RU2157850C1 - Method of determination of anticholine esterase compounds in water and aqueous extracts - Google Patents
Method of determination of anticholine esterase compounds in water and aqueous extracts Download PDFInfo
- Publication number
- RU2157850C1 RU2157850C1 RU99110551A RU99110551A RU2157850C1 RU 2157850 C1 RU2157850 C1 RU 2157850C1 RU 99110551 A RU99110551 A RU 99110551A RU 99110551 A RU99110551 A RU 99110551A RU 2157850 C1 RU2157850 C1 RU 2157850C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- enzymatic hydrolysis
- substrate
- cholinesterase
- analyzed
- sample
- Prior art date
Links
Images
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
Настоящее изобретение относится к области контроля загрязнений окружающей среды. The present invention relates to the field of environmental pollution control.
Многие токсичные соединения являются ингибиторами холинэстеразы (ХЭ), что успешно используется для разработки ферментативных методов их анализа. Many toxic compounds are cholinesterase (CE) inhibitors, which has been successfully used to develop enzymatic methods for their analysis.
Ферментативные способы анализа соединений антихолинэстеразного действия, к числу которых относятся высокотоксичные фосфорорганические инсектициды, отравляющие вещества и карбаматы, основаны на измерении исходной активности холинэстеразы (ХЭ) в контрольном опыте и после взаимодействия с анализируемой пробой с последующим определением степени ингибирования фермента. Enzymatic methods for the analysis of anticholinesterase compounds, which include highly toxic organophosphorus insecticides, poisonous substances and carbamates, are based on measuring the initial activity of cholinesterase (CE) in a control experiment and after interaction with the analyzed sample, followed by determining the degree of enzyme inhibition.
К настоящему времени разработан целый ряд способов определения активности ХЭ, которые отличаются друг от друга используемым субстратом и методом регистрации аналитического эффекта [1-5]. To date, a number of methods have been developed for determining the activity of CEs, which differ from each other by the substrate used and the method of recording the analytical effect [1-5].
Известен визуальный способ анализа соединений антихолинэстеразного действия, основанный на регистрации времени, необходимого для выравнивания окраски анализируемой пробы воды (водного экстракта), в которую внесены холинэстераза сыворотки крови лошади (ЛХЭ), субстрат бутирилхолин йодистый и pH индикатор, с окраской эталона [6, 7]. Этот способ является аналогом предлагаемого. A known visual method for the analysis of anticholinesterase compounds is based on recording the time required to even out the color of the analyzed water sample (water extract), in which horse serum cholinesterase (LCE), a butyrylcholine iodide substrate and a pH indicator, with a standard color have been added [6, 7 ]. This method is an analogue of the proposed.
Способ-аналог имеет ряд недостатков: необходимость тщательной нейтрализации анализируемой пробы воды (водного экстракта), проведение ингибирования ЛХЭ и ферментативного гидролиза субстрата вне диапазона оптимальных условий проявления активности фермента. Погрешность результатов анализа водных экстрактов может возрастать в случае содержания в них соединений, влияющих на буферную емкость реакционного раствора, в котором проводится анализ. Визуальная регистрация аналитического эффекта также может приводить к увеличению погрешности. Особенно затрудняется интерпретация результата анализа при искусственном освещении. Указанные выше недостатки увеличивают погрешность результатов анализа. The analogue method has several disadvantages: the need for careful neutralization of the analyzed water sample (water extract), inhibition of LCE and enzymatic hydrolysis of the substrate outside the range of optimal conditions for the manifestation of enzyme activity. The error in the results of the analysis of aqueous extracts can increase if they contain compounds that affect the buffer capacity of the reaction solution in which the analysis is carried out. Visual recording of the analytical effect can also lead to an increase in the error. The interpretation of the analysis result under artificial lighting is especially difficult. The above disadvantages increase the error of the analysis results.
Часть этих недостатков снимается при использовании фотоколориметрического способа анализа соединений антихолинэстеразного действия, предусматривающего проведение анализа в среде буфера с использованием ферментов из различных биологических источников: пропионилхолинэстеразы из мозговой ткани (ПХЭ), ацетилхолинэстеразы из эритроцитов крови человека (АХЭ) и холинэстеразы сыворотки крови лошади (ЛХЭ) [8]. Some of these drawbacks are removed by using the photocolorimetric method for the analysis of anticholinesterase compounds, which involves analysis in a buffer medium using enzymes from various biological sources: propionylcholinesterase from brain tissue (PCE), acetylcholinesterase from human blood erythrocytes (AChE) and horse blood serum cholinesterase ) [eight].
