RU2166332C2 - Bilayer preparations - Google Patents

Abstract

FIELD: medicine, pharmacology, pharmacy. SUBSTANCE: invention relates to bilayer lipid preparation in polar solvent that involves 0.01-90 wt.-%, preferably 0.1-50 wt.-%, material forming a bilayer. The above mentioned material forming bilayer is galactolipid material from cereals containing at least 50% of digalactosyldiacylglycerides and remained part involves other polar lipids. Invention relates to also the pharmaceutical composition involving therapeutically active substance in mixture with the above mentioned bilayer preparation. EFFECT: enhanced resistance, chemical stability of preparations. 12 cl, 2 dwg, 26 ex

Description

Изобретение относится к двуслойным препаратам липидов в полярных растворителях. Такие препараты применимы в качестве носителей активных веществ в фармацевтических композициях, а также при производстве пищевых, косметических и сельскохозяйственных продуктов. The invention relates to bilayer lipid preparations in polar solvents. Such preparations are applicable as carriers of active substances in pharmaceutical compositions, as well as in the manufacture of food, cosmetic and agricultural products.

Натуральные амфифильные липидные наполнители находят лишь ограниченное применение в производстве фармацевтической и косметической продукции. Причинами тому служат недостаток сырья, высокие производственные расходы, а также плохая наполняемость получаемого липидного материала. Natural amphiphilic lipid fillers find only limited use in the manufacture of pharmaceutical and cosmetic products. The reasons for this are the lack of raw materials, high production costs, as well as poor filling of the resulting lipid material.

Среди природных полярных липидов, способных к образованию бислоя, т.е. амфифильных липидов, чаще всего находят применение в фармацевтическом и косметическом производстве фосфолипиды. В связи со своей способностью образовывать двойной слой (бислой) такие полярные липиды могут использоваться для получения различного вида агрегатов и частиц, таких как везикулы и жидкие кристаллы, которые находят применение в различных областях техники. Among natural polar lipids capable of forming a bilayer, i.e. Amphiphilic lipids are most often used in the pharmaceutical and cosmetic production of phospholipids. Due to their ability to form a double layer (bilayer), such polar lipids can be used to produce various types of aggregates and particles, such as vesicles and liquid crystals, which are used in various fields of technology.

Однако использование липидных гелей фосфолипидной природы ограничено только фармацевтической технологией, в основном, в связи с их недостаточной гелеобразуюцей способностью и слабой химической стабильностью. Фосфатидилхолин из яичного желтка или соевых бобов как наиболее часто используемый натуральный липид, образующий двойной слой (бислой), обладает лишь незначительной липофильностью для оптимального набухания в воде и образования гибких двойных слоев (бислоев), построенных из жидких кристаллических ламеллярных структур. However, the use of lipid gels of a phospholipid nature is limited only by pharmaceutical technology, mainly due to their insufficient gel-forming ability and poor chemical stability. Phosphatidylcholine from egg yolk or soybeans, as the most commonly used natural lipid, forming a double layer (bilayer), has only slight lipophilicity for optimal swelling in water and the formation of flexible double layers (bilayers) built from liquid crystalline lamellar structures.

Поскольку липосомы представляют собой дисперсии бислойной или ламеллярной фаз в избытке водного раствора, способ использования ламеллярных фаз фосфолипидной природы через образование липосом не является оптимальным. Процедура набухания протекает медленно, и образование липосом и везикул из фосфолипидного материала в течение подходящего периода времени требует высоких затрат механической энергии. Since liposomes are dispersions of a bilayer or lamellar phase in excess of an aqueous solution, the method of using the lamellar phases of a phospholipid nature through the formation of liposomes is not optimal. The swelling procedure is slow, and the formation of liposomes and vesicles from phospholipid material for a suitable period of time requires high expenditures of mechanical energy.

Натуральные фосфолипиды, такие как фосфатидилхолин из яичного желтка, являются высоконенасыщенными веществами. А ненасыщенность ацильных цепей фосфолипида служит условием образования жидкой кристаллической ламеллярной фазы при комнатной температуре. Кроме того, это означает, что двуслойные мембраны, образуемые натуральными фосфолипидами, обладают высокой проницаемостью для водорастворимых лекарств, поскольку ацильные цепи находятся в неупорядоченном жидком состоянии. Липосомы, образованные из натуральных фосфолипидов, характеризуются низкой капсулирующей эффективностью в связи с протеканием включенного лекарственного средства через липосомные бислои. Обычно, если проводят включение лекарственных средств в натуральные фосфолипидные липосомы, их следует стабилизировать добавлением большого количества холестерина в количестве 30-50 мол.% от общего состава липидной композиции. Natural phospholipids, such as egg yolk phosphatidylcholine, are highly unsaturated. And the unsaturation of the acyl chains of the phospholipid is a condition for the formation of a liquid crystalline lamellar phase at room temperature. In addition, this means that the bilayer membranes formed by natural phospholipids have high permeability to water-soluble drugs, since the acyl chains are in a disordered liquid state. Liposomes formed from natural phospholipids are characterized by low encapsulating efficiency due to the flow of the incorporated drug through liposomal bilayers. Usually, if drugs are included in natural phospholipid liposomes, they should be stabilized by adding large amounts of cholesterol in an amount of 30-50 mol% of the total composition of the lipid composition.

Все сказанное справедливо также в отношении иных активных веществ, не лекарств, которые также по различным соображениям могут включаться в липосомы или другие двуслойные структуры. All of the above is also true for other active substances, not drugs, which can also be included in liposomes or other two-layer structures for various reasons.

Везикулы и липосомы фосфолипидной природы имеют обычно очень короткое время жизни после введения их в ток крови. Vesicles and liposomes of a phospholipid nature usually have a very short lifetime after their introduction into the blood stream.

Быстрое выведение из крови связано с поглощением их ретикуло-эндотелиальной системой (РЭС) печени и селезенки. Чтобы обойти это затруднение, липосомы следует стерически стабилизовать добавлением ганглиозидов, содержащих несколько углеводных единиц, или гидрофильных полимеров, таких как полиэтиленоксид или пуллулан. Последние агенты обычно связывают ковалентно с фосфатидилэтаноламином. В принципе такой подход является очень эффективным, поскольку модифицированные липосомы могут избежать поглощения РЭС. Однако практическая реализация этого способа сопряжена с недостатками как экономического характера, так и с точки зрения безопасности, связанными с необходимостью вносить в липосомную формулу дополнительные компоненты либо натуральные и редкие, что приводит к его удорожанию, либо синтетические, которые не всегда являются биологически совместимыми. Rapid elimination from the blood is associated with the absorption of their liver and spleen by the reticuloendothelial system (RES). To circumvent this difficulty, liposomes should be sterically stabilized by the addition of gangliosides containing several carbohydrate units or hydrophilic polymers such as polyethylene oxide or pullulan. The latter agents are usually covalently bound to phosphatidylethanolamine. In principle, this approach is very effective, since modified liposomes can avoid the absorption of RES. However, the practical implementation of this method is associated with shortcomings both of an economic nature and from a safety point of view related to the need to add additional components, either natural or rare, to the liposome formula, which leads to its cost increase, or synthetic, which are not always biologically compatible.

Использование фосфолипидов и других полярных липидов для получения жидких кристаллов и липосом хорошо известно. The use of phospholipids and other polar lipids to produce liquid crystals and liposomes is well known.

Патент EP-B1-0126751 раскрывает композицию с контролируемым высвобождением, которая может включать амфифильное вещество, относящееся, в частности, к галактолипидам, фосфолипидам и моноглицеридам. Упомянутый патент относится к кубическим и обратимым гексагональным жидким кристаллическим фазам, стабильным при избытке водного раствора. Patent EP-B1-0126751 discloses a controlled release composition, which may include an amphiphilic substance, in particular galactolipids, phospholipids and monoglycerides. The mentioned patent relates to cubic and reversible hexagonal liquid crystalline phases, stable with an excess of aqueous solution.

Другой патент (WO 91/11993) раскрывает спиртово-водную фосфолипидную композицию гелевого типа. Спирт представлен этанолом, 1-пропанолом или 2-пропанолом. Содержание фосфолипидов варьирует от 15 до 30 вес.%. Кроме того, в патенте раскрывается использование фосфолипидной композиции для приготовления липосом при разбавлении водным раствором, а также гельсодержащих препаратов местного действия. Another patent (WO 91/11993) discloses a gel-type alcohol-aqueous phospholipid composition. The alcohol is ethanol, 1-propanol or 2-propanol. The content of phospholipids varies from 15 to 30 wt.%. In addition, the patent discloses the use of a phospholipid composition for the preparation of liposomes when diluted with an aqueous solution, as well as local gel preparations.

Патент WO 91/04013 раскрывает гибридные низколамеллярные липидные везикулы, содержащие в липидных бислоях фосфо- или гликолипид и неионное, анионное или цвиттер-ионное поверхностно-активное вещество. К предпочтительным гликолипидам относятся цереброзиды, ганглиозиды и сульфатиды, каждое из которых принадлежит к семейству гликосфинголипидов. Patent WO 91/04013 discloses hybrid low-lamellar lipid vesicles containing phospho or glycolipid and non-ionic, anionic or zwitterionic surfactants in lipid bilayers. Preferred glycolipids include cerebrosides, gangliosides and sulfatides, each of which belongs to the glycosphingolipid family.

Гликозилглицериды представляют собой вид гликолипидов, которые, как известно, входят в состав клеточных мембран растений. Наиболее распространены два таких типа, построенных на основе галактозы: моногалактозилдиацилглицерин - МГДГ (MGDG) и дигалактозилдиацилглицерин - ДГДГ (DGDG), которые составляют до 40% сухого веса тилакоидных мембран. Glycosyl glycerides are a type of glycolipids that are known to be part of the cell membranes of plants. The two most common types based on galactose are most common: monogalactosyldiacylglycerol - MGDG (MGDG) and digalactosyldiacylglycerol - DGDG (DGDG), which make up to 40% of the dry weight of thylakoid membranes.

Растительные гликолипиды несут углеводные единицы, в основном галактозные, связанные с глицерином. В МГДГ 1-я позиция галактозного кольца соединяется β- связью с глицерином, а в ДГДГ между сахарами имеется α,1→6 связь. Минорная составляющая представлена растительным сульфолипидом, называемым более точно сульфохиновозилдиацилглицерином - СХДГ (SQDG), который содержит скорее сульфонатную, а не гидроксильную группу, которая связывается с 6-м атомом углерода терминирующего дезоксиглюкозного остатка. Большая часть растительных гликолипидов может быть описана основной формулой

где R₁ и R₂ независимо друг от друга являются насыщенными или ненасыщенными остатками жирной кислоты, содержащей 2-24 атома углерода и 0-6 двойных связей, этерифицированных оксикислотами, что дает эстолиды или водород; углевод представляет собой моносахаридную единицу; n = 1-5; и R₃ обозначает гидроксильную или сульфонатную группу.Plant glycolipids carry carbohydrate units, mainly galactose, associated with glycerol. In MGDG, the 1st position of the galactose ring is linked by a β-bond with glycerol, and in DDG there is an α, 1 → 6 bond between sugars. The minor component is represented by a plant sulfolipid, more precisely called sulfoquinovosyldiacylglycerol - SQDG, which contains a sulfonate rather than a hydroxyl group that binds to the 6th carbon atom of the terminating deoxyglucose residue. Most plant glycolipids can be described by the basic formula

where R ₁ and R ₂ independently from each other are saturated or unsaturated fatty acid residues containing 2-24 carbon atoms and 0-6 double bonds esterified with hydroxy acids to give estolides or hydrogen; a carbohydrate is a monosaccharide unit; n is 1-5; and R ₃ is a hydroxyl or sulfonate group.

В исследованиях взаимодействия гликозилглицеридов с водой и другими полярными растворителями авторы неожиданно обнаружили, что специфический гликолипидный материал из злаковых характеризуется такими особенностями, которые упрощают использование упомянутого материала в качестве носителя, в первую очередь в случае фармацевтических композиций, но также и для приготовления других препаратов, в частности, косметического, сельскохозяйственного, диетического и пищевого назначения. In studies of the interaction of glycosyl glycerides with water and other polar solvents, the authors unexpectedly found that specific cereal glycolipid material is characterized by features that simplify the use of the material as a carrier, primarily in the case of pharmaceutical compositions, but also for the preparation of other drugs, in particular, cosmetic, agricultural, dietary and food purposes.

Хорошо известно, что липиды злаковых могут взаимодействовать с водой в связи с наличием в них в относительно высокой пропорции полярных компонентов с образованием ламеллярной жидкой кристаллической фазы (G. Jayasinghe et al. , J. Disp. Sci. Technol., 1991, vol. 12, 443-451). It is well known that cereal lipids can interact with water due to the presence of a relatively high proportion of polar components in them with the formation of a lamellar liquid crystalline phase (G. Jayasinghe et al., J. Disp. Sci. Technol., 1991, vol. 12 , 443-451).

В документе SE 9400368-8 раскрывается промышленно применимый способ получения из растений, преимущественно из злаковых, гликолипидного материала, с применением экстракции и хроматографического разделения. Приготовленный таким образом гликолипидный материал может быть затем использован в качестве амфифильного материала в производстве фармацевтических средств, косметики и пищевой продукции. SE 9400368-8 discloses an industrially applicable method for producing from plants, mainly from cereals, glycolipid material, using extraction and chromatographic separation. The glycolipid material thus prepared can then be used as an amphiphilic material in the manufacture of pharmaceuticals, cosmetics and food products.

Изобретение относится к двуслойному липидному препарату в полярном липидном растворителе, состоящем на 0.01-90 вес.%, предпочтительно на 0.1-50 вес. %, из образующего двойной слой (бислой) материала в полярном растворителе, который отличается тем, что упомянутый образующий двойной слой материал представляет собой галактолипидный материал из злаковых, состоящий по меньшей мере на 50% из дигалактозилдиацилглицеринов, а остаток заполнен другими полярными липидами. The invention relates to a bilayer lipid preparation in a polar lipid solvent, consisting of 0.01-90 wt.%, Preferably 0.1-50 wt. %, from a bilayer-forming material in a polar solvent, which is characterized in that said bilayer-forming material is a cereal galactolipid material, consisting of at least 50% digalactosyldiacylglycerols, and the remainder is filled with other polar lipids.

В предпочтительном препарате галактолипидный материал состоит примерно на 70-80% из дигалактозилдиацилглицеринов, а на 20-30% из других полярных липидов. In a preferred preparation, the galactolipid material consists of about 70-80% of the digalactosyldiacylglycerols, and 20-30% of the other polar lipids.

