JP2706649B2 - Method for trapping compounds in sterol vesicles - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

【０００１】[0001]

【発明の属する技術分野】本発明は、二重層を形成し得
るステロールの有機酸誘導体の塩形態から成るリポソー
ム中への化合物の捕捉についての方法に関するものであ
る。TECHNICAL FIELD The present invention relates to a method for entrapping a compound in a liposome comprising a salt form of an organic acid derivative of sterol capable of forming a bilayer.

【０００２】[0002]

【従来の技術】[Prior art]

１．リポソーム リポソームは内包された水性相を含有する完全に閉鎖さ
れた二重層膜である。リポソームは、種々のマルチラメ
ラベシクル（水性相によって互いに離された同中心的な
膜二重層群によって特徴づけられるタマネギ状構造）ま
たはユニラメラベシクル（単一の膜二重層を有するも
の）である。リポソーム調製の２つのパラメータは、ベ
シクル径と脂質濃度の作用である。 （１）脂質の与えられた量によって囲まれた容積として
定義される捕捉容量は、全脂質のモル当り（ｍｏｌ~¹）
の捕捉リットルの単位として表わされる。捕捉容量は、
ベシクルの脂質組成および媒質のイオン組成によっても
また影響されるリポソームの半径に依存する。（２）二
重層によって隔離された水性成分の画分として定義され
る内包能は、パーセンテージとして表わされる。内包能
は、脂質濃度に直接比例し、より多くの脂質が存在する
場合、より多くの溶質がリポソーム中へと隔離され得る
（ディーマーとアステター、１９８３年、リポソームプ
レパレーション：メソッズ アンド メカニズムス、リ
ポソーム中、エム．オストロ編、マルセル デッカー
インコーポレーテッド、ニューヨーク、第２７〜５１頁
［Ｄｅａｍｅｒ ａｎｄ Ｕｓｔｅｒ，１９８３，Ｌｉ
ｐｏｓｏｍｅＰｒｅｐａｒａｔｉｏｎ：Ｍｅｔｈｏｄｓ
ａｎｄ Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ，ｉｎＬｉｐｏｓｏｍｅ
ｓ，ｅｄ．Ｍ．Ｏｓｔｒｏ，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅ
ｒ，Ｉｎｃ．，ＮＹ，ｐｐ．２７−５１］を参照のこ
と。）。リポソーム調製に関する元来の方法（バングハ
ムら、１９６５年、ジャーナルオブ モレキュール バ
イオロジー １３：２３８−２５２［Ｂａｎｇｈａｍｅ
ｔ．ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１３：２３８−２
５２］は、有機溶媒中にリン脂質を懸濁させ、そして次
に反応容器中にリン脂質の粘稠な沈殿物を残して乾燥す
るまで蒸発させることを含むものであった。次に水性相
の適当な量が添加され、混合物が「膨潤」し、そしてマ
ルチラメラベシクル（以下ＭＬＶと呼称する。）から成
る生成リポソームが、機械的手段により分散させられ
た。生成した膜二重層の構造は、脂質の疎水性（非極
性）「テール」が二重層の中心へ向って配向し、一方親
水性（極性）「ヘッド」が水性相へ向って配向したよう
なものとなっている。この技法は、パパハジョプーロス
とミラー［ｐａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓ ａｎｄ
Ｍｉｌｌｅｒ］（１９６７年、バイオヒミカ エトバイ
オフィジカ アクタ １３５：６２４−６３８［１９６
７，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．１３
５：６２４−６３８］）によって述べられた音波処理さ
れた微小なユニラメラベクシル（以下ＳＵＶと呼称す
る。）への発展の基礎となった。しかしながら、ＭＬＶ
とＳＵＶの双方ともモデルシステムとしては限界がある
ものであった。1. Liposomes Liposomes are completely closed bilayer membranes containing an encapsulated aqueous phase. Liposomes are various multilamellar vesicles (an onion-like structure characterized by concentric membrane bilayers separated from each other by an aqueous phase) or unilamellar vesicles (those having a single membrane bilayer). Two parameters of liposome preparation are the effects of vesicle size and lipid concentration. (1) The capture volume, defined as the volume surrounded by a given amount of lipid, is per mole of total lipid (mol- ¹ )
Expressed as units of captured liters. The capture volume is
It depends on the liposome radius, which is also affected by the vesicle lipid composition and the ionic composition of the medium. (2) The encapsulation capacity, defined as the fraction of the aqueous component separated by the bilayer, is expressed as a percentage. The encapsulation capacity is directly proportional to the lipid concentration, and more solutes can be sequestered into liposomes when more lipids are present (Diemer and Aster, 1983, Liposomal Preparations: Methods and Mechanisms, Liposomes Middle, M. Ostro, Marcel Decker
Incorporated, New York, pp. 27-51 [Diamer and Uster, 1983, Li.
posePreparation: Methods
and Mechanism, in Liposome
s , ed. M. Ostro, Marcel Dekke
r, Inc. , NY, pp .; 27-51]. ). Original method for liposome preparation (Bangham et al., 1965, Journal of Molecular Biology 13 : 238-252 [Banghame
t. al. , J. et al. Mol. Biol. 13 : 238-2
52] involved suspending the phospholipid in an organic solvent and then evaporating to dryness, leaving a viscous precipitate of the phospholipid in the reaction vessel. An appropriate amount of the aqueous phase was then added, the mixture "swelled", and the resulting liposomes consisting of multilamellar vesicles (hereinafter MLV) were dispersed by mechanical means. The structure of the resulting membrane bilayer is such that the hydrophobic (non-polar) "tail" of the lipid is oriented toward the center of the bilayer, while the hydrophilic (polar) "head" is oriented toward the aqueous phase. It has become something. This technique is described in Papahajopoulos and Miller [papahadjopoulos and
Miller] (1967, Bio-Himika Eto Biophysica Actor 135 : 624-638 [196
7, Biochim. Biophys. Acta. 13
5 : 624-638]), which was the basis for the development of sonicated micronillamella vexils (hereinafter referred to as SUVs). However, MLV
And SUV both have limitations as model systems.

【０００３】捕捉容量ないしは内包能を増大させる試み
において、リン脂質二重層からなるリポソームの調製に
関するいくつかの方法が発展してきてはいるが、どの方
法も、有機溶媒の使用を必要としている。これらのいく
つかの方法を以下に簡単に記す。内包能を増加させるた
めに、リポソーム前駆体すなわちミセル、すなわち、極
性ヘッド基が水性相に指向するように配向された脂質分
子の単一層によって囲まれた水性相を含むベシクルを最
初に形成する方法が提案されている。リポソーム前駆体
は、内包されるべき水性溶液を有機溶媒中の極性脂質の
溶液中へ添加し、そして音波処理することで形成され
る。このリポソーム前駆体は、次に、過剰の脂質の存在
下第二の水性相中へ乳化させられ、そして蒸発させられ
る。脂質二重層によって内包された水性相から成る、生
成リポソームは水性相中に分散させられる（エム、シュ
ナイダー［Ｍ．Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ］に対して１９８０
年９月２３日に発行された米国特許第４，２２４，１７
９号を参照のこと。）。内包能を最大にするための他の
試みにおいて、パパハジョプロース（１９８０年１１月
２５日発行の米国特許第４，２３５，８７１号）は、逆
相蒸発ベシクル［ｒｅｖｅｒｓｅ−ｐｈａｓｅ ｅｖａ
ｐｏｒａｔｉｏｎ ｖｅｓｉｃｌｅ］（以下、ＲＥＶと
呼称する。）としてもまた知られているオリゴラメラ脂
質ベシクルを形成するための「逆相蒸発方法［ｒｅｖｅ
ｒｓｅ−ｐｈａｓｅ ｅｖａｐｏｒａｔｉｏｎ ｐｒｏ
ｃｅｓｓ］」を述べている。この方法によると、内包さ
れるべき水性脂質は、有機溶媒中の極性脂質混合物へと
添加される。次に均質な油中水［ｗａｔｅｒ−ｉｎ−ｏ
ｉｌ］型エマルジョンが形成され、そしてゲルが形成さ
れるまで有機溶媒が蒸発させられる。ゲルは次に、水性
媒体中のゲル様混合物を分散させることにより、懸濁液
へ転化される。生成されたＲＥＶは、多くのユニラメラ
ベクシル（ラージユニラメラベクシル、ＬＵＶ）と、大
きな内的水性空間を有するわずか二、三の同中心的二重
層によって特徴づけられるわずかのオリゴラメラベシク
ルから成る。薬剤供給系へのリポソームの使用の可能性
に関しては、多くの記述がある。例えば、イゥ−ヤァ
ラーマンとエリザベス エイ．セルニー［Ｙｅｕｈ−Ｅ
ｒｈＲａｈｍａｎ ａｎｄ Ｅｌｉｚａｂｅｔｈ Ａ．
Ｃｅｒｎｙ］に対して１９７６年１１月２３日に発行さ
れた米国特許第３，９９３，７５４号や、バリーディ
ー．シェアーズ［Ｂａｒｒｙ Ｄ．Ｓｅａｒｓ］に対し
て１９７９年３月２０日に発行された米国特許第４，１
４５，４１０号を参照されたい。リポソーム薬剤供給系
においては、医薬は、リポソーム形成の間に捕捉され、
次いで治療されるべき患者へと投与される。この医薬
は、水にあるいは非極性溶媒に可溶である。このような
記述の代表的なものは、パパハジョプーロスとスゾカ
［Ｓｚｏｋａ］に対して１９８０年１１月２５日発行さ
れた米国特許第４，２３５，８７１号およびエム．シュ
ナイダーに対して１９８０年９月２３日に発行された米
国特許第４，２２４，１７９号である。生体内に使用す
るリポソームを調製する場合、（１）リポソームの調製
の間の有機溶媒を使用する必要性をなくすこと、および
（２）捕捉物質のより大きな容量と濃度が、一服用量当
りに供給されることが可能となるよう、内包能および捕
捉容量を最大化することが、有利となるであろう。[0003] In an attempt to increase the trapping capacity or encapsulation capacity, several methods for the preparation of liposomes composed of phospholipid bilayers have been developed, but all require the use of organic solvents. Some of these methods are briefly described below. To increase the encapsulation capacity, a method is first to form a liposome precursor or micelle, i.e., a vesicle comprising an aqueous phase surrounded by a monolayer of lipid molecules oriented such that the polar head groups are oriented in the aqueous phase. Has been proposed. Liposomal precursors are formed by adding the aqueous solution to be encapsulated to a solution of polar lipids in an organic solvent and sonicating. The liposome precursor is then emulsified into a second aqueous phase in the presence of excess lipid and evaporated. The resulting liposomes, consisting of an aqueous phase encapsulated by a lipid bilayer, are dispersed in the aqueous phase (M. Schneider, 1980).
US Patent No. 4,224,17, issued September 23,
See No. 9. ). In another attempt to maximize encapsulation capacity, papajajoprose (U.S. Pat. No. 4,235,871 issued Nov. 25, 1980) uses reverse-phase evaporative vesicles [reverse-phase eva].
A "reverse phase evaporation method [reve] for forming oligolamellar lipid vesicles, also known as" portion vehicles "(hereinafter referred to as REV).
rse-phase evaporation pro
cess]]. According to this method, the aqueous lipid to be included is added to a polar lipid mixture in an organic solvent. Next, a homogeneous water-in-oil [water-in-o
An [il] type emulsion is formed and the organic solvent is evaporated until a gel is formed. The gel is then converted to a suspension by dispersing the gel-like mixture in an aqueous medium. The REV produced consists of a number of unilamellar vesicles (Large Unilamellar Vexil, LUV) and a few oligolamellar vesicles characterized by only a few concentric bilayers with large internal aqueous spaces. There are many statements regarding the potential use of liposomes in drug delivery systems. For example,
Rahman and Elizabeth A. Cerny [Yeuh-E
rhRahman and Elizabeth A.
U.S. Pat. No. 3,993,754 issued Nov. 23, 1976 to Barry. Shares [Barry D. Sears], U.S. Pat. No. 4,1,1 issued Mar. 20, 1979.
See No. 45,410. In liposome drug delivery systems, the drug is entrapped during liposome formation,
It is then administered to the patient to be treated. The medicament is soluble in water or in a non-polar solvent. Representative of such descriptions are U.S. Pat. No. 4,235,871, issued Nov. 25, 1980 to Papaha Jopulos and Szoka, and M.M. U.S. Pat. No. 4,224,179 issued Sep. 23, 1980 to Schneider. When preparing liposomes for use in vivo, (1) eliminating the need to use an organic solvent during the preparation of the liposomes, and (2) a larger volume and concentration of capture substance per dose It would be advantageous to maximize encapsulation capacity and capture volume so that it could be delivered.

【０００４】２ 水溶性ステロール 種々のステロールとそれらの水溶性誘導体が、化粧用、
薬学用および診断学用の目的のために用いられている。
水溶性ステロールとしては例えば、分枝脂肪酸コレステ
ロールエステル、ステロールエステルおよびＰＥＧ−植
物ステロールが化粧用調製品において使用されている
（欧州特許出願第２８，４５６号、米国特許第４，３９
３，０４４号ならびにシュライダー、ドラッグ アンド
コスメティック インダストリー、１９８３年９月第
３３頁および１９８３年１０月第４６頁［Ｓｃｈｒａｄ
ｅｒ，Ｄｒｕｇ ａｎｄ Ｃｏｓｍｅｔｉｃ Ｉｎｄｕ
ｓｔｒｙ，Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ １９８３，ｐ．３３
ａｎｄ Ｏｃｔｏｂｅｒ １９８３，ｐ．４６］）。サ
ッカーとキューン［Ｔｈａｋｋａｒ ａｎｄ Ｋｕｅｈ
ｎ］（１９６９年、ジャーナル・オブ・ファーマシュー
ティカル・サイエンス５８（７）：８５０−８５２［１
９６９，Ｊ．Ｐｈａｒｍ，Ｓｃｉ．５８（７）： ８５
０−８５２）は、１〜５％濃度のステロイド非イオン性
界面活性剤、特に、エトキシ化コレステロール（すなわ
ち、ＰＥＧ−コレステロール）の水性溶液を用いてのス
テロイドホルモンの安定化を開示している。しかしなが
ら、生体内での可溶化ステロイドホルモンの有効性ある
いは利用は示されていない。多くの水溶性コレステロー
ルが調製されそして生体液中のコレステロール値の測定
に関する水溶性標準として用いられている（米国特許第
３，８５９，０４７号、米国特許第４，０４０，７８４
号、米国特許第４，０４２，３３０号、米国特許第４，
１８３，８４７号、米国特許第４，１８９，４００号お
よび米国特許第４，２２４，２２９号）。シニツズキー
ら［Ｓｈｉｎｉｔｚｋｙ ｅｔ．ａｌ．］（１９７９
年、プロスィーデング オブ ザ ナショナル アカデ
ミー オブ サイエンスィズ オブ ザ ユナイテット
ステート オブ アメリカ ７６：５３１３〜５３１
６［１９７９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ７６：５３１３〜５３１６］は低濃度のコレ
ステロールおよびコレステリルヘミサクシネートを含有
する組織培養培地中に腫瘍細胞を培養した。細胞膜内へ
のコレステロールまたはコレステリルヘミサクシネート
の取込みは、膜流動性を減少し、そして膜−脂質ミクロ
ビスコシティーを増加させた。コレステロールおよびそ
の他のステロールはまた、脂質二重層の物理的特性を変
えるためにリン脂質リポソーム膜内へ取込まれている。
例えば、最近の抜粋において、エレンズら［Ｅｌｌｅｎ
ｓ ｅｔ．ａｌ．］（１９８４年、バイオフィジィック
ス ジャーナル ４５：７０ａ［１９８４，Ｂｉｏｐｈ
ｙｓ．Ｊ．４５：７０ａ］） はホスファチジルエタノ
ールアミンおよびコレステリルヘミサクシネートから成
る脂質ベシクルの安定性におけるＨ⁺ の効果について論
議している。事実、ブロッカホフとラムサミー［Ｂｒｏ
ｃｋｅｒｈｏｆｆ ａｎｄ Ｒａｍｓａｍｍｙ］（１９
８２年、バイオヒミカ・エ・バイオフィジカ・アクタ
６９１：２２７〜２３２［１９８２，Ｂｉｏｃｈｉｍ．
Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．］）は、安定化する親水性
アンカーが供給されるならば二重層が完全にコレステロ
ールから成るもので構成され得ることを報告している。
マルチラメラおよびユニラメラコレステロールリポソー
ムは上述した周知の方法において、有機溶媒中に分散さ
れたコレステロール誘導体（すなわち、コレステロール
ホスフォコリン、コレステロール−ポリエチレングリ
コール、またはコレステロール−ＳＯ₄ ）を乾燥するま
で蒸発させ、反応容器中に沈殿した脂質フィルムを残す
ことで調製された。この脂質フィルムはマイクロチップ
を有する超音波ホモジナイザーを用いて２ｍｌ水下で音
波処理された。マルチラメラベシクルの形成には１０分
間の音波処理が必要であり、一方スモールユニラメラベ
クシルの形成には４時間の音波処理が必要であった。こ
のマルチラメラリポソーム生成懸濁液は乳白色で、一方
ユニラメラリポソームの懸濁液は透明であった。 2 Water-soluble sterols Various sterols and their water-soluble derivatives are used in cosmetics,
It is used for pharmaceutical and diagnostic purposes.
As water-soluble sterols, for example, branched fatty acid cholesterol esters, sterol esters and PEG-plant sterols are used in cosmetic preparations (EP-A-28,456, U.S. Pat. No. 4,39).
No. 3,044 and Schlider, Drag and Cosmetic Industry, September 1983, p. 33 and October 1983, p. 46 [Schrad
er, Drug and Cosmetic Indu
stry, September 1983, p. 33
and October 1983, p. 46]). Soccer and Kuhn [Thakkar and Kueh
n] (1969, Journal of Pharmaceutical Sciences 58 (7): 850-852 [1
969, J.C. Pharm, Sci. 58 (7): 85
0-852) discloses the stabilization of steroid hormones with aqueous solutions of steroid non-ionic surfactants, especially ethoxylated cholesterol (ie PEG-cholesterol) at a concentration of 1-5%. However, the efficacy or utilization of solubilized steroid hormones in vivo has not been demonstrated. Many water-soluble cholesterols have been prepared and used as water-soluble standards for measuring cholesterol levels in biological fluids (US Pat. No. 3,859,047, US Pat. No. 4,040,784).
No. 4,042,330; U.S. Pat.
183,847, U.S. Pat. No. 4,189,400 and U.S. Pat. No. 4,224,229). Shinitzzky et al. [Shinitzky et. al. ] (1979
Year, Prossing of the National Academy of Sciences of the United State of America 76: 5313-531
6 [1979, Proc. Natl. Acad. Sc
i. USA 76: 5313-5316] cultured tumor cells in tissue culture media containing low concentrations of cholesterol and cholesteryl hemisuccinate. Incorporation of cholesterol or cholesteryl hemisuccinate into cell membranes reduced membrane fluidity and increased membrane-lipid microviscosities. Cholesterol and other sterols have also been incorporated into phospholipid liposome membranes to alter the physical properties of the lipid bilayer.
For example, in a recent excerpt, Ellens et al. [Ellen
set. al. (1984, Biophysics Journal 45 : 70a [1984, Bioph
ys. J. 45 : 70a]) discuss the effect of H ^{+ on} the stability of lipid vesicles consisting of phosphatidylethanolamine and cholesteryl hemisuccinate. In fact, Brokkahoff and Ramsammy [Bro
cerhoff and Ramsammy] (19
1982, Bio-Himika & Bio-Physica Acta
691: 227-232 [1982, Biochim.
Biophys. Acta. ]) Report that the bilayer could be composed entirely of cholesterol if provided with a stabilizing hydrophilic anchor.
Multilamellar and unilamellar cholesterol liposomes are prepared by evaporating a cholesterol derivative (ie, cholesterol phosphocholine, cholesterol-polyethylene glycol, or cholesterol-SO ₄ ) dispersed in an organic solvent to dryness in a well-known manner as described above, It was prepared by leaving a lipid film precipitated in it. This lipid film was sonicated under 2 ml of water using an ultrasonic homogenizer having a microchip. Formation of multilamellar vesicles required sonication for 10 minutes, while formation of small unilamellar vesicles required sonication for 4 hours. The suspension of the multilamellar liposome was milky white, while the suspension of the unilamellar liposome was clear.

【０００５】[0005]

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、水溶性
活性物質のより高い服用量の投与を提供するためおよび
水不溶性の活性物質の投与を容易とするために、生体内
投与に適したステロールベシクルへ生物学的活性物質を
有効に捕捉する方法は、これまでに明らかとはされてお
らず、これらの方法を提供することが本発明の課題であ
る。However, in order to provide higher dose administration of water-soluble actives and to facilitate administration of water-insoluble actives, sterol vesicles suitable for in vivo administration have been developed. Methods for effectively capturing biologically active substances have not been elucidated so far, and it is an object of the present invention to provide these methods.

【０００６】[0006]

【課題を解決するための手段】本発明は、ステロールの
有機酸誘導体の塩形態からなる二重層からなるリポソー
ム中への種々の化合物の捕捉方法である。即ち本発明
は、（１）（ａ）有機溶媒中に水不溶性化合物を溶解
し、（ｂ）該有機溶媒を除去して水不溶性化合物で構成
されるフィルムを残し、（ｃ）閉鎖されたベシクルを形
成し得るステロールの有機酸誘導体の塩形態を完全に閉
鎖されたベシクルを形成するのに十分な量で水性相に添
加し、混合物を振盪することによって得られるマルチラ
メラベシクルのステロールリポソームの乳白色の懸濁液
もしくは該乳白色の懸濁液を、さらに音波処理して得ら
れるユニラメラベシクルの懸濁液を上記フィルムへ添加
する、ことからなるステロールベシクル中への水不溶性
化合物の捕捉方法、 （２）（ａ）水不溶性化合物および水性相中で二重層を
形成し得るステロールの有機酸誘導体の塩形態を、有機
溶媒中に共溶解させ、（ｂ）該有機溶媒を蒸発させて、
上記化合物およびステロールの有機酸誘導体の塩形態を
含有するフィルムを残し、（ｃ）水性相を該フィルムに
添加し、そして完全に閉鎖されたマルチラメラベシクル
の乳白色の懸濁液が形成するように振盪する、ことから
なるステロールベシクル中への水不溶性化合物の捕捉方
法、および （３）ユニラメラベシクルを形成するために、乳白色の
懸濁液をさらに音波処理することを有するものである上
記（２）記載の方法、に関するものである。SUMMARY OF THE INVENTION The present invention is a method for trapping various compounds in a liposome composed of a bilayer composed of a salt of an organic acid derivative of sterol. That is, the present invention provides (1) (a) dissolving a water-insoluble compound in an organic solvent, (b) removing the organic solvent to leave a film composed of the water-insoluble compound, and (c) closed vesicle. Milky white of a multilamellar vesicle sterol liposome obtained by adding a salt form of an organic acid derivative of a sterol that is capable of forming a vesicle to the aqueous phase in an amount sufficient to form a completely closed vesicle. Adding a suspension of unilamellar vesicles obtained by further sonicating the suspension of the above or the milky suspension to the above-mentioned film, the method of capturing a water-insoluble compound in sterol vesicles, 2) (a) a water-insoluble compound and a salt form of an organic acid derivative of sterol capable of forming a double layer in the aqueous phase are co-dissolved in an organic solvent, and (b) the organic solvent is evaporated. Let me emit
(C) adding the aqueous phase to the film, leaving a film containing the compound and a salt form of an organic acid derivative of a sterol, and forming a milky suspension of a fully closed multilamellar vesicle. Shaking the method of trapping the water-insoluble compound in sterol vesicles, and (3) further sonicating the milky suspension to form a unilamellar vesicle. ) Method described above.