Этот способ включает экспозицию анализируемой пробы воды (водного экстракта) с соответствующей холинэстеразой и 5,5''-дитиобис-(2-нитробензойной кислотой) в среде фосфатного буфера (pH 7,5) с последующим добавлением субстрата ацетилтиохолина йодистого, при ферментативном гидролизе которого выделяется тиохолин. Тиохолин взаимодействует с 5,5''-дитио-бис-(2-нитробензойной кислотой) с образованием окрашенного в желтый цвет аниона 2-нитро-5-меркаптобензойной кислоты (максимум светопоглощения при 412 нм)
-S(CH2)2 N(CH3)3N+J-+ RS-SR--->RS-S(CH2)2N(CH3)3N+ J-+RS-
Регистрация аналитического эффекта проводится на фотоэлектроколориметре (спектрофотометре) при длине волны 412 нм.This method includes exposure of the analyzed water sample (water extract) with the corresponding cholinesterase and 5.5 '' dithiobis- (2-nitrobenzoic acid) in phosphate buffer medium (pH 7.5), followed by the addition of the substrate acetylthiocholine iodide, during enzymatic hydrolysis of which thiocholine is released. Thiocholine interacts with 5.5 '' - dithio-bis- (2-nitrobenzoic acid) to form a yellow-colored 2-nitro-5-mercaptobenzoic acid anion (maximum light absorption at 412 nm)
- S (CH 2 ) 2 N (CH 3 ) 3 N + J - + RS-SR ---> RS-S (CH 2 ) 2 N (CH 3 ) 3 N + J - + RS -
The analytical effect is recorded on a photoelectrocolorimeter (spectrophotometer) at a wavelength of 412 nm.
Данный способ имеет наибольшее число общих признаков с предлагаемым и принят нами в качестве прототипа. This method has the largest number of common features with the proposed and adopted by us as a prototype.
Способ-прототип снимает погрешности, связанные с влиянием pH среды пробы и визуальной регистрацией аналитического эффекта на результаты анализа пробы. The prototype method removes errors associated with the influence of the pH of the sample medium and the visual registration of the analytical effect on the results of the analysis of the sample.
Однако способ-прототип сложен в исполнении и трудоемок. К числу существенных недостатков способа-прототипа следует отнести сложности, возникающие при анализе водных экстрактов, которые часто окрашены в желтые тона и имеют интенсивную полосу поглощения в той же спектральной области, что и анион 2-нитро-5-меркаптобензойной кислоты. Это приводит к необходимости разбавлять или обесцвечивать анализируемую пробу водного экстракта перед анализом, что ведет к снижению чувствительности анализа пробы. Регистрация аналитического эффекта по способу-прототипу осуществляется по времени tоп, за которое значение оптической плотности реакционного раствора возрастает на величину 0,05 или 0,10. В выбранных условиях tоп может достигать до 20 минут в зависимости от концентрации анализируемого соединения в пробе.However, the prototype method is complicated and time-consuming. Significant disadvantages of the prototype method include the difficulties encountered in the analysis of aqueous extracts, which are often colored in yellow and have an intense absorption band in the same spectral region as the anion of 2-nitro-5-mercaptobenzoic acid. This leads to the need to dilute or discolor the analyzed sample of the aqueous extract before analysis, which leads to a decrease in the sensitivity of the analysis of the sample. Registration of the analytical effect of the prototype method is carried out at time t op , during which the optical density of the reaction solution increases by 0.05 or 0.10. Under the selected conditions, t op can reach up to 20 minutes, depending on the concentration of the analyte in the sample.
Трудоемкость обсуждаемого способа также возрастает в связи с необходимостью готовить раствор сравнения для каждой анализируемой пробы того же состава, что и рабочий раствор, за исключением субстрата. The complexity of the discussed method also increases due to the need to prepare a comparison solution for each analyzed sample of the same composition as the working solution, with the exception of the substrate.
Указанные выше недостатки ведут к увеличению как погрешности результата анализа, так и времени его проведения. The above disadvantages lead to an increase in both the error of the analysis result and the time it takes.
Предлагаемое решение направлено на снижение предела определения и погрешности анализа соединения антихолинэстеразного действия, а также устранение необходимости разбавления анализируемых окрашенных экстрактов. The proposed solution is aimed at reducing the limit of determination and the error in the analysis of anticholinesterase compounds, as well as eliminating the need for dilution of the analyzed colored extracts.