В другом предпочтительном препарате галактолипидный материал состоит вплоть до 100% из дигалактозилдиацилглицеринов. In another preferred preparation, the galactolipid material consists up to 100% of digalactosyldiacylglycerols.

Дигалактозилдиацилглицерины могут быть описаны общей формулой

где R₁ и R₂ независимо друг от друга являются насыщенными или ненасыщенными остатками жирной кислоты, содержащей 10-22 атома углерода и 0-4 двойных связей или водород; и R₃ обозначает гидроксильную или сульфонатную группу.Digalactosyldiacylglycerols can be described by the general formula

where R ₁ and R ₂ independently from each other are saturated or unsaturated fatty acid residues containing 10-22 carbon atoms and 0-4 double bonds or hydrogen; and R ₃ is a hydroxyl or sulfonate group.

В качестве предпочтительных жирнокислотных остатков, обозначаемых R₁ и R₂, можно упомянуть натуральные ацильные группы жирных кислот, такие, например, как остатки насыщенных пальмитиновой (C₁₅H₃₁CO; 16:0) и стеариновой кислот (C₁₇H₃₅CO; 18:0); мононенасыщенной олеиновой кислоты (C₁₇H₃₃CO; 18: 1); и полиненасыщенных линолевой (C₁₇H₃₁CO; 18: 2) и линоленовой кислот (C₁₇H₂₉CO; 18: 3). Остатки жирных кислот могут также включать оксикислоты, соединенные с глицериновой частью через гидроксильные группы, этерифицированные другими жирными кислотами, так называемые эстолиды.As the preferred fatty acid residues designated R ₁ and R ₂ , mention may be made of natural acyl groups of fatty acids, such as, for example, saturated palmitic (C ₁₅ H ₃₁ CO; 16: 0) and stearic acid (C ₁₇ H ₃₅ CO; 18: 0); monounsaturated oleic acid (C ₁₇ H ₃₃ CO; 18: 1); and polyunsaturated linoleic (C ₁₇ H ₃₁ CO; 18: 2) and linolenic acids (C ₁₇ H ₂₉ CO; 18: 3). Fatty acid residues may also include hydroxy acids linked to the glycerol moiety through hydroxyl groups esterified with other fatty acids, so-called estolides.

Другие полярные липиды, входящие в состав галактолипидного материала, представляют собой смесь различных глико- и фосфолипидов, таких, как МГДГ и фосфатидилхолины. Состав их зависит от исходного материала и способа производства галактолипидов. Other polar lipids that make up the galactolipid material are a mixture of various glyco- and phospholipids, such as MGDG and phosphatidylcholines. Their composition depends on the starting material and the method of production of galactolipids.

Конкретное соотношение компонентов в галактолипидном материале не является существенным для настоящего изобретения, поскольку содержание ДГДГ составляет не менее 50%. Однако при использовании в различных целях максимальный эффект достигается при высоком содержании ДГДГ как наиболее важного компонента, формирующего бислой. The specific ratio of components in the galactolipid material is not essential for the present invention, since the content of DGDG is not less than 50%. However, when used for various purposes, the maximum effect is achieved with a high content of DGDG as the most important bilayer forming component.

Галактолипидный материал может быть проэкстрагирован практически из любого вида растительного материала. Предпочтительным растительным материалом являются семена и зерна из зерновых и злаковых, например из пшеницы, ржи, овса, кукурузы, риса, проса и кунжута. Овсяная крупа и пшеничная клейковина характеризуются высокой концентрацией липида и поэтому они очень хорошо подходят для настоящего способа получения. Дигалактозилдиацилглицерины в галактолипидном материале также могут, если это применимо, иметь синтетическое происхождение. Galactolipid material can be extracted from almost any type of plant material. Preferred plant material is seeds and grains from cereals and cereals, for example from wheat, rye, oats, corn, rice, millet and sesame. Oatmeal and wheat gluten are characterized by a high concentration of lipid and therefore they are very well suited for the present production method. The digalactosyldiacylglycerols in the galactolipid material can also, if applicable, be of synthetic origin.

Галактолипидный материал может использоваться как полярный липидный компонент в различных упорядоченных растворах, где липид образует упорядоченные частицы, диспергированные в разбавленном, смешанном случайным образом растворе, включающем такие полярные растворители, как вода, этанол, глицерин и другие полярные растворители и их смеси. Молекулярная геометрия ДГДГ напоминает усеченный конус, что делает возможным образование гибких бислоев, представляющих собой в водных растворах в физиологических условиях ламеллярные жидкие кристаллические фазы и липосомы или везикулы. The galactolipid material can be used as a polar lipid component in various ordered solutions, where the lipid forms ordered particles dispersed in a diluted, randomly mixed solution, including polar solvents such as water, ethanol, glycerol and other polar solvents and mixtures thereof. The molecular geometry of the DGDG resembles a truncated cone, which makes it possible to form flexible bilayers, which in aqueous solutions under physiological conditions are lamellar liquid crystalline phases and liposomes or vesicles.

Галактолипиды могут включать большое количество полярного растворителя, такого как вода, что сопровождается набуханием. Добавление воды к галактолипидам приводит к спонтанному образованию прозрачного вязкого геля. Гель состоит из ламеллярной жидкой кристаллической фазы - L_a, в которой липидные бислои чередуются с водой в ламеллярной структуре. L_a-фаза, легко выявляемая в поляризационном световом микроскопе, термодинамически стабильна.Galactolipids may include a large amount of a polar solvent, such as water, which is accompanied by swelling. The addition of water to galactolipids leads to the spontaneous formation of a transparent viscous gel. The gel consists of a lamellar liquid crystalline phase - L _a , in which lipid bilayers alternate with water in a lamellar structure. The L _a phase, readily detected in a polarizing light microscope, is thermodynamically stable.

Процесс набухания происходит относительно медленно в связи с высокой вязкостью ламеллярной жидкой кристаллической структуры геля; в течение 24 ч медленной агрегации можно приготовить прозрачные гомогенные образцы, содержащие всего 10 вес.% водного раствора. Сразу после своего формирования гель обладает чрезвычайно высокой стабильностью к химической и микробной деградации, что позволяет поддерживать его физическую целостность в течение длительного периода времени. The swelling process is relatively slow due to the high viscosity of the lamellar liquid crystal structure of the gel; within 24 hours of slow aggregation, transparent homogeneous samples containing only 10 wt.% aqueous solution can be prepared. Immediately after its formation, the gel has extremely high stability to chemical and microbial degradation, which allows it to maintain its physical integrity for a long period of time.

Чередующиеся слои галактозилацилглицеринов и полярного растворителя делают структуру геля пригодной для включения в него как липофильных, так и гидрофильных биологически активных веществ. Ламеллярная структура обладает относительно низкой вязкостью при высоких скоростях перемещения, что позволяет инъецировать гель с помощью шприца и тонкой иглы. Препарат может быть использован для введения лекарств в различные участки организма животного и человека. Alternating layers of galactosylacylglycerols and a polar solvent make the gel structure suitable for incorporating both lipophilic and hydrophilic biologically active substances. The lamellar structure has a relatively low viscosity at high speeds, which allows the gel to be injected with a syringe and a thin needle. The drug can be used to administer drugs to various parts of the animal and human body.

Среди полярных растворителей предпочтение отдается биологически совместимым разрешенным для использования в фармацевтических, косметических и пищевых продуктах, таким как вода, этанол, 1-пропанол, 1,2-пропандиол, глицерин и их смеси. Among polar solvents, preference is given to biocompatible approved for use in pharmaceutical, cosmetic and food products, such as water, ethanol, 1-propanol, 1,2-propanediol, glycerin and mixtures thereof.

В своем предпочтительном варианте изобретение относится к гелевым препаратам, включающим 25-90 вес. % галактолипидного материала в полярном растворителе. In a preferred embodiment, the invention relates to gel preparations comprising 25-90 weight. % galactolipid material in a polar solvent.

Гели могут быть легко приготовлены при добавлении полярного растворителя, такого как вода или водный раствор, к сухому галактолипидному материалу с достижением окончательной липидной концентрации в диапазоне 25-90 вес. %. Смеси оставляют для набухания в течение 1-24 ч при комнатной температуре при несильном перемешивании в соответствующем контейнере, т.е. либо в стеклянной колбе, либо в открытом химическом стакане. Гели могут быть приготовлены в стеклянных пробирках при перемешивании палочкой и дальнейшем центрифугировании при комнатной температуре. The gels can be easily prepared by adding a polar solvent, such as water or an aqueous solution, to the dry galactolipid material to achieve a final lipid concentration in the range of 25-90 weight. % The mixture is left to swell for 1-24 hours at room temperature with gentle stirring in an appropriate container, i.e. either in a glass flask or in an open beaker. Gels can be prepared in glass tubes with stirring with a stick and further centrifugation at room temperature.

Гели являются псевдопластиками и характеризуются замечательной стабильностью в отношении своего физического вида и устойчивостью к действию микробов. Вязкости таких гелей незначительно подвергаются влиянию умеренных изменений температуры, поэтому, они могут быть перенесены непосредственно из холодильника в шприц или другое устройство для введения препарата. Gels are pseudoplastics and are characterized by remarkable stability in relation to their physical appearance and resistance to the action of microbes. The viscosities of such gels are not significantly affected by moderate temperature changes, therefore, they can be transferred directly from the refrigerator to a syringe or other device for administering the drug.

Далее показано, что гели настоящего изобретения могут действовать как среда, замедляющая высвобождение активного ингредиента, причем более эффективно, чем гели, полученные на основе фосфолипидов. It is further shown that the gels of the present invention can act as a medium slowing down the release of the active ingredient, more effectively than gels based on phospholipids.

Показано, кроме того, что гели настоящего изобретения могут включать в себя широкий спектр терапевтически активных компонентов, в том числе липофильные компоненты, гидрохлориды, нитраты, амфифилы, белки и пептиды. It is further shown that the gels of the present invention may include a wide range of therapeutically active components, including lipophilic components, hydrochlorides, nitrates, amphiphiles, proteins and peptides.

В соответствии с другим предпочтительным вариантом это изобретение относится к липосомальному препарату, содержащему 0.01-25 вес.% галактолипидного материала в полярном растворителе. In another preferred embodiment, this invention relates to a liposome preparation containing 0.01-25 wt.% Galactolipid material in a polar solvent.

Выгодной особенностью, свойственной галактозилацилглицеринам, является наличие галактозных единиц, включающих полярную головную группу в каждой липидной молекуле, которая способна стерически стабилизировать липосомы, обеспечивая таким образом продолжительное время их жизни в кровяном русле. An advantageous feature inherent in galactosylacylglycerols is the presence of galactose units, including a polar head group in each lipid molecule, which is capable of sterically stabilizing liposomes, thus ensuring their long life in the bloodstream.

Липосомы в виде многослойных везикул получают посредством прямой гидратации. К сухому галактолипидному материалу добавляют полярный растворитель, такой как вода или водный раствор, что приводит к достижению конечных концентраций липида в диапазоне 0.01-25 вес.%. Смеси оставляют для набухания и уравновешивания при комнатной температуре при несильном перемешивании в течение 1-24 ч, получая в результате липосомальную дисперсию. Липосомы могут быть также приготовлены при добавлении избытка полярного растворителя к гелю, полученному в соответствии с вышеизложенным, т.е. просто при разбавлении геля. Liposomes in the form of multilayer vesicles are obtained by direct hydration. A polar solvent, such as water or an aqueous solution, is added to the dry galactolipid material, resulting in final lipid concentrations in the range of 0.01-25 wt.%. The mixture was left to swell and balance at room temperature with gentle stirring for 1-24 hours, resulting in a liposomal dispersion. Liposomes can also be prepared by adding an excess of polar solvent to the gel obtained in accordance with the foregoing, i.e. just by diluting the gel.

Однослойные везикулы получают дисперсией многослойных везикул, т.е. с помощью экструзии через мембраны или гомогенизации под высоким давлением. Unilamellar vesicles are prepared by dispersion of multilayer vesicles, i.e. by membrane extrusion or high pressure homogenization.

Необычная и неожиданная способность галактолипидного материала к набуханию позволяет очень легко готовить на его основе липосомальные дисперсии и водные гели. Так, например, возможность спонтанного образования в воде липосом неожиданно оказалась весьма полезной для приготовления липосомальных дисперсий даже в крупных масштабах. Эта процедура заметно отличается от тех, которые необходимы для образования липосом из фосфолипидов, где используются органические растворители, такие как хлороформ, эфир, этанол или их комбинация. Хорошо известны проблемы, возникающие при перенесении обычной процедуры получения липосомальных препаратов в крупномасштабное производство, для решения которых разрабатывалось множество вариантов. Настоящее изобретение предлагает простой и воспроизводимый способ получения липосомальных дисперсий, важность которого особенно возрастает при практическом применении липосом, например в качестве носителей при изготовлении лекарственных средств. The unusual and unexpected ability of the galactolipid material to swell makes it very easy to prepare liposomal dispersions and aqueous gels on its basis. For example, the possibility of spontaneous formation of liposomes in water unexpectedly proved to be very useful for preparing liposome dispersions even on a large scale. This procedure differs markedly from those necessary for the formation of liposomes from phospholipids where organic solvents such as chloroform, ether, ethanol, or a combination thereof are used. The problems that arise during the transfer of the usual procedure for producing liposomal preparations into large-scale production are well known, for the solution of which many options were developed. The present invention provides a simple and reproducible method for producing liposomal dispersions, the importance of which is especially increased in the practical use of liposomes, for example, as carriers in the manufacture of medicines.

Было показано, что липосомы настоящего изобретения характеризуются неожиданно высокой инкапсулирующей эффективностью. It was shown that the liposomes of the present invention are characterized by unexpectedly high encapsulating efficiency.

Кроме того, было показано, что липосомы настоящего изобретения обладают удивительной ярко выраженной способностью увеличивать время жизни активного ингредиента даже в том случае, если везикулы создавались в растворе этих компонентов, и, таким образом, только часть упомянутых компонентов инкапсулируeтся в везикулы. In addition, it was shown that the liposomes of the present invention have an amazingly pronounced ability to increase the lifetime of the active ingredient even if the vesicles were created in a solution of these components, and thus only a part of the mentioned components are encapsulated in the vesicles.

Было показано далее, что липосомы настоящего изобретения снижают токсичность мощного противоракового препарата без снижения его фармакологического эффекта. It was further shown that the liposomes of the present invention reduce the toxicity of a powerful anti-cancer drug without reducing its pharmacological effect.

Липосомы настоящего изобретения обладают биоадгезивным свойством и могут в этой связи быть полезными для решения проблемы адекватной доступности включенного активного компонента к определенным биологическим поверхностям, таким как роговица и слизистая оболочка. The liposomes of the present invention have a bioadhesive property and may therefore be useful in solving the problem of adequate accessibility of the incorporated active component to certain biological surfaces, such as the cornea and mucous membrane.