【０００７】化合物の捕捉は、本明細書において、ステ
ロール二重層内への水不溶性化合物の捕捉として定義さ
れる。本発明のステロールリポソームは、捕捉した化合
物の生体内投与に特に有用であり、この場合、ステロー
ルの有機酸誘導体の生体適合性塩形態がリポソームの調
製に用いられるべきである。実際、生体内投与に関し
て、ステロールの有機酸誘導体のトリス（ヒドロキシメ
チル）アミノメタン塩（トリス−塩）形態がベシクル二
重層構成成分として特に有用である。ステロールベシク
ルを調製する方法は、水性緩衝溶液に、水性成分を捕捉
する完全に閉塞された二重層を形成するのに十分な量
の、閉塞二重層を形成し得るステロールの有機酸誘導体
の塩形態を添加することを包含するものである。マルチ
ラメラベシクルの懸濁液はこの混合物を振盪することに
よって形成される。水性緩衝溶液が溶液中に該塩の対イ
オンをも含んでいるとすると、ベシクルの形成は促進さ
れる。さらにまた、ステロールの有機酸誘導体の解離化
塩形態が中性ｐＨで負に帯電されるとすると、水性緩衝
溶液は本質的に二価または多価カチオンが存在しないも
のとされるべきである。同様にステロールの有機酸誘導
体の解離化塩形態が中性ｐＨで正に帯電されるとする
と、水性緩衝溶液は本質的に二価または多価アニオンが
存在しないものとされるべきである。懸濁液へのエネル
ギーの適用、例えば音波処理、またはフレンチ加圧セル
（フレンチプレス［Ｆｒｅｎｃｈ Ｐｒｅｓｓ］）を通
してのもしくは適当な孔径を有する多孔性フィルターを
通してのベシクルの押出しは、マルチラメラステロール
ベシクルをユニラメラベクシルへと転化させるであろ
う。本発明のステロールベシクル中へ水溶性化合物、部
分水溶性化合物または水不溶性化合物を捕捉させるため
には、いくつかの方法が可能である。ステロール二重層
中へ分配されるもの（例えば、水不溶性化合物）または
水溶性化合物のいずれであっても、ベシクル形成の間に
この物質をベシクル中に捕捉するために、ベシクル形成
以前に水性相へ添加することができる。あるいはまた、
水不溶性または脂溶性である化合物は、ベシクルが形成
された後に、ステロールベシクルの懸濁液に添加される
ことができ、この場合、化合物はステロール二重層中に
分配される。他の実施態様において、水溶性化合物およ
びステロールの有機酸誘導体の塩形態は、この双方を溶
解する（相互可溶とする）ために有機溶媒へ添加するこ
とができる。有機溶媒は、次に、水不溶性化合物とステ
ロール誘導体の均質な分配物を含有するフィルムを残し
て蒸発される。水不溶性化合物を捕捉するステロールリ
ポソームは、水性緩衝溶液がフィルムへ振盪しながら添
加された時に形成される。本発明のステロールリポソー
ムは、水不溶性の生物学的活性物質または水中にわずか
に溶ける生物学的活性物質を捕捉するのに用いられる場
合に、特に有利である。これは、水不溶性薬剤の生体内
投与を可能とし、そしてさらに、これは、服用量：容量
比の変化を許容するゆえに、高濃度の水不溶性化合物の
生体内投与を可能とするものである。本発明のステロー
ルベシクルは生体外的な診断学的検定法において用いら
れ得る。[0007] Compound entrapment is defined herein as entrapment of a water-insoluble compound within the sterol bilayer. The sterol liposomes of the present invention are particularly useful for in vivo administration of the entrapped compound, in which case a biocompatible salt form of an organic acid derivative of the sterol should be used in preparing the liposomes. In fact, for in vivo administration, the tris (hydroxymethyl) aminomethane salt (tris-salt) form of the organic acid derivative of sterol is particularly useful as a vesicle bilayer component. A method of preparing sterol vesicles comprises the steps of: preparing an aqueous buffer solution in an amount sufficient to form a completely occluded bilayer entrapping the aqueous component, in the form of a salt of an organic acid derivative of a sterol capable of forming an occluded bilayer. Is added. A suspension of multilamellar vesicles is formed by shaking the mixture. If the aqueous buffer solution also contains a counterion of the salt in solution, vesicle formation is promoted. Furthermore, given that the dissociated salt form of the organic acid derivative of sterol is negatively charged at neutral pH, the aqueous buffer solution should be essentially free of divalent or multivalent cations. Similarly, given that the dissociated salt form of the organic acid derivative of sterol is positively charged at neutral pH, the aqueous buffer solution should be essentially free of divalent or polyvalent anions. Application of energy to the suspension, such as sonication, or extrusion of the vesicles through a French pressurized cell (French Press) or through a porous filter having the appropriate pore size, may be performed by unilamellar sterol vesicles. It will be converted to lamelavexil. Several methods are possible for trapping water-soluble, partially water-soluble or water-insoluble compounds in the sterol vesicles of the present invention. Whatever is distributed into the sterol bilayer (eg, a water-insoluble compound) or a water-soluble compound, to trap this substance in the vesicle during vesicle formation, the Can be added. Alternatively,
The compound, which is water-insoluble or fat-soluble, can be added to the sterol vesicle suspension after the vesicles have been formed, in which case the compound partitions into the sterol bilayer. In another embodiment, the salt form of the water-soluble compound and the organic acid derivative of sterol can be added to an organic solvent to dissolve (make them mutually soluble) both. The organic solvent is then evaporated leaving a film containing a homogeneous distribution of the water-insoluble compound and the sterol derivative. Sterol liposomes that trap water-insoluble compounds are formed when an aqueous buffer solution is added to the film with shaking. The sterol liposomes of the present invention are particularly advantageous when used to entrap water-insoluble or sparingly soluble biologically active agents in water. This allows for the in vivo administration of the water-insoluble drug, and moreover, it allows for the in vivo administration of high concentrations of the water-insoluble compound, because it allows for changes in the dose: volume ratio. The sterol vesicles of the present invention can be used in in vitro diagnostic assays.

【０００８】本発明のステロールベシクルは、（１）容
易にかつ迅速に形成される、（２）リン脂質−ＭＬＶと
比較して高い内包能を有する、（３）生体内に投与され
た場合、放出されそして新陳代謝される生物学的に活性
物質なあるいは薬剤を捕捉することができる。生体内で
の捕捉物質がどのような経路をたどるかは、投与の様式
に依存する。本発明は、水不溶性化合物のリポソーム中
への捕捉、即ち閉塞した二重層を形成し得るステロール
の有機酸誘導体の塩形態よりなる二重層への捕捉方法に
関するものである。本発明のステロールリポソームは、
（１）ステロール二重層中へと分配する水不溶性化合物
を捕捉する、あるいはまた（２）水溶性化合物と水不溶
性化合物の双方を１つのリポソーム調製物中へ捕捉する
ように調製され得る。水性溶液中で完全に閉鎖された二
重層（すなわちリポソーム）を形成し得るステロールの
有機酸誘導体の任意の塩形態が本発明の実施において用
いられ得る。ステロールの有機酸誘導体の特定の塩形態
の好適性は、水溶性化合物が外部環境と接触してないた
めに、水溶性化合物を捕捉するその能力の如何にかかっ
ている。任意のリポソームの水性成分中での捕捉が生じ
たことを明確に測定するために、以下の基準が確立され
ている（セサとウェイシュマン、１９７０年 ジャーナ
ル オブ バイオロジー アンド ケミストリー ２４
５：３２９５［Ｓｅｓｓａ ａｎｄ Ｗｅｉｓｓｍａ
ｎ，１９７０，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４５：３２
９５］を参照のこと。）：（ａ）ゲル濾過によって検定
された際に捕捉された化合物と遊離の化合物が完全に分
離されていなければならない、（ｂ）最外郭のベシクル
二重層と捕捉した化合物との間の疎水性相互作用または
荷電−荷電相互作用があってはならない。というのは、
この相互作用が分子ふるいによるリポソームからの遊離
化合物の分離を達成することを妨害し、それによって見
せかけの捕捉ないしは内包能を不自然に増加させるため
である。この可能性を回避するために、あらかじめ形成
されたリポソームの懸濁液に添加された水溶性化合物
が、あらかじめ形成されたリポソームと相互に溶出しな
いことを示すべきである。（ｃ）洗浄剤あるいは他の膜
摂動剤の使用によるゲル濾過されたリポソームの破裂
は、リポソームピークと一致する位置から遊離分子で溶
出する位置への、捕捉された分子のゲル濾過パターンに
おけるシフトを誘導するものでなければならない。The sterol vesicles of the present invention are (1) easily and rapidly formed, (2) have a high encapsulation capacity as compared to phospholipid-MLV, and (3) when administered in vivo, Capable of capturing released and metabolized biologically active substances or drugs. The route that the capture substance follows in vivo depends on the mode of administration. The present invention relates to a method for trapping a water-insoluble compound in a liposome, that is, a trapping method for forming a closed bilayer into a bilayer formed of a salt of an organic acid derivative of a sterol. The sterol liposome of the present invention,
It can be prepared to (1) capture water-insoluble compounds that partition into the sterol bilayer, or (2) capture both water-soluble and water-insoluble compounds into one liposome preparation. Any salt form of an organic acid derivative of a sterol that can form a completely closed bilayer (ie, a liposome) in an aqueous solution can be used in the practice of the present invention. The suitability of a particular salt form of an organic acid derivative of a sterol depends on its ability to trap the water-soluble compound because the compound is not in contact with the external environment. The following criteria have been established to unambiguously determine that entrapment of any liposome in the aqueous component has occurred (Sesa and Weishmann, 1970 Journal of Biology and Chemistry 24).
5 : 3295 [Sessa and Weissma]
n, 1970, J. Am. Biol. Chem. 245 : 32
95]. ): (A) the captured and free compounds must be completely separated when assayed by gel filtration; (b) the hydrophobicity between the outermost vesicle bilayer and the captured compounds There must be no interaction or charge-charge interaction. I mean,
This interaction prevents the molecular sieve from achieving the separation of the free compound from the liposome, thereby unnaturally increasing the apparent trapping or encapsulating capacity. To avoid this possibility, it should be shown that the water-soluble compounds added to the suspension of preformed liposomes do not elute with the preformed liposomes. (C) Rupture of gel-filtered liposomes by use of detergents or other membrane perturbants causes a shift in the gel filtration pattern of the captured molecules from a position coinciding with the liposome peak to a position eluting with free molecules. Must be guiding.

【０００９】一般に、有機酸の付加により変性され得る
任意のステロールが、本発明の実施において用いられ得
る。例えばこのようなステロールとしては、コレステロ
ール、ビタミンＤ、植物ステロール類（シトステロー
ル、カンペステロール、スチグマステロールおよび同様
のものが含まれるが、何らこれらに限定されるものでは
ない。）、ステロイドホルモン類および同様のものが含
まれるが、もちろんこれらに限定されるものではない。
ステロールを誘導体化するのに用いられ得る有機酸は、
カルボン酸類、ジカルボン酸類、ポリカルボン酸類、ヒ
ドロキシ酸類、アミノ酸類およびポリアミノ酸類を含む
が、もちろんこれらに限定されるものではない。塩形態
は有機酸の水溶解性を高めるゆえに、任意の有機酸がス
テロールを誘導体化するために用いられ得る。しかしな
がら、有機酸部分自身が水溶性である場合には、ある利
点が得られる。このような水溶性有機酸部分は、酢酸、
プロピオン酸、酪酸、吉草酸および同様のものなどのよ
うな水溶性脂肪族カルボン酸類（注：炭素数４個までの
酸は水と混和する、炭素数５個の遊離酸は部分的に溶解
し、より長い鎖を有する遊離酸は実質的に不溶性とな
る。）；マロン酸、コハク酸、グルタル酸、アジピン
酸、ピメリン酸、マレイン酸および同様のものなどのよ
うな水溶性脂肪族ジカルボン酸類（注：より短い鎖のも
のは、水中で幾分かより溶解する。水中での溶解性のボ
ーダラインは炭素数６ないし７で起こる。）；そしてヘ
ミメリチン酸、トリメシン酸、サクシンイミドおよび同
様なものなどのような水不溶性芳香族ジカルボン酸類；
ポリカルボン酸類；グリコール酸、乳酸、マンデル酸、
グリセリン酸、リンゴ酸、洒石酸、クエン酸および同様
のものなどのような水溶性ヒドロキシ酸（注：カルボニ
ル基の第α位の炭素に付着した分枝鎖を有するα−ヒド
ロキシ酸は加水分解をより受けにくく、そしてそれゆ
え、本発明の実施において有利である。）；ならびに任
意のアミノ酸類およびポリアミノ酸類が含まれるが、も
ちろんこれらに限定されるわけではない。有機酸は、周
知の方法（例えば米国特許第３，８５９，０４７号、米
国特許第４，０４０，７８４号、米国特許第４，０４
２，３３０号、米国特許第４，１８３，８４７号、米国
特許第４，１８９，４００号を参照のこと。）を用いて
エステルまたはエーテル結合を介してステロールの水酸
基へと結合されることができる。誘導体化ステロールの
塩形態は、ステロールの有機酸誘導体と塩の対イオン
（例えば、塩の遊離塩基）の双方を適当な揮発性溶媒中
に溶解し、そして該溶媒を蒸発あるいは同様の技法によ
り除去し、ステロールの有機酸誘導体の塩形態からなる
残留物を残すことにより調製され得る。用いられ得る対
イオンとしては、トリス（［ｔｒｉｓ］ トリス（ヒド
ロキシメチル）アミノメタン）、２−アミノ−２−メチ
ル−１，３−プロパンジオール、２−アミノエタノー
ル、ビス−トリスプロパン、トリエタノールアミンおよ
び同様なものが含まれ（もちろんこれらに限定されるわ
けではない。）、相応する塩が形成される。実際、ミコ
ナゾール遊離塩基および同様のものなどのようなイオン
化可能な生物学的活性剤の遊離塩基が対イオンとして用
いられ得る。In general, any sterol that can be modified by the addition of an organic acid can be used in the practice of the present invention. For example, such sterols include cholesterol, vitamin D, plant sterols (including, but not limited to, sitosterol, campesterol, stigmasterol and the like), steroid hormones and Similar ones are included, but of course are not limited to these.
Organic acids that can be used to derivatize sterols are
It includes, but is not limited to, carboxylic acids, dicarboxylic acids, polycarboxylic acids, hydroxy acids, amino acids and polyamino acids. Any organic acid can be used to derivatize sterols, since the salt form increases the water solubility of the organic acid. However, certain advantages are obtained if the organic acid moiety itself is water-soluble. Such water-soluble organic acid moieties include acetic acid,
Water-soluble aliphatic carboxylic acids such as propionic acid, butyric acid, valeric acid and the like (Note: Acids with up to 4 carbon atoms are miscible with water; free acids with 5 carbon atoms are partially soluble. , Free acids with longer chains become substantially insoluble.); Water-soluble aliphatic dicarboxylic acids such as malonic acid, succinic acid, glutaric acid, adipic acid, pimelic acid, maleic acid and the like ( Note: shorter chains are somewhat more soluble in water. Borderlines soluble in water occur at 6 to 7 carbon atoms.); And hemimellitic acid, trimesic acid, succinimide and the like. Water-insoluble aromatic dicarboxylic acids such as
Polycarboxylic acids; glycolic acid, lactic acid, mandelic acid,
Water-soluble hydroxy acids such as glyceric acid, malic acid, oxalic acid, citric acid and the like (Note: α-hydroxy acids with a branched chain attached to the carbon at position α of the carbonyl group are hydrolyzed And is therefore advantageous in the practice of the present invention.); And any amino acids and polyamino acids, of course, but not limited to. Organic acids can be prepared by known methods (eg, US Pat. No. 3,859,047, US Pat. No. 4,040,784, US Pat. No. 4,044).
See U.S. Pat. No. 2,330, U.S. Pat. No. 4,183,847, U.S. Pat. No. 4,189,400. ) Can be attached to the hydroxyl group of the sterol via an ester or ether linkage. The salt form of the derivatized sterol is obtained by dissolving both the organic acid derivative of the sterol and the counterion of the salt (eg, the free base of the salt) in a suitable volatile solvent and removing the solvent by evaporation or a similar technique. And leaving a residue consisting of the salt form of the organic acid derivative of sterol. Counterions that can be used include tris ([tris] tris (hydroxymethyl) aminomethane), 2-amino-2-methyl-1,3-propanediol, 2-aminoethanol, bis-trispropane, triethanolamine And the like, of course, but not limited to, and the corresponding salts are formed. Indeed, the free base of an ionizable biologically active agent such as miconazole free base and the like can be used as a counterion.

【００１０】本発明で用いられるステロールリポソーム
は、二重層を形成し得るステロールの有機酸誘導体の塩
形態を、該誘導体化ステロールがベシクル（すなわち、
捕捉した水性成分を含有する完全に閉鎖した二重層）を
形成するのに十分な量存在するように、水性相へ添加す
ることにより調製され得る。この調製物は、次にマルチ
ラメラコレステロールベシクルの乳白色の懸濁液が形成
されるまで振盪される。好ましい実施態様においては、
水性相は、ベシクル形成を促進するように溶液中に該塩
を含むべきである。さらにまた、ステロールの有機酸誘
導体の解離塩形態が中性ｐＨで負に荷電されている場合
には、水性緩衝溶液は本質的に多価カチオンの存在しな
いものでなければならない。同様に、有機酸誘導体の解
離塩形態が中性ｐＨにおいて正に荷電されている場合に
は、水性緩衝溶液は、本質的に多価アニオンの存在しな
いものでなければならない。マルチラメラベシクル形成
に関する報告された方法（例えば、ブロッカホフとラム
サミー、１９８２年、バイオヒミカ・エ・バイオフィジ
カ・アクタ ６９１：２２７〜２３２［Ｂｒｏｃｋｅｒ
ｈｏｆｆ ａｎｄ Ｒａｍｓａｎｎｙ，１９８２，Ｂｉ
ｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｉｓ．Ａｃｔａ．６９１：２２
７−２３２］のリン脂質ベシクルまたはコレステロール
リポソーム）との完全な差異として、本発明のステロー
ルマルチラメラベシクルの形成に関する方法は、有機溶
媒の使用を必要としない。さらにまた、ブロッカホフと
ラムサミーの方法（上記）とは異なり、ステロールマル
チラメラベシクルを形成するために音波処理は必ずしも
必要ではない。事実、本発明のステロールマルチラメラ
ベシクルの乳白色の懸濁液の音波処理、あるいは後に続
く音波処理を伴なうフレンチプレス（エスエルエム−ア
ミンコ［ＳＬＭ−Ａｍｉｎｃｏ］、アラバマ、イリノイ
州）の使用は、マルチラメラステロールベシクルの乳白
色の懸濁液をユニラメラステロールベクシルの透明な懸
濁液へと転化するために用いることができる。同様に直
径１００ｎｍに等しいあるいはこれ以下の孔径を有する
フィルターを通しての適当な圧力下でのマルチラメラス
テロールベシクルの多段階押出しは、ユニラメラステロ
ールベクシルを得るために用いることが可能である。こ
の押出し技法は、「ユニラメラベクシル調製のための押
出し技法［Ｅｘｔｒｕｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｆ
ｏｒ ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ Ｕｎｉｌａｍｅｌｌａｒ
Ｖｅｓｉｃｌｅｓ］」に関するキューリスら［Ｃｕｌｌ
ｉｓ ｅｔ ａｌ．］によって１９８４年６月２０日に
出願された同時係属出願一連番号第６２２，６９０号中
に詳細に述べられており、参照されたい。The sterol liposome used in the present invention comprises a salt form of an organic acid derivative of sterol capable of forming a bilayer, wherein the derivatized sterol is a vesicle (ie,
It can be prepared by adding to the aqueous phase such that it is present in an amount sufficient to form a completely closed bilayer containing the entrapped aqueous component). This preparation is then shaken until a milky suspension of multilamellar cholesterol vesicles is formed. In a preferred embodiment,
The aqueous phase should include the salt in solution to promote vesicle formation. Furthermore, if the dissociated salt form of the organic acid derivative of sterols is negatively charged at neutral pH, the aqueous buffer solution must be essentially free of polyvalent cations. Similarly, if the dissociated salt form of the organic acid derivative is positively charged at neutral pH, the aqueous buffer solution must be essentially free of polyvalent anions. Reported methods for multilamellar vesicle formation (e.g., Brokkahoff and Ramsami, 1982, Bio-Himika et Biophysica acta 691 : 227-232 [Blocker
Hoff and Ramsany, 1982, Bi.
ochim. Biophis. Acta. 691 : 22
7-232], the method for forming sterol multilamellar vesicles of the present invention does not require the use of organic solvents. Furthermore, unlike the Blockerhof and Ramsammy method (described above), sonication is not necessary to form sterol multilamellar vesicles. In fact, the use of a French press (SLM-Aminco, Alabama, Ill.) With the sonication of a milky suspension of the sterol multilamellar vesicles of the present invention, or with subsequent sonication, is not a multi-product. It can be used to convert a milky suspension of lamella sterol vesicles to a clear suspension of unilamella sterol vexyl. Similarly, multi-stage extrusion of multilamellar sterol vesicles under appropriate pressure through a filter having a pore size equal to or less than 100 nm in diameter can be used to obtain unilamellar sterol vesils. This extrusion technique is described in "Extrusion Technique for Preparing Unilamella Vexil [Extrusion Techniquef
or producing Unilamellar
[Cultures]
is et al. And reference is made to co-pending application Ser. No. 622,690 filed Jun. 20, 1984.

