 10 μm thick. The results of histochemical reactions were quantified by the cytospectrophotometric method [12]. The optical density was measured in 40 randomly selected neurons of the ventrolateral nucleus of the anterior horns of the spinal cord.

При длительной гипокинезии в двигательных нейронах спинного мозга зарегистрировано статистически значимое снижение активности СДГ и НАД-Ф, а также увеличение активности ЛДГ (табл. 1), свидетельствующее о нарушении энергетического обмена. На препаратах, окрашенных по Нисслю, в двигательных нейронах отмечался выраженный хроматолиз базофильного вещества, характеризующий снижение функциональной активности нервных клеток (чертеж а). Перечисленные показатели свидетельствуют о дегенеративных изменениях в исследуемой ткани. With prolonged hypokinesia in the motor neurons of the spinal cord, a statistically significant decrease in the activity of LDH and NAD-F was registered, as well as an increase in the activity of LDH (Table 1), indicating a violation of energy metabolism. On preparations stained according to Nissl, in motor neurons, pronounced chromatolysis of the basophilic substance was observed, which characterizes a decrease in the functional activity of nerve cells (Figure a). These indicators indicate degenerative changes in the test tissue.

Введение животным, переживающим длительную гипокинезию, препарата ПСМ существенно нормализовало энергетический обмен в двигательных нейронах, достоверно (Р<0,01; Р<0,01) повышая активность СДГ и НАД-Ф, а также снижая активность ЛДГ по сравнению с показателями нелеченых крыс. Морфологические исследования свидетельствовали о нормализации функционального состояния двигательных нейронов: базофилия хроматофильного вещества Ниссля возрастала и явления хроматолиза определялись в слабой степени выраженности и в меньшем числе нейронов (чертеж б). The administration of PSM to animals undergoing prolonged hypokinesia significantly normalized energy metabolism in motor neurons, significantly (P <0.01; P <0.01), increasing the activity of LDH and NAD-F, as well as decreasing LDH activity compared to untreated rats . Morphological studies testified to the normalization of the functional state of motor neurons: basophilia of the chromatophilic substance Nissl increased and the phenomena of chromatolysis were detected in a weak degree of severity and in a smaller number of neurons (Figure b).

Таким образом, результаты проведенных исследований позволяют заключить, что ПСМ способен поддерживать энергетический метаболизм в двигательных нейронах спинного мозга, а также стимулировать синтетические процессы на гранулярной эндоплазматической сети и, тем самым, восстанавливать функциональную активность спинного мозга при дегенеративных изменениях. Thus, the results of the studies allow us to conclude that PSM is able to maintain energy metabolism in the motor neurons of the spinal cord, as well as stimulate synthetic processes on the granular endoplasmic reticulum and, thereby, restore the functional activity of the spinal cord during degenerative changes.

Пример 4. В работе использовали белых аутбредных крыс с массой тела 180-200 г одного (любого) пола. Животных наркотизировали внутрибрюшинно нембуталом и после наступления сна дорсальным доступом производили подоболочечную гемисекцию спинного мозга на уровне L₂-L₄ в стерильных условиях. Рану зашивали стерильным шовным материалом и обрабатывали раствором йода.Example 4. In the work used white outbred rats with a body weight of 180-200 g of one (any) gender. Animals were anesthetized intraperitoneally with Nembutal and after sleep dorsal access, subshell hemisection of the spinal cord was performed at the level of L ₂ -L ₄ under sterile conditions. The wound was sutured with sterile suture material and treated with iodine solution.

На следующий день, после появления симптомов нарушения двигательных функций, формировали две равноценные по развившемуся симптомокомплексу группы животных. Контрольную группу формировали из интактных крыс. The next day, after the onset of symptoms of impaired motor function, two groups of animals equivalent in size to the developed symptom complex were formed. The control group was formed from intact rats.

Контрольной и первой опытной группам ежедневно внутримышечно в течение 5 дней вводили адекватный объем раствора натрия хлорида 0,9% для инъекций. An adequate volume of 0.9% sodium chloride solution for injection was injected intramuscularly daily into the control and first experimental groups for 5 days.

Второй опытной группе в течение 5 дней после операции ежедневно внутримышечно вводили ПСМ в дозе 0,2 мл/кг. For the second experimental group, PSM at a dose of 0.2 ml / kg was administered daily intramuscularly within 5 days after the operation.

На 6-й день проводили оценку показателей двигательных функций животных всех групп по их способности удерживаться на вращающемся (30 об/мин) стержне и наклонной (под углом 70^o) платформе из металлических ячеек, а также по скорости плавания (определяли время "вынужденного заплыва" на 1,5 м) [13].On the 6th day, we assessed the indices of motor functions of animals of all groups by their ability to stay on a rotating (30 rpm) rod and an inclined (at an angle of 70 ^o ) platform of metal cells, as well as by swimming speed (determined the time of "forced swim "by 1.5 m) [13].