Липосомы настоящего изобретения могут заключать в себя активные компоненты в очень широком диапазоне, в том числе липофильные компоненты, гидрохлориды, нитраты, амфифилы, белки, пептиды и др. The liposomes of the present invention can comprise active components in a very wide range, including lipophilic components, hydrochlorides, nitrates, amphiphiles, proteins, peptides, etc.

В соответствии с настоящим изобретением могут использоваться синтетические дигликозилдиацилглицерины, полученные на основе галактозы или любой другой моносахаридной единицы, такой как глюкоза, а также натуральные гликозилглицериды, которые могут быть выделены из любых источников и основаны на других углеводных единицах, отличных от галактозы, например на глюкозе. Synthetic diglycosyl diacylglycerols derived from galactose or any other monosaccharide unit such as glucose, as well as natural glycosyl glycerides that can be isolated from any source and based on other carbohydrate units other than galactose, such as glucose, can be used in accordance with the present invention. .

Галактолипидный материал
Галактолипидный материал получают из различных злаковых культур по приведенному ниже способу и используют далее для приготовления препаратов и фармацевтических композиций настоящего изобретения, как это показано в примерах. В описании % обозначает весовой %, если особо не оговорено иное. Пропорция растворителей в смесях растворителей указывается в объемных частях.Galactolipid material
Galactolipid material is obtained from various cereals according to the following method and is used further for the preparation of preparations and pharmaceutical compositions of the present invention, as shown in the examples. In the description,% means weight%, unless otherwise specified. The proportion of solvents in solvent mixtures is indicated in volume parts.

Галактолипидный материал из овса
200 кг овсяного зерна (Kungsornen AB, Швеция) размалывают и экстрагируют с помощью 1000 л 95%-ного этанола при температуре 70^oC в течение 3 ч в экстракторе при перемешивании. Шлам центрифугируют в теплом состоянии и отделяют от твердых частиц. Жидкую фракцию выпаривают при температуре 60^oC, получая около 10 кг светло-коричневого масла.Galactolipid material from oats
200 kg of oat grain (Kungsornen AB, Sweden) are ground and extracted with 1000 l of 95% ethanol at a temperature of 70 ^o C for 3 hours in an extractor with stirring. The sludge is centrifuged in a warm state and separated from solid particles. The liquid fraction is evaporated at a temperature of 60 ^o C, receiving about 10 kg of a light brown oil.

Масло наносят на колонку из нержавеющей стали с 6.25 кг силикагеля [Матрекс Силика Si (Matrex Silica Si), размер частиц 20-45 мм, размер пор 60

, получен от Амикон Корп., США]. Температура колонки составляет 50^oC. Затем для удаления всех неполярных липидов колонку промывают 30 л смеси гексан: изопропанол, 90:10.The oil is applied to a stainless steel column with 6.25 kg of silica gel [Matrex Silica Si (Matrex Silica Si), particle size 20-45 mm, pore size 60

, obtained from Amicon Corp., USA]. The column temperature is 50 ^° C. Then, to remove all non-polar lipids, the column is washed with 30 L of a mixture of hexane: isopropanol, 90:10.

Галактолипидный материал элюируют с колонки с помощью 20 л смеси гексан: изопропанол, 60: 40 с получением дигалактозилдиацилглицериновой фракции. Выпаривание этой фракции дает примерно 700 г ДГДГ - основного класса липидов. Затем галактолипидный материал диспергируют в воде и подвергают лиофильной сушке, получая непылящий порошок. The galactolipid material was eluted from the column using a 20 L hexane: isopropanol 60:40 mixture to give a digalactosyl diacylglycerol fraction. Evaporation of this fraction gives approximately 700 g of DGDG, the main class of lipids. Then the galactolipid material is dispersed in water and freeze-dried to obtain a non-dusting powder.

Обогащение ДГДГ из галактолипидов
50 г галактолипидов, полученных из овса, как описано выше, которые имеют содержание ДГДГ около 70%, растворяют в 250 мл смеси гексана:изопропанола, 70: 30, до конечного объема 300 мл. Полученный раствор вносят на колонку с силикагелем (110 г) и элюируют менее полярные составляющие 1 л смеси гексана: изопропанола, 70: 30. Обогащенную ДГДГ фракцию элюируют 2 л ацетона. Ацетоновую фракцию выпаривают и высушивают при температуре ниже 0^oC. Получают 17 г практически чистого ДГДГ продукта.Enrichment of DGDG from galactolipids
50 g of galactolipids obtained from oats, as described above, which have a DHDG content of about 70%, are dissolved in 250 ml of a mixture of hexane: isopropanol, 70: 30, to a final volume of 300 ml. The resulting solution was applied to a silica gel column (110 g) and the less polar components of 1 L of a mixture of hexane: isopropanol, 70: 30 were eluted. The fraction enriched in DGDG was eluted with 2 L of acetone. The acetone fraction is evaporated and dried at a temperature below 0 ^° C. 17 g of substantially pure DGDG product are obtained.

Гидрогенизация галактолипидов
200 г галактолипидной смеси, полученной из овса описанным выше методом, растворяют в 2 л теплого изопропанола. На дно находящегося под давлением реактора [модель N 4552М; Парр Инструментc Ко., США (Parr Instruments Co.)], снабженного двумя ручками на лопастях мешалки, помещают 15 г катализатора палладия на угле [Pd 15%, влажность 53%, Энгельгардт, Рим, Италия (Engelhardt Rome s.r.i.)]. После этого раствор переносят в герметично закрытый реактор, в котором создана атмосфера азота, для снижения опасности возгорания. Реакционный сосуд герметично закрывают и вначале трижды пропускают под давлением азот для удаления остатков воздуха, а затем также трижды под давлением пропускают водород [Плас 4.5, от АГА Газ АБ, Швеция (Plus 4.5, AGA Gas AB)]. Давление водорода поддерживают на уровне 6 бар, мешалку ставят на отметку 600 об/мин и нагревают смесь до температуры 70^oC. Требуется 14 мин для того, чтобы реакционная смесь приняла нужную температуру. Процесс гидрогенизации проводят в течение 6 ч, после чего реакционный продукт фильтруют через фильтр с размером пор 0.45 мкм для удаления частиц угля и палладия. Растворитель выпаривают в роторном испарителе, остаточный материал диспергируют в 1600 мл деионизированной воды и лиофильно высушивают.Hydrogenation of galactolipids
200 g of the galactolipid mixture obtained from oats by the method described above are dissolved in 2 l of warm isopropanol. At the bottom of a pressurized reactor [model N 4552М; Parr Instruments Co., USA (Parr Instruments Co.)], equipped with two handles on the agitator blades, placed 15 g of palladium-carbon catalyst on coal [Pd 15%, humidity 53%, Engelhardt, Rome, Italy (Engelhardt Rome sri)]. After that, the solution is transferred to a hermetically sealed reactor in which a nitrogen atmosphere is created to reduce the risk of fire. The reaction vessel is sealed and, first, nitrogen is passed three times under pressure to remove air residues, and then hydrogen is also passed three times under pressure [Plas 4.5, from AGA Gas AB, Sweden (Plus 4.5, AGA Gas AB)]. The hydrogen pressure is maintained at 6 bar, the stirrer is set at 600 rpm and the mixture is heated to a temperature of 70 ^o C. It takes 14 minutes for the reaction mixture to reach the desired temperature. The hydrogenation process is carried out for 6 hours, after which the reaction product is filtered through a filter with a pore size of 0.45 μm to remove particles of coal and palladium. The solvent is evaporated in a rotary evaporator, the residual material is dispersed in 1600 ml of deionized water and freeze-dried.

Выход гидрогенизированных галактолипидов после фильтрации и лиофильной сушки составляет 155 г. Процесс гидрогенизации отслеживают с помощью газовой хроматографии; в гидрогенизированном продукте обнаруживаются только насыщенные жирные кислоты. The yield of hydrogenated galactolipids after filtration and freeze drying is 155 g. The hydrogenation process is monitored by gas chromatography; only saturated fatty acids are found in the hydrogenated product.

Галактолипиды из клейковины пшеницы
1 кг порошка пшеничной клейковины [АБ Сканебраннерир

Швеция] экстрагируют 4 л 95%-ного этанола в химическом стакане при температуре 70^oC в течение 3 ч. Затем под давлением 400-500 кПа отфильтровывают шламм, а отфильтрованный жмых промывают 1 л теплого 95%-ного этанола. Объединенные этанольные фракции выпаривают при температуре максимум 60^oC с получением 60 г масла желтого цвета.Wheat Gluten Galactolipids
1 kg of wheat gluten powder [AB Skanebrunnerir

Sweden] extracted with 4 l of 95% ethanol in a beaker at a temperature of 70 ^o C for 3 hours. Then, the sludge is filtered off at a pressure of 400-500 kPa, and the filtered cake is washed with 1 l of warm 95% ethanol. The combined ethanol fractions were evaporated at a maximum temperature of 60 ^° C. to give 60 g of a yellow oil.

Масло наносят на колонку из нержавеющей стали, содержащую 45 г силикагеля [Матрекс Силика Si (Matrex Silica Si), размер частиц 20-45 мкм, размер пор 60

, получен от Амикон Корп., США]. Затем колонку промывают 700 мл смеси гексан:изопропанол, 90:10, для удаления нейтральных липидов.The oil is applied to a stainless steel column containing 45 g of silica gel [Matrex Silica Si (Matrex Silica Si), particle size 20-45 μm, pore size 60

, obtained from Amicon Corp., USA]. The column is then washed with 700 ml of a mixture of hexane: isopropanol, 90:10, to remove neutral lipids.

Для удаления МГДГ и ряда других полярных липидов колонку последовательно промывают 1000 мл смеси гексан:изопропанол, 70:30. Элюцию ДГДГ осуществляют с помощью 1000 мл чистого ацетона. После выпаривания получают примерно 4 г практически чистого продукта ДГДГ. To remove MHD and a number of other polar lipids, the column is washed successively with 1000 ml of a mixture of hexane: isopropanol, 70:30. The elution of DGDG is carried out using 1000 ml of pure acetone. After evaporation, approximately 4 g of the practically pure DGDG product are obtained.

Галактолипиды из ржи
100 г ржаных хлопьев [Кунгсëрнен АБ (Kungsörnen AB), Швеция] перемешивают в течение 60 мин в смеси промышленного гексана и изопропанола, 90:10. Шламм отфильтровывают и выпаривают с получением 0.5 г полярных липидов. Остаток, растворенный в 10 мл смеси гексана и изопропанола, 70:30, вносят на серию трех колонок с силикагелем [Сеп-пак Силика плас (Seppak Silica plus) Миллипор Корп., США], промывают 20 мл той же смеси растворителей и элюируют 15 мл ацетона. Элюат выпаривают и лиофильно сушат, получая 47 мг галактолипидов.Galactolipids from rye
100 g of rye flakes [Kungsörnen AB, Sweden] is stirred for 60 minutes in a mixture of industrial hexane and isopropanol, 90:10. The sludge is filtered off and evaporated to give 0.5 g of polar lipids. The residue dissolved in 10 ml of a mixture of hexane and isopropanol, 70:30, is applied to a series of three columns with silica gel [Sep-Pak Silica Plaza (Seppak Silica plus) Millipore Corp., USA], washed with 20 ml of the same mixture of solvents and eluted 15 ml of acetone. The eluate was evaporated and freeze-dried to obtain 47 mg of galactolipids.

Химические и физические характеристики различных галактолипидных материалов
Анализ на принадлежность к липидному классу
Анализ на принадлежность к липидному классу проводят с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии - ВЭЖХ, используя колонку, наполненную силикагелем, модифицированную с помощью диола (ЛИКросфер 100 ДИОЛ, 5 мкм, 250 х 4 мм - внутр. диам., Е. Мерк, Германия). Колонку помещают в водяную баню с температурой 75^oC. Аналитическая система состоит из насоса ВЭЖХ СМ 4000 [LDC/Милтон Рой (LDC/Milton Roy), США] и инжектора, модель 7125, снабженного инъекционной петлей размером 20 мкм [Реодин Инк. (Rheodyne Inc.), США] . Используют испарительный светорассеивающий детектор Седекс 45 (Sedex, S.E.D.E.R.E, Франция), снабженный камерой для распыления Седекс 55, установленной на показания температуры и давления воздуха на входе в пределах соответственно 97^oC и 2.0 бар.Chemical and physical characteristics of various galactolipid materials
Lipid Class Analysis
The analysis of belonging to the lipid class is carried out using high-performance liquid chromatography - HPLC using a column filled with silica gel, modified with a diol (Lycrosphere 100 DIOL, 5 μm, 250 x 4 mm - inner dia., E. Merck, Germany). The column was placed in a 75 ^° C water bath. The analytical system consists of a CM 4000 HPLC pump [LDC / Milton Roy, USA] and an injector model 7125 equipped with an injection loop of 20 μm [Reodin Inc. (Rheodyne Inc.), USA]. A Cedex 45 vapor-diffusing light detector (Sedex, SEDERE, France) is used, equipped with a Cedex 55 atomization chamber, which is set to read inlet temperature and air pressure between 97 ^° C and 2.0 bar, respectively.

В ходе анализа скорость протекания движущейся фазы составляет 1 мл/мин. Градиент бинарного растворителя поддерживается линейным в течение 25 мин, затем его меняют, начиная со 100% A и кончая 100% Б, где А = гексан:изопропанол: н-бутанол: тетрагидрофуран: изооктан: вода, 64:20:6:4.5:4.5:1, а Б = изопропанол: н-бутанол: тетрагидрофуран: изооктан:вода, 75:6:4.5:4.5:10. Все растворители содержат ацетат аммония, 180 мг/л. During the analysis, the flow rate of the moving phase is 1 ml / min. The gradient of the binary solvent is maintained linear for 25 minutes, then it is changed from 100% A to 100% B, where A = hexane: isopropanol: n-butanol: tetrahydrofuran: isooctane: water, 64: 20: 6: 4.5: 4.5: 1, and B = isopropanol: n-butanol: tetrahydrofuran: isooctane: water, 75: 6: 4.5: 4.5: 10. All solvents contain ammonium acetate, 180 mg / L.