【００１１】先に説明したようにステロールの任意の有
機酸誘導体のトリス−塩形態は、本発明の実施において
有効に用いられる。例をあげると、例えばステロールヘ
ミサクシネートまたはステロールヘミサクシネート類の
混合物などのような、ステロールヘミジカルボン酸のト
リス−塩形態は、生体内に投与されるステロイドリポソ
ームのベシクル二重層を形成するのに特に有用である。
例えば、コレステロールヘミサクシネートを用いた場
合、２．５〜７０μｍｏｌの、トリス−塩形態が、トリ
ス−ＨＣｌ［Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ］（トリス（ヒドロキシ
メチル）アミノメタン ハイドロクロライド）を含有す
る２．０ｍｌの水性緩衝溶液へベシクルを形成するよう
に添加される。この場合、水性緩衝溶液は本質的に二価
または多価カチオンの存在しないものでなければならな
い。本発明によると、水不溶性化合物あるいはわずかに
可溶な化合物の、ステロールの有機酸誘導体の塩形態か
ら構成されるリポソーム中への捕捉は、いくつかの方法
によって達成されることができる。 （１）水不溶性化合物は、ステロールの有機酸誘導体の
適当な塩形態を用いて上記したようにして調製されたス
テロールリポソーム（マルチラメラステロールベシクル
またはユニラメラステロールベクシルのいずれか）の懸
濁液へ添加されることができる。該化合物は、ステロー
ル二重層へ分配されるゆえ、リポソーム中へ捕捉され
る。この実施態様は通常以下のように実行される。すな
わち、水不溶性化合物は適当な有機溶媒中に溶解され、
続いて蒸発が行なわれ、フィルムすなわち該化合物の残
留物を残すものである。そして、予め形成されたステロ
ールリポソームの水性懸濁液が該残留物へ添加された
際、該残留物はステロールリポソームの二重層中に捕捉
される。好ましい実施態様においては、ユニラメラステ
ロールベクシルが用いられるべきである。マルチラメラ
ステロールベシクルが用いられた場合には、水不溶性化
合物はリポソームの最外殻の二重層中に捕捉され、不変
化の最内殻の二重層を残すこととなり、ステロール成分
を不必要に使用するという結果に終るためである。 （２）水不溶性化合物とステロールの有機酸誘導体の塩
形態は双方とも有機溶媒中に共溶解することができ、続
いて、蒸発が行なわれ、水不溶性化合物とステロール誘
導体との均質な分配物からなるフィルムを残すものであ
る。捕捉した化合物を含有するマルチラメラステロール
ベシクルの懸濁液が、振盪を行ないながら該フィルムに
水性相を加えることによって形成される。このマルチラ
メラベシクルは前記したようにユニラメラベクシルに転
化されることができる。 （３）水溶性化合物または水不溶性化合物は、ステロー
ルベシクルの調製において用いられる水性相中に該化合
物を添加することで、ステロールリポソーム中に捕捉さ
れることができる。すなわち、該化合物は、水性相に、
ステロールの有機酸誘導体の塩形態を添加する前にまた
は同時に添加され得る。この場合、水不溶性化合物は、
ベシクル形成の間にこれが二重層中へ分配された際に捕
捉されたものとなり、一方水溶性化合物は、ベシクル形
成の間にステロールベシクルの水性成分中に捕捉された
ものとなる。いずれの場合も、マルチラメラベシクルは
前記したようにしてユニラメラベクシルに転化されるこ
とができる。 （４）もし生物学的活性物質が、イオン化され得るもの
である場合、生物学的活性物質の遊離塩基は、ステロー
ルの有機酸誘導体の塩形態を調製するための対イオンと
して用いられ得る。ステロールリポソームは、ステロー
ルの有機酸誘導体の生物学的活性物質−塩形態を用い
て、本明細書において前述した任意の方法によって調製
され得る。例えば、抗真菌性化合物であるミコナゾール
の遊離塩基は、本発明のこの実施態様において塩誘導体
を形成するために用いられ得る。 以上述べた４つの方法のいずれかを用いることで、水溶
性化合物および水不溶性化合物の双方が１つのステロー
ルリポソーム調製物中に捕捉され得る。As explained above, the tris-salt form of any organic acid derivative of sterol can be effectively used in the practice of the present invention. By way of example, a tris-salt form of a sterol hemidicarboxylic acid, such as, for example, sterol hemisuccinate or a mixture of sterol hemisuccinates, forms a vesicle bilayer of steroid liposomes administered in vivo. Especially useful for:
For example, using cholesterol hemisuccinate, 2.5-70 μmol, 2.0 ml of Tris-salt form containing Tris-HCl [Tris-HCl] (Tris (hydroxymethyl) aminomethane hydrochloride). It is added to the aqueous buffer solution to form vesicles. In this case, the aqueous buffer solution must be essentially free of divalent or multivalent cations. According to the present invention, entrapment of a water-insoluble compound or a slightly soluble compound in liposomes composed of a salt form of an organic acid derivative of sterol can be achieved by several methods. (1) The water-insoluble compound is added to a suspension of sterol liposomes (either multilamellar sterol vesicle or unilamellar sterol vexyl) prepared as described above using a suitable salt form of an organic acid derivative of sterol. Can be added. The compound is sequestered in liposomes because it partitions into the sterol bilayer. This embodiment is usually implemented as follows. That is, the water-insoluble compound is dissolved in a suitable organic solvent,
Subsequent evaporation takes place, leaving a film, a residue of the compound. Then, when a pre-formed aqueous suspension of sterol liposomes is added to the residue, the residue is trapped in the bilayer of sterol liposomes. In a preferred embodiment, unilamella sterol vexyl should be used. If multilamellar sterol vesicles were used, the water-insoluble compound would be trapped in the outermost bilayer of the liposome, leaving an unchanged innermost bilayer, and unnecessary use of sterol components In order to end up doing so. (2) Both the water-insoluble compound and the salt form of the organic acid derivative of sterol can be co-dissolved in an organic solvent, followed by evaporation, from a homogeneous distribution of the water-insoluble compound and the sterol derivative. Film. A suspension of multilamellar sterol vesicles containing the entrapped compound is formed by adding the aqueous phase to the film with shaking. This multilamellar vesicle can be converted to a unilamellar vexil as described above. (3) The water-soluble compound or the water-insoluble compound can be captured in the sterol liposome by adding the compound to the aqueous phase used in the preparation of the sterol vesicle. That is, the compound is added to the aqueous phase,
It can be added before or simultaneously with the addition of the salt form of the organic acid derivative of sterol. In this case, the water-insoluble compound is
During vesicle formation, it becomes trapped as it is distributed into the bilayer, while the water-soluble compounds become trapped in the aqueous component of sterol vesicles during vesicle formation. In each case, the multilamellar vesicles can be converted to unilamellar vexil as described above. (4) If the biologically active substance is capable of being ionized, the free base of the biologically active substance can be used as a counter ion to prepare a salt form of an organic acid derivative of a sterol. Sterol liposomes can be prepared by any of the methods described herein above using a biologically active agent-salt form of an organic acid derivative of sterol. For example, the free base of the antifungal compound miconazole can be used to form a salt derivative in this embodiment of the invention. By using any of the four methods described above, both water-soluble and water-insoluble compounds can be captured in one sterol liposome preparation.

【００１２】本発明のステロールベシクルを用いての水
不溶性化合物の捕捉に関して上記された方法によれば、
いったん二重層中へ水不溶性化合物が分配すれば、ベシ
クルを完全な形にとどめておく必要はない。実際、ひと
たび化合物が二重層中へ分配すると、ベシクルは、捕捉
した水性の化合物の漏出ないしは放出を導きながら撹乱
ないしは崩壊されることが考えられ得る。このような
「漏れやすい」ベシクルは捕捉した水不溶性化合物を搬
送するためには用いることができるが、水溶性物質の内
包ないし搬送には用いるべきではない。本発明の一実施
態様によると、ステロールリポソームは、コレステロー
ルヘミサクシネートのトリス−塩形態を用いて以下のよ
うにして調製される：コレステロールヘミサクシネート
のトリス−塩形態４．５〜２００ｍｇが０．０１Ｍトリ
ス−ＨＣｌ、０．１４Ｍ ＮａＣｌを含有する水性緩衝
溶液１ｍｌ当りについて添加される。混合物は振盪され
そしてコレステロールヘミサクシネートマルチラメラベ
シクルの乳白色懸濁液が形成される。ベシクルは遠心分
離によってペレット化することができ、そして水性緩衝
溶液を用いて繰返し洗浄される。コレステロールヘミサ
クシネートマルチラメラベシクル（ＣＨＳ−ＭＬＶ）の
懸濁液はコレステロールヘミサクシネートユニラメラベ
クシル（ＣＨＳ−ＳＵＶ）を形成するために、音波処理
（例えば浴型音波処理器において）され得る。あるいは
また、ＣＨＳ−ＭＬＶは、４００００ｐｓｉでフレンチ
圧力ふるい（フレンチプレス）を通して濾過させる。も
しくはＣＨＳ−ＭＬＶは３００〜４００ｐａで２つの１
００ｎｍヌクレオポア［Ｎｕｃｌｅｏｐｏｒｅ］（商標
名）フィルターを通過させて，ＣＨＳ−ＳＵＶを形成す
る。コレステロールヘミサクシネートベシクル（ＭＬＶ
かＳＵＶのいずれか）は２価のカチオンの存在下におい
て不安定である、すなわち、２価のカチオンにさらすこ
とで、捕捉した水性成分および水溶性化合物を放出す
る。これゆえ、ベシクルの調製においてあるいは貯蔵の
間に用いられる水性媒体は、本質的に２価のカチオンの
存在しないものであるべきである。According to the method described above for trapping water-insoluble compounds using the sterol vesicles of the present invention,
Once the water-insoluble compound partitions into the bilayer, it is not necessary to keep the vesicles intact. Indeed, once the compound partitions into the bilayer, the vesicles can be considered to be disturbed or disrupted, leading to leakage or release of the trapped aqueous compound. Such "leaky" vesicles can be used to transport captured water-insoluble compounds, but should not be used to encapsulate or transport water-soluble substances. According to one embodiment of the present invention, sterol liposomes are prepared using the tris-salt form of cholesterol hemisuccinate as follows: 4.5-200 mg of the tris-salt form of cholesterol hemisuccinate is 0%. Added per ml of aqueous buffer solution containing 0.01M Tris-HCl, 0.14M NaCl. The mixture is shaken and a milky suspension of cholesterol hemisuccinate multilamellar vesicle is formed. The vesicles can be pelleted by centrifugation and washed repeatedly with an aqueous buffer solution. A suspension of cholesterol hemisuccinate multilamellar vesicle (CHS-MLV) can be sonicated (e.g., in a bath sonicator) to form cholesterol hemisuccinate unilamellabexil (CHS-SUV). Alternatively, the CHS-MLV is filtered through a French pressure sieve (French press) at 40000 psi. Or CHS-MLV is 300-400 pa and two 1
Pass through a 00 nm Nuclepore ™ filter to form CHS-SUV. Cholesterol hemisuccinate vesicle (MLV
Or SUVs) are unstable in the presence of divalent cations, that is, they release trapped aqueous components and water-soluble compounds upon exposure to divalent cations. Thus, the aqueous medium used in the preparation of the vesicles or during storage should be essentially free of divalent cations.

【００１３】本発明の方法により捕捉される化合物は、
種々の方法で用いることができる。例えば、化合物が生
物学的活性物質である場合、ステロールリポソームに捕
捉された化合物は、生体内に投与され得る。これは、通
常、水溶液中に不溶またはほとんど溶けない生物学的活
性物質の生体内投与を容易にする。ステロールの有機酸
誘導体の塩形態から構成されたリポソーム中への捕捉
は、より高い服用量：容量比でこのような不溶性化合物
の投与を容易なものにし得る。実際、本発明のステロー
ルベシクルは、該ベシクルが生体内供給のための１ない
しそれ以上の生物学的活性物質を捕捉するのに用いられ
得るゆえ、生体内で特に有利に使用される。捕捉した作
用物質の生体内でどのような経路をたどるかは、投与の
経路または様式により変ってくる。例えばステロールリ
ポソームに捕捉された作用物質が静脈内に投与された場
合、作用物質の生体内におけるクリアランスは、捕捉さ
れていない作用物質、またはリン脂質から構成された従
来のリポソーム（すなわち、ＭＬＶ、ＳＵＶ、ＲＥＶ、
ＬＵＶ）中に捕捉された作用物質とは異なる経路を伴
う。一方、ステロールリポソームに捕捉された作用物質
の筋内投与は、該作用物質の生体内における持続された
放出をもたらす。The compound captured by the method of the present invention is
It can be used in various ways. For example, where the compound is a biologically active agent, the compound entrapped in sterol liposomes can be administered in vivo. This facilitates in vivo administration of biologically active substances that are usually insoluble or poorly soluble in aqueous solutions. Entrapment in liposomes composed of the salt form of an organic acid derivative of a sterol may facilitate administration of such insoluble compounds at higher dose: volume ratios. In fact, the sterol vesicles of the present invention are particularly advantageously used in vivo because the vesicles can be used to capture one or more biologically active substances for in vivo delivery. The route that the captured agent will follow in vivo will vary depending on the route or mode of administration. For example, when an active substance entrapped in sterol liposomes is administered intravenously, the clearance of the active substance in vivo is reduced by the non-entrapped active substance or a conventional liposome composed of phospholipids (ie, MLV, SUV). , REV,
It involves a different pathway than the agent captured in LUV). On the other hand, intramuscular administration of an agent entrapped in sterol liposomes results in sustained release of the agent in vivo.

【００１４】実質的に任意の生物学的活性物質が、本発
明のステロールリポソーム中へ捕捉されることができ
る。このような作用物質としては、例えば抗細菌性物
質、抗ウィルス性物質、抗真菌性物質、抗寄生虫性物
質、抗腫瘍性物質、抗代謝剤、ポリペプチド、ペプチ
ド、タンパク質、毒素、酵素、ホルモン、神経伝達物
質、糖タンパク、リポタンパク、免疫グロブリン、免疫
調節剤、血管拡張剤、染料、放射線標識、放射線不透過
性化合物、蛍光化合物、受容体結合分子、抗炎症剤、抗
緑内障剤、散瞳性化合物、局所麻酔剤、麻薬、ビタミ
ン、核酸、ポリヌクレオチドなどが含まれるが、もちろ
んこれらに限定されるものではない。２ないしそれ以上
の化合物を同時に捕捉することは、これらの化合物が相
補的なあるいは相乗的な効果をもたらす場合に特に望ま
しい。ステロールリポソームに捕捉された作用物質は、
接種もしくは注射（例えば、静脈内、腹腔内、筋内、皮
下、耳内、関節内、***内等）、局所適用（例をあげる
と、例えば眼、皮膚などのような部位上に、耳内に、あ
るいは創傷および火傷などのような傷の上に）、および
上皮または粘膜皮膚内面（例えば鼻の、口内の、膣の、
直腸の、胃腸の粘膜など）を通じての吸収などのような
（もちろんこれに限定されるわけではない。）任意の好
ましい経路によって生体内に投与される。これらの使用
の他の例において、ステロールリポソームに捕捉された
化合物は、他の脂質のベシクルないしリポソーム、ゲ
ル、オイル、エマルジョンおよび同様のものなど（もち
ろんこれらに限定されるわけではない。）のような広い
範囲の物質中へ取り込まれ得る。例えば、捕捉化合物を
有するステロールリポソームの懸濁液は、任意の種類の
リポソーム調製物（例えば、リン脂質のＭＬＶ，ＳＵ
Ｖ，ＬＵＶ，ＲＥＶなど）における成分である水性相に
添加される。これによってリン脂質リポソーム中へ上記
化合物を捕捉することができる。上記以外の他の使用に
ついては、調製物の特別の特性によっており、当業者が
容易に想像し得るものである。例えばこれらの二価カチ
オン感応性ゆえに、本発明のコレステロールヘミサクシ
ネートリポソームは、二価カチオンに対して感応性の指
示染料を捕捉することにより、生体外における比色的な
診断学的検定法に用いることができる。[0014] Virtually any biologically active substance can be entrapped in the sterol liposomes of the present invention. Such agents include, for example, antibacterial, antiviral, antifungal, antiparasitic, antitumor, antimetabolites, polypeptides, peptides, proteins, toxins, enzymes, Hormones, neurotransmitters, glycoproteins, lipoproteins, immunoglobulins, immunomodulators, vasodilators, dyes, radiolabels, radiopaque compounds, fluorescent compounds, receptor binding molecules, anti-inflammatory agents, anti-glaucoma agents, Mydriatic compounds, local anesthetics, narcotics, vitamins, nucleic acids, polynucleotides, etc., are of course, but not limited to. Capturing two or more compounds simultaneously is particularly desirable where these compounds have complementary or synergistic effects. The active substance entrapped in the sterol liposome
Inoculation or injection (eg, intravenous, intraperitoneal, intramuscular, subcutaneous, intraaural, intraarticular, intramammary, etc.), topical application (eg, on the site such as the eye, skin, etc. Or over wounds such as wounds and burns), and epithelial or mucosal skin linings (eg, nasal, oral, vaginal,
It is administered in vivo by any preferred route, such as, but not limited to, absorption through the rectum, gastrointestinal mucosa, and the like. In other examples of these uses, the compounds entrapped in sterol liposomes, such as, but not limited to, other lipid vesicles or liposomes, gels, oils, emulsions and the like. It can be incorporated into any of a wide range of substances. For example, a suspension of sterol liposomes with a capture compound can be prepared from any type of liposome preparation (eg, phospholipid MLV, SU
V, LUV, REV, etc.). This allows the compound to be trapped in the phospholipid liposome. Other uses besides those mentioned above will depend on the particular properties of the preparation and will be readily apparent to those skilled in the art. For example, because of their sensitivity to divalent cations, the cholesterol hemisuccinate liposomes of the present invention can be used in in vitro colorimetric diagnostic assays by capturing indicator dyes that are sensitive to divalent cations. Can be used.

【００１５】本発明におけるステロールリポソームにお
いては、有機酸の塩形態などのような親水性部が付着さ
れており、例えばコレステロールあるいは他の脂質のな
どのようなステロールが、マルチラメラベシクル［ｍｕ
ｌｔｉｌａｍｅｌｌａｒ ｖｅｓｉｃｌｅ］またはスモ
ールユニラメラベシクル［ｓｍａｌｌ ｕｎｉｌａｍｅ
ｌｌａｒ ｖｅｓｉｃｌｅ］の懸濁液の調製に用いるこ
とができる。本発明におけるステロールリポソームは、
有機溶媒を用いてあるいは用いずに調製され得る。これ
らのベシクル（小胞体）は、水溶性化合物、部分水溶性
化合物および水不溶性化合物を捕捉し得るが、水不溶性
化合物の捕捉において特に有利である。本発明における
ステロールベシクルは、生体内に［ｉｎ ｖｉｖｏ］投
与され得る生物学的に活発な化合物ないしは薬学的な化
合物の捕捉に特に有用である。あるいはまた、本発明の
ステロールリポソームは、生体外的に［ｉｎ ｖｉｔｒ
ｏ］に用いられ得る。例えば、本明細書中に述べられる
コレステロールヘミサクシネートリポソームは、生体外
において二価カチオン依存検定システムに用いられ得
る。In the sterol liposome of the present invention, a hydrophilic portion such as a salt form of an organic acid is attached, and a sterol such as cholesterol or another lipid is used as a multilamellar vesicle [mu].
tillamella vesicle] or small unilamellar vesicle [small unilaname vesicle]
llar vehicle]. The sterol liposome in the present invention,
It can be prepared with or without an organic solvent. These vesicles (vesicles) can capture water-soluble compounds, partially water-soluble compounds and water-insoluble compounds, but are particularly advantageous in capturing water-insoluble compounds. The sterol vesicles of the present invention are particularly useful for capturing biologically active compounds or pharmaceutical compounds that can be administered in vivo [ in vivo ]. Alternatively, the sterol liposomes of the present invention may be used in vitro [ in vitro
o ]. For example, the cholesterol hemisuccinate liposomes described herein can be used in vitro in a divalent cation-dependent assay system.

【００１６】[0016]

【実施例】以下の参考例および実施例は、説明の目的の
ために与えられるものであり、本発明の範囲を限定する
ものではない。水溶性化合物を捕捉するコレステロールヘミサクシネー
トリポソーム 以下、アルセナゾIII 、イヌリンまたはクロムを捕捉す
るコレステロールヘミサクシネートリポソームの調製を
述べるものである。内包能および捕捉容量などのような
パラメーターが評価されている。このコレステロールベ
シクルのカルシウム依存不安定性が表示される。コレス
テロールヘミサクシネートベシクルの冷凍エッチング電
子顕微鏡像、Ｘ線回折像および電子スピン共鳴吸収につ
いて、また述べられている。 例１ コレステロールヘミサクシネートの種々の塩形態
を用いて調製されたリポソーム（参考例） 以下の文節は、コレステロールヘミクシネートの種々の
塩形態を用いてのＣＨＳリポソームの調製を述べるもの
である。コレステロールヘミサクシネートのトリス−塩
形態（以下トリス−塩ＣＨＳと呼称する。）を含むすべ
ての例において、トリス−塩ＣＨＳは、シグマバイオケ
ミカルズ、セントルイス、ミズリー州［Ｓｉｇｍａ Ｂ
ｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ］か
ら購入され、精製されずに用いられたか、あるいは以下
のようにして合成されたもののいずれかであった。トリ
ス塩基の３．３モル溶液３０ｍｌが、エーテル中のコレ
ステロールヒドロゲン サクシネート（アイシーエス、
クリーブランド、オハイオ州［ＩＮＣ、Ｃｌｅｖｅｌａ
ｎｄ，Ｏｈｉｏ］）の６７Ｍモル溶液１．５リットルに
添加された。得られた溶液は、しめった残留物となるま
で回転蒸発されそして１２時間凍結乾燥された。得られ
たトリス−塩ＣＨＳは、酢酸エチルから３度再結晶化さ
れた。残留酢酸エチルは減圧下（０．１ｍｍＨｇ）５６
℃に加熱することによって除去された。The following Reference Examples and Examples are given for illustrative purposes and do not limit the scope of the present invention. Cholesterol hemisacine that traps water-soluble compounds
The following describes the preparation of cholesterol hemisuccinate liposomes that capture arsenazo III, inulin or chromium. Parameters such as encapsulation capacity and capture volume have been evaluated. The calcium-dependent instability of this cholesterol vesicle is indicated. Freeze-etched electron microscopy images, X-ray diffraction images and electron spin resonance absorption of cholesterol hemisuccinate vesicles are also described. Example 1 Various salt forms of cholesterol hemisuccinate
Liposomes Prepared Using the Reference Examples The following paragraphs describe the preparation of CHS liposomes using various salt forms of cholesterol hemicinate. In all instances, including the tris-salt form of cholesterol hemisuccinate (hereinafter referred to as Tris-salt CHS), Tris-salt CHS was obtained from Sigma Biochemicals, St. Louis, Mo. [Sigma B.
iochemicals, St. Louis, MO] and either used without purification or synthesized as follows. 30 ml of a 3.3 molar solution of tris base was added to cholesterol hydrogen succinate in ether (ICS,
Cleveland, Ohio [INC, Clevela
nd, Ohio]). The resulting solution was rotoevaporated to a moist residue and lyophilized for 12 hours. The resulting tris-salt CHS was recrystallized three times from ethyl acetate. Residual ethyl acetate was removed under reduced pressure (0.1 mmHg) 56
Removed by heating to ° C.

【００１７】例１−１ トリス−塩コレステロールヘミ
サクシネート−ＭＬＶ トリス−塩ＣＨＳ（５４ｍｇ）が０．０１Ｍ トリス−
ＨＣｌ（ｐＨ７．３）、０．１４Ｍ ＮａＣｌ中のアル
セナゾIII（４．５ｍＭ、最終濃度）の溶液１ｍｌに添
加された。ＣＨＳ−ＭＬＶの乳白色の懸濁液が機械的振
盪によって形成された。このＣＨＳ−ＭＬＶは１０，０
００×ｇで１５分間遠心分離されて、ペレット化され、
そして得られたペレットは０．０１Ｍトリス−ＨＣｌ
（ｐＨ７．３），０．１４Ｍ ＮａＣｌの１０ｍｌを用
いて３度洗浄された。得られたペレットは、アルセナゾ
IIIの捕捉を示す赤色を呈していた。 例１−２ ２−アミノ−２−メチル−１，３−プロパン
ジオールコレステロール ヘミサクシネート−ＭＬＶ コレステロールヘミサクシソート（５０ｍｇ）の２−ア
ミノ−２−メチル−１，３−プロパンジオール塩が０．
０１Ｍ ２−アミノ−２−メチル１，３−プロパンジオ
ール−ＨＣｌ（ｐＨ７．３）、０．０７Ｍ ＫＣｌ，
０．０７Ｍ ＮａＣｌ中のアルセナゾIII（４．５ｍ
Ｍ、最終濃度）の溶液１ｍｌへ添加された。ＣＨＳ−Ｍ
ＬＶの懸濁液はガラス製ビーズを用いての旋回混合によ
って、形成された。このＣＨＳ−ＭＬＶは１０，０００
×ｇで１５分間遠心分離されて、ペレット化され、そし
て得られたペレットは例１−１で述べた様にして３度洗
浄された。得られたペレットは、アルセナゾIIIの捕捉
を色示していた。例１−３ ２−アミノエタノールコレステロールヘミサ
クシネート−ＭＬＶ コレステロールヘミサクシネート（５０ｍｇ）の２−ア
ミノエタノール塩が０．０１Ｍ ２−アミルエタノール
−ＨＣｌ（ｐＨ７．３），０．０７Ｍ ＫＣｌ，０．０
７Ｍ ＮａＣｌ中のアルセナゾIII（４．５ｍＭ、最終
濃度）の溶液１ｍｌへ添加された。ＣＨＳ−ＭＬＶの懸
濁液はガラス製ビーズを用いての旋回混合によって形成
された。このＣＨＳ−ＭＬＶは１０，０００×ｇで１５
分間遠心分離されて、ペレット化され、そして得られた
ペレットは、上記例１−１において述べる様にして３度
洗浄された。得られたぺレットは、アルセナゾIIIの捕
捉を示す赤色を呈していた。 Example 1-1 Tris-salt cholesterol hemi
Succinate-MLV Tris-salt CHS (54 mg) in 0.01 M Tris-
HCl (pH 7.3) was added to 1 ml of a solution of arsenazo III (4.5 mM, final concentration) in 0.14 M NaCl. A milky suspension of CHS-MLV was formed by mechanical shaking. This CHS-MLV is 10,0
Centrifuged at 00 × g for 15 minutes, pelleted,
And the obtained pellet is 0.01M Tris-HCl
(PH 7.3), and washed three times with 10 ml of 0.14 M NaCl. The resulting pellet is arsenazo
It was red, indicating the capture of III. Example 1-2 2-Amino-2-methyl-1,3-propanediol cholesterol hemisuccinate-MLV The cholesterol hemisuccisole (50 mg) contains 0.2 mg of 2-amino-2-methyl-1,3-propanediol salt.
01M 2-amino-2-methyl 1,3-propanediol-HCl (pH 7.3), 0.07M KCl,
Arsenazo III (4.5 m) in 0.07 M NaCl
M, final concentration). CHS-M
The LV suspension was formed by swirling with glass beads. This CHS-MLV is 10,000
Centrifuged at xg for 15 minutes, pelleted, and the resulting pellet was washed three times as described in Example 1-1. The resulting pellets showed Arsenazo III capture. Example 1-3 2-aminoethanol cholesterol hemisa
Succinate-MLV cholesterol 2-aminoethanol salt of hemisuccinate (50 mg) is 0.01 M 2-amylethanol-HCl (pH 7.3), 0.07 M KCl, 0.07 M
Added to 1 ml of a solution of arsenazo III (4.5 mM, final concentration) in 7 M NaCl. A suspension of CHS-MLV was formed by swirling using glass beads. This CHS-MLV is 10,000 × g and 15
Centrifuged for minutes, pelleted, and the resulting pellet was washed three times as described in Example 1-1 above. The resulting pellets had a red color indicating capture of Arsenazo III.