Установлено, что после травматического повреждения спинного мозга изучаемые показатели двигательных функций животных резко снижались в сравнении с контролем (Р<0,02; Р<0,001; Р<0,05; таблица 2). Введение крысам в течение 5 дней после травмы ПСМ способствовало существенной нормализации двигательных функций, которые хоть и не достигали контрольных значений, но тем не менее статистически значимо (Р<0,001; Р<0,001; Р<0,02) превышали соответствующие показатели группы нелеченых животных (группа 2). It was established that after traumatic damage to the spinal cord, the studied indices of the motor functions of animals sharply decreased in comparison with the control (P <0.02; P <0.001; P <0.05; Table 2). Administration to rats within 5 days after injury of PSM contributed to a significant normalization of motor functions, which, although they did not reach control values, were nevertheless statistically significantly (P <0.001; P <0.001; P <0.02) higher than the corresponding indices of the group of untreated animals (group 2).

Таким образом, введение ПСМ в раннем периоде после тяжелой спинно-мозговой травмы способствует восстановлению двигательных функций животных. Следовательно, препарат может применяться у пострадавших с целью снижения ранней посттравматической смертности, числа возможных осложнений, а также для сокращения сроков лечения. Thus, the introduction of PSM in the early period after severe spinal cord injury helps to restore the motor functions of animals. Therefore, the drug can be used in patients with the aim of reducing early post-traumatic mortality, the number of possible complications, as well as to shorten the treatment time.

Пример 5. Оценку противосудорожной активности ПСМ проводили с использованием теста коразоловых судорог, который служит классической моделью для проверки активности противосудорожных средств [14]. Механизм действия коразола связан с его влиянием на межуточный, средний и спинной мозг. Коразол усиливает процессы иррадиации, повышает суммационную способность ЦНС, облегчает передачу импульсов в межнейронных связях и укорачивает моторную хронаксию. По современным представлениям клонико-тонический компонент судорог, индуцированных коразолом, соответствует малому эпилептиформному приступу "petit mal", наблюдаемому в клинике. Example 5. Evaluation of the anticonvulsant activity of PSM was carried out using the test of corazole seizures, which serves as a classic model for checking the activity of anticonvulsants [14]. The mechanism of action of corazole is associated with its effect on the interstitial, middle and spinal cord. Corazole enhances the processes of irradiation, increases the summation ability of the central nervous system, facilitates the transmission of impulses in interneuronal connections, and shortens motor chronaxy. According to modern concepts, the clonic-tonic component of seizures induced by corazole corresponds to the small petit mal epileptiform seizure observed in the clinic.

В работе использовали белых аутбредных мышей обоего пола массой 20-22 г. За 30 мин до введения судорожного агента первой (контрольной) группе животных вводили раствор натрия хлорида 0,9% для инъекций, а второй (опытной) группе - ПСМ в дозе 0,1 мл/кг массы внутримышечно. Коразол вводили также внутримышечно в дозе 100 мг/кг [15], после чего животных помещали в прозрачные плексигласовые камеры и наблюдали в течение 60 мин, регистрируя продолжительность судорог и количество павших животных. We used white outbred mice of both sexes weighing 20-22 g. 30 minutes before the administration of the convulsive agent, the first (control) group of animals was injected with 0.9% sodium chloride solution for injection, and the second (experimental) group - PSM at a dose of 0, 1 ml / kg of mass intramuscularly. Corazole was also administered intramuscularly at a dose of 100 mg / kg [15], after which the animals were placed in transparent Plexiglas chambers and observed for 60 minutes, recording the duration of seizures and the number of dead animals.

Полученные данные (табл. 3) свидетельствуют о том, что ПСМ обладает выраженным противосудорожным действием, вызывает достоверное укорочение клонической фазы судорожного припадка (Р<0,05) и защищает животных от гибели. The data obtained (Table 3) indicate that PSM has a pronounced anticonvulsant effect, causes a significant shortening of the clonic phase of a convulsive seizure (P <0.05) and protects animals from death.

Источники информации
1. Гришенкова Л.Н. и др.//Вопр.нейрохирургии. - 1997. - 2. - С.37-44.Sources of information
1. Grishenkova L.N. et al. // Issues of Neurosurgery. - 1997. - 2. - P.37-44.

2. Privat A.//"Rev.Prat." - 1995. - Vol. 45. - 16. - P.2051-2056. 2. Privat A.//"Rev.Prat. " - 1995. - Vol. 45. - 16. - P.2051-2056.

3. Ducker T.B., Zeidman S.M.//Spine.-1994.-Vol. 19.- 20.-P.2281-2287. 3. Ducker T.B., Zeidman S.M.//Spine.-1994.-Vol. 19.- 20.-P.2281-2287.

4. Efficasy and Mechanism of Action of Methylprednisolone in Acute Spinal Cord Trauma//Innovation in Trauma Management. The Upjohn Company. - 1991. - Vol. 1. - P.11. 4. Efficasy and Mechanism of Action of Methylprednisolone in Acute Spinal Cord Trauma // Innovation in Trauma Management. The Upjohn Company. - 1991. - Vol. 1. - P.11.