Сбор и обработка данных были выполнены на системе ГинкоСофт Дата (GynkoSoft Data), версия 4.22 (Софтрон ГмбХ, Германия). В типичном случае инъецируемое количество составляет 100 мкг. Идентификация основана на сравнении времени удерживания исследуемого образца со стандартными препаратами [Карлсхамнс ЛипидТекник АБ (Karlshamns LipidTeknik АВ), Швеция]. Эта система не обнаруживает летучие компоненты. Количественное определение проводят на основании вычисления площади пика. Data collection and processing were performed on the GinkoSoft Data system (GynkoSoft Data), version 4.22 (Softron GmbH, Germany). Typically, the injectable amount is 100 mcg. Identification is based on comparing the retention time of the test sample with standard drugs [Karlshamns LipidTeknik AB (Karlshamns LipidTeknik AB), Sweden]. This system does not detect volatile components. Quantification is based on the calculation of the peak area.

Зета-потенциалы определяют в разбавленных водных дисперсиях галактолипида с помощью прибора Зетасайзер 4, производимого Малверн Инструментc Лтд., Великобритания (Zetasizer 4, Malvern Instruments Ltd.). Zeta potentials are determined in dilute aqueous dispersions of galactolipid using a Zetasizer 4 instrument manufactured by Malvern Instruments Ltd., UK (Zetasizer 4, Malvern Instruments Ltd.).

В табл. 1, как и в табл. 2, использованы следующие сокращения:
о-ГЛ = галактолипиды из овса;
о-г-ГЛ = гидрогенизированные галактолипиды из овса;
о-ДГДГ = обогащенные галактолипиды из овса;
п-ГЛ = галактолипиды из пшеницы;
п-ДГДГ = обогащенные галактолипиды из пшеницы;
р-ГЛ = галактолипиды из ржи.In the table. 1, as in table. 2, the following abbreviations are used:
o-GL = galactolipids from oats;
o-g-GL = hydrogenated oat galactolipids;
o-DGDG = enriched oat galactolipids;
p-GL = galactolipids from wheat;
p-DGDG = enriched galactolipids from wheat;
r-GL = galactolipids from rye.

Анализ жирных кислот
Определение профиля жирных кислот было проведено с помощью газового хроматографа после переэтерификации липидов в метильные эфиры жирных кислот. Указанные эфиры отделяют и анализируют количественно на газовом хроматографе с капиллярной колонкой Вариан 3500 (Varian 3500 Capillary Gas Chromatograph) с использованием в данном случае капиллярной колонки 30 х 0.25 мм - внутр. диам. (DB-WAX, J& W Scientific, США), колоночного инжектора и пламенно-ионизационного детектора. В качестве газа-носителя использовался гелий. Вычисление проводят с помощью системы ГинкоСофт Дата, версия 4.22 (Софтрон ГмбХ, Германия). Переэтерификацию осуществляют при добавлении 1 мг липидного образца к 2 мл смеси диметиловый карбонат:изооктан, 1:1. Добавляют 1 мл раствора, содержащего 2.3 г натрия, растворенного в 200 мл этанола и энергично перемешивают тестируемые пробирки в течение 30 с, оставляя их затем при комнатной температуре на 15 мин для завершения реакции. Добавляют 3 мл воды, перемешивают пробирки с исследуемым соединением, после чего проводят центрифугирование при 2 х g. С соблюдением указанных ниже условий, необходимых для разделения, в хроматограф инъецируют 0.5 мкл органического слоя. Термостатирующее устройство колонки запрограммировано на следующий температурный режим: начальная температура 130^oC (2 мин), в течение следующих 10 мин повышение температуры до 150^oC (со скоростью 30^oC/мин) и до 220^oC (со скоростью 3.2^oC/мин). Температура инжектора составляет 130^oC, а температура детектора составляет 250^oC. Исходный поток газа имеет скорость 2.7 мл/мин. Полученные результаты выражают в виде нормализованных весовых процентов с использованием метода внешнего стандарта. Относительно минорных компонентов, для которых стандарты либо недоступны, либо недостаточно чисты, факторы коррекции отсутствуют.Fatty Acid Analysis
The determination of the profile of fatty acids was carried out using a gas chromatograph after transesterification of lipids into methyl esters of fatty acids. These esters are separated and quantified on a Varian 3500 Capillary Gas Chromatograph gas chromatograph using a capillary column 30 x 0.25 mm in this case, int. diam. (DB-WAX, J & W Scientific, USA), a column injector and a flame ionization detector. Helium was used as the carrier gas. The calculation is carried out using the GinkoSoft Date system, version 4.22 (Softron GmbH, Germany). The transesterification is carried out by adding 1 mg of a lipid sample to 2 ml of a mixture of dimethyl carbonate: isooctane, 1: 1. 1 ml of a solution containing 2.3 g of sodium dissolved in 200 ml of ethanol is added and the test tubes are vigorously stirred for 30 s, then left at room temperature for 15 minutes to complete the reaction. Add 3 ml of water, mix the tubes with the test compound, and then carry out centrifugation at 2 x g. Subject to the following conditions necessary for separation, 0.5 μl of the organic layer is injected into the chromatograph. The column thermostatic device is programmed for the following temperature conditions: initial temperature 130 ^o C (2 min), over the next 10 minutes the temperature rises to 150 ^o C (at a speed of 30 ^o C / min) and up to 220 ^o C (at a speed of 3.2 ^o C / min). The temperature of the injector is 130 ^° C. and the temperature of the detector is 250 ^° C. The feed gas stream has a flow rate of 2.7 ml / min. The results obtained are expressed as normalized weight percent using the external standard method. Regarding minor components for which standards are either unavailable or not clean enough, there are no correction factors.

ЯМР-спектроскопия дигалактозилдиацилглицеринов
На спектрометре Брукер АМ-400 (Bruker АМ-400, от Bruker Analytische Messtechnik GmbH, Германия) записывают одномерный спектр протонного расщепления методом ЯМР для определения естественного распространения ¹³C, при частоте ¹³C, равной 100.614 МГц. Угол подачи импульса составляет 36^o, интервал между повтором импульса равен 1.0 с, а разрешение составляет 1.526 Гц на данную точку. В ходе анализа применяют линию расширения в 3 Гц. Образцы (10-40 мг) разбавляют смесью 730 мкл ДМСО-d₆ [Олдрич Кемикал Корп. (Aldrich Chemical Corp., Inc.), США] и 20 мкл D₂O [Олдрич Кемикал Корп. (Aldrich Chemical Corp., Inc.), США] и переносят в пробирку (внутр. диам. 5 мм) для проведения анализа методом ЯМР (табл. 3).NMR spectroscopy of digalactosyldiacylglycerols
The Bruker AM-400 spectrometer (Bruker AM-400, from Bruker Analytische Messtechnik GmbH, Germany) records a one-dimensional proton splitting NMR spectrum to determine the natural propagation of ¹³ C, at a frequency of ¹³ C, equal to 100.614 MHz. The angle of the pulse is 36 ^o , the interval between repetition of the pulse is 1.0 s, and the resolution is 1.526 Hz at this point. During the analysis, an extension line of 3 Hz is used. Samples (10-40 mg) are diluted with a mixture of 730 μl DMSO-d ₆ [Aldrich Chemical Corp. (Aldrich Chemical Corp., Inc.), USA] and 20 μl of D ₂ O [Aldrich Chemical Corp. (Aldrich Chemical Corp., Inc.), USA] and transferred into a test tube (internal diameter. 5 mm) for analysis by NMR (table. 3).

Примеры
Пример 1
Получение водного геля
Галактолипидный материал, полученный из овса, смешивают с различными количествами воды для того, чтобы определить набухаемость в воде. Водно-липидные образцы готовят в весовых частях в стеклянных пробирках. Образцы попеременно перемешивают палочкой и центрифугируют при комнатной температуре до образования полностью гомогенных систем. После выдерживания при комнатной температуре в течение шести месяцев проводят физическое исследование образцов. Ламеллярную жидкую кристаллическую фазу определяют с помощью световой поляризационной микроскопии. Результаты представлены в табл. 4.Examples
Example 1
Getting water gel
The galactolipid material obtained from oats is mixed with various amounts of water in order to determine the swelling in water. Water-lipid samples are prepared in parts by weight in glass tubes. Samples are alternately mixed with a stick and centrifuged at room temperature until completely homogeneous systems are formed. After aging at room temperature for six months, a physical examination of the samples is carried out. The lamellar liquid crystalline phase is determined using light polarization microscopy. The results are presented in table. 4.

Приведенные данные показывают, что при содержании галактолипида около 25% и выше образуется однофазный гомогенный гель. The data presented show that with a galactolipid content of about 25% and above, a single-phase homogeneous gel is formed.

Пример 2
Вязкие свойства водного геля
По методике примера 1 готовят галактолипидный гель, содержащий 55% воды. Измерения вязкости проводят с помощью реометра Боглин ФОР (Bohlin VOR Reologi АВ, Швеция), снабженного концентрическим цилиндром (C14; вращающий элемент: 91 г/см) при различных скоростях сдвига и температурах. Вязкость измеряют через 24 ч после изготовления. Значения вязкости стационарного потока (в Па•с) приведены в табл. 5.Example 2
Viscous properties of aqueous gel
According to the method of example 1, prepare a galactolipid gel containing 55% water. Viscosity measurements are performed using a Boglin FOR rheometer (Bohlin VOR Reologi AB, Sweden) equipped with a concentric cylinder (C14; rotating element: 91 g / cm) at various shear rates and temperatures. Viscosity is measured 24 hours after manufacture. The values of the viscosity of the stationary flow (in Pa • s) are given in table. 5.

Был сделан вывод о том, что образец является разжижаемым под действием сдвига веществом (псевдопластиком), т.е. его вязкость зависит от скорости сдвига, что демонстрирует реологическое поведение, характерное для ламеллярных жидких кристаллических фаз. Кроме того, увеличение температуры приводит лишь к незначительному снижению вязкости, что указывает на отсутствие фазовых переходов в исследованном температурном диапазоне. После выдерживания геля при комнатной температуре в течение 18 месяцев провели его визуальное обследование. Не отмечался микробный рост. Физический вид при стоянии не претерпел изменений, что удивительно, поскольку не было предпринято каких-либо предосторожностей, связанных с температурой хранения, добавлением антиоксидантов, консервантов и т.д. It was concluded that the sample is a fluidized fluid under the action of shear (pseudoplastic), i.e. its viscosity depends on the shear rate, which demonstrates the rheological behavior characteristic of lamellar liquid crystalline phases. In addition, an increase in temperature leads only to a slight decrease in viscosity, which indicates the absence of phase transitions in the studied temperature range. After maintaining the gel at room temperature for 18 months, it was visually examined. No microbial growth was noted. The physical appearance did not change when standing, which is surprising since no precautions were taken regarding storage temperature, the addition of antioxidants, preservatives, etc.

Приведенные данные демонстрируют превосходную стабильность галактолипидного материала даже в водном окружении, способном вызвать, например, гидролиз ацильных цепей или микробную деградацию. These data demonstrate the excellent stability of the galactolipid material even in an aqueous environment capable of causing, for example, hydrolysis of acyl chains or microbial degradation.

Пример 3
Тестирование высвобождения
In vitro на галактолипидном и фосфолипидном гелях, содержащих в исходном состоянии 60% липида и 50 мМ водорастворимого красителя метиленового синего, определяют высвобождение упомянутого красителя. Галактолипидный материал получают из овса. Фосфолипидный материал представляет собой хроматографически очищенный фосфатидилхолин из соевых бобов (s-PC; Карлсхамнс ЛипидТекник АБ, Швеция). Диффузионная среда представляет собой профильтрованную через мембрану воду, уравновешенную при 37^oC. Диффузионная ячейка состоит из мембранной трубки, выполненной из регенерированной целлюлозы (Спектра/Пор; отрезки с молекулярным весом 6000 - 8000; ширина среза 1.0 см), которая содержит около 2.5 г геля. Трубки погружают в термостатируемый стакан (внутр. диам. 10 см), содержащий 250 г среды при фиксации его положения на расстоянии 3 см от дна. Стакан помещают на магнитную мешалку со скоростью вращения 200 об/мин. В определенные моменты времени отбирают аликвоты среды и исследуют их на спектрофотометре при длине волны 665 нм. В качестве стандарта промеряют также высвобождение метиленового синего из целлюлозной трубки, содержащей 50 мМ водного раствора метиленового синего.Example 3
Release testing
In vitro on the galactolipid and phospholipid gels containing in the initial state 60% lipid and 50 mm water-soluble dye methylene blue, determine the release of the dye. Galactolipid material is obtained from oats. The phospholipid material is chromatographically purified soybean phosphatidylcholine (s-PC; Karlshamns LipidTeknik AB, Sweden). The diffusion medium is membrane filtered water balanced at 37 ^o C. The diffusion cell consists of a membrane tube made of regenerated cellulose (Spectra / Pore; segments with a molecular weight of 6000 - 8000; slice width 1.0 cm), which contains about 2.5 g gel. The tubes are immersed in a thermostatic cup (internal diameter 10 cm) containing 250 g of medium while fixing its position at a distance of 3 cm from the bottom. The beaker is placed on a magnetic stirrer with a rotation speed of 200 rpm. At certain points in time, aliquots of the medium are selected and examined on a spectrophotometer at a wavelength of 665 nm. The release of methylene blue from a cellulose tube containing a 50 mM aqueous solution of methylene blue is also measured as a standard.

По прошествии 2.5 ч не было отмечено заметного высвобождения красителя из галактолипидного геля, тогда как из s-PC геля высвободилось 1.3%. Через 5 ч галактолипидный гель высвободил только 0.13% содержащегося в нем красителя, что было примерно в 12 раз ниже, чем соответствующий показатель для s-PC геля. After 2.5 hours, no noticeable dye release from the galactolipid gel was observed, while 1.3% was released from the s-PC gel. After 5 hours, the galactolipid gel released only 0.13% of the dye contained in it, which was approximately 12 times lower than the corresponding indicator for the s-PC gel.

Приведенные результаты показывают, что для галактолипидного препарата характерно медленное высвобождение биологически активного материала в случае введения его in vivo, и в этой связи он может использоваться как препарат, создающий в организме депо. The above results show that the galactolipid preparation is characterized by a slow release of biologically active material when introduced in vivo, and in this regard, it can be used as a drug that creates a depot in the body.

Пример 4
Тест на высвобождение
На галактолипидном геле, изначально содержащем 60% липидов, 15% ремоксиприда гидрохлорида и 25% воды in vitro проводят тест на высвобождение водорастворимого лекарственного средства - гидрохлорида ремоксиприда моногидрата (Астра АБ, Швеция).Example 4
Release test
On a galactolipid gel, initially containing 60% lipids, 15% remoxipride hydrochloride and 25% water in vitro, a test for the release of a water-soluble drug, remoxipride monohydrate hydrochloride (Astra AB, Sweden), is performed.