Технический результат достигается тем, что в способе определения соединения антихолинэстеразного действия, включающем измерение скорости ферментативного гидролиза ацилтиохолина, в качестве индикатора на тиольную группу используют 4,4''-бис-(2-гидрокси-6,8-дисульфо-1-нафтилазо)фенилдисульфида тетракалиевую соль (далее БАС),
анализ проводят в оптимальных для конкретного препарата ХЭ условиях, регистрацию аналитического эффекта осуществляют фотоколориметрической регистрацией аналитического эффекта по тангенсу угла наклона начального участка кинетической кривой ферментативного гидролиза бутирилтиохолина (БТХ) при длине волны 575 нм.The technical result is achieved by the fact that in a method for determining a compound of anticholinesterase action, including measuring the rate of enzymatic hydrolysis of acylthiocholine, 4.4 '' - bis- (2-hydroxy-6.8-disulfo-1-naphthylazo) is used as an indicator on the thiol group phenyl disulfide tetra potassium salt (hereinafter ALS),
the analysis is carried out under optimal conditions for a particular CE drug; the analytical effect is recorded by photocolorimetric registration of the analytical effect by the slope of the initial portion of the kinetic curve of the enzymatic hydrolysis of butyrylthiocholine (BTX) at a wavelength of 575 nm.
Выбор индикатора на тиольную группу 4,4''-бис-(2-гидрокси- 6,8-дисульфо-1-нафтилазо)-фенилдисульфида тетракалиевой соли обусловлен как его спектральными параметрами, так и его стабильностью при хранении. The choice of the indicator for the thiol group of 4.4 '' - bis- (2-hydroxy-6.8-disulfo-1-naphthylazo) -phenyl disulfide of tetra potassium salt is due to both its spectral parameters and its storage stability.
Так, продукт взаимодействия БАС с тиохолином имеет полосу поглощения в синей области спектра ( λmax = 575 нм), что позволяет анализировать окрашенные водные экстракты без предварительного их разбавления или обесцвечивания.Thus, the product of the interaction of BAS with thiocholine has an absorption band in the blue region of the spectrum (λ max = 575 nm), which allows the analysis of colored aqueous extracts without preliminary dilution or discoloration.
При прочих равных условиях чувствительность фотоколориметрического анализа определяется величиной мольного коэффициента поглощения ελ индикатора. Величина мольного коэффициента поглощения продукта взаимодействия БАС с тиохолином ελ составляет 42100 л•моль-1/см-1. Это в 3 раза выше, чем для продукта взаимодействия 5,5''-дитио-бис-(2-нитробензойной кислоты) с тиохолином - 2-нитро-5-меркаптобензойной кислоты, значение ελ для которой составляет 13600 л•моль-1/см-1 [11].Other things being equal, the sensitivity of the photocolorimetric analysis is determined by the molar absorption coefficient ε λ of the indicator. The molar absorption coefficient of the product of the interaction of BAS with thiocholine ε λ is 42100 l • mol -1 / cm -1 . This is 3 times higher than for the product of the interaction of 5.5 '' - dithio-bis- (2-nitrobenzoic acid) with thiocholine - 2-nitro-5-mercaptobenzoic acid, the value of ε λ for which is 13600 l • mol -1 / cm -1 [11].
Измерение скорости ферментативного гидролиза бутирилтиохолина йодистого по тангенсу угла наклона начального участка кинетической кривой позволяет отказаться от необходимости готовить для каждой анализируемой пробы раствор сравнения, содержащий все компоненты реакционного раствора, кроме субстрата. Благодаря используемому способу измерения скорости ферментативного гидролиза субстрата регистрация аналитического эффекта при любой концентрации соединения антихолинэстеразного действия в анализируемой пробе возможна через 30 - 90 с после добавления субстрата в реакционный раствор. Measurement of the rate of enzymatic hydrolysis of butyrylthiocholine iodide by the slope of the initial portion of the kinetic curve eliminates the need to prepare a comparison solution for each analyzed sample containing all components of the reaction solution except the substrate. Thanks to the method used to measure the rate of enzymatic hydrolysis of the substrate, the registration of the analytical effect at any concentration of the anticholinesterase compound in the analyzed sample is possible 30 to 90 seconds after adding the substrate to the reaction solution.
Использование специфичного для каждого препарата ХЭ субстрата и оптимального значения pH позволяет повысить чувствительность анализа. The use of a substrate specific for each preparation of CE and an optimal pH value can increase the sensitivity of the analysis.
К числу недостатков способа-прототипа следует отнести и использование ацетилтиохолина йодистого для всех препаратов ХЭ из различных биологических источников, в то время как предпочтительно использование специфичного субстрата. Ацетилтиохолин также может быть использован в качестве субстрата, однако при этом погрешность результатов анализа существенно возрастает. The disadvantages of the prototype method include the use of acetylthiocholine iodide for all CE preparations from various biological sources, while the use of a specific substrate is preferable. Acetylthiocholine can also be used as a substrate, however, the error of the analysis results increases significantly.