【００１８】例１−４ ビス−トリス−プロパンコレス
テロールヘミサクシネート−ＭＬＶ コレステロールヘミサクシネート（５０ｍｇ）のビス−
トリス−プロパン塩が０．０１Ｍビス−トリス−プロパ
ン−ＨＣｌ（ｐＨ７．３），０．０７Ｍ ＫＣｌ，０．
０７Ｍ ＮａＣｌ中のアルセナゾIII（４．５ｍＭ、最
終濃度）の溶液１ｍｌへ添加された。ＣＨＳ−ＭＬＶの
懸濁液はガラス製ビーズを用いての旋回混合によって形
成された。このＣＨＳ−ＭＬＶは１０，０００×ｇで１
５分間遠心分離されて、ペレット化され、そして得られ
たペレットは、例１−１において述べる様にして３度洗
浄された。得られたぺレットは、アルセナゾIIIの捕捉
を示す赤色を呈していた。 例１−５ トリエタノールアミン コレステロール ヘ
ミサクシネート−ＭＬＶ コレステロールヘミサクシネート（５０ｍｇ）のトリエ
タノールアミン塩が０．０１Ｍトリエタノールアミン−
ＨＣｌ（ｐＨ７．３），０．０７Ｍ ＫＣｌ、０．０７
Ｍ ＮａＣｌ中のアルセゾIII（４．５ｍＭ、最終濃
度）の溶液１ｍｌへ添加された。ＣＨＳ−ＭＬＶの懸濁
液は１０，０００×ｇで１５分間遠心分離され、ペレッ
ト化され、そして得られたペレットは例１−１に述べる
様にして３度洗浄された。得られたぺレットは、アルセ
ナゾIIIの捕捉を示す赤色を呈していた。例１−６ ミコナゾールコレステロールヘミサクシネー
ト−ＭＬＶ ミコナゾールの遊離塩基が以下のようにして調製され
た。すなわち、ＮａＯＨの水溶液がエーテル中のミコナ
ゾール−ニトレートの懸濁液中へ滴定さた。エーテル相
は、採取され、そしてエーテルは、ミコナゾール遊離塩
からなるオイルを残して蒸発される。該オイルは次にコ
レステロールヒドロゲンサクシネートを含有するエタノ
ールへ添加された。エタノールは、ミコナゾールコレス
テロールヘミサクシネートの塩形態からなるフィルムを
残して蒸発される。次に、該フィルムに食塩水が添加さ
れる。延長的な旋回混合の後に、ベシクルが溶液中に観
察された。 例１−７ 音波処理により調製されたコレステロールヘ
ミサクシネート−ＳＵＶ アルセナゾIIIを用いない以外は、上記例１−１、１−
２、１−３、１−４、および１−５述べたものと同様に
して、ＣＨＳ−ＭＬＶが調製された。それぞれのベシク
ルの最終ペレットは、それが調製された緩衝溶液の２ｍ
ｌ中へ再懸濁され、そして乳白色の懸濁液が透明とな
り、ＣＨＳ−ＭＬＶのＣＨＳ−ＳＵＶへの転化を示すま
で浴型音波処理器において音波処理された。 例１−８ 押出し技法により調製されたコレステロール
ヘミサクシネート−ＳＵＶ ＣＨＳが、１００ｍｇ／ｍｌの濃度で、１０ｍＭヘペス
［ＨＥＰＥＳ］、１５０ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ７．５）
中へ分散させられた。この物質は、３０ｎｍヌクレオポ
アフィルターを通して１０回押出され、ＣＨＳ−ＳＵＶ
を得た。EXAMPLE 1-4 Bis-tris-propane choles
Terol hemisuccinate-MLV cholesterol hemisuccinate (50 mg) bis-
Tris-propane salt is 0.01M bis-Tris-propane-HCl (pH 7.3), 0.07M KCl, 0.1M
Added to 1 ml of a solution of Arsenazo III (4.5 mM, final concentration) in 07M NaCl. A suspension of CHS-MLV was formed by swirling using glass beads. This CHS-MLV is 10,000 × g and 1
Centrifuged for 5 minutes, pelleted, and the resulting pellet was washed three times as described in Example 1-1. The resulting pellets had a red color indicating capture of Arsenazo III. Example 1-5 triethanolamine cholesterol
Missuccinate-MLV cholesterol hemisuccinate (50 mg) is triethanolamine salt of 0.01 M triethanolamine-
HCl (pH 7.3), 0.07M KCl, 0.07
Added to 1 ml of a solution of Arceso III (4.5 mM, final concentration) in M NaCl. The CHS-MLV suspension was centrifuged at 10,000 xg for 15 minutes, pelleted, and the resulting pellet was washed three times as described in Example 1-1. The resulting pellets had a red color indicating capture of Arsenazo III. Example 1-6 Miconazole cholesterol hemisuccinate
The free base of G-MLV miconazole was prepared as follows. That is, an aqueous solution of NaOH was titrated into a suspension of miconazole-nitrate in ether. The ether phase is collected and the ether is evaporated leaving an oil consisting of the miconazole free salt. The oil was then added to ethanol containing cholesterol hydrogen succinate. Ethanol is evaporated leaving a film consisting of the salt form of miconazole cholesterol hemisuccinate. Next, saline is added to the film. After prolonged swirling, vesicles were observed in the solution. Examples 1-7 To cholesterol prepared by sonication
Examples 1-1 and 1-, except that Missuccinate-SUV Arsenazo III was not used.
CHS-MLV was prepared in a manner similar to that described in 2, 1-3, 1-4, and 1-5. The final pellet of each vesicle is 2 m of the buffer solution from which it was prepared.
The suspension was sonicated in a bath sonicator until the milky suspension became clear and showed conversion of CHS-MLV to CHS-SUV. Examples 1-8 Cholesterol prepared by extrusion technique
Hemisuccinate-SUV CHS is 100 mM / ml at 10 mM HEPES [HEPES], 150 mM NaCl (pH 7.5).
Dispersed inside. This material was extruded 10 times through a 30 nm nucleopore filter, CHS-SUV
I got

【００１９】例２ コレステロールヘミサクシネートＭ
ＬＶ中へのイヌリンの捕捉（参考例） 捕捉される作用物質として ³Ｈ−イヌリンを取込んだコ
レステロールヘミサクシネートマルチラメラベシクル
（ＣＨＳ−ＭＬＶ）は、以下の様にして調製された。³
Ｈ−イヌリン（１．０ｍＣｉ／ｍｌ、ニューイングラン
ド ヌクレア［Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｎｕｃｌｅａ
ｒ］、ボストン、マサチューセッツ州）は、０．０１Ｍ
トリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．３）、０．１４Ｍ ＮａＣ
ｌ ２ｍｌ中へ溶解された。次にトリス−塩ＣＨＳ４０
ｍｇが該溶液へ添加され、そして得られた混合物は振盪
により機械的に分散された。マルチラメラベシクル形成
を示す乳白色の懸濁液が形成された。この懸濁液は、２
時間静置され、この時間経過時に懸濁液は０．０１Ｍ
トリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．３）、０．１４Ｍ ＮａＣｌ
を用いて最終濃度の１０ｍｌへと希釈された。１つの１
０μｌアリコット（［ａｌｉｑｕｏｔ］、分割物）の放
射能は、該アリコットをシンチレーション流体（オムニ
フルア［Ｏｍｍｉｆｌｏｕｒ］（ニューイングランド
ヌクレア、ボストン、マサチューセッツ州）４０ｇ、ト
ルエン６ｌ、エチレングリコールモノエチルエーテル４
ｌ）１０ｍｌ中に添加し、そして０．４００にウィンド
ウをセットしてベックマンＬ６８００リクイド シンチ
レーションカウンター［Ｂｅｃｋｍａｎ Ｌ６８００
ｌｉｑｕｉｄ ｓｃｉｎｔｉｌａｔｉｏｎ ｃｏｕｎｔ
ｅｒ］を用いて放射能測定をすることにより、２４，６
２５ｃｐｍ／１０μｌであると測定された。１分間あた
りのカウント数（ｃｐｍ）における放射能はケンチング
補正のＨ＃方法［ｔｈｅ Ｈ＃ ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ
ｑｕｅｎｃｈ ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ］を適用すること
によって１分間あたりの崩壊に変換された（ホロック、
ディーエル ザ ナンバー コンセプト、ベックマン
インストルメンツ、１９７７［Ｈｏｒｒｏｃｋ，Ｄ．
Ｌ． Ｔｈｅ Ｎｕｍｂｅｒ Ｃｏｎｃｅｐｔ，Ｂｅｃ
ｋｍａｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，１９７７］）。こ
のＣＨＳ−ＭＬＶは次に１０，０００×ｇで１５分間遠
心分離されてペレット化された。得られたペレットは該
ペレットを０．０１Ｍトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．３）、
０．１４Ｍ ＮａＣｌを用いて最終濃度の１０ｍｌ中に
再懸濁させ、そして１０，０００×ｇで１５分間遠心分
離して再ペレット化することによって３度洗浄された。
ベシクルの洗浄されたペレットは、最終容量１０ｍｌと
なるように０．０１Ｍトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．３）、
０．１４Ｍ ＮａＣｌ中へ再懸濁された。１０μｌアリ
コットの放射能は３，４４２ｃｐｍ／１０μｌであると
測定された。それゆえ、最初の ³Ｈ−イヌリンの全体の
１４％がＣＨＳ−ＭＬＶ中に捕捉された。 Example 2 Cholesterol hemisuccinate M
Capture of Inulin in LV (Reference Example) A cholesterol hemisuccinate multilamellar vesicle (CHS-MLV) incorporating ³ H-inulin as an agent to be captured was prepared as follows. ^Three
H-inulin (1.0 mCi / ml, New England Nuclea [New England Nuclea]
r], Boston, Mass.) is 0.01M
Tris-HCl (pH 7.3), 0.14 M NaC
l Dissolved in 2 ml. Then Tris-salt CHS40
mg was added to the solution and the resulting mixture was dispersed mechanically by shaking. A milky suspension was formed indicating multilamellar vesicle formation. This suspension contains 2
The suspension is allowed to stand for
Tris-HCl (pH 7.3), 0.14 M NaCl
And diluted to a final concentration of 10 ml. One of one
The radioactivity of a 0 μl aliquot ([aliquot], aliquots) was determined by adding the aliquot to a scintillation fluid (Omniflor (New England).
Nuclea, Boston, Mass.) 40 g, toluene 6 l, ethylene glycol monoethyl ether 4
l) Add in 10 ml and set window to 0.400 and set Beckman L6800 Liquid scintillation counter [Beckman L6800
liquid scintillation count
er] to measure the radioactivity
It was determined to be 25 cpm / 10 μl. The radioactivity in counts per minute (cpm) is determined by the H # method of quenching correction [the H # method of
quench correction] was converted to decay per minute (Holoch,
Del the number concept, Beckman
Instruments, 1977 [Horrock, D .;
L. The Number Concept, Bec
kman Instruments, 1977]). The CHS-MLV was then centrifuged at 10,000 xg for 15 minutes to pellet. The obtained pellet was prepared by mixing the pellet with 0.01 M Tris-HCl (pH 7.3),
Resuspended in a final concentration of 10 ml with 0.14 M NaCl and washed three times by re-pelleting by centrifugation at 10,000 xg for 15 minutes.
The washed pellets of the vesicles were diluted to a final volume of 10 ml with 0.01 M Tris-HCl (pH 7.3),
Resuspended in 0.14M NaCl. The radioactivity of a 10 μl aliquot was determined to be 3,442 cpm / 10 μl. Therefore, 14% of the total of the first ³ H-inulin was captured in CHS-MLV.

【００２０】例２−１ コレステロールヘミサクシネー
ト−ＭＬＶおよび卵ホスファチジルコリン−ＭＬＶにお
けるイヌリン内包能 コレステロールヘミサクシネートの変動濃度からなるＭ
ＬＶ中に捕捉されたイヌリンの内包能が、卵ホスファチ
ジルコリンの変動濃度からなるＭＬＶ中に捕捉されたイ
ヌリンの内包能と比較された（注．任意のリポソームに
関する内包能は、二重層によって隔離された水性成分の
画分と定義され、そしてそれはパーセンテージで表わさ
れる。従来技術の項参照のこと。）。卵ホスファチジル
コリン（ＥＰＣ）またはトリス−塩ＣＨＳのいずれかで
構成されるマルチラメラベシクルは、内包能を比較する
ために全く同じ処方を用いて調製された。従って ³Ｈ−
イヌリン（２１７．０ｍＣｉ／ｍｇ）５μｌを有する。
０．０１Ｍ トリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．３）、０．１４
Ｍ ＮａＣｌ緩衝溶液２．０ｍｌ中の４０、８０、１６
０、３２０もしくは４００ｍｇの濃度のトリス−塩ＣＨ
Ｓが旋回混合され、そして２時間放置され、捕捉された
化合物として ³Ｈ−イヌリンを有するＣＨＳ−ＭＬＶが
形成された。０．０１Ｍ トリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．
３）、０．１４Ｍ ＮａＣｌ緩衝溶液の追加的な３ｍｌ
が該懸濁液に添加され、懸濁液は室温下１晩放置され
た。次に、０．０１Ｍ トリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．
３）、０．１４Ｍ ＮａＣｌ緩衝溶液約３．０ｍｌが全
容量を１０ｍｌまでにするために添加された。卵ホスフ
ァチジルコリン（アバンティ、バーミンガム、アラバマ
州［Ａｖａｎｔｉ，Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，ＡＬ］）か
ら構成されるマルチラメラベシクル（ＥＰＣ−ＭＬＶ）
は以下の処方により調製された。４０、８０、１６０、
３２０もしくは４００ｍｇ／ｍｌのＥＰＣが、このリン
脂質を完全に溶解するのに十分な量のクロロホルム中に
懸濁された。クロロホルムは乾燥するまで蒸発され、試
験管にワックス状の沈殿物が残された。次に ³Ｈ−イヌ
リン（２１７．０ｍＣｉ／ｍｇ）５μｇを有する０．０
１Ｍ トリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．３）、０．１４Ｍ Ｎ
ａＣｌ緩衝溶液２．０ｍｌが添加され、この混合物は
「膨張」させられ、得られたＥＰＣ−ＭＬＶは延長され
た旋回混合により分散させられた。追加的な０．０１Ｍ
トリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．３）、０．１４Ｍ ＮａＣ
ｌ緩衝溶液３ｍｌが該懸濁液に添加され、懸濁液は室温
下一晩放置された。次に０．０１Ｍトリス−ＨＣｌ（ｐ
Ｈ７．３）、０．１４Ｍ ＮａＣｌ緩衝溶液を用いて、
全容量を１０ｍｌとした。ＣＨＳ−ＭＶＳおよびＥＰＣ
−ＭＬＶによる ³Ｈ−イヌリン内包能が以下のようにし
て測定された。成分のそれぞれ最初の混合物の２０μｌ
における放射能が、前記したようにシンチレーションカ
ウンティングによって計測された。形成の後、リポソー
ムは、懸濁液を１０，０００×ｇで１０〜２０分間遠心
分離することによってペレット化され、それぞれのペレ
ットは、０．０１Ｍ トリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．３）、
０．１４Ｍ ＮａＣｌ緩衝溶液１０ｍｌ中で４度洗浄さ
れ、そして最終容量１０ｍｌの０．０１Ｍトリス−ＨＣ
ｌ（ｐＨ７．３）、０．１４Ｍ ＮａＣｌ緩衝溶液へ再
懸濁された。この最終的に洗浄されたサンプルの２０μ
ｌアリコットの放射能が測定された。この最終的なサン
プルにおいて計測された最初の放射能の分数が、脂質ベ
シクル中に捕捉された ³Ｈ−イヌリンを表わした。表１
に示すように、内包能における増加は、ＣＨＳ濃度にお
ける増加に比例しているが、より重要なことは２０〜２
００ｍｇ／ｍｌ ＣＨＳを用いて調製されたＣＨＳ−Ｍ
ＬＶは、同濃度のリン脂質を用いて調製されたＥＰＣ−
ＭＬＶのものよりも、より高いイヌリン内包能を示した
ことである。Example 2-1 Cholesterol hemisacine
G-MLV and egg phosphatidylcholine-MLV
Containing variable concentration of cholesterol hemisuccinate M
The encapsulation capacity of inulin entrapped in LV was compared to the encapsulation capacity of inulin entrapped in MLV consisting of varying concentrations of egg phosphatidylcholine. It is defined as the fraction of the aqueous component, which is expressed as a percentage, see the prior art section). Multilamellar vesicles composed of either egg phosphatidylcholine (EPC) or Tris-salt CHS were prepared using the exact same formulation to compare encapsulation capacity. Therefore ³ H-
Has 5 μl of inulin (217.0 mCi / mg).
0.01 M Tris-HCl (pH 7.3), 0.14
40, 80, 16 in 2.0 ml of M NaCl buffer solution
Tris-salt CH at a concentration of 0, 320 or 400 mg
S was swirled and allowed to stand for 2 hours to form CHS-MLV with ³ H-inulin as the trapped compound. 0.01 M Tris-HCl (pH 7.
3), an additional 3 ml of 0.14 M NaCl buffer solution
Was added to the suspension and the suspension was left overnight at room temperature. Next, 0.01M Tris-HCl (pH7.
3) About 3.0 ml of 0.14 M NaCl buffer solution was added to bring the total volume up to 10 ml. Multilamellar vesicles (EPC-MLV) composed of egg phosphatidylcholine (Avanti, Birmingham, AL)
Was prepared according to the following formulation. 40, 80, 160,
320 or 400 mg / ml EPC was suspended in enough chloroform to completely dissolve the phospholipid. The chloroform was evaporated to dryness, leaving a waxy precipitate in the test tube. Then 0.0 with 5 μg of ³ H-inulin (217.0 mCi / mg).
1 M Tris-HCl (pH 7.3), 0.14 M N
2.0 ml of aCl buffer solution was added, the mixture was "swollen" and the resulting EPC-MLV was dispersed by extended swirling. Additional 0.01M
Tris-HCl (pH 7.3), 0.14 M NaC
3 ml of 1 buffer solution was added to the suspension and the suspension was left overnight at room temperature. Next, 0.01M Tris-HCl (p
H7.3), using a 0.14 M NaCl buffer solution,
The total volume was 10 ml. CHS-MVS and EPC
³ H-inulin encapsulation ability by -MLV was measured as follows. 20 μl of each initial mixture of ingredients
Was measured by scintillation counting as described above. After formation, the liposomes are pelleted by centrifuging the suspension at 10,000 xg for 10-20 minutes, each pellet containing 0.01 M Tris-HCl (pH 7.3),
Washed four times in 10 ml of 0.14 M NaCl buffer solution and a final volume of 10 ml of 0.01 M Tris-HC
1 (pH 7.3), 0.14 M NaCl buffer solution. 20 μl of this finally washed sample
One aliquot of radioactivity was measured. The first fraction of radioactivity measured in this final sample was indicative of ³ H-inulin trapped in lipid vesicles. Table 1
The increase in encapsulation capacity is proportional to the increase in CHS concentration as shown in FIG.
CHS-M prepared using 00 mg / ml CHS
LV is EPC-prepared using the same concentration of phospholipid.
It showed higher inulin encapsulation ability than that of MLV.

【００２１】 表 １ リン脂質ベシクルとコレステロールヘミサクシネートベシクルに おけるイヌリンの内包能の比較 脂質の濃度(mg／ml） 捕捉された ³Ｈ−イヌリン（％） ＥＰＣ−ＭＬＶ a ＣＨＳ−ＭＬＶ b ２０ ２ １０ ４０ ４ １４ ８０ ５ ２９ １６０ ８ ３８ ２００ １１ ６０ ────────── ａ 卵ホスファチジルコリン マルチラメラ ベシクル ｂ コレステロール ヘミサクシネート マルチラメラベシクル ＣＨＳ−ＭＬＶの内包能が、水性緩衝溶液中でＣＨＳが
遊離 ³Ｈ−イヌリンと接触した時間の量によって影響さ
れるか否かを測定するために、ＣＨＳ−ＭＬＶが以下の
ようにして調製された。トリス−塩ＣＨＳ８０ｍｇある
いは３００ｍｇが ³Ｈ−イヌリン（２１７ｍＣｉ／ｍｇ
比放射能）１０μｌを含有する０．０１Ｍ トリス−Ｈ
Ｃｌ、０．１４Ｍ ＮａＣｌ緩衝溶液２０ｍｌ中に旋回
混合され、これによりそれぞれ４０ｍｇ／ｍｌおよび１
５０ｍｇ／ｍｌ ＣＨＳの濃度を用いたＣＨＳ−ＭＬＶ
を形成した。２つの脂質濃度のそれぞれ５つのサンプル
が調製され、ＣＨＳ−ＭＬＶ懸濁液は、０．０１Ｍ ト
リス−ＨＣｌ（ｐＨ７．３）、０．１４Ｍ ＮａＣｌ緩
衝溶液２．０ｍｌ中で室温下放置された。以下の時間間
隔、すなわち０、１５、３０、６０および１２０分で、
サンプルは同じ緩衝溶液を用いて１０ｍｌ容量とされ
た。それぞれのサンプルの最初の１０μｌアリコット
は、前記したようなシンチレーションカウンティングの
ために取り除かれた。サンプルは次に１０，０００×ｇ
で１０分間遠心分離され、それぞれのペレットは緩衝溶
液１０ｍｌ中で４度洗浄された。最終的なペレットは最
終容量１０ｍｌへと緩衝溶液中へ懸濁され、それぞれの
最終的サンプル１０μｌアリコットの放射能が、それぞ
れの時間点での最初のサンプルの放射能と比較された。
この結果は、試験された脂質のいずれの濃度においても
５つの時間点に関する内包能における顕著な違いが全く
なかったことを示すものであった。これは、調製物に対
して添加された最初の ³Ｈ−イヌリンの約１２％もしく
は２０％の捕捉は、それぞれＣＨＳ４０ｍｇ／ｍｌもし
くは１５０ｍｇ／ｍｌでの接触時間に関係なく起ること
を示している。これは、卵ホスファチジルコリンを用い
て調製された従来のＭＬＶとは異なり、「膨脹時間」
は、ＣＨＳ−ＭＬＶの調製においては不必要であること
を示すものである。[0021] Table 1 Phospholipid vesicles and density comparison lipid encapsulation efficiency of inulin definitive cholesterol hemisuccinate vesicles (mg / ml) captured ³ H- inulin (%) EPC-MLV a CHS -MLV b 20 2 10 40 4 14 80 5 29 160 8 38 200 11 60 ａa Egg phosphatidylcholine multilamellar vesicle b cholesterol hemisuccinate multilamellar vesicle CHS-MLV has an ability to contain CHS-MLV in an aqueous buffer solution. To determine whether it was affected by the amount of time contacted with free ³ H-inulin, CHS-MLV was prepared as follows. 80 mg or 300 mg of tris-salt CHS is ³ H-inulin (217 mCi / mg
0.01 M Tris-H containing 10 μl
Cl, 20 ml of 0.14 M NaCl buffer solution, which results in 40 mg / ml and 1 ml, respectively.
CHS-MLV using a concentration of 50 mg / ml CHS
Was formed. Five samples of each of two lipid concentrations were prepared, and the CHS-MLV suspension was left at room temperature in 2.0 ml of 0.01 M Tris-HCl (pH 7.3), 0.14 M NaCl buffer solution. At the following time intervals: 0, 15, 30, 60 and 120 minutes,
The sample was made up to 10 ml volume using the same buffer solution. The first 10 μl aliquot of each sample was removed for scintillation counting as described above. The sample is then 10,000 xg
And each pellet was washed four times in 10 ml of buffer solution. The final pellet was suspended in buffer solution to a final volume of 10 ml and the radioactivity of each 10 μl aliquot of each final sample was compared to the radioactivity of the first sample at each time point.
The results indicated that there was no significant difference in encapsulation for the five time points at any of the lipid concentrations tested. This indicates that about 12% or 20% capture of the initial ³ H-inulin added to the preparation occurs regardless of the contact time at 40 mg / ml or 150 mg / ml CHS, respectively. . This differs from conventional MLVs prepared with egg phosphatidylcholine in that the "expansion time"
Indicates that it is unnecessary in the preparation of CHS-MLV.