Роль диффузной среды выполняет фосфатный буфер (pH 7.4; ионная сила 0.05 М), уравновешенный при температуре 37^oC. Диффузионная ячейка состоит из мембранной трубки, выполненной из регенерированной целлюлозы (Спектра/Пор 3; молекулярный вес отрезка 3.500; ширина среза 1.0 см; длина 4 см), которая содержит около 1 мл геля. Трубку закрывают с обоих концов зажимами и помещают на дно термостатируемой бани для растворения (Сотакс AT 6; внутр. диам. 10 см), содержащей 600 мл фосфатного буфера. Буферный раствор перемешивают с помощью лопастной мешалки со скоростью 50 об/мин. В заданное время отбирают образец для анализа объемом 1 мл. Отобранный образец замещают 1 мл буфера. Концентрацию ремоксиприда определяют посредством жидкостной хроматографии с обращением фаз с использованием колонки м-Бондапак C18 (m-Bondapak C18). Используемый элюент представляет собой смесь фосфатного буфера, pH 1.8 и ацетонитрила, 4: 1. Используют спектрофотометрический детектор, а измерение проводят при длине волны 254 нм.The role of the diffuse medium is played by a phosphate buffer (pH 7.4; ionic strength 0.05 M), balanced at a temperature of 37 ^o C. The diffusion cell consists of a membrane tube made of regenerated cellulose (Spectra / Pore 3; molecular weight of the segment is 3,500; cut width 1.0 cm; length 4 cm), which contains about 1 ml of gel. The tube is closed at both ends with clamps and placed on the bottom of a thermostatic bath for dissolution (Sotax AT 6; internal diameter 10 cm) containing 600 ml of phosphate buffer. The buffer solution is mixed with a paddle mixer at a speed of 50 rpm. At a given time, a sample is taken for analysis with a volume of 1 ml. The selected sample is replaced with 1 ml of buffer. The concentration of remoxipride was determined by reverse phase liquid chromatography using a m-Bondapak C18 column (m-Bondapak C18). The eluent used is a mixture of phosphate buffer, pH 1.8 and acetonitrile, 4: 1. A spectrophotometric detector is used, and the measurement is carried out at a wavelength of 254 nm.

Гель давал возможность поддерживать удивительно низкий уровень высвобождения включенного лекарственного средства. Через 2 ч из галактолипидного геля высвободилось менее 2% включенного лекарственного средства. И примерно около 3% высвободилось через 4 ч. The gel made it possible to maintain a surprisingly low release level of the included drug. After 2 hours, less than 2% of the incorporated drug was released from the galactolipid gel. And about 3% was released after 4 hours.

Полученные данные позволяют предположить, что галактолипидная формула пригодна для парентерального использования с целью создания в организме депо биологически активного материала с последующим длительным его высвобождением, как это было показано на примере ремоксиприда гидрохлорида. The data obtained suggest that the galactolipid formula is suitable for parenteral use in order to create a biologically active material in the body with its subsequent long release, as was shown by the example of remoxipride hydrochloride.

Пример 5
Образование липосом
Липосомы в виде многослойных везикул получают и исследуют следующим образом. К галактолипидам из овса добавляют воду с получением конечной концентрации 1.0 и 10.0% липида. Образцы уравновешивают при комнатной температуре в течение 24 ч при несильном перемешивании с получением липосомальных дисперсий.Example 5
Liposome formation
Liposomes in the form of multilayer vesicles are prepared and examined as follows. Water is added to galactolipids from oats to obtain a final concentration of 1.0 and 10.0% lipid. Samples were equilibrated at room temperature for 24 hours with gentle stirring to obtain liposomal dispersions.

Для получения липосом в виде однослойных везикул часть дисперсии переносят в стеклянную пробирку и разрушают в атмосфере азота при температуре 0^oC с помощью ультразвукового дезинтегратора [XL-2020; Хит Системз Инк. (XL-2020; Heat Systems Inc.), США], снабженного устройством с наконечником для отбора микропроб. Применяют следующий режим работы: контроль выхода 3.5; время обработки 3 х 2 мин, импульсный режим 2 х 4 мин.To obtain liposomes in the form of single-layer vesicles, part of the dispersion is transferred into a glass tube and destroyed in a nitrogen atmosphere at a temperature of 0 ^o C using an ultrasonic disintegrator [XL-2020; Hit Systems Inc. (XL-2020; Heat Systems Inc.), USA], equipped with a device with a tip for sampling. Apply the following mode of operation: output control 3.5; processing time 3 x 2 min, pulse mode 2 x 4 min.

Распределение полученных липосомальных дисперсий по размерам частиц определяют с помощью динамического светорассеяния [Затасайзер 4, Малверн Инструментc (Zetasizer 4, Malvern Instruments), Великобритания] под углом 90^o и при комнатной температуре, с использованием калиброванной ячейки ZET5110 путем мультимодального анализа. Были получены следующие результаты, которые представлены в виде средних значений Z в табл. 6.The particle size distribution of the obtained liposomal dispersions is determined by dynamic light scattering [Zatasizer 4, Malvern Instruments (Zetasizer 4, Malvern Instruments), UK] at an angle of 90 ^° and at room temperature using a calibrated ZET5110 cell by multimodal analysis. The following results were obtained, which are presented as average Z values in the table. 6.

С помощью оптического микроскопа [40-100x, Олимпус CH-2 (40-100x, Olympus CH-2)] исследуют полученные дисперсии до и после озвучивания. Небольшое количество липосомальной дисперсии помещают на предметное стекло. Затем рассматривают образец между скрещивающимися поляризаторами. Обнаруживаются только неозвученные липосомы, которые имеют характерную форму мальтийских крестов. Способность галактолипидов образовывать везикулы была подтверждена также при просвечивающей электронной микроскопии замороженных изломов. Using an optical microscope [40-100x, Olympus CH-2 (40-100x, Olympus CH-2)], the dispersions obtained are studied before and after sonication. A small amount of liposome dispersion is placed on a glass slide. Then examine the sample between the crossed polarizers. Only non-voiced liposomes are found that have the characteristic shape of Maltese crosses. The ability of galactolipids to form vesicles was also confirmed by transmission electron microscopy of frozen fractures.

Приведенные данные демонстрируют превосходную способность галактолипидов образовывать многослойные везикулы с использованием простого метода направленной гидратации и без добавления летучих органических растворителей или сопутствующих поверхностно-активных веществ. Небольшие однослойные везикулы легко образуются затем при ультразвуковой дезинтеграции с соблюдением описанных выше условий или с применением традиционных методов, таких как экструзия через поликарбонатную мембрану. These data demonstrate the excellent ability of galactolipids to form multilayer vesicles using a simple method of directed hydration and without the addition of volatile organic solvents or associated surfactants. Small single-layer vesicles are then easily formed by ultrasonic disintegration under the conditions described above or using traditional methods, such as extrusion through a polycarbonate membrane.

Пример 6
Эффективность инкапсуляции
Изучается эффективность инкапсуляции красителя, включаемого в везикулы галактолипидного материала, полученного из овса. Галактолипидный материал подвергают направленной гидратации в 20 мМ водного раствора флуоресцеина при концентрации 4.8%. Дисперсию оставляют для набухания при комнатной температуре в течение 24 ч.Example 6
Encapsulation Efficiency
The efficiency of the encapsulation of the dye included in the vesicles of galactolipid material obtained from oats is studied. Galactolipid material is subjected to directed hydration in a 20 mM aqueous solution of fluorescein at a concentration of 4.8%. The dispersion is left to swell at room temperature for 24 hours.

Нагруженные красителем везикулы отделяют от невключенного красителя гель-фильтрацией на колонке с Сефадексом G 50 (высота 60 см, внутр. диам. 1.5 см) при комнатной температуре. В качестве элюента используют ЭДТА-буфер (1 мМ ЭДТА, 5 мМ Трис, 150 мМ NaCl), доведенный до pH 7.4. Концентрированную липосомальную дисперсию, загруженную красителем, наносят на колонку, затем вносят забуференный раствор ЭДТА. Колоночный элюент постоянно отслеживают на поглощение при длине волны 240 нм с помощью УФ-спектрофотометра, снабженного микроячейкой и самописцем, и далее собирают фракции на автоматическом коллекторе. Две фракции - загруженные красителем везикулы и раствор непоглощенного красителя - собирают отдельно и доводят до определенного объема. Спектрофотометрически при длине волны 258.2 нм определяют концентрации красителя и вычисляют на основании этих данных величины поглощенного объема и эффективность инкапсуляции. Были получены следующие результаты: поглощенный объем составляет 2.1 мкл/мг липида, а эффективность инкапсуляции равна 11%. Размер частиц составляет на основании проведенного определения 509 нм (среднее значение Z). The dye-loaded vesicles are separated from the unincorporated dye by gel filtration on a Sephadex G 50 column (height 60 cm, internal diameter 1.5 cm) at room temperature. An EDTA buffer (1 mM EDTA, 5 mM Tris, 150 mM NaCl) adjusted to pH 7.4 was used as eluent. The concentrated dye loaded liposome dispersion is applied to the column, then a buffered EDTA solution is added. The column eluent is constantly monitored for absorption at a wavelength of 240 nm using a UV spectrophotometer equipped with a microcell and a recorder, and then the fractions are collected on an automatic collector. Two fractions — vesicles loaded with dye and a solution of unabsorbed dye — are collected separately and adjusted to a certain volume. Spectrophotometrically at a wavelength of 258.2 nm, dye concentrations are determined and the absorbed volume and encapsulation efficiency are calculated based on these data. The following results were obtained: the absorbed volume is 2.1 μl / mg lipid, and the encapsulation efficiency is 11%. The particle size is based on the determination of 509 nm (average Z value).

Прямая гидратация галактолипидов приводит к образованию многослойных везикул, как это было показано в примере 5. Вышеприведенные данные указывают на то, что описываемые частицы характеризуются гораздо более высоким значением поглощенного объема и эффективности инкапсуляции, чем традиционные везикулы, основанные на фосфолипидах, которые, как следует из сообщений, имеют величину поглощенного объема около 0.5 мкл/мг липида. Direct hydration of galactolipids leads to the formation of multilayer vesicles, as was shown in example 5. The above data indicate that the described particles are characterized by a much higher value of the absorbed volume and encapsulation efficiency than traditional vesicles based on phospholipids, which, as follows from messages have an absorbed volume of about 0.5 μl / mg lipid.

Метод прямой гидратации, применяемый для получения многослойных везикул, технически прост и быстр и поэтому пригоден для применения в промышленности. При использовании в этом методе галактолипидного материала можно достигнуть еще больших значений поглощенного объема, что свидетельствует о значительно более высокой эффективности инкапсуляции, которая ранее при использовании фосфолипидов для получения многослойных везикул была низкой, что рассматривалось как основной недостаток метода. The direct hydration method used to obtain multilayer vesicles is technically simple and quick and therefore suitable for industrial use. When using galactolipid material in this method, even higher values of the absorbed volume can be achieved, which indicates a significantly higher encapsulation efficiency, which was previously low when using phospholipids to obtain multilayer vesicles, which was considered as the main disadvantage of the method.

Пример 7
Образование водных дисперсий
Для тестирования набухаемости в воде обогащенный галактолипидный материал ДГДГ из овса смешивают с водой. Водно-липидные образцы готовят по методу, приведенному в примере 1. Полученные результаты суммированы в табл. 7.Example 7
The formation of aqueous dispersions
To test the swelling in water, the oat-rich galactolipid material DGDG from oats is mixed with water. Water-lipid samples are prepared according to the method described in example 1. The results obtained are summarized in table. 7.

Как и в случае необогащенного материала, набухаемость в воде обогащенного материала была очень хорошей, при этом легко получались гомогенные дисперсии. As in the case of non-enriched material, the swelling in water of the enriched material was very good, and homogeneous dispersions were easily obtained.

Пример 8
Образование водных дисперсий
Гидрогенизированный галактолипидный материал из овса смешивают с водой для определения набухаемости его в воде. Водно-липидные образцы получают по методу примера 1 (табл. 8).Example 8
The formation of aqueous dispersions
The hydrogenated galactolipid material from oats is mixed with water to determine its swelling in water. Water-lipid samples are obtained according to the method of example 1 (table. 8).

Как и в случае негидрогенизированного материала, набухаемость в воде гидрогенизированного материала была чрезвычайно хорошей. Указанный материал содержит только остатки насыщенных жирных кислот, что определяет возможность создания высокоупорядоченной кристаллической структуры как в сухом состоянии, так и в присутствии воды. На основании данных дифференциальной сканирующей калориметрии показано, что точка плавления цепи в гидрогенизированном материале, имеющем вид дисперсии в воде, составляет около 55^oC. Соответствующее значение для негидрогенизированного материала находится достаточно ниже 0^oC.As with the non-hydrogenated material, the water swellability of the hydrogenated material was extremely good. The specified material contains only residues of saturated fatty acids, which determines the possibility of creating a highly ordered crystalline structure both in the dry state and in the presence of water. Based on the data of differential scanning calorimetry, it was shown that the melting point of the chain in a hydrogenated material having the form of a dispersion in water is about 55 ^° C. The corresponding value for a non-hydrogenated material is sufficiently below 0 ^° C.

Пример 9
Приготовление вязкой неводной дисперсии
Вязкие дисперсии получают в соответствии со следующими прописями
Ингредиент - %
Галактолипиды - 10.0
Глицерин, 99% - 90.0
Ингредиент - %
Галактолипиды - 20.0
Глицерин, 99% - 80.0
Галактолипиды, полученные из овса, и глицерин поочередно перемешивают палочкой и центрифугируют при комнатной температуре до образования очень вязких, гомогенных и явно изотропных жидкостей. Оба вида жидкостей состоят из дисперсии ламеллярной фазы в глицерине, т.е. многослойных везикул, как показывает исследование их строения в световом поляризационном микроскопе. После выдерживания образцов в течение одного года при комнатной температуре проводят их физическое исследование. Независимо от концентрации галактолипида не обнаруживается никакого осадка, что указывает на наличие стабилизирующего эффекта глицерина на дисперсию везикул.Example 9
Preparation of a viscous non-aqueous dispersion
Viscous dispersions are obtained in accordance with the following formulations
Ingredient%
Galactolipids - 10.0
Glycerin, 99% - 90.0
Ingredient%
Galactolipids - 20.0
Glycerin, 99% - 80.0
Galactolipids derived from oats and glycerol are alternately mixed with a stick and centrifuged at room temperature until very viscous, homogeneous and clearly isotropic liquids are formed. Both types of liquids consist of a dispersion of the lamellar phase in glycerol, i.e. multilayer vesicles, as shown by the study of their structure in a light polarizing microscope. After keeping the samples for one year at room temperature, they are physically examined. Regardless of the concentration of galactolipid, no precipitate is detected, which indicates the presence of a stabilizing effect of glycerol on the dispersion of vesicles.