5. Brachen M. B. , Holdford T.R.//"Ibid." - 1993. - Vol. 79. - 4. - P. 500-507. 5. Brachen M. B., Holdford T.R.//"Ibid. " - 1993. - Vol. 79. - 4. - P. 500-507.

6. Hall E.D.//"J.Neurosurg."- 1992. - Vol. 76. - 1. - P.13-22. 6. Hall E.D.//"J. Neurosurg."- 1992. - Vol. 76. - 1. - P.13-22.

7. Подачин В. Н., Мусалов Г.Г., Незлина Н.И. Структурно-функциональные основы компенсации функций при травме спинного мозга. - М. - 1983. 7. Podachin V. N., Musalov G. G., Nezlina N. I. Structural and functional basis for compensation of functions in spinal cord injury. - M. - 1983.

8. Методические рекомендации по изучению общетоксического действия фармакологических средств. Утверждены МЗ РФ 29.12.97. 8. Guidelines for the study of the general toxic effects of pharmacological agents. Approved by the Ministry of Health of the Russian Federation on December 29, 1997.

9. Беленький М. Л. Элементы количественной оценки фармакологического эффекта. Л.: - Медгиз. - 1963. - С. 152. 9. Belenky M. L. Elements of a quantitative assessment of the pharmacological effect. L .: - Medgiz. - 1963.- S. 152.

10. Коваленко Е.А., Гуровский Н.Н. Гипокинезия. М. - 1980. - 318 с. 10. Kovalenko EA, Gurovsky N.N. Hypokinesia. M. - 1980 .-- 318 p.

11. Берстон М. Гистохимия ферментов. М. - 1965. - 810 с. 11. Burston M. Histochemistry of enzymes. M. - 1965. - 810 p.

12. Нарциссов Р.П., Дюкова И.И., Петерсон И.С. "Арх.анат." - 1969. - Т. 57. - 12. - С.112-116. 12. Narcissov R.P., Dyukova I.I., Peterson I.S. "Arch.anat." - 1969. - T. 57. - 12. - S.112-116.

13. Буреш Я., Бурешова О., Хьюстон П. Методики и основные эксперименты по изучению мозга и поведения. М. -1991. - 399 с. 13. Buresh Ya., Bureshova O., Houston P. Techniques and basic experiments on the study of the brain and behavior. M. -1991. - 399 p.

14. Раевский К. С. Фармакология нейролептиков. М.: Медицина. - 1976. - 271 с. 14. Raevsky KS. Pharmacology of antipsychotics. M .: Medicine. - 1976. - 271 p.

15. РД 42-28-8-89. - С.15-17. 15. RD 42-28-8-89. - S.15-17.

Claims (3)

1. Способ получения фармакологического средства, нормализующего функциональную активность спинного мозга, включающий измельчение ткани спинного мозга убойных сельскохозяйственных животных, ее гидролиз нейтральной протеазой, отделение экстракта от жмыха, выделение низкомолекулярной фракции гидролизата методом ультрафильтрации на мембранах с селективностью 10-15 кДа с последующим выпариванием под вакуумом. 1. A method of obtaining a pharmacological agent that normalizes the functional activity of the spinal cord, including grinding the spinal cord tissue of slaughtered farm animals, its hydrolysis with a neutral protease, separation of the extract from the cake, isolation of the low molecular weight fraction of the hydrolyzate by ultrafiltration on membranes with a selectivity of 10-15 kDa, followed by evaporation under a vacuum. 2. Фармакологическое средство для нормализации функциональной активности спинного мозга, содержащее в качестве активного начала в эффективном количестве целевой продукт, полученный способом по п. 1, и представляющее собой низкомолекулярную фракцию гидролизата спинно-мозговой ткани убойных сельскохозяйственных животных, содержащую комплекс аминокислот в концентрации 2-4 мг/мл и пептидов в концентрации 6-8 мг/мл. 2. A pharmacological agent for normalizing the functional activity of the spinal cord, containing, as an active principle, in an effective amount, the target product obtained by the method according to claim 1, which is a low molecular weight fraction of the hydrolyzate of the spinal cord tissue of slaughter farm animals, containing a complex of amino acids at a concentration of 2 4 mg / ml and peptides at a concentration of 6-8 mg / ml. 3. Способ нормализации функциональной активности спинного мозга, заключающийся в восстановлении метаболизма в двигательных нейронах при дегенеративных изменениях, купировании судорожного синдрома путем применения терапевтически эффективного количества фармакологического средства по п. 2 в дозе 0,1-0,25 мл/кг массы тела в течение 10 дней. 3. A method of normalizing the functional activity of the spinal cord, which consists in restoring the metabolism in motor neurons during degenerative changes, stopping the convulsive syndrome by applying a therapeutically effective amount of a pharmacological agent according to claim 2 at a dose of 0.1-0.25 ml / kg body weight for 10 days.

Images