【００２２】例３ コレステロールヘミサクシネート−
ＳＵＶにおけるイヌリンの捕捉（参考例） 捕捉された作用物質として ³Ｈ−イヌリンを含有するコ
レステロールヘミサクシネートから構成されたスモール
ユニメラベシクル（ＣＨＳ−ＳＵＶ）は次のようにして
調製された。１．０ｍＣｉ／ｍｌ ³Ｈ−イヌリン（ニュ
ーイングランドヌクレア、ボストン、マサチューセッツ
州）の１００μｌが、トリス−塩ＣＨＳ１００ｍｇある
いは２００ｍｇのいずれかが添加される０．０１Ｍ ト
リス−ＨＣｌ（ｐＨ７．３）、０．１４Ｍ ＮａＣｌ
２．５ｍｌ溶解された。ガラス製ビーズを用いての旋回
混合の後、混合物は、ビーズからピペット中へ吸引さ
れ、そして透明となるまで、すなわち約２時間、音波処
理された。懸濁液の透明化は、ＣＨＳ−ＭＬＶのスモー
ルユニラメラベシクルへの転化を示す。ＣＨＳ−ＳＵＶ
懸濁液中のＣＨＳの最終濃度はそれぞれ４０ｍｇ／ｍｌ
および８０ｍｇ／ｍｌであった。イヌリン捕捉を明らか
とするために（発明の詳細な説明の項参照）、ＣＨＳ−
ＳＵＶは、以下のようなゲル濾過により未捕捉のイヌリ
ンから分離された。それぞれのリポソーム懸濁液は、
０．０１Ｍ トリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．３）、０．１４
Ｍ ＮａＣｌ緩衝溶液で平衡化され校正された、分子量
４０，０００〜１５，０００，０００ドルトンの操作範
囲を有するバイオーゲル Ａ−１５ｍ［Ｂｉｏ−Ｇｅｌ
Ａ−１５ｍ］１００〜２００メッシュアガロースカラ
ム（バイオ−レッド ラボラトリーズ［Ｂｉｏ−Ｒｅｄ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ］、リッチモンド、カリフ
ォルニア州）に別々に適用された。次にカラムから溶出
された１ｍｌ分画は採取されそしてそれぞれの分画の１
０μｌアリコットの放射能が、前記したようにして測定
された。隔離されたイヌリンの存在しない透明な分離物
がゲル濾過によって得られ、これゆえＣＨＳ−ＳＵＶ中
へのイヌリンの捕捉が示された。この分析は、イヌリン
の約１％がＣＨＳ−ＳＵＶ中に捕捉されたことを示して
いた。 EXAMPLE 3 Cholesterol hemisuccinate
Capture of inulin in SUV (reference example) captured small unilamellar vesicles composed of cholesterol hemisuccinate containing ³ H- inulin as an agent (CHS-SUV) were prepared as follows. 100 μl of 1.0 mCi / ml ³ H-inulin (New England Nuclear, Boston, Mass.) Was added to 0.01 M Tris-HCl, pH 7.3, to which either 100 mg or 200 mg of Tris-salt CHS was added. .14M NaCl
2.5 ml was dissolved. After swirling with glass beads, the mixture was aspirated from the beads into a pipette and sonicated until clear, ie, about 2 hours. Clarification of the suspension indicates conversion of CHS-MLV to small unilamellar vesicles. CHS-SUV
The final concentration of CHS in the suspension is 40 mg / ml each
And 80 mg / ml. To demonstrate inulin capture (see Detailed Description of the Invention), CHS-
SUVs were separated from uncaptured inulin by gel filtration as follows. Each liposome suspension is
0.01 M Tris-HCl (pH 7.3), 0.14
Bio-Gel A-15m [Bio-Gel, equilibrated and calibrated with M NaCl buffer solution and having a working range of 40,000 to 15,000,000 daltons in molecular weight]
A-15m] 100-200 mesh agarose column (Bio-Red Laboratories [Bio-Red]
Laboratories], Richmond, CA). The 1 ml fractions eluted from the column were then collected and 1 of each fraction
Radioactivity of a 0 μl aliquot was measured as described above. A clear isolate free of sequestered inulin was obtained by gel filtration, thus indicating entrapment of inulin in CHS-SUV. This analysis indicated that about 1% of the inulin was captured in CHS-SUV.

【００２３】例４ コレステロールヘミサクシネートＭ
ＬＶ中へのクロムの捕捉（参考例） 捕捉された作用物質として⁵¹Ｃｒを取込むコレステロー
ルヘミサクシネートマルチラメラベシクルは、以下のよ
うにして調製された。トリス塩ＣＨＳ １５．０μｍｏ
ｌ、４０．０μｍｏｌ、６５．８μｍｏｌ、１００．０
μｍｏｌ、１７５．０μｍｏｌ、２６３．２μｍｏｌ、
５２６．４μｍｏｌもしくは６５８．０μｍｏｌが⁵¹Ｃ
ｒ（ニューイングランド ヌクレア、ボストン、マサチ
ューセッツ州）の痕跡量を含有する、０．０１Ｍ トリ
ス−ＨＣｌ、０．１４Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．３ ５ｍ
ｌへ添加され、そして室温下で２時間放置され、捕捉し
たＣｒを含有するＣＨＳ−ＭＬＶの懸濁液が得られた。 Example 4 Cholesterol hemisuccinate M
Capture of Chromium in LV (Reference Example) A cholesterol hemisuccinate multilamellar vesicle incorporating ⁵¹ Cr as a captured active substance was prepared as follows. Tris salt CHS 15.0 μmo
1, 40.0 μmol, 65.8 μmol, 100.0 μmol
μmol, 175.0 μmol, 263.2 μmol,
526.4 μmol or 658.0 μmol is ⁵¹ C
r (New England Nuclea, Boston, Mass.), 0.01 M Tris-HCl, 0.14 M NaCl, pH 7.35 m
1 and left for 2 hours at room temperature to obtain a suspension of CHS-MLV containing the captured Cr.

【００２４】例４−１ コレステロールヘミサクシネー
ト−ＭＬＶ中へのクロムの内包能 例４において調製されたＣＨＳ−ＭＬＶの内包能を測定
するために、それぞれの調製物のサンプルが蒸溜水中で
３度煮沸された透析バッグ（トーマスサイエンティフィ
ス［Ｔｈｏｍａｓ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ］、カタログ
番号第３７８７−Ｄ２２号、１２，０００ドルトンの分
子量除去）中へピペットにより入れられた。透析バッグ
中のサンプルは、ガンマカウンター（ティーエム アナ
リテック［Ｔｍ Ａｎａｌｙｔｉｃ］、モデル番号第１
１９１号）にて最初に計測された。サンプルは次に、
１：１５０よりも大きい保持物：透析物比において同じ
０．０１Ｍトリス−ＨＣｌ、０．１４Ｍ ＮａＣｌ、ｐ
Ｈ７．３緩衝溶液に対してそれぞれ２０時間透析され
た。透析物は最初の６時間においては２時間毎に満たさ
れた。内包能は、残存した最初のカウントのパーセンテ
ージを計算することにより決定された。表２に示すよう
に、内包能における増加は、ＣＨＳ濃度の増加に比例す
るものである。 Example 4-1 Cholesterol hemisacine
To measure the encapsulation efficiency of the prepared CHS-MLV in encapsulation efficiency Example 4 chromium into the preparative MLVs, dialysis bags sample of each preparation was boiled three times with distilled water (Thomas Scientific office [Thomas Scientific], catalog number 3787-D22, molecular weight removal of 12,000 daltons). The sample in the dialysis bag was analyzed using a gamma counter (TM Analytical [Tm Analytical], model number 1).
191). The sample is then
The same 0.01 M Tris-HCl, 0.14 M NaCl, p at a retentate: dialysate ratio greater than 1: 150
Each was dialyzed against H7.3 buffer solution for 20 hours. Dialysate was filled every 2 hours for the first 6 hours. Encapsulation capacity was determined by calculating the percentage of the first count remaining. As shown in Table 2, the increase in encapsulation capacity is proportional to the increase in CHS concentration.

【００２５】 表 ２ コレステロールヘミサクシネートベシクル中へのクロムの内包能 ＣＨＳの濃度（μmol) 捕捉された⁵¹Ｃｒ（％） １５．０ １４．７９ ４０．０ １５．２０ ６５．８ １５．０９ １００．０ １６．１０ １６５．０ ２０．１３ ２６３．０ ２７．９０ ５２６．４ ４０．７４ ６５８．０ ４８．０３ 。 Table 2 Incorporation of chromium into cholesterol hemisuccinate vesicles Concentration of CHS (μmol) ⁵¹ Cr (%) captured 15.0 14.79 40.0 15.20 65.8 15.09 100 0.0 16.10 165.0 20.13 263.0 27.90 526.4 40.74 658.0 48.03 .

【００２６】例４−２ コレステロールヘミサクシネー
ト中への捕捉容量：クロム捕捉およびコレステロールヘ
ミサクシネート濃度 例４−１において述べたようにして調製されたＣＨＳベ
シクルの捕捉容量が、次の計算式、 を用いて捕捉容量を計算することによって、それぞれの
コレステロールヘミサクシネートの濃度に関して測定さ
れた。図１に図示された結果は、トリス−塩ＣＨＳの濃
度が増加するに従いより少ないクロム／モル（脂質）が
捕捉された。ゆえに、内包能における増加は、脂質濃度
における増加に比例しているが、捕捉容量は、脂質濃度
の増加に従い減少する。１つの点当りの試みの回数は、
それぞれの点の横のカッコ内に示す。Example 4-2 Capture Capacity in Cholesterol Hemisuccinate : Chromium Capture and Cholesterol
Missuccinate concentration The capture capacity of CHS vesicles prepared as described in Example 4-1 was calculated by the following formula: Was determined for each cholesterol hemisuccinate concentration by calculating the capture volume using. The results illustrated in FIG. 1 captured less chromium / mole (lipid) as the concentration of Tris-salt CHS was increased. Thus, while the increase in encapsulation capacity is proportional to the increase in lipid concentration, the capture volume decreases with increasing lipid concentration. The number of attempts per point is
Shown in parentheses next to each point.

【００２７】例５ コレステロールヘミサクシネートリ
ポソームの超微細構造（参考例） イヌリンが用いられない以外は例１−１において述べる
ようにしてコレステロールヘミサクシネートのトリス−
塩を用いて調製された、ＣＨＳ−ＭＬＶおよびＣＨＳ−
ＳＵＶのサンプルが、凍結エッチング電子顕微鏡（凍結
エッチング法に関しては、プフェニンガーら、１９７５
年、ジャーナル オブ セル バイオロジーズ６５：１
５〜２８［Ｐｆｅｎｎｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ，１９７
５，Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．６５：１５−２８］を参
照のこと。）のために調製された。ＣＨＳ−ＭＬＶ凍結
エッチング化調製物の電子顕微鏡は、少なくとも１つの
ラメラによって結合された不連続単位、すなわちリポソ
ームないしは脂質ベシクルを見せるものであった。直径
８００〜１０，０００ｎｍの範囲にわたる、ＣＨＳ−Ｍ
ＬＶの大きさのかなりの不均質性があった。より大きな
ベシクルは、１つのあるいは２、３の外核ラメラを有す
るもの、および多くのラメラを有するものなどを含むい
くつかの分類に類別され得るものであった。より大きな
ベシクルの多くは、水性画室を示し得る、木目のような
外観を内部に有する実質的な空間を有していた。多くの
例において、小さなベシクルあるいは小さなベシクルの
群は、より大きなベシクルの内側にはっきりして、幾分
か遊離したもので、時々は４もしくは５層の深さであっ
た。このはっきりした「造巣［ｎｅｓｔｉｎｇ］」は負
に帯電したリン脂質を用いて調製された従来のリポソー
ムにおいて普通に観察されるものである。時折、密着し
て並んだラメラのゾーンを観察することができた。これ
らは従来のリン脂質ＭＬＶのラメラとすべての点におい
て同様のものであった。調べられた音波処理されたサン
プルはまた、５０ｎｍ〜５００ｎｍの範囲の多くの微小
な球状体を含んでいた。これらのベシクルはおそらくリ
ン脂質ＭＬＶの音波処理により調製されたＳＵＶに相当
する。より微小なＣＨＳ−ベシクルは裂くことができな
いので内部またはこれらの成分ラメラの構造を識別する
ことは不可能であった。３０ｎｍフィルターを通過して
押出された（１０回）、平均直径約６５ｎｍを有するＣ
ＨＳベシクルが観察された。これはフレンチプレス法に
より調製された極端に小さい（平均直径約２５ｎｍまた
はそれ以下）ＣＨＳベシクルと対比される。 Example 5 Cholesterol hemisuccinate
Ultrastructure of Posomes (Reference Example) Tris of cholesterol hemisuccinate as described in Example 1-1 except that inulin is not used.
CHS-MLV and CHS- prepared using salts
An SUV sample was prepared by freeze-etching electron microscopy (see Pfeninger et al., 1975 for freeze-etching techniques).
Year, Journal of Cell Biology 65 : 1
5-28 [Pfenninger et al, 197
5, J .; Cell Biol. 65 : 15-28]. ). Electron microscopy of the CHS-MLV freeze-etched preparation showed a discrete unit, ie, liposomes or lipid vesicles, bound by at least one lamella. CHS-M, ranging in diameter from 800 to 10,000 nm
There was considerable heterogeneity in LV size. Larger vesicles could be categorized into several classes, including those with one or a few outer lamellae, and those with many lamellae. Many of the larger vesicles had substantial space inside with a grain-like appearance, which could indicate an aqueous compartment. In many instances, small vesicles or groups of small vesicles were distinct and somewhat loose inside larger vesicles, sometimes 4 or 5 layers deep. This sharp "nesting" is what is commonly observed in conventional liposomes prepared with negatively charged phospholipids. Occasionally, lamellar zones closely aligned could be observed. These were similar in all respects to the lamellae of conventional phospholipid MLVs. The sonicated samples examined also contained many microspheres ranging from 50 nm to 500 nm. These vesicles probably correspond to SUVs prepared by sonication of phospholipid MLV. Since smaller CHS-vesicles could not be torn, it was not possible to identify the structure of the interior or these component lamellae. C extruded through a 30 nm filter (10 times) with an average diameter of about 65 nm
HS vesicles were observed. This is in contrast to extremely small (average diameter about 25 nm or less) CHS vesicles prepared by the French press method.

【００２８】例６ コレステロールヘミサクシネートの
Ｘ線回折分析（参考例） 種々のＣＨＳ−ＭＬＶ調製物のＸ線回折が、他のもの
（グルーナー、エス．エム、１９７７年、物理学博士論
文、プリンストンユニバーシティ、プリンストンニュー
ジャージー州 ０９５４０ アメリカ合衆国［Ｇｒｕｎ
ｅｒ，Ｓ．Ｍ．，１９７７，ｐｈＤ ｔｈｅｓｉｓ，Ｐ
ｒｉｎｃｅｔｏｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｐｒｉｎｃ
ｅｔｏｎ ＮＪ ０９５４０ ＵＳＡ］；レイノルズ、
ゼオ．ティー．，ミリック、ジェイ．アール．およびグ
ルーナー、エス．エム．、１９７８年、リバイズド サ
イエンティフィックインストラクションズ ４９：１２
４１〜１２４９［Ｒｅｙｎｏｌｄｓ，Ｇｅｏ．Ｔ．Ｍｉ
ｌｃｈ，Ｊ．Ｒ．ａｎｄＧｒｕｎｅｒ，Ｓ．Ｍ．，１９
７８，Ｒｅｖ．Ｓｃｉ．Ｉｎｓｔｒ．４９：１２４１−
１２４９］；テルコック、シー．ピー．ティー．、バリ
ー、エム．ビー．、ファーレン、エス．ビー．、キュー
リス、ピー．アール．およびグルーナー、エス．エ
ム．、１９８４年、バイオケミカリー、２３：２６９６
〜２７０３［Ｔｉｌｃｏｃｋ，Ｃ．Ｐ．Ｔ．，Ｂａｌｌ
ｙ，Ｍ．Ｂ．，Ｆａｒｒｅｎ，Ｓ．Ｂ．，Ｃｕｌｌｉ
ｓ，Ｐ．Ｒ．ａｎｄ Ｇｒｕｎｅｒ，Ｓ．Ｍ．，１９８
４，Ｂｉｏｃｈｅｍ，２３：２６９６−２７０３］）に
述べられた２次元画像−増幅Ｘ線検知装置を用いて行な
われた。Ｘ線反復間隔は±０．５Åとして表わされた。
ＣＨＳ分散液は、エポキシの栓により密封された１．５
ｍｍのガラス製Ｘ線キャピラリー中に保たれた。標本は
ゆっくりとまたは活発に水和された。ゆっくりとした水
和に関しては、緩衝溶液は、シリンジを介してＸ線キャ
ピラリーの底部における乾燥ＣＨＳ上へ積み重ねられ
た。このキャピラリーは次に、脂質水ペーストからの空
気泡を消すためにテーブルトップ遠心機中でしばらく遠
心分離された。キャピラリーは、次に密封されそして５
℃で少なくとも４時間平衡化された。活発な水和は、乾
燥ＣＨＳを緩衝溶液および２個のガラス製混合ビーズと
試験管中にて渦動することによって行なわれた。１つの
アリコットが次にＸ線キャピラリーへと移された。Ｘ線
回折は、水和されたＣＨＳがマルチラメラ構造を形成し
ていることを示した。図２ａおよび図２ｂは、それぞれ
６８．９重量％および５９．１重量％のＣＨＳから成る
ゆっくりと水和された標本から得られた低角度回折を示
す。回折の最高４つまでの均等な間隔を保たれた秩序置
換［ｏｒｄｅｒ］は視認でき、それぞれ６８．１Åおよ
び７９．８Å、反復、のマルチラメラ配列で一致してい
た。この秩序置換はシャープでかつよく分析されてお
り、格子がほとんど無秩序置換［ｄｉｓｏｒｄｅｒ］を
含んでいないことを示していた。これらの濃縮されたＣ
ＨＳ標本は、視認出来る過剰な緩衝溶液を有しない均一
なペースト様外観を有し、水性含量の増加に従って反復
間隔が増加する事実と一致する。極めて高い水性濃度に
おいては、ゆっくりと水和されたＣＨＳ標本は、水和さ
れた脂質の頂部上に過剰な緩衝溶液の明らかに視認でき
る溜りを示す。こういうサンプル（全重量に対し２０．
２％のＣＨＳ）からの回折は図２ｃに示される。より高
角度の回折ピークの広がることは、格子における少なか
らぬ無秩序置換を暗示するものである。回折における無
秩序置換は決定的な格子割当を困難とするが、図２ｃに
おいて示されたように、ラメラ適合がなされると、反復
は約８６Åであり、脂質二重層間の広い水性空間を示唆
するものであった。ゆっくりした水和を用いる代わり
に、２０．７％ＣＨＳ標本が、乾燥脂質を緩衝溶液と旋
回的に混合することによって調製される場合、得られる
標本は、均一な乳白色の外観を有していた。図２ｄに示
すように、低角度回折は、鋭く限定された格子の形跡を
殆ど有さない広い散乱のバンドを示すものであった。同
様の回折特色が、ラメラ間の水性幅が広く変化したマル
チラメラ系から期待できる。希釈ＣＨＳ分散液のＸ線回
折は、ラメラ間力が弱いマルチラメラ系から発生するも
のとして、最も矛盾なく解釈される。例えば希釈卵ホス
ファチジルコン分散液などのような、他の脂質系におい
ては、Ｘ線回折パターンは、重量的にほとんど脂質であ
る鋭く限定されたラメラ格子を示す（ランド、１９８１
年、アニュアル・レヴュー・オブ・バイオフィジックス
・アンド・バイオエンジニアリング １０：２１７〜３
１４［Ｒａｎｄ，１９８１，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏ
ｐｈｙｓ．Ｂｉｏｅｎｇ．１０：２１７−３１４］）。
この明確な格子反復は、脂質層分離の関数である格子電
位におけるかなり鋭い極小の結果である。電位対距離曲
線が浅いくぼみしか有していない場合には、弱いラメラ
間力および少なからぬ格子無秩序置換を予想するもので
ある。これはＣＨＳベシクルでの場合であるようであ
る。図２ｄの標本は、図２ａの６８．１Å反復に比較さ
れる、約８６Å反復を有している。このことは、過剰の
緩衝溶液の存在下において、ＣＨＳリポソームが脂質に
対する水の高い割合を有していることを示す。同様の結
果が、他の帯電脂質系において観察できる（ランド，１
９８１年，上記）。 Example 6 Cholesterol hemisuccinate
X-Ray Diffraction Analysis (Reference Example) X-ray diffraction of various CHS-MLV preparations was determined by others (Gruner, S.M., 1977, Doctoral Dissertation, Princeton University, Princeton NJ 09540 United States [Grun
er, S .; M. , 1977, phD thesis, P
rinceton University, Prince
eton NJ 09540 USA]; Reynolds,
Zeo. tea. , Milrick, Jay. R. And Gruner, S. M. , 1978, Ribaizudo Scientific Insutorakushonzu 49: 12
41 to 1249 [Reynolds, Geo. T. Mi
Ich, J .; R. andGruner, S.M. M. , 19
78, Rev. Sci. Instr. 49 : 1241-
1249]; Telcock, C .; P. tea. , Barry, M. Bee. , Fahren, S. Bee. , Curis, P. R. And Gruner, S. M. 1984, Biochemical, 23 : 2696
~ 2703 [Tilcock, C.I. P. T. , Ball
y, M. B. , Farren, S .; B. , Culli
s, P. R. and Gruner, S.M. M. , 198
4, Biochem, 23 : 2696-2703]). X-ray repeat intervals were expressed as ± 0.5 °.
The CHS dispersion was sealed 1.5 times with an epoxy stopper.
mm glass x-ray capillaries. Specimens were slowly or actively hydrated. For slow hydration, the buffer solution was stacked via syringe on dry CHS at the bottom of the X-ray capillary. The capillary was then centrifuged briefly in a table top centrifuge to eliminate air bubbles from the lipid water paste. The capillary is then sealed and 5
Equilibrated for at least 4 hours at ° C. Active hydration was performed by swirling dry CHS in a test tube with buffer solution and two glass mixing beads. One aliquot was then transferred to the X-ray capillary. X-ray diffraction showed that the hydrated CHS formed a multilamellar structure. Figures 2a and 2b show low angle diffraction obtained from slowly hydrated specimens consisting of 68.9% and 59.1% by weight of CHS, respectively. Up to four evenly spaced ordered permutations of the diffraction [order] were visible, consistent with the multilamellar sequences of 68.1 ° and 79.8 °, respectively, repeating. This order substitution was sharp and well analyzed, indicating that the lattice contained almost no disorder. These concentrated C
HS specimens have a uniform paste-like appearance with no visible excess buffer solution, consistent with the fact that the repetition interval increases with increasing aqueous content. At very high aqueous concentrations, the slowly hydrated CHS specimen shows a clearly visible pool of excess buffer solution on top of the hydrated lipid. Such a sample (20.
The diffraction from 2% CHS) is shown in FIG. 2c. The broadening of the higher angle diffraction peaks implies considerable disorder substitution in the lattice. Although disordered substitutions in diffraction make crucial lattice assignment difficult, as shown in FIG. 2c, when lamellar fitting is performed, the repeat is about 86 °, suggesting a large aqueous space between lipid bilayers. Was something. If, instead of using slow hydration, a 20.7% CHS specimen was prepared by swirling the dry lipid with a buffer solution, the resulting specimen had a uniform milky appearance . As shown in FIG. 2d, the low angle diffraction showed a broad scatter band with little evidence of sharply defined gratings. Similar diffraction features can be expected from multilamellar systems where the aqueous width between the lamellas has changed widely. X-ray diffraction of the diluted CHS dispersion is most consistently interpreted as originating from a multilamellar system with weak interlamellar forces. In other lipid systems, such as, for example, diluted egg phosphatidylcon dispersions, the X-ray diffraction pattern shows a sharply defined lamella lattice that is mostly lipid by weight (Land, 1981).
Year, Annual Review of Biophysics and Bioengineering 10 : 217-3
14 [Rand, 1981, Annu. Rev .. Bio
phys. Bioeng. 10 : 217-314]).
This distinct lattice repetition is the result of a rather sharp minimum in the lattice potential, which is a function of lipid layer separation. If the potential versus distance curve has only shallow depressions, one would expect weak interlamellar forces and considerable lattice disorder replacement. This seems to be the case with CHS vesicles. The specimen of FIG. 2d has about 86 ° repeats, compared to the 68.1 ° repeat of FIG. 2a. This indicates that CHS liposomes have a high water to lipid ratio in the presence of excess buffer solution. Similar results can be observed in other charged lipid systems (Land, 1
981, supra).