Пример 10
Приготовление неводного препарата для использования с целью улучшения состояния слизистой
Агенты, содержащие сульфгидрильные группы, такие как DL-цистеин и N-ацетил-L-цистеин, могут стимулировать лечение и предупреждать возникновение рецидивов дуоденальных язв у людей. Язвы желудка могут быть вызваны ишемией и вредными веществами, такими как этанол и ацетилсалициловая кислота, которые поражают и удаляют слизистую двенадцатиперстной кишки.Example 10
Preparation of a non-aqueous preparation for use in order to improve the condition of the mucosa
Agents containing sulfhydryl groups such as DL-cysteine and N-acetyl-L-cysteine can stimulate treatment and prevent recurrence of duodenal ulcers in humans. Gastric ulcers can be caused by ischemia and harmful substances, such as ethanol and acetylsalicylic acid, which infect and remove the duodenal mucosa.

Готовят препарат с использованием следующих ингредиентов:
Ингредиент - %
Галактолипиды из овса - 10.0
N-ацетил-L-цистеин - 10.0
Глицерин, 99% - 80.0
N-ацетил-L-цистеин растворяют в глицерине при несильном перемешивании и нагревании примерно до 60^oC в открытом химическом стакане. После этого добавляют галактолипидный материал, а полученную отчетливо прозрачную жидкость переносят в стеклянный контейнер с пластиковой крышкой. Препарат, представляющий собой, как показало его исследование в световом поляризационном микроскопе, дисперсию хранят в холодильнике в течение более 6 месяцев.Prepare the drug using the following ingredients:
Ingredient%
Galactolipids from oats - 10.0
N-Acetyl-L-Cysteine - 10.0
Glycerin, 99% - 80.0
N-acetyl-L-cysteine is dissolved in glycerol with gentle stirring and heating to about 60 ^° C. in an open beaker. After that, galactolipid material is added, and the resulting clearly transparent liquid is transferred to a glass container with a plastic lid. The drug, which is, as shown by a study in a light polarizing microscope, the dispersion is stored in the refrigerator for more than 6 months.

В качестве растворителя был выбран глицерин в связи с тем, что вещества, содержащие сульфгидрильные группы, такие как, например, N-ацетил-L-цистеин, нестабильны в водном растворе и могут быть трансформированы в вещества, которые не оказывают фармакологического воздействия на слизистую. Glycerin was chosen as a solvent due to the fact that substances containing sulfhydryl groups, such as, for example, N-acetyl-L-cysteine, are unstable in aqueous solution and can be transformed into substances that do not have a pharmacological effect on the mucosa.

Галактолипидный материал полезен сам по себе, поскольку, как было показано в исследованиях in vivo на крысах, он оказывает защитное воздействие на слизистую желудка. Galactolipid material is useful on its own, because, as shown in in vivo studies in rats, it has a protective effect on the gastric mucosa.

По методам, приведенным ниже в примерах 11-14, были приготовлены различные местные препараты с противовоспалительным средством - гидрокортизоном. Галактолипидный материал получают из овса. Все композиции оказываются стабильными при хранении более 2 месяцев при комнатной температуре. According to the methods described below in examples 11-14, various local preparations with an anti-inflammatory agent hydrocortisone were prepared. Galactolipid material is obtained from oats. All compositions are stable when stored for more than 2 months at room temperature.

Пример 11
Ингредиент - %
Галактолипиды - 10.3
Гидрокортизон - 1.0
Вода - 88.7
Гидрокортизон и галактолипиды тщательно перемешивают с помощью вихревого миксера. После добавления воды препарат подвергают вихревому перемешиванию, центрифугируют и осторожно нагревают до получения тонкой молочной дисперсии.Example 11
Ingredient%
Galactolipids - 10.3
Hydrocortisone - 1.0
Water - 88.7
Hydrocortisone and galactolipids are thoroughly mixed using a vortex mixer. After adding water, the drug is subjected to vortex mixing, centrifuged and carefully heated until a fine milk dispersion is obtained.

Пример 12
Ингредиент - %
Галактолипиды - 22.1
Гидрокортизон - 1.2
1-пропанол - 16.1
Вода - 60.6
Гидрокортизон растворяют в 1-пропаноле при слабом нагревании и перемешивании. После добавления воды и галактолипидов смесь подвергают вихревому перемешиванию, центрифугируют и осторожно нагревают до получения непрозрачного очень вязкого геля.Example 12
Ingredient%
Galactolipids - 22.1
Hydrocortisone - 1.2
1-propanol - 16.1
Water - 60.6
Hydrocortisone is dissolved in 1-propanol with gentle heating and stirring. After adding water and galactolipids, the mixture is vortexed, centrifuged and carefully heated until an opaque, very viscous gel is obtained.

Пример 13
Ингредиент - %
Галактолипиды - 18.9
Гидрокортизон - 0.8
1,2-пропандиол - 26.3
Вода - 54.0
Гидрокортизон растворяют в 1,2-пропандиоле при несильном нагревании и перемешивании. После добавления воды и галактолипидного материала смесь подвергают вихревому перемешиванию, центрифугируют и слегка нагревают до получения желтоватого почти прозрачного геля.Example 13
Ingredient%
Galactolipids - 18.9
Hydrocortisone - 0.8
1,2-propanediol - 26.3
Water - 54.0
Hydrocortisone is dissolved in 1,2-propanediol with gentle heating and stirring. After adding water and galactolipid material, the mixture is vortexed, centrifuged and slightly heated until a yellowish, almost transparent gel is obtained.

Пример 14
Ингредиент - %
Галактолипиды - 26.8
Гидрокортизон - 1.2
Этанол - 20.7
Вода - 51.3
Гидрокортизон растворяют в этаноле при несильном нагревании и перемешивании. После добавления воды и галактолипидов смесь подвергают вихревому перемешиванию, центрифугируют и слегка нагревают до получения светло-коричневого прозрачного геля.Example 14
Ingredient%
Galactolipids - 26.8
Hydrocortisone - 1.2
Ethanol - 20.7
Water - 51.3
Hydrocortisone is dissolved in ethanol with gentle heating and stirring. After adding water and galactolipids, the mixture is vortexed, centrifuged and slightly heated until a light brown transparent gel is obtained.

В примерах 15-17 описаны различные безводные местные препараты. Здесь так же, как и раньше, в качестве модели лекарственного средства выбран гидрокортизон. Галактолипиды получают из овса. Все препараты стабильны при хранении более 2 месяцев при комнатной температуре. Examples 15-17 describe various anhydrous topical preparations. Here, as before, hydrocortisone is selected as the model of the drug. Galactolipids are obtained from oats. All preparations are stable when stored for more than 2 months at room temperature.

Пример 15
Ингредиент - %
Галактолипиды - 7.0
Гидрокортизон - 0.8
Глицерин, 99 об.% - 92.2
Галактолипиды диспергируют в глицерине. После получения гомогенной гелевой фазы добавляют гидрокортизон. Смесь слегка нагревают и затем перемешивают с помощью вихревого миксера. Полученный препарат-суспензия представляет собой желтоватый вязкий гель, содержащий мелкодиспергированные твердые частицы гидрокортизона.Example 15
Ingredient%
Galactolipids - 7.0
Hydrocortisone - 0.8
Glycerin, 99 vol.% - 92.2
Galactolipids are dispersed in glycerol. After obtaining a homogeneous gel phase, hydrocortisone is added. The mixture is slightly heated and then stirred using a vortex mixer. The resulting suspension preparation is a yellowish viscous gel containing finely dispersed hydrocortisone solids.

Пример 16
Ингредиент - %
Галактолипиды - 13.5
Гидрокортизон - 1.1
Глицерин, 99 об.% - 85.4
Препарат готовят по методу примера 15. Полученная композиция представляет собой непрозрачный очень вязкий гель светло-желтого цвета.Example 16
Ingredient%
Galactolipids - 13.5
Hydrocortisone - 1.1
Glycerin, 99 vol.% - 85.4
The preparation is prepared according to the method of example 15. The resulting composition is an opaque, very viscous gel of light yellow color.

Пример 17
Ингредиент - %
Галактолипиды - 21.8
Гидрокортизон - 1.1
Пропанол - 14.5
Глицерин, 99 об.% - 62.6
Гидрокортизон частично растворяют в пропаноле при несильном нагревании и перемешивании. После добавления галактолипидов с последующим энергичным перемешиванием вносят глицерин. Затем композицию подвергают вихревому перемешиванию, центрифугируют и нагревают до получения желтоватой гелевой фазы. Гель содержит мелкодисперсные частицы гидрокортизона.Example 17
Ingredient%
Galactolipids - 21.8
Hydrocortisone - 1.1
Propanol - 14.5
Glycerin, 99 vol.% - 62.6
Hydrocortisone is partially dissolved in propanol with gentle heating and stirring. After the addition of galactolipids, followed by vigorous stirring, glycerol is added. Then the composition is subjected to vortex mixing, centrifuged and heated to obtain a yellowish gel phase. The gel contains fine particles of hydrocortisone.

Пример 18
Противогрибковый препарат для вагинального введения
Ингредиент - %
Галактолипиды - 45.6
Миконазола нитрат - 1.8
Вода - 52.6
Миконазола нитрат и галактолипиды, полученные из овса, хорошо перемешивают в вихревом миксере. После добавления воды композицию подвергают вихревому перемешиванию и встряхивают до получения коричневатого гомогенного очень вязкого геля.Example 18
Antifungal drug for vaginal administration
Ingredient%
Galactolipids - 45.6
Miconazole Nitrate - 1.8
Water - 52.6
Miconazole nitrate and galactolipids derived from oats are mixed well in a vortex mixer. After adding water, the composition is vortexed and shaken until a brownish, homogeneous, very viscous gel is obtained.

Пример 19
Антибактериальный препарат в виде повязки на рану
Ингредиент - %
Галактолипиды - 42.8
Доксоциклина гидрохлорид - 1.7
Вода - 55.5
Доксоциклина гидрохлорид растворяют в воде с получением желтого раствора. После добавления галактолипидов, полученных из овса, смесь перемешивают в вихревом миксере и встряхивают до получения светло-коричневого очень вязкого геля.Example 19
Antibacterial wound dressing
Ingredient%
Galactolipids - 42.8
Doxocycline hydrochloride - 1.7
Water - 55.5
Doxocycline hydrochloride is dissolved in water to give a yellow solution. After adding the galactolipids derived from oats, the mixture is stirred in a vortex mixer and shaken until a light brown, very viscous gel is obtained.

Пример 20
Антибактериальный препарат для введения в наружный слуховой проход
Ингредиент - %
Галактолипиды - 2.0
Доксоциклина гидрохлорид - 2.0
Вода - 96.0
Доксоциклина гидрохлорид растворяют в воде с получением желтого раствора. После добавления галактолипидов, полученных из овса, смесь перемешивают в вихревом миксере до получения желтой молочной дисперсии везикул, нагруженных доксоциклином.Example 20
Antibacterial drug for insertion into the external auditory meatus
Ingredient%
Galactolipids - 2.0
Doxocycline hydrochloride - 2.0
Water - 96.0
Doxocycline hydrochloride is dissolved in water to give a yellow solution. After the addition of galactolipids derived from oats, the mixture is stirred in a vortex mixer until a yellow milky dispersion of vesicles loaded with doxocycline is obtained.

Пример 21
Антидиабетическая композиция для назального введения
Ингредиент - %
Галактолипиды - 3.5
Раствор инсулина, 100 Ед/мл [Актрапид Хьюман, Ново Нордиск AS (Actrapid Human, Novo Nordisk AS), Швеция] - 96.5
Галактолипиды, полученные из овса, гидратируют в растворе коммерческого инсулина при несильном перемешивании в течение 24 ч. Полученную дисперсию переносят в обычный флакон с насосом для интраназального введения, из которого может быть получена тонкая аэрозольная струя.Example 21
Antidiabetic composition for nasal administration
Ingredient%
Galactolipids - 3.5
A solution of insulin, 100 U / ml [Actrapid Human, Novo Nordisk AS (Actrapid Human, Novo Nordisk AS), Sweden] - 96.5
Galactolipids obtained from oats are hydrated in a solution of commercial insulin with gentle stirring for 24 hours. The resulting dispersion is transferred to a normal bottle with an intranasal pump, from which a thin aerosol stream can be obtained.

Пример 22
Сперматоцидная композиция
Ингредиент - %
Галактолипиды - 22.5
Ноноксинол - 5.0
Вода - 72.5
Смесь трех компонентов подвергают поочередно вихревому перемешиванию, центрифугированию и несильному перемешиванию до получения коричневатого прозрачного геля.Example 22
Spermatocidal composition
Ingredient%
Galactolipids - 22.5
Nonoxynol - 5.0
Water - 72.5
The mixture of the three components is subjected to alternating vortex mixing, centrifugation and gentle mixing to obtain a brownish transparent gel.

Пример 23
Анальгезирующая композиция для ректального введения
Ингредиент - %
Галактолипиды - 43.4
Парацетамол - 2.9
Вода - 53.7
Полученные из овса галактолипиды и парацетамол хорошо перемешивают. После добавления воды препарат поочередно перемешивают палочкой, слегка нагревают и затем центрифугируют при комнатной температуре до получения желто-коричневого очень вязкого геля.Example 23
Rectal Analgesic Composition
Ingredient%
Galactolipids - 43.4
Paracetamol - 2.9
Water - 53.7
Galactolipids and paracetamol obtained from oats mix well. After adding water, the preparation is alternately stirred with a stick, slightly heated, and then centrifuged at room temperature to obtain a tan very viscous gel.

На вязкость галактолипидных композиций оказывают лишь незначительное воздействие умеренные изменения температур. Композицию, хранящуюся в холодильнике, можно легко сразу перенести в шприц или аналогичное устройство и затем ввести ректально, при этом композиция, нагреваясь до температуры тела, не теряет свойственные ей вязкость и консистенцию. The viscosity of galactolipid compositions is only slightly affected by moderate temperature changes. The composition stored in the refrigerator can easily be immediately transferred to a syringe or similar device and then administered rectally, while the composition, when heated to body temperature, does not lose its inherent viscosity and texture.