Более высокое сродство ЛХЭ к БТХ, чем к АТХ, следует из значений констант Михаэлиса Км (см. табл. 1).A higher affinity of LCE for BTX than for ATX follows from the values of Michaelis constants K m (see Table 1).
Именно проведение анализа не в оптимальных для ЛХЭ условиях и использование менее специфичного для данного фермента субстрата определяют его недостаточную чувствительность к соединениям антихолинэстеразного действия способа-пототипа (см. табл. 2). Эффективность предлагаемого способа показана на примере фермент-субстратной системы ЛХЭ-бутирилтиохолин йодистый
Выбор ЛХЭ обусловлен высокой стабильностью его препаратов, в то время как используемые в способе-прототипе препараты холинэстеразы ПХЭ и АХЭ отличаются низкой стабильностью даже при хранении в лиофилизированном состоянии, а в виде рабочих растворов срок их хранения при температуре 25oC составляет 8 часов [8]. И ПХЭ и АХЭ ингибируются высокими концентрациями субстрата, что затрудняет выбор его оптимальной концентрации. ЛХЭ отличается более высоким сродством к бутирилтиохолину (см. табл. 1), чем к ацетилтиохолину, поэтому в предлагаемом способе используется бутирилтиохолин йодистый. Достоинством последнего также является его более высокая гидролитическая устойчивость по сравнению с ацетилтиохолином. Именно проведение анализа предлагаемым способом в оптимальных условиях, при которых ЛХЭ проявляет максимальную активность по отношению как к ингибитору, так и субстрату бутирилтиохолину йодистому, позволило повысить чувствительность анализа соединений антихолинэстеразного действия.It is the analysis that is not in optimal conditions for LCE and the use of a substrate less specific for this enzyme that determines its insufficient sensitivity to the anticholinesterase compounds of the pototype method (see Table 2). The effectiveness of the proposed method is shown by the example of the enzyme-substrate system LCE-butyrylthiocholine iodide
The choice of LCE is due to the high stability of its preparations, while the preparations of the cholinesterase PCE and AChE used in the prototype method are characterized by low stability even when stored in a lyophilized state, and in the form of working solutions, their shelf life at a temperature of 25 o C is 8 hours [8 ]. Both PCE and AChE are inhibited by high concentrations of the substrate, which makes it difficult to choose its optimal concentration. LCE is characterized by a higher affinity for butyrylthiocholine (see Table 1) than for acetylthiocholine, therefore, butyrylthiocholine iodide is used in the proposed method. An advantage of the latter is its higher hydrolytic stability compared to acetylthiocholine. It is the analysis of the proposed method under optimal conditions, under which LCE exhibits maximum activity with respect to both the inhibitor and the substrate butyrylthiocholine iodide, which made it possible to increase the sensitivity of the analysis of anticholinesterase compounds.
Существенные признаки предлагаемого способа и способа-прототипа приведены в табл. 3. The essential features of the proposed method and the prototype method are given in table. 3.
Пример 1. Example 1
Проведен анализ десяти проб воды и водных экстрактов с заданными значениями концентрации O-изобутил-S-2- (диэтиламино)этилметилтиофосфоната. Полученные значения были сопоставлены с результатами анализа способом-прототипом [8]. Ten water samples and water extracts were analyzed with the specified concentration values of O-isobutyl-S-2- (diethylamino) ethyl methylthiophosphonate. The obtained values were compared with the results of the analysis by the prototype method [8].
Для проведения анализа были использованы следующие реагенты (отечественного производства):
Калий фосфорнокислый однозамещенный, ГОСТ 4198-78, "хч".For the analysis, the following reagents (domestic production) were used:
Potassium phosphate monosubstituted, GOST 4198-78, "hch".
Натрий фосфорнокислый двузамещенный, ГОСТ 4172-78,"хч". Sodium phosphate disubstituted, GOST 4172-78, "hch".
Препарат холинэстеразы сыворотки крови лошади VI класса, лиофилизированный, ТУ 5765/42.14-42-86. Lyophilized horse serum cholinesterase drug of class VI horse, TU 5765 / 42.14-42-86.
Бутирилтиохолин йодистый, ТУ 6-09-09-684-76, "хч". Butyrylthiocholine iodide, TU 6-09-09-684-76, "hch".
4,4''-бис-(2-гидрокси-6,8-дисульфо-1 -нафтилазо)фенилдисульфида тетракалиевая соль (БАС), ТУ 6-09-09-209-84. 4.4 '' - bis- (2-hydroxy-6,8-disulfo-1-naphthylazo) phenyl disulfide tetra potassium salt (BAS), TU 6-09-09-209-84.