【００２９】例７ コレステロールヘミサクシネート
リポソームの電子スピン共鳴分析（参考例） 卵ホスファチジルコリン（アバンティ ポーラ リピッ
ズ［Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓｐ］、バ
ーミンガム、アラバマ州）から調製されたマルチラメラ
ベシクルはスピン標識化され、そして本質的には前記し
たようにして調製された、同様にスピン標識化されたト
リス−塩ＣＨＳ−ＭＬＶと比較された。ＥＰＣ−ＭＬＶ
の場合には、５、７、９、１０、１２または１６ドキシ
ルステアレート（モレキュラープローブス［Ｍｏｌｅｃ
ｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ］、ジャンクション シティ
オレゴン州）の１モルパーセントが、脂質４０ｍｇのク
ロロホルム溶液に添加され、そして得られた溶液は回転
蒸発によって薄いフィルムとなるまで乾燥された。次に
トリス−ＨＣｌ緩衝溶液２ｍｌを用いて、このフィルム
が完全に懸濁されるまで渦動することによりフィルムを
水和した。得られたＥＰＣ−ＭＬＶは分光分析の前に２
度洗浄された。ＣＨＳ−ＭＬＶの場合には、エタノール
中の適当なスピン標識が、試験管側面に薄いフィルムを
形成するまで乾燥され、そしてここにトリス−塩ＣＨＳ
粉末４０ｍｇおよびトリス−ＨＣｌ緩衝溶液２ｍｌが添
加された。この懸濁液は渦動され、そして得られたリポ
ソームは２度洗浄された。すべての電子スピン共鳴実験
は、アイビーエムインストルメンツ ＥＲ１００Ｄ Ｅ
ＳＲ スペクトロメーター［ＩＢＭ Ｉｎｓｔｒｕｍｅ
ｎｔｓ ＥＲ１００Ｄ ＥＳＲ ｓｐｅｃｔｒｏｍｔｅ
ｒ］を用いて行なわれた。秩序パラメーター［ｏｒｄｅ
ｒ ｐａｒａｍｅｔｅｒ］（Ｓ）は、他の文献（グリッ
フィスとジスト、スピン ラベリング、ベルリナー、エ
ル．ジェイ（編）、アカデミック プレス、ニューヨー
ク、１９７６年中［Ｇｒｉｆｆｉｔｈ ａｎｄ Ｊｕｓ
ｔ ｉｎ、Ｓｐｉｎ Ｌａｂｅｌｌｉｎｇ、Ｂｅｒｌｉ
ｎｅｒ、Ｌ．Ｊ（ｅｄ．）、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅ
ｓｓ、Ｎ．Ｙ．１９７６）に述べられるようにして算定
された。図３は、５、６、７、９、１０、１２または１
６ドキシルステアレートでこれらの調製物をスピン標識
化することによって決定されるＣＨＳ−ＭＬＶおよびＥ
ＰＣ−ＭＬＶの秩序パラメーター特性を示す。ＥＰＣ二
重層に関しては、すでに報告されているように、二重層
中への炭素数の増加に伴い、秩序パラメーターが減少す
る。ＣＨＳ二重層の超分子構造は、顕著に異なるもので
ある：すなわち、ＥＰＣ二重層よりもＣＨＳ二重層が劇
的により剛直であるのみならず、ＣＨＳ系は５０番目か
ら９０番目の炭素にかけて秩序が増大しており、以前に
報告されているものとは全く異なる物理的および化学的
二重層構造を示すものである。 EXAMPLE 7 Cholesterol hemisuccinate
Electron Spin Resonance Analysis of Liposomes (Reference Example) Multilamellar vesicles prepared from egg phosphatidylcholine (Avanti Polar Lipids, Birmingham, Ala.) Are spin-labeled and essentially as described above. Compared to prepared, similarly spin-labeled Tris-salt CHS-MLV. EPC-MLV
In the case of 5, 7, 9, 10, 12 or 16 doxyl stearate (Molecular Probes [Molec
ullar Probes], Junction City
One mole percent of Oregon) was added to a solution of 40 mg of lipid in chloroform, and the resulting solution was dried to a thin film by rotary evaporation. The film was then hydrated with 2 ml of Tris-HCl buffer by swirling until the film was completely suspended. The resulting EPC-MLV was 2 hours prior to spectroscopic analysis.
Washed once. In the case of CHS-MLV, the appropriate spin label in ethanol is dried to form a thin film on the side of the test tube, where the tris-salt CHS
40 mg of powder and 2 ml of Tris-HCl buffer solution were added. The suspension was swirled and the resulting liposomes were washed twice. All electron spin resonance experiments were performed by IBM Instruments ER100D E
SR Spectrometer [IBM Instrument
nts ER100D ESR spectrum
r]. Order parameter [orde
r parameter] (S) is described in other literature (Griffith and Juist, Spin Labeling, Berliner, El J. (ed.), Academic Press, New York, 1976 [Griffith and Jus].
tin, Spin Labelling, Berli
ner, L .; J (ed.), Academic Pre
ss, N.M. Y. 1976). FIG. 3 shows 5, 6, 7, 9, 10, 12 or 1
CHS-MLV and E determined by spin labeling these preparations with 6-doxyl stearate
3 shows the order parameter characteristics of PC-MLV. For EPC bilayers, as previously reported, the order parameter decreases with increasing carbon number in the bilayer. The supramolecular structure of the CHS bilayer is significantly different: not only is the CHS bilayer dramatically stiffer than the EPC bilayer, but the CHS system is also ordered from the 50th to 90th carbon. It is growing and exhibits a completely different physical and chemical bilayer structure than previously reported.

【００３０】例８ コレステロールヘミサクシネートリ
ポソームの等張膨脹（参考例） 以下の一連の実験において、コレステロールヘミサクシ
ネートおよびリン脂質のマルチラメラベシクルの等張膨
脹挙動が比較された。 （１） ＣＨＳ−ＭＬＶは、０．０１Ｍトリス−ＨＣ
ｌ、０．１Ｍ ＫＣｌ緩衝溶液２．０ｍｌ中のトリス−
塩ＣＨＳ ４０ｍｇを用いて例１において述べたように
して調製された。 （２） ＥＰＣ−ＭＬＶは、０．０１Ｍトリス−ＨＣ
ｌ、０．１Ｍ ＫＣｌ緩衝溶液２．０ｍｌ中のＥＰＣ５
１．８ｍｇを用いて例２−１において述べたようにして
調製された。 （３） ＥＰＣおよび卵ホスファチジン酸（ＥＰＡ）か
ら構成される脂質二重層を有するマルチラメラベシクル
が、０．０１Ｍトリス−ＨＣｌ、０．１Ｍ ＫＣｌ緩衝
溶液２２．０ｍｌ中のＥＰＣ４１．１ｍｇおよびＥＰＡ
９．７９ｍｇを用いて、ＥＰＣ−ＭＬＶ調製に関して例
２−１において述べられた方法を用いて調製された。得
られたＭＬＶ（ＥＰＣ：ＥＰＡ−ＭＬＶ）は、それぞれ
が８：２のモル比のＥＰＣ：ＥＰＡで構成されていた。
旋回混合の後、ＭＬＶのそれぞれの懸濁液（すなわち、
ＣＨＳ−ＭＬＶ，ＥＰＣ−ＭＬＶおよびＥＰＣ：ＥＰＡ
−ＭＬＶ）が調製に用いられた緩衝溶液中で２時間室温
下に放置された。それぞれのリポソーム調製物の２０μ
ｌアリコットが、次に、０．０５５Ｍから０．５Ｍまで
の範囲の濃度のＫＣｌを含む０．０１Ｍトリス−ＨＣｌ
緩衝溶液の連続群１．０ｍｌへ添加された。１．５時間
の平衡化の後、５５０ｎｍの波長でのサンプルの吸光度
を計測することにより光散乱が測定された。結果をベシ
クルがさらされる媒体のＫＣｌ濃度の逆数に対して吸光
度がプロットされるものである図４に図示する。増加し
た吸光度は、脂質ベシクルの膨脹を示す。曲線Ｂおよび
Ｄは、予期したように、リン脂質ＭＬＶ（すなわちＥＰ
Ｃ−ＭＬＶおよびＥＰＣ：ＥＰＡ−ＭＬＶ）が理想浸透
圧計であるようにふるまったことを示す。しかしながら
曲線Ｃは、ＣＨＳ−ＭＬＶが閉鎖したベシクル構造とし
てふるまうが、これらは、低張および高張媒体において
は非理想的挙動を示すことを示唆している。図４に示し
たこの挙動は、ブロッカホフとラムサミー（１９８２
年、バイオヒミカ エト バイオフィジカ アクタ ６
９１：２２７〜２３２［１９８２，Ｂｉｏｃｈｉ．Ｂｉ
ｏｐｈｉｓ．Ａｃｔａ．６９１：２２７〜２３２］）の
コレステロールリポソームにおいて観察されるものとは
全く異なるものである。 Example 8 Cholesterol hemisuccinate
Pososome Isotonic Swelling (Reference Example) In the following series of experiments, the isotonic swelling behavior of multilamellar vesicles of cholesterol hemisuccinate and phospholipid was compared. (1) CHS-MLV is 0.01M Tris-HC
1, Tris in 2.0 ml of 0.1 M KCl buffer solution
Prepared as described in Example 1 using 40 mg of salt CHS. (2) EPC-MLV is 0.01M Tris-HC
1, EPC5 in 2.0 ml of 0.1 M KCl buffer solution
Prepared as described in Example 2-1 using 1.8 mg. (3) A multilamellar vesicle having a lipid bilayer composed of EPC and egg phosphatidic acid (EPA) was prepared by combining 41.1 mg of EPC in 22.0 ml of 0.01 M Tris-HCl, 0.1 M KCl buffer solution and EPA.
Prepared using the method described in Example 2-1 for EPC-MLV preparation using 9.79 mg. The resulting MLVs (EPC: EPA-MLV) were each composed of a 8: 2 molar ratio of EPC: EPA.
After orbital mixing, each suspension of MLV (ie,
CHS-MLV, EPC-MLV and EPC: EPA
-MLV) was left in the buffer solution used for preparation for 2 hours at room temperature. 20 μl of each liposome preparation
One aliquot then contains 0.01M Tris-HCl containing KCl at a concentration ranging from 0.055M to 0.5M.
Added to a continuous group of 1.0 ml of buffer solution. After equilibration for 1.5 hours, light scatter was measured by measuring the absorbance of the sample at a wavelength of 550 nm. The results are illustrated in FIG. 4, where absorbance is plotted against the reciprocal of the KCl concentration of the medium to which the vesicles are exposed. Increased absorbance indicates expansion of the lipid vesicles. Curves B and D show, as expected, the phospholipid MLV (ie, EP
C-MLV and EPC: EPA-MLV) show that they behaved as ideal osmometers. Curve C, however, suggests that CHS-MLV behaves as a closed vesicle structure, but that they exhibit non-ideal behavior in hypotonic and hypertonic media. This behavior, shown in FIG. 4, is similar to that of Blockerhof and Ramsami (1982).
Year, Bio-Himika et Bio-Physica Actor 6
91 : 227-232 [1982, Biochi. Bi
opis. Acta. 691 : 227-232]), which is completely different from that observed in cholesterol liposomes.

【００３１】例９ 難溶性化合物を捕捉するコレステロ
ールヘミサクシネートリポソーム（実施例） 水にわずかに溶解する化合物のＣＨＳ−リポソーム中へ
の捕捉が、ウシ成長ホルモン、インスリンおよびタイロ
シン（ｔｙｌｏｓｙｎ）に関して実証された。 例９−１ コレステロールヘミサクシネート−ＳＵＶ中
に捕捉されたウシ成長ホルモン 約１９１のアミノ酸の単鎖から成る単純タンパクであ
る、ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）は、部分水溶性であ
る。通常溶解度は、ｐＨ８．０で１〜１．５ｍｇ／ｍｌ
である。ＢＧＨは、クロロホルムのような有機溶媒中に
沈澱する。Example 9 Cholesterol trapping poorly soluble compounds
Lulehemisuccinate liposomes (Examples) Entrapment of slightly soluble compounds in water into CHS-liposomes has been demonstrated for bovine growth hormone, insulin and tylosyn. Example 9-1 Bovine Growth Hormone Captured in Cholesterol Hemisuccinate-SUV Bovine growth hormone (BGH), a simple protein consisting of a single chain of about 191 amino acids, is partially water soluble. Normal solubility is 1-1.5 mg / ml at pH 8.0
It is. BGH precipitates in organic solvents such as chloroform.

【００３２】ＣＨＳ−ＭＬＶは、０．０１Ｍトリス−Ｈ
Ｃｌ（ｐＨ７．４）、０．１４ＭＮａＣｌ緩衝溶液１．
０ｍｌ中のトリス−塩ＣＨＳ２７ｍｇを用いて例２に記
載されたようにして調製された。ＣＨＳ−ＭＬＶ調製物
は、音波処理化ＣＨＳ−ＭＬＶを形成するために、透明
となるまで音波処理され、そして次にＢＧＨ（エリリリ
ー アンド カンパニー［Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ ＆ Ｃ
ｏ．］、インディアナポリス、インディアナ州）５，１
０，１５，２５，３０または１６６ｍｇのいずれかが、
音波処理化ＣＨＳ−ＭＬＶ懸濁液の別々のアリコットへ
加えられた。懸濁液は、延長的に旋回混合され、ＣＨＳ
−ＳＵＶ二重層中へのタンパクの分配を起こした。音波
処理化ＣＨＳ−ＳＵＶ懸濁液は、１日、２日および２１
日に沈澱物の存在に関して目視的に観察された。沈澱物
は観察されず、室温下で２１日間試験されたすべての濃
度でウシ成長ホルモンはＣＨＳリポソーム中に捕捉され
たままであったことを示した。CHS-MLV is 0.01M Tris-H
Cl (pH 7.4), 0.14 M NaCl buffer solution
Prepared as described in Example 2 using 27 mg of Tris-salt CHS in 0 ml. The CHS-MLV preparation is sonicated until clear to form a sonicated CHS-MLV, and then BGH (Eli Lilly & C).
o. ], Indianapolis, Indiana) 5,1
0, 15, 25, 30, or 166 mg of any of
The sonicated CHS-MLV suspension was added to separate aliquots. The suspension is swirled and mixed with CHS
Caused partitioning of the protein into the SUV bilayer. The sonicated CHS-SUV suspension was 1 day, 2 days and 21 days
The day was visually observed for the presence of a precipitate. No precipitate was observed, indicating that at all concentrations tested at room temperature for 21 days, bovine growth hormone remained entrapped in the CHS liposomes.

【００３３】例９−２ コレステロールヘミサクシネー
ト−ＳＵＶ中に捕捉されたインスリン 亜鉛−インスリン（ポリペプチドホルモンの１つであ
る。）は、希釈酸またはアルカリに容易に溶解するが、
ｐＨ４．５〜７．０の水性相に実質的に不溶である。実
際、マクロ集塊を形成するインスリン溶液の傾向は、長
期間インスリン供給系の発達において障害であった。Ｃ
ＨＳ−ＭＬＶは、０．０１Ｍトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．
４）、０．１４ＭＮａＣｌ緩衝溶液１．０ｍｌ中のトリ
ス−塩ＣＨＳ２７ｍｇを用いて、例２に述べるようにし
て調製された。ＣＨＳ−ＭＬＶ調製物は、音波処理化Ｃ
ＨＳ−ＳＵＶを形成するために透明となるまで音波処理
され、そして亜鉛−インスリン粉末（ウシ膵臓インスリ
ン、シグマケミカルカンパニー、セントルイス、ミズー
リー州［Ｂｏｖｉｎｅ Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ Ｉｎｓ
ｕｌｉｎ，Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ，Ｓ
ｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ］）が４７ｍｇに至るまで、ＣＨ
Ｓ−ＳＵＶ懸濁液へ添加された。懸濁液は、延長的に旋
回混合され、インスリンのＣＨＳ−ＳＵＶ中への分配を
起こした。音波処理化ＣＨＳ−ＳＵＶは、１日、２日お
よび２１日に沈澱物の存在に関して目視的に観察され
た。沈澱物は観察されず、室温下で少なくとも２１日
間、５ｍｇ／ｍｌの濃度でインスリンは捕捉されたまま
であったことを示した。 Example 9-2 Cholesterol hemisacine
G-Insulin trapped in SUVs Zinc-insulin (one of the polypeptide hormones) readily dissolves in dilute acids or alkalis,
It is substantially insoluble in the aqueous phase at pH 4.5-7.0. In fact, the tendency of insulin solutions to form macro-agglomerates has been an obstacle in the development of the insulin supply system over time. C
HS-MLV is 0.01M Tris-HCl (pH7.
4), prepared as described in Example 2 using 27 mg of Tris-salt CHS in 1.0 ml of 0.14 M NaCl buffer solution. The CHS-MLV preparation was sonicated C
Sonicated until clear to form HS-SUVs and zinc-insulin powder (bovine pancreatic insulin, Sigma Chemical Company, St. Louis, Mo. [Bovine Pancreatic Ins]
ulin, Sigma Chemical Co, S
t. Louis, MO]) up to 47 mg.
Added to S-SUV suspension. The suspension was vortex mixed elongate, causing partitioning of the insulin into the CHS-SUV. Sonicated CHS-SUVs were visually observed on days 1, 2 and 21 for the presence of precipitate. No precipitate was observed, indicating that insulin remained trapped at a concentration of 5 mg / ml for at least 21 days at room temperature.

【００３４】例９−３ コレステロールヘミサクシネー
ト−ＳＵＶ中に捕捉されたタイロシン タイロシンは、水に２５℃で５ｍｇ／ｍｌ溶解してそし
て低級アルコール類、エステル類およびケトン類、塩素
化炭化水素類ならびにエーテルにもまた可溶である抗生
物質である。スモールユニラメラベシクルは以下のよう
に調製された。タイロシン−塩基（エリ リリー アン
ドカンパニー，インディアナポリス、インディアナ州）
１００ｍｇおよびトリス−塩ＣＨＳ２００ｍｇが、リン
酸緩衝化食塩水（ｐＨ７．４）４ｍｌ中にて旋回混合さ
れた。得られたＣＨＳ−ＭＬＶの乳白色懸濁液は、プロ
ーブチップ音波処理器［ｐｒｏｂｅ ｔｉｐ ｓｏｎｉ
ｃａｔｏｒ］を用いて１５分間音波処理された（予防処
置として、氷浴が、混合物の温度を低下させつづけるよ
うに試験管のまわりに配置された。）。混合物は、次に
１時間４５分の間、浴型音波処理器中へ移された。２時
間の音波処理期間の後、タイロシンを捕捉したＣＨＳ−
ＳＵＶが、１０，０００×ｇで１０分間の懸濁液の遠心
分離によって、小さなペレットと乳白光を発する上澄み
を形成することによって懸濁液から分離された。上澄み
中の音波処理化ＣＨＳ−ＳＵＶはタイロシン−塩基（エ
リ リリー アンド カンパニー，インディアナポリ
ス，インディアナ州）１００ｍｇを水の同容量に添加し
た懸濁液と目視的に比較された。タイロシン−塩基の懸
濁液においては沈澱物が形成されたが、ＣＨＳ−ＳＵＶ
タイロシン調製物においては沈澱物は形成されなかっ
た。これゆえタイロシンは少なくとも４８時間捕捉され
ていた。 Example 9-3 Cholesterol hemisuccinate
Tyrosine tylosin entrapped in G-SUV is an antibiotic that is soluble in water at 25 ° C. at 5 mg / ml and is also soluble in lower alcohols, esters and ketones, chlorinated hydrocarbons and ethers It is. Small unilamellar vesicles were prepared as follows. Tylosin-base (Eli Lilly and Company, Indianapolis, Indiana)
100 mg and 200 mg of Tris-salt CHS were swirled in 4 ml of phosphate buffered saline (pH 7.4). The obtained milky suspension of CHS-MLV was used as a probe tip sonicator [probe tip soni.
sonication for 15 minutes (as an preventive measure, an ice bath was placed around the test tube to keep the mixture cool). The mixture was then transferred into a bath sonicator for 1 hour and 45 minutes. After a 2 hour sonication period, CHS-
SUVs were separated from the suspension by centrifugation of the suspension at 10,000 xg for 10 minutes to form a small pellet and an opalescent supernatant. Sonicated CHS-SUV in the supernatant was compared visually with a suspension of 100 mg tylosin-base (Eli Lilly and Company, Indianapolis, IN) in the same volume of water. A precipitate was formed in the tylosin-base suspension, but CHS-SUV
No precipitate was formed in the tylosin preparation. Thus, tylosin had been captured for at least 48 hours.

【００３５】例１０ 脂質溶性化合物の捕捉へのコレス
テロールヘミサクシネートの使用（実施例） 脂質に対して可溶である生物学的活性物質の捕捉が、イ
ンドメタシンおよびジアゼパムに関して実証された。例
１０−１ コレステロールヘミサクシネート−ＭＬＶ中
に捕捉されたインドメタシン プロスタグランジン阻止剤の１つである、インドメタシ
ンの遊離酸は、エタノール、エーテル、アセトンおよび
ひまし油に可溶である。生物学的活性剤としてインドメ
タシンの変化する量を取込むＣＨＳ−ＭＬＶが、以下の
ようにして調製された。丸底フラスコ中に、トリス−塩
ＣＨＳ２７ｍｇ、インドメタシン１〜５ｍｇおよび¹⁴Ｃ
−インドメタシン（２２．０ｍＣｉ／ｍｍｏｌ，ニュー
イングランド ヌクレア，ボストン，マサチューセッツ
州）１０μｌが混ぜ合せられた。すべての成分を溶解す
るのに十分な量のメタノールが添加された。混合物は次
に、容器上に薄いフィルムを形成させるために回転蒸発
され、そしてすべてのメタノールの除去を保証するため
に一晩真空乾燥された。次にＣＨＳ−ＭＬＶが、それぞ
れのフラスコに０．０１Ｍトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．
３）、０．１４Ｍ ＮａＣｌ緩衝溶液１．０ｍｌを添加
することにより形成された。懸濁液は、ガラス製ビーズ
を用いて旋回混合され、そして２時間静置された。２時
間の後、ＣＨＳ−ＭＬＶ中に捕捉されたインドメタシン
の相対量が次のようにして測定された。０．０１Ｍトリ
ス−ＨＣｌ（ｐＨ７．３）、０．１４ＭＮａＣｌ緩衝溶
液９．０ｍｌがそれぞれのサンプルへ添加され、そして
混合物は、１０，０００×ｇで１０〜２０分間遠心分離
された。得られたペレットは、０．０１Ｍトリス−ＨＣ
ｌ（ｐＨ７．３）、０．１４Ｍ ＮａＣｌ緩衝溶液１０
ｍｌ中で３度洗浄され、そして最終容量１．０ｍｌの
０．０１Ｍトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．３）、０．１４Ｍ
ＮａＣｌ緩衝溶媒中へ懸濁された。「標準」は、最初
の混合物中に放射線標識化インドメタシンのみを添加す
る（すなわち、インドメタシン１〜５ｍｇは、ＣＨＳ−
ＭＬＶ標準調製から除外された。）以外はサンプルと同
様の方法で調製された。それぞれのサンプルからの濾過
された２０μｌアリコット中に含まれる放射能がシンチ
レーション流体１０ｍｌ中でカウントされた。「標準」
とインドメタシンの種々の濃度を含むサンプルとの比較
により、捕捉されたインドメタシンのパーセンテージの
決定を行なった。結果は表３に示す。Example 10 Choles for the Capture of Lipid Soluble Compounds
Use of Terol Hemisuccinate (Example) Entrapment of biologically active substances that are soluble in lipids has been demonstrated for indomethacin and diazepam. Example 10-1 Cholesterol Hemisuccinate- Indomethacin Entrapped in MLV One of the prostaglandin inhibitors, the free acid of indomethacin, is soluble in ethanol, ether, acetone and castor oil. CHS-MLV incorporating varying amounts of indomethacin as a biologically active agent was prepared as follows. In a round bottom flask, 27 mg of Tris-salt CHS, 1-5 mg of indomethacin and ¹⁴ C
-10 [mu] l of indomethacin (22.0 mCi / mmol, New England Nuclea, Boston, MA) was mixed. Sufficient methanol was added to dissolve all components. The mixture was then rotary evaporated to form a thin film on the container and vacuum dried overnight to ensure removal of all methanol. Next, CHS-MLV added 0.01 M Tris-HCl (pH 7.0) to each flask.
3), formed by adding 1.0 ml of 0.14 M NaCl buffer solution. The suspension was swirled using glass beads and allowed to stand for 2 hours. After 2 hours, the relative amount of indomethacin captured in CHS-MLV was measured as follows. 9.0 ml of 0.01 M Tris-HCl (pH 7.3), 0.14 M NaCl buffer solution was added to each sample, and the mixture was centrifuged at 10,000 xg for 10-20 minutes. The resulting pellets are 0.01M Tris-HC
1 (pH 7.3), 0.14 M NaCl buffer solution 10
Washed three times in 0.1 ml final volume of 1.0 ml 0.01 M Tris-HCl (pH 7.3), 0.14 M
Suspended in NaCl buffer solvent. "Standard" means that only radiolabeled indomethacin is added to the initial mixture (i.e., 1-5 mg of indomethacin is CHS-
Excluded from MLV standard preparation. Except for), it was prepared in the same manner as the sample. Radioactivity contained in a filtered 20 μl aliquot from each sample was counted in 10 ml of scintillation fluid. "standard"
The determination of the percentage of indomethacin captured was made by comparison with and samples containing various concentrations of indomethacin. The results are shown in Table 3.