Пример 24
Антиглаукомная композиция для глазного введения
Ингредиент - %
Галактолипиды - 1.00
Тимола малеат - 0.34
Вода - 98.66
Полученные из овса галактолипиды диспергируют в одной части воды и оставляют на ночь для набухания при несильном перемешивании при комнатной температуре. Затем добавляют растворенный в оставшемся количестве воды тимола малеат, переносят полученную липосомальную дисперсию в стеклянную пробирку и проводят разрушение в течение 10 мин в атмосфере азота при температуре 0^oC с помощью ультразвукового дезинтегратора [XL-2020, Хит Системз Инк., США (XL-2020; Heat Systems Inc.), контроль выхода 4], снабженного устройством с наконечником для отбора микропроб.Example 24
Antiglaucoma composition for ophthalmic administration
Ingredient%
Galactolipids - 1.00
Timola maleate - 0.34
Water - 98.66
Galactolipids obtained from oats are dispersed in one part of water and allowed to swell overnight with gentle stirring at room temperature. Then thymol maleate dissolved in the remaining amount of water is added, the resulting liposomal dispersion is transferred to a glass tube and destruction is carried out for 10 min in a nitrogen atmosphere at 0 ^° C using an ultrasonic disintegrator [XL-2020, Heat Systems Inc., USA (XL- 2020; Heat Systems Inc.), output control 4], equipped with a device with a tip for sampling microsamples.

Получают в результате прозрачную дисперсию, содержащую небольшие однослойные везикулы и лекарственное средство в фармакологически эффективном количестве, которая может использоваться как глазные капли. При этом галактолипиды увеличивают вязкость полученной композиции, а также улучшают ее биоадгезивность, что может привести к улучшению биологической доступности лекарственного средства в связи с увеличением периода нахождения в роговице. The result is a transparent dispersion containing small single-layer vesicles and a pharmacologically effective amount of the drug, which can be used as eye drops. At the same time, galactolipids increase the viscosity of the resulting composition, as well as improve its bioadhesiveness, which can lead to improved bioavailability of the drug due to the increase in the period of stay in the cornea.

Пример 25
Включение литиевой соли гамма-линоленовой кислоты в галактолипидные липосомы
Липосомальную галактолипидную композицию, включающую литиевую соль гамма-линоленовой кислоты, которая применяется как антираковое средство, готовят следующим образом:
Ингредиент - %
Ли-ГЛК - 1.5
Обогащенный галактолипид - 10.0
Глицерин в воде 2,3% - До 100.0
Ли-ГЛК с содержанием гамма-линоленовой кислоты в 75% получают от Калланиш Лтд., Шотландия (Callanish Ltd.). Обогащенный галактолипидный материал, полученный из овса, и Ли-ГЛК смешивают друг с другом, после чего добавляют 2.3%-ный раствор глицерина. Смесь оставляют на 8 ч для гидратации (или набухания). После очень сильного перемешивания при 12000 об/мин в течение 30 с липосомальную дисперсию гомогенизируют под давлением 86 МПа в течение 3 мин [ЭмульсиФлекс-C30, Авестин Инк. , Канада (EmulsiFlex-C30, Avestin Inc.)]; 1.5%-ная концентрация Ли-ГЛК соответствует 53 мМ.Example 25
The incorporation of the lithium salt of gamma-linolenic acid into galactolipid liposomes
A liposomal galactolipid composition comprising a lithium salt of gamma-linolenic acid, which is used as an anti-cancer agent, is prepared as follows:
Ingredient%
Li-GLK - 1.5
Enriched Galactolipid - 10.0
Glycerin in water 2.3% - Up to 100.0
Li-GLA with a gamma-linolenic acid content of 75% is obtained from Callanish Ltd., Scotland (Callanish Ltd.). Enriched galactolipid material obtained from oats and Li-GLA are mixed with each other, after which a 2.3% glycerol solution is added. The mixture is left for 8 hours to hydrate (or swell). After very strong stirring at 12000 rpm for 30 s, the liposome dispersion is homogenized under a pressure of 86 MPa for 3 min [EmulsiFlex-C30, Avestin Inc. , Canada (EmulsiFlex-C30, Avestin Inc.)]; 1.5% Li-GLA concentration corresponds to 53 mM.

Гемолитический эффект липосомальной дисперсии определяют in vitro по методу, приведенному ниже в тесте 6. The hemolytic effect of liposomal dispersion is determined in vitro by the method described below in test 6.

Пример 26
Получение дисперсии, содержащей 10% L-тирозина
Дисперсию готовят следующим образом:
Ингредиент - %
Галактолипиды из овса - 6.4
L-тирозин - 10.0
Вода - 83.6
Все ингредиенты смешивают и подвергают усиленному перемешиванию при 15000 об/мин в течение 4 мин до образования гомогенной дисперсии. Образовавшаяся дисперсия стабильна в течение нескольких недель после приготовления.Example 26
Obtaining a dispersion containing 10% L-tyrosine
The dispersion is prepared as follows:
Ingredient%
Galactolipids from oats - 6.4
L-tyrosine - 10.0
Water - 83.6
All ingredients are mixed and subjected to vigorous stirring at 15,000 rpm for 4 minutes until a homogeneous dispersion is formed. The resulting dispersion is stable for several weeks after preparation.

На фиг. 1 приведена микрофотография в поляризованном свете липосом, полученных в примере 9 из 10 об.% галактолипидов в глицерине при увеличении х100. Для липосом характерна сферическая форма с мальтийскими крестами. In FIG. 1 shows a photomicrograph in polarized light of liposomes obtained in example 9 out of 10 vol.% Galactolipids in glycerol with an increase of x100. Liposomes are characterized by a spherical shape with Maltese crosses.

На фиг. 2 показано нервно-блокирующее действие локального анестетика на модели крыс с длительным внутриоболочечным имплантатом в соответствии с данными теста 3. In FIG. Figure 2 shows the neuromuscular action of a local anesthetic in a rat model with a long intracranial implant according to test 3.

Биологические тесты
Тест 1
Кожное раздражение in vivo
С целью оценки кожной токсичности галактолипидов настоящего изобретения были проведены следующие тесты.Biological tests
Test 1
In vivo skin irritation
In order to evaluate the skin toxicity of the galactolipids of the present invention, the following tests were carried out.

Галактолипиды из овса смешивают с водой для инъекции с получением 10% геля и наносят его в виде дозы, соответствующей 0.5 мл на животное, на интактную кожу самцов 6 новозеландских белых кроликов (New Zealand White rabbits) и держат его под полугерметичной повязкой в течение 4 ч. Обследование кожи на наличие эритемы и отека проводят через 1, 24, 48 и 72 ч после удаления повязки. Затем вычисляют средние значения на основе оценки повреждений кожи через 24, 48 и 72 ч. Результаты приведены в табл. 9. Galactolipids from oats are mixed with water for injection to obtain a 10% gel and applied in the form of a dose corresponding to 0.5 ml per animal onto the intact skin of males of 6 New Zealand White rabbits and kept under a semi-hermetic dressing for 4 hours Examination of the skin for erythema and edema is carried out after 1, 24, 48 and 72 hours after removal of the dressing. Then calculate the average values based on the assessment of skin lesions after 24, 48 and 72 hours. The results are shown in table. 9.

На основании приведенных данных можно сделать вывод о том, что нанесение галактолипидного геля не вызывает заметного раздражения кожи. Based on the data presented, we can conclude that the application of galactolipid gel does not cause noticeable skin irritation.

Тест 2
Оценка клиренса галактолипидных липосом in vivo
Получение ДГДГ с меченой ³H-жирной кислотой
500 мг галактолипидов из овса метят тритием при каталитическом восстановлении двойных связей в жирных кислотах с помощью газообразного трития [Амершам Тритиум Лэбеллинг Сервис (Amersham Tritium Labelling Service), Великобритания] . Удельная активность его составляет 30-60 Ci/ммоль в расчете на восстановленную двойную связь. ³H-ДГДГ чистят с помощью двумерной тонкослойной хроматографии на пластинах с силикагелем 60. Движущиеся фазы в первом направлении представлены смесью хлороформ:метанол:вода, 65:25:4 (объем/объем), а во втором направлении - хлороформ:метанол:уксусная кислота: вода, 85: 15:10:3.5 (объем/объем). Пятно ДГДГ элюируют последовательно смесями хлороформ:метанол:вода, 65:25:4 (объем/объем) и 50:50:10 (объем/объем), чистым метанолом и, наконец, смесью метанол:вода, 1:1 (объем/объем). Пропорция ³H в липофильной части галактолипидного материала была определена следующим образом: 18 nCi ³H-меченого ДГДГ и 2 мг немеченого материала подвергают щелочному гидролизу в 1 мл 1 М КОН при температуре 60^oC в течение 4 ч. После нейтрализации с помощью 0.2 мл 5 М HCl добавляют 5 мл хлороформа, 1.5 мл этанола и 2.5 мл воды. В указанной двухфазной распределительной системе 97% радиоактивности регенерируется в нижней (хлороформной) фазе.Test 2
Assessment of clearance of galactolipid liposomes in vivo
Obtaining DGDG with labeled ³ H-fatty acid
500 mg galactolipids from oats are labeled with tritium during catalytic reduction of double bonds in fatty acids using tritium gas [Amersham Tritium Labelling Service, UK]. Its specific activity is 30-60 Ci / mmol, calculated on the restored double bond. ³ H-DGDG was cleaned using two-dimensional thin layer chromatography on silica gel plates 60. The moving phases in the first direction were represented by a mixture of chloroform: methanol: water, 65: 25: 4 (v / v), and in the second direction, chloroform: methanol: acetic acid: water, 85: 15: 10: 3.5 (v / v). The spot DGDG elute sequentially with mixtures of chloroform: methanol: water, 65: 25: 4 (v / v) and 50:50:10 (v / v), pure methanol and, finally, a mixture of methanol: water, 1: 1 (v / v) volume). The proportion of ³ H in the lipophilic part of the galactolipid material was determined as follows: 18 nCi ³ H-labeled DGDG and 2 mg of unlabeled material were subjected to alkaline hydrolysis in 1 ml of 1 M KOH at 60 ^° C for 4 hours. After neutralization with 0.2 ml 5 ml of HCl add 5 ml of chloroform, 1.5 ml of ethanol and 2.5 ml of water. In said biphasic distribution system, 97% of the radioactivity is regenerated in the lower (chloroform) phase.

Немеченый галактолипид и ³H-ДГДГ при общей концентрации в 2.0 об.% диспергируют в 2.5 об.% глицерина в воде. Липосомальную дисперсию уравновешивают в течение 36 ч при температуре 4^oC. После этого ее озвучивают при температуре 0^oC в атмосфере азота с применением устройства с наконечником для отбора микропроб в течение 3 х 2 мин, в режиме 4 мин импульса.Unlabeled galactolipid and ³ H-DGDG at a total concentration of 2.0 vol.% Are dispersed in 2.5 vol.% Glycerol in water. The liposomal dispersion is balanced for 36 hours at a temperature of 4 ^o C. After that, it is voiced at a temperature of 0 ^o C in a nitrogen atmosphere using a device with a tip for sampling for 3 x 2 min, in a 4 min pulse mode.

Тесты на крысах
Голодающие самцы крыс Спрэг Доли (Sprague Dawley) с весом около 250 г подвергаются анестезии диэтиловым эфиром. 0.5 мл озвученной дисперсии с уровнем радиоактивности 1.8-2.7 мкCi вводят во внешнюю яремную вену. Через 2 мин, 15 мин, 60 мин, 4 ч и 20 ч животных умерщвляют через прокол аорты. Липиды из образцов печени и плазмы крови экстрагируют смесью хлороформ:метанол, 1: 1 (объем/объем). Экстракты высушивают в атмосфере азота, перерастворяют в хлороформе и подвергают хроматографированию в тонком слое на пластинках с силикагелем 60, осуществляемому в системе хлороформ:метанол:вода: уксусная кислота, 65:25:4:4 (объем/объем). Пятно ДГДГ счищают в ампулы для счета; затем добавляют 1 мл смеси метанол:вода, 1:1 (объем/объем), после чего добавляют 10 мл смеси толуол: Инстагель [Паккард Инструментс В.V. (Instagel, Packard Instruments В.V.), Нидерланды], 1:1 (объем/объем), подвергают полученную смесь вихревому перемешиванию. Радиоактивность определяют в жидком сцинтилляционном счетчике Паккард ТриКарб (Packard TriCarb). Данные выражают в виде % от инъецированной дозы ³H-ДГДГ в 10 мл плазмы (4% от общего веса тела) и всей печени в разное время, которые суммированы в табл. 10.Rat Tests
Starving male rats Sprague Dawley weighing about 250 g are anesthetized with diethyl ether. 0.5 ml sonicated dispersion with a radioactivity level of 1.8-2.7 μCi is injected into the external jugular vein. After 2 minutes, 15 minutes, 60 minutes, 4 hours and 20 hours, the animals are sacrificed through aortic puncture. Lipids from liver and plasma samples are extracted with a mixture of chloroform: methanol, 1: 1 (v / v). The extracts are dried under nitrogen, redissolved in chloroform, and subjected to thin layer chromatography on silica gel plates 60, carried out in the chloroform: methanol: water: acetic acid system, 65: 25: 4: 4 (v / v). The spot DGDG clean off in ampoules for counting; then add 1 ml of a mixture of methanol: water, 1: 1 (volume / volume), after which add 10 ml of a mixture of toluene: Instagram [Packard Instruments B.V. (Instagel, Packard Instruments B.V.), Netherlands], 1: 1 (v / v), the resulting mixture is subjected to vortex mixing. Radioactivity is determined in a Packard TriCarb liquid scintillation counter. Data are expressed as% of the injected dose of ³ H-DGDG in 10 ml of plasma (4% of total body weight) and the entire liver at different times, which are summarized in table. 10.

Полученные результаты позволяют предположить, что везикулы, включающие ДГДГ, при внутривенной инъекции крысам имеют период полужизни около 30 мин. Кроме того, очевидно, что галактолипидные везикулы выводятся из кровяного русла и подвергаются эффективной деградации, главным образом в печени. The results suggest that vesicles including DGDG, when administered to rats intravenously, have a half-life of about 30 minutes. In addition, it is obvious that galactolipid vesicles are excreted from the bloodstream and undergo effective degradation, mainly in the liver.

Тест 3
Композиции с локальным анестезирующим лекарственным средством и исследование in vivo спинно-мозговой анестезии у крыс
Различные композиции с бупивакаина гидрохлоридом готовят следующим образом (табл. 11).Test 3
Compositions with a local anesthetic drug and in vivo study of spinal cord anesthesia in rats
Various compositions with bupivacaine hydrochloride are prepared as follows (table. 11).

Способность композиций увеличивать длительность действия локального анестетика на спинной мозг и нервные корешки исследовали в контролируемом эксперименте на крысах с длительно имплантированными внутриоболочечно катетерами. The ability of the compositions to increase the duration of the action of a local anesthetic on the spinal cord and nerve roots was studied in a controlled experiment in rats with long-term implanted intrathecal catheters.

Четыре группы самцов крыс Спрэг Доли (Sprague Dawley) (вес 235-300 г) обследовали через неделю после имплантации внутриоболочечного катетера по методу Якша и Руди (T.L. Yaksh and Т.A. Rudy, Physiol. Behav., 1976, vol. 17, 1031-1036). При этом двум группам крыс вводили бупивакаин в галактолипидной формуле (композиция А), третьей группе давали бупивакаин в виде водного раствора (композиция Б), а четвертой группе давали галактолипидную формулу без какого-либо местного анестетика (композиция В), в соответствии с режимом, представленным в табл. 12. Four groups of male rats, Sprague Dawley (weight 235-300 g), were examined one week after implantation of an intrathecal catheter by the method of Yaksh and Rudy (TL Yaksh and T.A. Rudy, Physiol. Behav., 1976, vol. 17, 1031-1036). In this case, two groups of rats were given bupivacaine in the galactolipid formula (composition A), the third group was given bupivacaine in the form of an aqueous solution (composition B), and the fourth group was given the galactolipid formula without any local anesthetic (composition C), in accordance with the regimen presented in table. 12.

Крысы были помещены случайным образом в одну из четырех групп. Тестируемое вещество вводят в нижний поясничный участок в дуральный мешочек через имплантированный катетер. Действие исследуемого вещества на двигательную функцию отслеживают через регулярные интервалы времени и распределяют по шкале 0, 1, 2, 3 и 4, где 0 - отсутствие моторных нарушений, а 4 - паралич обеих задних и обеих передних конечностей. Крыс наблюдали в течение не менее 90 мин. Rats were randomly placed in one of four groups. The test substance is introduced into the lower lumbar region into the dural sac through an implanted catheter. The effect of the test substance on the motor function is monitored at regular time intervals and distributed on a scale of 0, 1, 2, 3 and 4, where 0 is the absence of motor impairment, and 4 is the paralysis of both hind and both front limbs. Rats were observed for at least 90 minutes.

Результаты представлены на фиг. 2. Все животные, получавшие активный локальный анестетик, демонстрируют выраженное нарушение двигательных функций достаточно быстро после введения дозы. Однако продолжительность этого действия заметно отличается для трех разных групп, при этом наибольшая продолжительность отмечается в группе, получающей высокую дозу, и наименьшая продолжительность паралича - в контрольной группе. К 90-й мин все животные полностью восстановились. При 20 мин различия относительно контроля были статистически значимыми для групп, принимавших соответственно высокую дозу и низкую дозу [ранжирование по Вилькоксону (Wilcoxon signed rank test)]. Группа, принимавшая высокую дозу, отличалась от контрольной группы также на 30-й мин. Группа, принимавшая плацебо, не демонстрировала какого-либо эффекта ни в какое время. Не отмечалось неожиданных или токсических эффектов, а все наблюдавшиеся эффекты были обратимыми. The results are shown in FIG. 2. All animals treated with an active local anesthetic demonstrate a pronounced impairment of motor function rather quickly after a dose. However, the duration of this action is markedly different for three different groups, with the greatest duration being noted in the group receiving the highest dose, and the shortest duration of paralysis in the control group. By the 90th minute, all animals had fully recovered. At 20 min, differences relative to control were statistically significant for groups taking a high dose and a low dose, respectively [Wilcoxon signed rank test]. The high dose group differed from the control group also by the 30th minute. The placebo group did not show any effect at any time. No unexpected or toxic effects were noted, and all observed effects were reversible.

Заключение. Галактолипидная композиция с бупивакаином может значительно увеличить продолжительность действия бупивакаина по блокированию нервов на модели крыс с внутриоболочечным хроническим имплантатом. Кроме того, приведенные данные подтверждают полезность применения галактолипидной композиции для продления времени взаимодействия биологически активных компонентов. Conclusion The galactolipid composition with bupivacaine can significantly increase the duration of the action of bupivacaine to block nerves in rat models with an intrathecal chronic implant. In addition, the data presented confirm the usefulness of using a galactolipid composition to extend the interaction time of biologically active components.

Тест 4
Тест на гемолиз in vitro липосом, содержащих Ли-ГЛК
По приведенной ниже процедуре исследовали гемолитическое действие липосомальной Ли-ГЛК композиции, полученной по методу примера 25, сравнивая ее с тремя другими Ли-ГЛК с использованием цельной крови.Test 4
In vitro hemolysis test for liposomes containing Li-GLA
The hemolitic effect of the liposomal Li-GLA composition obtained by the method of Example 25 was investigated by the procedure below, comparing it with three other Li-GLAs using whole blood.

Кровь от здоровых волонтеров отбирали в 10-мл пробирки Вакутейнера [Бектон Диккинсон, Канада (Vakutainer, Becton Dickinson, Canada)], содержащие 143 ед. натрий-гепарина (Американская фармакопея, USP). Blood from healthy volunteers was collected in 10 ml Vakuteyner tubes [Bekton Dickinson, Canada (Vakutainer, Becton Dickinson, Canada)] containing 143 units. heparin sodium (American Pharmacopoeia, USP).

Образцы крови по 2 мл переносят в 25-мл колбы Эрленмейера, каждый из них перемешивают с 1.0 мл исследуемой композиции, разбавленной 0.9%-ным солевым раствором до нужной концентрации. Затем образцы инкубируют при температуре 37^oC в обогащенной атмосфере кислорода:двуокиси углерода, 95:5, 3 л/мин, в течение 1 ч при постоянном несильном перемешивании. К концу инкубации 10 мкл смеси крови переносят к 500 мкл солевого раствора в 1.5-мл эппендорфовской пробирке. Демонстрирующие 100%-ный гемолиз стандарты готовят добавлением 10 мкл крови к 500 мкл чистой воды в 1.5-мл эппендорфовской пробирке. Затем все образцы откручивают в течение 2 мин в микроцентрифуге Эппендорфа [Бринкман Инструментc Лтд. (Brinkman Instruments Ltd.), Канада] и окончательно исследуют на центрифужном анализаторе [Кобал Биоэнелайзер; Хоффман-Ла Роше Лтд. (Cobal Bioanalyzer; Hoffman-La Roche Ltd.), Канада] в УФ-области при длине волны 540 нм. В табл. 13 представлены полученные результаты.Blood samples of 2 ml are transferred into a 25 ml Erlenmeyer flask, each of them is mixed with 1.0 ml of the test composition, diluted with 0.9% saline to the desired concentration. Then the samples are incubated at a temperature of 37 ^o C in an enriched atmosphere of oxygen: carbon dioxide, 95: 5, 3 l / min, for 1 h with constant gentle stirring. At the end of the incubation, 10 μl of the blood mixture was transferred to 500 μl of saline in a 1.5 ml Eppendorf tube. Demonstrating 100% hemolysis standards are prepared by adding 10 μl of blood to 500 μl of pure water in a 1.5 ml Eppendorf tube. Then all samples were unscrewed for 2 min in an Eppendorf microcentrifuge [Brinkman Instruments Ltd. (Brinkman Instruments Ltd.), Canada] and finally examined on a centrifuge analyzer [Cobal Bioenelizer; Hoffman La Rocher Co., Ltd. (Cobal Bioanalyzer; Hoffman-La Roche Ltd.), Canada] in the UV region at a wavelength of 540 nm. In the table. 13 presents the results.

Ли-ГЛК, растворенный в 0.9%-ном солевом растворе, вызывает 100%-ный гемолиз при концентрации около 4-5 мМ. Таким образом, гемолитическая активность Ли-ГЛК в липосомальной форме значительно снижается. Сниженная гемолитическая активность липосомальной Ли-ГЛК была подтверждена предварительными исследованиями in vivo на крысах: гемолиз снижается на 50-80%, если вместо свободной Ли-ГЛК используется липосомальная композиция. Липосомальная композиция в отличие от свободной Ли-ГЛК не приводит к образованию у крыс "красной мочи". Было, кроме того, показано, что антираковая активность in vitro у свободной Ли-ГЛК и липосомальной Ли-ГЛК практически идентичны. Описанные тесты позволяют предположить, что липосомальная галактолипидная композиция снижает гемолиз, тяжелую побочную реакцию лекарственного средства без воздействия на его фармакологическую эффективность. Li-GLA dissolved in 0.9% saline causes 100% hemolysis at a concentration of about 4-5 mM. Thus, the hemolytic activity of Li-GLA in liposome form is significantly reduced. Reduced hemolytic activity of liposomal Li-GLA was confirmed by preliminary in vivo studies in rats: hemolysis is reduced by 50-80% if a liposomal composition is used instead of free Li-GLA. The liposomal composition, unlike free Li-GLA, does not lead to the formation of red urine in rats. In addition, it was shown that the anti-cancer activity in vitro of free Li-GLA and liposomal Li-GLA is almost identical. The tests described suggest that the liposomal galactolipid composition reduces hemolysis, a severe adverse reaction of the drug without affecting its pharmacological effectiveness.

В заключение следует отметить, что в настоящем изобретении приведены данные, свидетельствующие о том, что липидные препараты в полярном растворителе, основанные на галактолипидном материале, обладают улучшенными в сравнении с фосфолипидными препаратами свойствами по всем аспектам, таким как физическая стабильность препаратов, эффективность включения лекарственных средств, а также способность замедлять высвобождение включенных лекарств. In conclusion, it should be noted that the present invention provides evidence that lipid preparations in a polar solvent based on galactolipid material have improved properties in comparison with phospholipid preparations in all aspects, such as physical stability of drugs, drug incorporation efficiency as well as the ability to slow down the release of included drugs.

Claims (12)

1. Применение двуслойного липидного препарата, содержащего полярный растворитель и 0,01 - 90 вес.%, предпочтительно 0,1 - 50 вес.% галактолипидов из злаковых, содержащих, по меньшей мере, 50% дигалактозилдиацилглицеринов и остальное - другие полярные липиды, в качестве носителя активного вещества в фармацевтических, косметических или пищевых продуктах. 1. The use of a bilayer lipid preparation containing a polar solvent and 0.01 to 90 wt.%, Preferably 0.1 to 50 wt.% Of cereal galactolipids containing at least 50% of dihalactosyldiacylglycerols and the rest are other polar lipids, as a carrier of the active substance in pharmaceutical, cosmetic or food products. 2. Применение по п.1, где галактолипиды из злаковых содержат 70 - 80% дигалактозилдиацилглицеринов и 20 - 30% других полярных липидов. 2. The use according to claim 1, where galactolipids from cereals contain 70 - 80% of dihalactosyldiacylglycerols and 20 - 30% of other polar lipids. 3. Применение по п.1, где галактолипиды из злаковых состоят вплоть до 100% из дигалактозилдиацилглицеринов. 3. The use according to claim 1, where galactolipids from cereals consist up to 100% of digalactosyldiacylglycerols. 4. Применение по п.1, где препарат находится в форме геля, содержащего 25 - 90 вес.% галактолипидов из злаковых и остальное - полярный растворитель. 4. The use according to claim 1, where the preparation is in the form of a gel containing 25 to 90 wt.% Galactolipids from cereals and the rest is a polar solvent. 5. Применение по любому из пп.1 - 3, где препарат находится в форме липосом, содержащих 0,01 - 25 вес.% галактолипидов из злаковых и остальное - полярный растворитель. 5. The use according to any one of claims 1 to 3, where the drug is in the form of liposomes containing 0.01 to 25 wt.% Galactolipids from cereals and the rest is a polar solvent. 6. Фармацевтическая композиция, включающая терапевтически активное вещество и двуслойный липидный препарат, содержащий полярный растворитель и 0,01 - 90 вес.%, предпочтительно 0,1 - 50 вес.% материала, формирующего двойной слой, отличающаяся тем, что материал, формирующий двойной слой, представляет собой галактолипиды из злаковых, содержащие, по меньшей мере, 50% дигалактозилдиацилглицеринов и остальное - другие полярные липиды. 6. A pharmaceutical composition comprising a therapeutically active substance and a bilayer lipid preparation containing a polar solvent and 0.01 to 90 wt.%, Preferably 0.1 to 50 wt.% Of a material forming a double layer, characterized in that the material forming a double the layer is galactolipids from cereals containing at least 50% of dihalactosyldiacylglycerols and the rest are other polar lipids. 7. Фармацевтическая композиция по п.6, отличающаяся тем, что галактолипиды из злаковых содержат 70 - 80% диалактозилдиацилглицеринов и 20 - 30% других полярных липидов. 7. The pharmaceutical composition according to claim 6, characterized in that the cereal galactolipids contain 70 - 80% of dialactosyldiacylglycerols and 20 - 30% of other polar lipids. 8. Фармацевтическая композиция по п.6, отличающаяся тем, что галактолипиды из злаковых состоят вплоть до 100% из дигалактозилдиацилглицеринов. 8. The pharmaceutical composition according to claim 6, characterized in that galactolipids from cereals consist up to 100% of digalactosyldiacylglycerols. 9. Фармацевтическая композиция по любому из пп.6 - 8, включающая терапевтически эффективное количество терапевтически активного вещества, 1 - 50 вес.% от всей композиции галактолипидов из злаковых, полярный растворитель и изотонически эффективное количество изотонического агента. 9. The pharmaceutical composition according to any one of claims 6 to 8, comprising a therapeutically effective amount of a therapeutically active substance, 1 to 50 wt.% Of the total composition of cereal galactolipids, a polar solvent, and an isotonically effective amount of an isotonic agent. 10. Фармацевтическая композиция по любому из пп.6 - 9, предназначенная для перорального, энтерального, парентерального, ректального, вагинального, местного, глазного, назального или ушного введения. 10. The pharmaceutical composition according to any one of claims 6 to 9, intended for oral, enteral, parenteral, rectal, vaginal, local, ocular, nasal or ear administration. 11. Фармацевтическая композиция по любому из пп.6 - 9, отличающаяся тем, что терапевтически активное вещество представляет собой соль или эфир γ- линолевой кислоты и количество галактолипидов из злаковых составляет меньше 25 вес.% от общей композиции. 11. The pharmaceutical composition according to any one of claims 6 to 9, characterized in that the therapeutically active substance is a γ-linoleic acid salt or ester and the amount of galactolipids from cereals is less than 25 wt.% Of the total composition. 12. Способ получения фармацевтической композиции по любому из пп.6 - 8, отличающийся тем, что 0,01 - 25 вес.% от всей композиции галактолипидов из злаковых, содержащих, по меньшей мере, 50 вес.% дигалактозилдиацилглицеринов, остальное - другие полярные липиды, смешивают с активным веществом в полярном растворителе в количестве, достигающем вплоть до 100 вес.%. 12. A method of obtaining a pharmaceutical composition according to any one of claims 6 to 8, characterized in that 0.01 to 25 wt.% Of the total composition of cereal galactolipids containing at least 50 wt.% Digalactosyldiacylglycerols, the rest are other polar lipids are mixed with the active substance in a polar solvent in an amount reaching up to 100 wt.%.

Images