【００３６】 表 ３ ＣＨＳ−ＭＬＶ中へのインドメタシンの捕捉 インドメタシン濃度 ＣＨＳ−ＭＬＶ中に捕捉された （ｍｇ／ｍｌ） ¹⁴Ｃ−インドメタシン（％） １ ７８ ２ ７０ ３ ３７ ４ ２８ ５ ３４ ───────────────────────────── 結果は、最高７８％までのインドメタシンがＣＨＳ−Ｍ
ＬＶ中に捕捉され得ることを示している。 Table 3 Capture of indomethacin in CHS-MLV Indomethacin concentration Captured in CHS-MLV (mg / ml) ¹⁴ C-Indomethacin (%) 178 270 373 37 428 534 ───────────────────────── Results show that up to 78% of indomethacin is CHS-M
It shows that it can be captured in LV.

【００３７】例１０−１−２ インドメタシンを含有す
るコレステロールヘミサクシネートベシクルの微細構造 捕捉されたインドメタシンが膜ベシクルを変化させるも
のであるか否かを調べるために、インドメタシンの存在
下調製されたＣＨＳ−ＭＬＶ（例１０−１−１参照のこ
と。）を前述のようにして凍結エッチング電子顕微鏡に
よって分析した。凍結エッチング電子顕微鏡において、
低拡大条件下、「空の［ｅｍｐｔｙ］」ＣＨＳ−ＭＬＶ
は、インドメタシンを含有するＣＨＳ−ＭＬＶと区別が
つかなかった。すなわち、このものが、このものあるい
は他のものに対して独特であるとして識別できる明らか
な特色がなかった。しかしながら、高拡大条件下では、
インドメタシンを含有するＣＨＳ−ＭＬＶの「二重層」
を検知できる。インドメタシンは水不溶性薬剤でありか
つエタノール、エーテル、アセトン、および他の非極性
溶媒に可溶であるので、脂質の存在下では、インドメタ
シンは水から隔離されるように配置されるであろう。電
子顕微鏡によって観察された二重層の調査は、二重層の
厚さは、交差破砕において変わることを示していた。こ
れは、インドメタシンが、実際に二重層の脂質部位に分
配され、これによって付加的な厚みと非常に不均一な配
列を与えることを示唆するものであった。すなわち、厚
さは、１つの二重層を破砕ラインに沿って追跡した際に
変化していた。この結果は、薬剤が二重層の脂質部位に
分画されるような溶解性を有する薬剤におそらく固有の
ものである。[0037] Example 10-1-2 indomethacin for microstructure captured indomethacin cholesterol hemi succinate Tobeshikuru containing examines whether or not to change the membrane vesicles, CHS prepared presence of indomethacin -MLV (see Example 10-1-1) was analyzed by freeze-etching electron microscopy as described above. In a freeze-etched electron microscope,
Under low expansion conditions, "empty" CHS-MLV
Was indistinguishable from CHS-MLV containing indomethacin. That is, there was no apparent feature that could identify this as unique to this or others. However, under high magnification conditions,
"Double layer" of CHS-MLV containing indomethacin
Can be detected. Since indomethacin is a water-insoluble drug and soluble in ethanol, ether, acetone, and other non-polar solvents, in the presence of lipids, indomethacin will be arranged to be sequestered from water. Examination of the bilayer, observed by electron microscopy, showed that the thickness of the bilayer varied in cross-fracture. This suggested that indomethacin was indeed partitioned into the lipid sites of the bilayer, thereby providing additional thickness and very heterogeneous alignment. That is, the thickness changed as one bilayer was traced along the crushing line. This result is probably inherent in drugs with solubility such that the drug is fractionated into the lipid sites of the bilayer.

【００３８】例１０−２ コレステロールヘミサクシネ
ート−ＳＵＶ中に捕捉されたジアゼパム 鎮静剤またはトランキライザーの１つであるジアゼパム
（すなわち、ヴァリアム［Ｖａｌｉｕｍ］）は、クロロ
ホルム、ベンゼン、アセトンおよびアルコールに可溶で
あるが、水にはほんのわずか溶解するにすぎない。ジア
ゼパムを取込むＣＨＳ−ＳＵＶは、次のようにして調製
された。ジアゼパム２，３，４または５ｍｇが ³Ｈ−ジ
アゼパム（７５．７Ｃｉ／ｍｍｏｌ，ニューイングラン
ドヌクレア，ボストン，マサチューセッシ州）５μｌを
含んでいる試験管へ添加された。該薬剤を溶解するのに
十分な量のメタノール（最大２ｍｌのメタノール）がそ
れぞれの試験管に加えられた。混合物は次に薄いフィル
ムになるまで回転蒸発され、そしてすべてのメタノール
の除去を保証するために一晩真空下で乾燥された。乾燥
フィルムは音波処理化ＣＨＳ−ＳＵＶ（ＣＨＳ５０，１
００、または２００ｍｇ／ｍｌを用いて以下に述べるよ
うにして調製された。）の懸濁液１ｍｌ中に再懸濁液さ
れ、ガラス製ビーズを用いて旋回混合し、そして０．２
２μｍミリポア［Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ］フィルター（ミ
リポアコーポレーション［Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒ
ｐ．］，ニューヨーク，ニューヨーク州）を用いて濾過
された。ＣＨＳ−ＳＵＶは以下の処方に基づき調製され
た。トリス−塩ＣＨＳ５０，１００または２００ｍｇが
０．０１Ｍトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．３）、０．１４Ｍ
ＮａＣｌ緩衝溶液１．０ｍｌと旋回混合された。プロー
ブ音波処理器を用いて、混合物は、５５０ｎｍの波長で
計測した約０．４０の光学密度（すなわち「透明な」溶
液）となるまで音波処理され、そして次に音波処理器の
プローブの先端からとれたかもしれないチタンを除去す
るために１，０００×ｇで遠心分離された。ＣＨＳ−Ｓ
ＵＶの懸濁液は次に試験管からデカンテーションされ
た。音波処理化ＣＨＳ−ＳＵＶによって捕捉され得たジ
アゼパムの相対量は、サンプルの「標準」調製物との比
較によって測定された。「標準」調製物は、放射線標準
化ジアゼパムのみを添加する（すなわち、ジアゼパム２
〜５ｍｇはＣＨＳ−ＳＵＶ標準調製からは除外され
た。）以外はサンプルと同様の方法において調製され
た。いずれの場合においても、濾過された懸濁液の１０
μｌアリコット中に含まれる放射能はシンチレーション
流体１０ｍｌ中でカウントされた。結果は表４に示され
る。 Example 10-2 Cholesterol hemisuccine
Diazepam, a sedative or tranquilizer of diazepam entrapped in SUVs (ie, Valium), is soluble in chloroform, benzene, acetone and alcohol, but only slightly soluble in water Just do it. CHS-SUV incorporating diazepam was prepared as follows. 2,3,4 or 5 mg of diazepam was added to a tube containing 5 μl of ³ H-diazepam (75.7 Ci / mmol, New England Nuclear, Boston, Mass.). Sufficient methanol (up to 2 ml methanol) was added to each tube to dissolve the drug. The mixture was then rotary evaporated to a thin film and dried under vacuum overnight to ensure removal of all methanol. The dried film was sonicated CHS-SUV (CHS50, 1
Prepared as described below using 00, or 200 mg / ml. ), Re-suspended in 1 ml of suspension, vortex mixed using glass beads and 0.2
2 μm Millipore [Millipore] filter (Millipore Corporation [Millipore Cor]
p. ], New York, NY). CHS-SUV was prepared based on the following formulation. Tris-salt CHS 50, 100 or 200 mg is 0.01M Tris-HCl (pH 7.3), 0.14M
It was swirled with 1.0 ml of NaCl buffer solution. Using a probe sonicator, the mixture is sonicated to an optical density of about 0.40 (ie, a “clear” solution) measured at a wavelength of 550 nm, and then from the sonicator probe tip. Centrifuged at 1,000 × g to remove any titanium that might have been removed. CHS-S
The UV suspension was then decanted from the test tube. The relative amount of diazepam that could be captured by sonicated CHS-SUV was determined by comparison to a "standard" preparation of the sample. The "standard" preparation has only radiation-normalized diazepam added (ie, diazepam 2
５5 mg was excluded from the CHS-SUV standard preparation. Except for), it was prepared in the same manner as the sample. In each case, 10% of the filtered suspension
Radioactivity contained in μl aliquots was counted in 10 ml of scintillation fluid. The results are shown in Table 4.

【００３９】 表 ４ 音波処理化ＣＨＳ−ベシクル中へのジアゼパムの捕捉 ジアゼパム濃度 捕捉された ³Ｈ−ジアゼパム（％） （ｍｇ／ｍｌ） ＣＨＳ濃度（ｍｇ／ｍｌ） ５０ １００ ２００ ２ ８６ １００ １００ ３ ７９ ９５ ８９ ４ ５８ １００ １００ ５ ５３ １００ １００ ──────────────────────────────── 結果は、ＣＨＳ１００ｍｇ／ｍｌおよび２００ｍｇ／ｍ
ｌは、用いられたジアゼパムの最高濃度である１００％
を捕捉することを示すものである。ＣＨＳ１００ｍｇ／
ｍｌおよび２００ｍｇ／ｍｌは共に十分にジアゼパムを
捕捉するので、１００ｍｇ／ｍｌがジアゼパムの捕捉に
関するＣＨＳのより理想的な濃度である。 Table 4 Capture of diazepam in sonicated CHS-vesicles Diazepam concentration Captured ³ H-diazepam (%) (mg / ml) CHS concentration (mg / ml) 50 100 200 286 100 100 100 379 95 89 458 100 100 5 53 100 100} The results were CHS 100 mg / ml and 200 mg / M
l is the highest concentration of diazepam used, 100%
Is to be captured. CHS100mg /
Since both ml and 200 mg / ml sufficiently capture diazepam, 100 mg / ml is a more ideal concentration of CHS for diazepam capture.

【００４０】例１１ 血清中のアミノグリコシド濃度を
測定するためのコレステロールヘミサクシネートリポソ
ームの使用（参考例） 比較的低濃度のＣＨＳ−ベシクル（１μｇ／ｍｌより少
なくＣＨＳ）がリン酸緩衝化食塩水（ＰＢＳ）中の懸濁
液から赤血球細胞（ＲＢＣ）を強く凝集することが観察
された。ＣＨＳ−ベシクルはＣａ⁺⁺および他のカチオ
ン、例えばアミノグリコシド抗生物質類などにより沈澱
されるので、ＣＨＳ−ベシクルは、（ａ）ＣＨＳ−ベシ
クルの固定量が沈澱される抗生物質を含む血清の希釈度
を測定し、そして（ｂ）抗生物質含有血清への添加の後
に沈澱されていない残存する遊離ベシクルの濃度を赤血
球凝集滴定により測定する、ことで血清中のアミノグリ
コシド抗生物質の濃度を測定することに用いられ得る。
いずれの場合においても、抗生物質の正確な量は抗生物
質の既知濃度から導き出された標準曲線での比較を行な
うことにより得られる。基礎実験は以下に述べられる。
すなわち、ＰＢＳ中の硫酸ゲンタマイシン（１ｍｇ／ｍ
ｌ）２４μｌが血清中に連続的に希釈された（すなわ
ち、血清の２５μｌアリコット）。次に０．０１Ｍ ト
リス−ＨＣｌ（ｐＨ７．３）、０．１４Ｍ ＮａＣｌ緩
衝溶液中で２５ｍｇ／ｍｌの濃度で、ｐＨ７．４でトリ
ス−塩ＣＨＳを音波処理することによって調製されたＣ
ＨＳ−ユニラメラベシクルの２４μｌアリコットがそれ
ぞれのサンプルに添加された。室温で１０分間経過の
後、それぞれの混合物の混濁度が記録された。５０μｇ
あるいはそれ以上のゲンタマイシンを含む混合物のみ
が、視認できる沈澱を示し、ＣＨＳベシクルがゲンタマ
イシンと相互作用したことを示した。次に沈澱した物質
は、ペレット化されそして上澄み液は、ニワトリ赤血球
細胞を用いての赤血球凝集によるＣＨＳ−ＳＵＶの濃度
を測定するために用いられた。赤血球凝集検定は、９６
Ｕ型ミクロウェルプレート［９６Ｕ−ｓｈａｐｅｄｍｉ
ｃｒｏｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ］中でＰＢＳ５０μｌにベ
シクル懸濁液を連続的に希釈し、そして次にＰＢＳ中の
０．５％ＲＢＣ４０μｌをそれぞれのウェルに加えるこ
とにより行なわれた。４℃で６０分間経過の後、赤血球
凝集は反転鏡を用いて観察された。比較対象（ＣＨＳベ
シクルの存在しないＲＢＣ）は全く赤血球凝集を示さな
かった。予備実験において濁りを起こしたものを除い
た、ＣＨＳを含むすべてのサンプルはＲＢＣを強く赤血
球凝集した。この結果は、ＣＨＳのみを含む比較対照の
懸濁液と比較して、かなり少量のベシクルが赤血球凝集
に有効であるために、ＣＨＳベシクルがゲンタマイシン
と相互作用したことを示すものであった。Example 11 Aminoglycoside concentration in serum
Cholesterol hemisuccinate liposomes for measurement
Use of a Chromosome (Reference Example) Relatively low concentration of CHS-vesicle (less than 1 μg / ml CHS) strongly agglutinates red blood cells (RBC) from suspension in phosphate buffered saline (PBS) Was observed. Since CHS-vesicles are precipitated by Ca ⁺⁺ and other cations, such as aminoglycoside antibiotics, CHS-vesicles are prepared by: (a) dilution of serum containing antibiotics in which fixed amounts of CHS-vesicles are precipitated And (b) measuring the concentration of unprecipitated free vesicles remaining after addition to the antibiotic-containing serum by hemagglutination titration, thereby determining the concentration of the aminoglycoside antibiotic in the serum. Can be used.
In each case, the exact amount of antibiotic is obtained by performing a comparison on a standard curve derived from known concentrations of antibiotic. Basic experiments are described below.
That is, gentamicin sulfate in PBS (1 mg / m
l) 24 μl were serially diluted in serum (ie a 25 μl aliquot of serum). Next, C prepared by sonicating Tris-salt CHS at pH 7.4 at a concentration of 25 mg / ml in 0.01 M Tris-HCl (pH 7.3), 0.14 M NaCl buffer solution.
A 24 μl aliquot of HS-Unilamellar vesicle was added to each sample. After 10 minutes at room temperature, the turbidity of each mixture was recorded. 50 μg
Alternatively, only mixtures containing more gentamicin showed a visible precipitate, indicating that the CHS vesicles had interacted with gentamicin. The precipitated material was then pelleted and the supernatant was used to determine the concentration of CHS-SUV by hemagglutination using chicken red blood cells. Hemagglutination assay is 96
U-type microwell plate [96U-shapedmi
The vesicle suspension was serially diluted in 50 μl of PBS in a [crowell plate] and then added to each well with 40 μl of 0.5% RBC in PBS. After 60 minutes at 4 ° C., hemagglutination was observed using a reversing mirror. The control (RBC without CHS vesicles) did not show any hemagglutination. All samples containing CHS, except those that became turbid in preliminary experiments, strongly agglutinated RBCs. This result indicated that CHS vesicles interacted with gentamicin because a much smaller amount of vesicles was effective in hemagglutination compared to a control suspension containing only CHS.

【００４１】例１２ コレステロールヘミサクシネート
リポソームの生体内投与（参考例） 以下に、本発明のコレステロールヘミサクシネートリポ
ソームを用いての生物学的活性物質の生体内投与に関す
る方法および組成物を述べるものである。捕捉された生
物学的活性物質の医学的効果が測定され、そして選択さ
れた臓器での薬剤分布が適当な所で追跡された。 例１２−１ コレステロールヘミサクシネートリポソー
ム中に捕捉されたインドメタシンを用いての関節炎の治
療 雄の白色ニュージランドウサギ（２〜２．５ｋｇ）が、
フロイント完全アジュバンド中で乳化された２０ｍｇ／
ｍｌウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（マイルズラボラト
リーズ［Ｍｉｌｅｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ］，エ
ルクハート，インディアナ州）１ｍｌを用いて２週間間
隔で２回皮内に免疫された。第３週目に、ウサギは関節
炎を起こさせるために右膝関節中へ食塩水１．０ｍｌ中
ＢＳＡ１０ｍｌの関節内注射を１回受けた。左膝関節は
比較対照として取扱われた。関節の直径は、０．０１ｍ
ｍ精度のフォウラー［ｆｏｗｌｅｒ］ダイアル式カリパ
スを用いて計測された。ＢＳＡを注入された関節は膨脹
し、そして通常、比較対照関節よりも３〜４ｍｍ大きか
った。第４週目において、ウサギは、関節炎を起こさせ
るために、食塩水中のＢＳＡの別の関節内注射を受け
た。ＣＨＳ２７０．０ｍｇおよびインドメタシン１０ｍ
ｇを用いて例１０−１において述べられたようにして、
ＣＨＳ−ＭＬＶが調製され、インドメタシンの最終濃度
１．０ｍｇ／ｍｌを得た。炎症誘導の３日間後、ＢＳＡ
を注入された動物はＣＨＳ−ベシクル中に捕捉されたイ
ンドメタシン１ｍｇ／ｍｌの関節内注射を１回受けた
（全投与量１ｍｇ／動物）。関節膨脹はその後１０日間
計測された。図５にグラフ的に図示された結果は、ＣＨ
Ｓ−ＭＬＶ中に捕捉されたインドメタシンは関節内投与
された際に関節膨脹を減少させることに有効であること
を示す。 例１２−２ コレステロールヘミサクシネートＳＵＶ中
に捕捉されたジアゼパムの生体内投与 マウスに、例１０−２において述べたようにして調製さ
れたＣＨＳ−ＳＵＶ中に捕捉されたジアゼパムの５００
μｇ／ｋｇ（体重）を静脈内にあるいは筋内に接種し
た。該ジアゼパムは、捕捉された薬剤の活性の保持を示
すものであるマウスにおける鎮静効果（マウスは接種後
に睡眠におちいる。）を有していた。例１２−２−１ 静脈内接種後の臓器分布 捕捉されたジアゼパムを含有するＣＨＳ−ＳＵＶは、例
１０−２において述べられるようにして調製された。浴
型音波処理器における音波処理の後、５５０ｎｍの波長
で計測された懸濁液の吸光度は０．３７０であった。次
にＣＨＳ−ＳＵＶ懸濁液の４４．２μｌアリコットが、
¹⁴Ｃ−ジアゼパム（比活性は、エタノール中の１００μ
Ｃｉ／ｍｌとして供給された１８１μＣｉ／ｍｇに等し
い。）の４０μＣｉが窒素条件下乾燥されたものである
ガラス製試験管中へ添加された。５分間の旋回混合の
後、０．０１Ｍトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．３）、０．１
４ＭＮａＣｌ緩衝溶液１．２８２ｍｌが該溶液中へ添加
され、ジアゼパム０．１６７ｍｇ／μｌのマウスに対す
る治療学的投与量を生じる、懸濁液の３０倍希釈物を得
た。ＣＨＳ−ＳＵＶ−¹⁴Ｃ−ジアゼパム懸濁液の０．１
ｍｌアリコットが意識のある拘束された３５ｍｇスイス
ウェブスター［Ｓｗｉｓｓ−Ｗｅｂｓｔｅｒ］マウスの
尾静脈中へ注射された。比較対照マウスには、捕捉され
ていない¹⁴Ｃ−ジアゼパムの等量を同様に接種した。注
入後１，２または５時間目に、マウスは脊髄脱臼により
殺し、そして内臓（腎臓、肺、脾臓、肝臓、腸、脳、心
臓、脾臓および脂肪）および血液サンプルを取り出し
た。臓器は計量されそしてそれぞれの小さなサンプル
（２０〜４０μｇ）がマイムとコーベルグ［Ｍａｈｉｍ
ａｎｄＫｏｈｂｅｒｇ］の方法（１９６６年，アナリ
ティカル バイオケミストリー１６：５００［１９６
６，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ，１６：５
００］）によって消化されそして脱色された。サンプル
は次に、化学ルミネッセンスを放射能計測前に静めるた
めに、５日間暗順応させた。 Example 12 Cholesterol hemisuccinate
In Vivo Administration of Liposomes (Reference Example) The following describes a method and composition relating to in vivo administration of a biologically active substance using the cholesterol hemisuccinate liposome of the present invention. The medical effect of the captured biologically active agent was measured and drug distribution in selected organs was followed where appropriate. Example 12-1 Treatment of Arthritis Using Indomethacin Entrapped in Cholesterol Hemisuccinate Liposomes
Care male white New Zealand rabbits (2~2.5kg) is,
20 mg / emulsified in Freund's complete adjuvant
Immunizations were performed twice intradermally at two week intervals with 1 ml of bovine serum albumin (BSA) (Miles Laboratories, Elkhart, IN). At the third week, rabbits received a single intra-articular injection of 10 ml BSA in 1.0 ml saline into the right knee joint to cause arthritis. The left knee joint was treated as a control. Joint diameter is 0.01m
It was measured using a m-precision Fowler dial caliper. Joints injected with BSA were swollen and were usually 3-4 mm larger than control joints. At week 4, the rabbits received another intra-articular injection of BSA in saline to cause arthritis. CHS 270.0mg and indomethacin 10m
g and as described in Example 10-1
CHS-MLV was prepared to give a final concentration of indomethacin of 1.0 mg / ml. Three days after inflammation induction, BSA
Received a single intra-articular injection of 1 mg / ml indomethacin entrapped in CHS-vesicles (total dose 1 mg / animal). Joint swelling was measured for the next 10 days. The results graphically illustrated in FIG.
Indomethacin entrapped in S-MLV is shown to be effective in reducing joint swelling when administered intra-articularly. Example 12-2 In vivo administration of diazepam entrapped in cholesterol hemisuccinate SUV 500 to diazepam entrapped in CHS-SUV prepared as described in Example 10-2
μg / kg (body weight) was inoculated intravenously or intramuscularly. The diazepam had a sedative effect in mice (mice fell asleep after inoculation), indicating retention of activity of the entrapped drug. Example 12-2-1 Organ Distribution After Intravenous Inoculation CHS-SUV containing captured diazepam was prepared as described in Example 10-2. After sonication in the bath sonicator, the absorbance of the suspension measured at a wavelength of 550 nm was 0.370. Next, a 44.2 μl aliquot of the CHS-SUV suspension was
¹⁴ C-diazepam (specific activity is 100 μl in ethanol
Equivalent to 181 μCi / mg supplied as Ci / ml. ) Was added into glass test tubes that had been dried under nitrogen. After vortexing for 5 minutes, 0.01M Tris-HCl (pH 7.3), 0.1M
1.282 ml of 4M NaCl buffer solution was added into the solution to give a 30-fold dilution of the suspension, resulting in a therapeutic dose for mice of 0.167 mg / μl diazepam. 0.1 of CHS-SUV- ¹⁴ C-diazepam suspension
A ml aliquot was injected into the tail vein of a conscious, restrained 35 mg Swiss-Webster mouse. Control mice were similarly inoculated with an equal amount of uncaptured ¹⁴ C-diazepam. One, two or five hours after injection, mice were sacrificed by spinal dislocation and visceral (kidney, lung, spleen, liver, intestine, brain, heart, spleen and fat) and blood samples were removed. The organs were weighed and each small sample (20-40 μg) was analyzed by Mime and Koberg [Mahim
and Kohberg] (1966, Analytical Biochemistry 16 : 500 [196]
6, Analytical Biochem, 16 : 5.
00]) and decolorized. The samples were then dark adapted for 5 days to allow the chemiluminescence to calm down before radioactivity measurement.

【００４２】この実験の結果は図６に示される。ＣＨＳ
−ＳＵＶに捕捉されたジアゼパムを接種されたマウスに
おいては、薬剤は、脾臓中には蓄積しておらず、ＣＨＳ
−ＳＵＶ中に捕捉されたジアゼパムは、リン脂質リポソ
ームに捕捉された薬剤が静脈内的に生体内投与された際
と同様の挙動をしないことを示している。FIG. 6 shows the results of this experiment. CHS
-In mice inoculated with diazepam captured by SUV, the drug did not accumulate in the spleen and CHS
-Diazepam entrapped in SUVs has shown that the drug entrapped in phospholipid liposomes does not behave as when intravenously administered in vivo.

【００４３】例１２−３ コレステロールヘミサクシネ
ート−ＭＬＶ中に捕捉されたクロムの生体内投与 ＣＨＳベシクルが生体内投与された際にそのまま残存す
るか否かを測定するために、遊離水性標識の臓器分布
が、ＣＨＳベシクル中に捕捉された水性標識の臓器分布
と比較して、マウスへの静脈内注射の後に測定された。
このために、捕捉されていない⁵¹クロム（⁵¹Ｃｒ）、Ｃ
ＨＳ−ＭＬＶ中に捕捉された⁵¹Ｃｒおよびリン脂質ベシ
クル中に捕捉されたＣｒ⁵¹の臓器分布の比較を行なっ
た。これらの処方は次の通りである。（ａ）捕捉されていない⁵¹Ｃｒ ⁵¹Ｃｒは０．９％殺菌
食塩水中の⁵¹ＣｒＯ₂ ⁼（ニューイングランドヌクレア，
ニュートン，マサチューセッツ州）として供給される。
これらの遊離の⁵¹Ｃｒ注射剤は、０．９％食塩水中の⁵¹
Ｃｒ １００μｌを０．０１Ｍトリス−ＨＣｌ、ｐＨ
７．３、０．１４ＮａＣｌ、５％デキストロースを用い
て最終容量１．５ｍｌへ希釈することで調製された。雄
の４０ｇスイスウェブスターマウス１６匹にそれぞれ尾
静脈を介して０．１ｍｌ（約７００，０００ｃｐｍ）の
静脈内注射を行なった。（ｂ）ＣＨＳ−ＭＬＶ中の⁵¹Ｃｒ は、極微量の⁵¹Ｃｒ
（殺菌０．９％食塩水中の⁵¹ＣｒＯ₂ ⁼ ）を含有する
０．０１ＭトリスＨＣｌ、ｐＨ７．３、０．１４Ｍ Ｎ
ａＣｌ、５％デキストロース中に、乾燥トリス−塩ＣＨ
Ｓ粉末を溶解することによって調製された。混合物は旋
回混合され、そしてすぐ後に３０分間音波処理された。
前記したように遠心分離によるペレット化および３度洗
浄した後に、最終的ペレットはＣＨＳ１０ｍｇ／ｍｌの
最終濃度に再懸濁され、そしてニコンプ準弾性光散乱分
析［Ｎｉｃｏｍｐ ｑｕｅｓｉｅｌａｓｔｉｃ ｌｉｇ
ｈｔ ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ ａｎａｌｙｓｉｓ］によ
って直径１ミクロンにおいて計測された。雄の４０ｇス
イスウェブスターマウス１２匹にそれぞれ尾静脈を介し
て０．１ｍｌ（約１２０，０００ｃｐｍ）の静脈内注射
を行なった。 （ｃ）ＥＰＣ−ＳＰＬＶ中の⁵¹Ｃｒは、参考のため本明
細書で引用している、「安定なプルリラメラベシクル、
その調製および使用」と題されたレンクら［Ｌｅｎｋ
ｅｔ ａｌ．］によって１９８３年３月２４日に出願さ
れた同時係属米国出願番号第４７６，４９６号中に詳述
に述べられる一般的方法によって調製された。卵ホスフ
ァチジルコリン（ＥＰＣ）６５ｍｇをクロロホルム中に
溶解しそしてフィルムを形成するようにＥＰＣを乾燥さ
せることによって、バッチ５ｍｌを調製し、フィルム
を、エーテル１０ｍｌ中に再懸濁し、そして、⁵¹ＣｒＯ
₂ ⁼の０．９％食塩水（ｐＨ８）溶液０．３ｍｌを加え
た。混合物は、次いで音波処理により乳化し、一方同時
にＮ₂ガス条件下でエーテルを蒸発した。得られた安定
なプルリラメラベシクル（ＳＰＬＶ）は０．０１Ｍトリ
ス−ＨＣｌ、ｐＨ７．３、０．１４Ｍ ＮａＣｌ、５％
デキストロース溶液５ｍｌ中に再懸濁した。そして遠心
分離によりペレット化し、このペレットは捕捉されてい
ない⁵¹Ｃｒを除去するために３度洗浄され、そして最終
的ペレットは０．０１Ｍトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．３、
０．１４Ｍ ＮａＣｌ、５％デキストロース溶液５ｍｌ
中に再懸濁した。ＥＰＣの最終濃度は１３ｍｇ／ｍｌで
あった。雄の４０ｇスイスウエブスターマウス１２匹
に、それぞれ尾静脈を介して０．１ｍｌ（約１００，０
００ｃｐｍ）の静脈内注射を行なった。１，２，５およ
び２４時間後に、リポソーム調製物で処理されたそれぞ
れのグループから３匹のマウスおよび捕捉されていない
⁵¹Ｃｒで処理されたグループから４匹のマウスを脊髄脱
臼により殺した。その臓器を取り出し、０．９％食塩水
で洗い、それぞれの臓器中に残存する投与量のパーセン
テージおよび投与量／グラムのパーセンテージの測定を
前記のようにして行なった。図７に示す結果は、捕捉さ
れていないクロム（図７Ｃ参照）は迅速に***され、試
験されたいずれの臓器中にも集中していないことを実証
している。ＥＰＣおよびＣＨＳに捕捉されたクロムは、
注射の２４時間後に計測し得る値をとどめており、ＣＨ
Ｓベシクルが、ＥＰＣ−ＳＰＬＶと同様に、生体内にそ
のままとどまることを示していた。さらに、０．５〜
１．０ミクロン間の平均直径を有するＥＰＣ−ＳＰＬＶ
（１３ｍｇ／ｍｌ）は、肝臓、肺および脾臓中に蓄積さ
れ（図７Ｂ参照）、すなわちリポソーム分布の代表的パ
ターンを示す。等モルのＣＨＳベシクルは主に肝臓中に
蓄積され、そして肺および脾臓における蓄積はそれより
少なかった（図７Ａ参照）。２種のリポソーム調製物の
生体内の分布パターンの違いを示している。Example 12-3 In Vivo Administration of Chromium Entrapped in Cholesterol Hemisuccinate-MLV To determine whether CHS vesicles remain intact when administered in vivo, a free aqueous labeled organ was used. Distribution was measured after intravenous injection into mice as compared to the organ distribution of aqueous label captured in CHS vesicles.
Because of this, ⁵¹ chromium ( ⁵¹ Cr), C
A comparison was made of the organ distribution of ⁵¹ Cr captured in HS-MLV and Cr ⁵¹ captured in phospholipid vesicles. These formulations are as follows: (A) ⁵¹ Cr ⁵¹ Cr not captured is ⁵¹ CrO _{2 in} 0.9% sterile saline ⁼ (New England Nuclear,
Newton, Mass.).
These free ⁵¹ Cr injections were prepared from ⁵¹ % in 0.9% saline.
100 μl of Cr and 0.01 M Tris-HCl
It was prepared by diluting to a final volume of 1.5 ml with 7.3, 0.14 NaCl, 5% dextrose. Sixteen male 40 g Swiss Webster mice were each injected with 0.1 ml (about 700,000 cpm) intravenously via the tail vein. (B) ⁵¹ Cr in CHS-MLV is a trace amount of ⁵¹ Cr
0.01 M Tris HCl, pH 7.3, 0.14 M N containing ( ⁵¹ CrO ₂ ^{= in} sterile 0.9% saline)
aCl, dry tris-salt CH in 5% dextrose
Prepared by dissolving S powder. The mixture was vortex mixed and immediately sonicated for 30 minutes.
After pelleting by centrifugation and washing three times as described above, the final pellet is resuspended to a final concentration of 10 mg / ml CHS and Nicomp quasi-elastic light scattering analysis [Nicomp quesielastic lig].
ht scattering analysis] at 1 micron in diameter. Twelve male 40 g Swiss Webster mice were each injected with 0.1 ml (about 120,000 cpm) intravenously via the tail vein. (C) ⁵¹ Cr in EPC-SPLV is referred to as “stable plurilamella vesicle, cited herein for reference.
Entitled “Preparation and Use”
et al. No. 476,496, filed Mar. 24, 1983, by the general method described in detail. A 5 ml batch is prepared by dissolving 65 mg of egg phosphatidylcholine (EPC) in chloroform and drying the EPC to form a film, resuspending the film in 10 ml of ether and adding ⁵¹ CrO
0.3 ml of ₂ ⁼ 0.9% saline (pH 8) solution was added. The mixture is then emulsified by sonication, whereas were simultaneously evaporated ether with N ₂ gas conditions. The resulting stable Plurium lamellar vesicle (SPLV) is 0.01 M Tris-HCl, pH 7.3, 0.14 M NaCl, 5%
Resuspended in 5 ml dextrose solution. It is then pelleted by centrifugation, the pellet is washed three times to remove unencapsulated ⁵¹ Cr, and the final pellet is 0.01 M Tris-HCl, pH 7.3,
5 ml of 0.14 M NaCl, 5% dextrose solution
Resuspended in. The final concentration of EPC was 13 mg / ml. Twelve male 40 g Swiss Webster mice were each injected via the tail vein with 0.1 ml (approx.
00 cpm). After 1, 2, 5 and 24 hours, 3 mice from each group treated with the liposome preparation and uncaptured
Four mice from the group treated with ⁵¹ Cr were killed by spinal dislocation. The organs were removed, washed with 0.9% saline, and the percentage of dose remaining in each organ and the percentage of dose / gram were determined as described above. The results shown in FIG. 7 demonstrate that unentrapped chromium (see FIG. 7C) was excreted rapidly and was not concentrated in any of the organs tested. Chromium trapped in EPC and CHS
The value that can be measured 24 hours after the injection remains CH
S vesicles, like EPC-SPLV, remained in vivo. In addition, 0.5-
EPC-SPLV with average diameter between 1.0 micron
(13 mg / ml) accumulates in the liver, lung and spleen (see FIG. 7B), indicating a representative pattern of liposome distribution. Equimolar CHS vesicles accumulated primarily in the liver, and less in the lungs and spleen (see FIG. 7A). The difference of the distribution pattern in vivo of two types of liposome preparations is shown.

【００４４】例１２−４ コレステロールヘミサクシネ
ートＭＬＶ中に捕捉されたヒト成長ホルモンの生体内投
与 ¹²⁵ Ｉ−ヒト成長ホルモン（ＨＧＨニューイングラン
ド、ヌクレア、ボストン，マサチューセッツ州）を取込
んだＣＨＳ−マルチラメラベシクルは以下のようにして
調製された。トリス−塩ＣＨＳが、 ¹²⁵Ｉ−ＨＧＨ（ニ
ューイングランドヌクレア、ボストン、マサチューセッ
ツ州）１μＣｉ／ｍｌを含有する０．０１Ｍトリス−Ｈ
Ｃｌ、０．１４Ｍ ＮａＣｌ緩衝溶液（ｐＨ７．４）中
へ、トリス−塩ＣＨＳ最終濃度２５ｍｇ／ｍｌとなるよ
うに添加された。この懸濁液をガラス製ビーズを用いて
旋回混合し、得られたＣＨＳ−ＭＬＶは、最初の放射能
カウント数と比較することにより測定して¹²⁵Ｉ−ＨＧ
Ｈの１０％を捕捉していた。雌のスイスウェブスターマ
ウス１２匹のグループに、ＣＨＳ−ＭＬＶに捕捉された
¹²⁵Ｉ−ＨＧＨの懸濁液０．５ｍｌを後肢に筋内的に注
射した。マウス１２匹の比較対象グループには、０．０
１Ｍトリス−ＨＣｌ、０．１４Ｍ ＮａＣｌ緩衝溶液中
の遊離¹²⁵Ｉ−ＨＧＨ ０．５ｍｌを注射した。双方の
グループのそれぞれの動物は、１匹当り約３５，０００
ｃｐｍのＨＧＨを投与されたことになる。注射後、週期
的間隔でマウスを殺し、後肢が解剖され、そして残存す
る全放射能のパーセンテージが測定された。表５のデー
タは、ＣＨＳ−ＭＬＶ中へ取込まれているものの場合、
¹²⁵Ｉ−ＨＧＨの保持が実質的に増加することを実証し
ている。したがって、筋内的に注射される場合、ＣＨＳ
−リポソームに捕捉された薬剤は、持続的に放出される
ものである。 Example 12-4 Cholesterol hemisuccine
Vivo injection of human growth hormone captured in autologous MLV
Given ¹²⁵ I- human growth hormone (HGH New England, Nuclear, Boston, MA) the taken the CHS- multilamellar vesicles were prepared in the following manner. Tris-salt CHS contains 0.01 M Tris-H containing 1 μCi / ml of ¹²⁵ I-HGH (New England Nuclear, Boston, Mass.)
Cl, 0.14 M NaCl buffer solution (pH 7.4) was added to a final concentration of Tris-salt CHS of 25 mg / ml. The suspension was swirled and mixed using glass beads and the resulting CHS-MLV was measured by comparing with the initial radioactive counts to ¹²⁵ I-HG.
10% of H was captured. Groups of 12 female Swiss Webster mice were captured by CHS-MLV
0.5 ml of a suspension of ¹²⁵ I-HGH was injected intramuscularly in the hind limbs. The control group of 12 mice had 0.0
0.5 ml of free ¹²⁵ I-HGH in 1 M Tris-HCl, 0.14 M NaCl buffer solution was injected. Each animal in both groups had approximately 35,000 animals per animal.
This means that HGH at cpm was administered. After injection, mice were sacrificed at weekly intervals, hind limbs were dissected, and the percentage of total radioactivity remaining was determined. The data in Table 5 is for CHS-MLV
It demonstrates that retention of ¹²⁵ I-HGH is substantially increased. Therefore, when injected intramuscularly, CHS
-The drug entrapped in the liposome is one that is sustainedly released.

【００４５】 表 ５ 投与されたＭＬＶに捕捉された¹²⁵Ｉ−ヒト成長ホルモンの持続 接 種 物 肢中に残存する放射能（％） （数：１２匹） 時間（時間） ３ ２４ ７２ １６８ 比較対照^{a 125}I −ＨＧＨ ５ 0.７ 0.２ 0.３ ＣＨＳ−ベシクル中の ¹²⁵Ｉ−ＨＧＨ^b ５６ ３７ ２９ ２２ ─────────────────── ａ．動物は、０．０１Ｍトリス−ＨＣｌ、０．１４Ｍ
ＮａＣｌ中の¹²⁵Ｉ−ヒト成長ホルモン０．５ｍｌを投
与された。 ｂ．動物は、０．０１Ｍトリス−ＨＣｌ、０．１４Ｍ
ＮａＣｌ中のＣＨＳ−ベシクル（２５ｍｇ／ｍｌ ＣＨ
Ｓ）中の¹²⁵Ｉ−ヒト成長ホルモン０．５ｍｌを投与さ
れた。 Table 5 Continuous inoculation of ¹²⁵ I-human growth hormone captured by the administered MLV Radioactivity (%) remaining in the limb (number: 12) Time (hour) 3 24 72 168 ^{a 125} I-HGH 5 0.7 0.2 0.3 ¹²⁵ I-HGH in CHS-vesicle ^b 5637 2922 {a. Animals were 0.01 M Tris-HCl, 0.14 M
0.5 ml of ¹²⁵ I-human growth hormone in NaCl was administered. b. Animals were 0.01 M Tris-HCl, 0.14 M
CHS-Vesicle in NaCl (25 mg / ml CH
0.5 ml of ¹²⁵ I-human growth hormone in S) was administered.

【００４６】[0046]

【発明の効果】水不溶性化合物をステロールベシクル中
へ効率よく捕捉することができ、水不溶性活性物質の高
い服用量での投与を容易にすることができる。As described above, the water-insoluble compound can be efficiently trapped in the sterol vesicle, and the administration of the water-insoluble active substance at a high dose can be facilitated.

【図面の簡単な説明】[Brief description of the drawings]

【図１】捕捉された溶質（クロム）とマルチラメラリポ
ソームを調製するのに用いられたコレステロールヘミサ
クシネートの濃度との逆比例関係をグラフで示したもの
である。FIG. 1 is a graphical representation of the inverse relationship between trapped solute (chromium) and the concentration of cholesterol hemisuccinate used to prepare multilamellar liposomes.

【図２】４つの異なるＣＨＳ−ＭＬＶ（コレステロール
ヘミサクシネート−マルチラメラベシクル）調製物に関
して得られたＸ線回折パターンを表わすものである。FIG. 2 represents the X-ray diffraction patterns obtained for four different CHS-MLV (cholesterol hemisuccinate-multilamellar vesicle) preparations.

【図３】ＣＨＳ−マルチラメラベシクルおよびＥＰＣ−
マルチラメラベシクル（卵ホスファチジルコリン−マル
チラメラベシクル）に関する電子スピン共鳴データを表
わすものである。FIG. 3: CHS-multilamellar vesicles and EPC-
FIG. 4 represents electron spin resonance data for a multilamellar vesicle (egg phosphatidylcholine-multilamellar vesicle).

【図４】種々の緊張力の水性緩衝溶液中でのコレステロ
ールヘミサクシネートリポソームおよび卵ホスファジル
コリンリポソームの膨潤特性を示すものである。FIG. 4 shows the swelling properties of cholesterol hemisuccinate liposomes and egg phosphadylcholine liposomes in aqueous buffer solutions of various tensions.

【図５】筋内的に投与された際の、コレステロールヘミ
サクシネートリポソーム中に捕捉されたインドメタシン
の関節膨脹を減少させる効果をグラフで示すものであ
る。FIG. 5 graphically illustrates the effect of indomethacin entrapped in cholesterol hemisuccinate liposomes to reduce joint swelling when administered intramuscularly.

【図６】マウスに静脈内的にＣＨＳ−ＳＵＶに内包され
ないで（遊離）あるいは内包されて投与された¹⁴Ｃ−ジ
アゼパムの臓器分布を示すものである。FIG. 6 shows the organ distribution of ¹⁴ C-diazepam administered intravenously to mice without being (free) or encapsulated in CHS-SUV.

【図７Ａ】マウスに静脈内的に投与された⁵¹Ｃｒの臓器
分布を示す図であり、その投与形態がＣＨＳ−ＭＬＶに
内包されたものである。FIG. 7A is a view showing the organ distribution of ⁵¹ Cr administered intravenously to mice, in which the administration form is encapsulated in CHS-MLV.

【図７Ｂ】マウスに静脈内的に投与された⁵¹Ｃｒの臓器
分布を示す図であり、その投与形態がＥＰＣ−ＳＰＬＶ
に内包されたものである。FIG. 7B is a view showing the organ distribution of ⁵¹ Cr administered intravenously to mice, in which the administration form is EPC-SPLV.
It is included in.

【図７Ｃ】マウスに静脈内的に投与された⁵¹Ｃｒの臓器
分布を示す図であり、その投与形態がＥＰＣ−ＳＰＬＶ
に内包されないで投与されたものである。FIG. 7C is a diagram showing the organ distribution of ⁵¹ Cr administered intravenously to mice, in which the administration form is EPC-SPLV.
It was administered without being included in

フロントページの続き (72)発明者 ポペスク、マーシー シー アメリカ合衆国 ニュージャージー州 08536 プレインスボーロ パークウェ イ アベニュー ５ (72)発明者 ウェイナー、アラン エル アメリカ合衆国 ニュージャージー州 08536 プレインスボーロ フォックス ラン ドライブ 39−06 (72)発明者 ボルクサク、ルイズ イー アメリカ合衆国 ニュージャージー州 08648 ローレンスヴィール タワープ レース 11 (72)発明者 トゥレムブレイ、ポール エイ アメリカ合衆国 ニュージャージー州 08619 ハミルトン ノッチングガム ウェイ 2633Continuation of front page    (72) Inventor Popesque, Mercy Sea               United States New Jersey               08536 Plainsboro Parkwe               I Avenue 5 (72) Inventors Weiner, Alan El               United States New Jersey               08536 Plainsborough Fox                 Run Drive 39-06 (72) Inventor Volksaku, Louise Y               United States New Jersey               08648 Lawrenceville Tower               Race 11 (72) Inventor Tulem Bray, Paul A               United States New Jersey               08619 Hamilton Notching Gum               Way 2633

Claims (1)

(57)【特許請求の範囲】 １．（ａ）有機溶媒中に水不溶性化合物を溶解し、
（ｂ）該有機溶媒を除去して水不溶性化合物で構成され
るフィルムを残し、（ｃ）閉鎖されたベシクルを形成し
得るステロールの有機酸誘導体の塩形態を完全に閉鎖さ
れたベシクルを形成するのに十分な量で水性相に添加
し、混合物を振盪することによって得られるマルチラメ
ラベシクルのステロールリポソームの乳白色の懸濁液も
しくは該乳白色の懸濁液を、さらに音波処理して得られ
るユニラメラベシクルの懸濁液を上記フィルムへ添加す
る、ことからなるステロールベシクル中への水不溶性化
合物の捕捉方法。 ２．（ａ）水不溶性化合物および水性相中で二重層を形
成し得るステロールの有機酸誘導体の塩形態を、有機溶
媒中に共溶解させ、（ｂ）該有機溶媒を蒸発させて、上
記化合物およびステロールの有機酸誘導体の塩形態を含
有するフィルムを残し、（ｃ）水性相を該フィルムに添
加し、そして完全に閉鎖されたマルチラメラベシクルの
乳白色の懸濁液が形成するように振盪する、ことからな
るステロールベシクル中への水不溶性化合物の捕捉方
法。 ３．ユニラメラベシクルを形成するために、乳白色の懸
濁液をさらに音波処理することを有するものである請求
項２記載の方法。(57) [Claims] (A) dissolving a water-insoluble compound in an organic solvent,
(B) removing the organic solvent to leave a film composed of the water-insoluble compound, and (c) forming a completely closed vesicle with a salt form of an organic acid derivative of sterol that can form a closed vesicle. The milky white suspension of the sterol liposomes of the multilamellar vesicles obtained by shaking the mixture or the unilamellae obtained by further sonicating the mixture obtained by shaking the mixture A method of capturing a water-insoluble compound in a sterol vesicle, comprising adding a vesicle suspension to the film. 2. (A) a water-insoluble compound and a salt form of an organic acid derivative of a sterol capable of forming a double layer in an aqueous phase are co-dissolved in an organic solvent; and (b) the organic solvent is evaporated to obtain the compound and the sterol. (C) adding the aqueous phase to the film and shaking to form a milky suspension of a fully closed multilamellar vesicle, leaving a film containing the salt form of the organic acid derivative of A method for capturing a water-insoluble compound in a sterol vesicle comprising: 3. 3. The method of claim 2, further comprising sonicating the milky suspension to form a unilamellar vesicle.