O-изобутил-S-2-(диэтиламино)этилметилтиофосфонат, 90% действующего начала. O-isobutyl-S-2- (diethylamino) ethyl methylthiophosphonate, 90% of the active principle.
Для проведения анализа использовались следующие растворы. For analysis, the following solutions were used.
Фосфатный буфер, 0,7 моль/л, pH 8,5; срок хранения раствора при комнатной температуре (в темном месте) не менее четырех недель. Phosphate buffer, 0.7 mol / L, pH 8.5; the shelf life of the solution at room temperature (in a dark place) is at least four weeks.
Раствор БАС, 550 мкмоль/л, срок хранения при комнатной температуре 3 месяца (при температуре 4oC - не менее 6 месяцев).BAS solution, 550 μmol / l, shelf life at room temperature for 3 months (at a temperature of 4 o C - at least 6 months).
Раствор бутирилтиохолина йодистого, 15 мкмоль/л, в 550 мкмоль/л БАС, (субстрат-индикаторный раствор), срок хранения раствора при комнатной температуре не менее суток, при температуре 4oC - не менее двух суток.A solution of butyrylthiocholine iodide, 15 μmol / L, in 550 μmol / L BAS, (substrate-indicator solution), the shelf life of the solution at room temperature is at least 24 hours, at a temperature of 4 o C - at least two days.
Раствор холинэстеразы сыворотки крови лошади в фосфатном буфере, 1 АЕ/мл, срок хранения раствора не менее двух суток при комнатной температуре и десять суток - при 4oC.A solution of horse serum cholinesterase in phosphate buffer, 1 AU / ml, the shelf life of the solution is at least two days at room temperature and ten days at 4 o C.
Измерения скорости ферментативного гидролиза субстрата проводили на фотометре фотоэлектрическом КФК-З (ГОСТ 15150-69) при длине волны 575 нм и температуре 25oC.The measurements of the enzymatic hydrolysis rate of the substrate were carried out on a KFK-3 photoelectric photometer (GOST 15150-69) at a wavelength of 575 nm and a temperature of 25 o C.
Ход анализа
В пробирку последовательно вносили 3 мл анализируемой пробы воды (дистиллированной воды при измерении исходной активности фермента), 0,5 мл раствора холинэстеразы, включали секундомер, через 15 минут вносили 0,5 мл субстрат-индикаторного раствора, включали секундомер, переливали реакционный раствор в кювету, кювету помещали в фотометр КФК-3 и через 30 с после добавления субстрата нажимали на кнопки "А" и "1" микрокомпьютера фотометра. Через 60 с снимали показания прибора - значение тангенса угла наклона на кинетической кривой ферментативного гидролиза субстрата.Analysis progress
3 ml of the analyzed water sample (distilled water when measuring the initial activity of the enzyme), 0.5 ml of cholinesterase solution were successively added to the test tube, the stopwatch was turned on, after 15 minutes 0.5 ml of the substrate-indicator solution was added, the stopwatch was turned on, the reaction solution was poured into the cuvette , the cuvette was placed in a KFK-3 photometer, and 30 seconds after adding the substrate, the “A” and “1” buttons of the micrometer of the photometer were pressed. After 60 s, the instrument readings were taken — the value of the slope on the kinetic curve of the enzymatic hydrolysis of the substrate.
Средние значения из 3 параллельных измерений концентрации O-изобутил-S-2-(диэтиламино)этилметилтиофосфоната в пробе воды предлагаемым способом представлены в табл. 4. The average values of 3 parallel measurements of the concentration of O-isobutyl-S-2- (diethylamino) ethyl methylthiophosphonate in a water sample of the proposed method are presented in table. 4.
Зависимость отклика (тангенса угла наклона начального участка на начальном участке кинетической кривой ферментативного гидролиза субстрата) от концентрации O-изобутил-S-2-(диэтиламино)этил-метилтиофосфоната носит линейный характер в интервале концентраций 0,27 мкг/мл - 1,95 мкг/мл и может быть представлена следующим уравнением регрессии:
tg α = 0,086 - 48000C,
где С - концентрация O-изобутил-S-2- (диэтиламино)этил-метилтиофосфоната.The dependence of the response (the slope of the initial section on the initial section of the kinetic curve of the enzymatic hydrolysis of the substrate) on the concentration of O-isobutyl-S-2- (diethylamino) ethyl methylthiophosphonate is linear in the concentration range 0.27 μg / ml - 1.95 μg / ml and can be represented by the following regression equation:
tg α = 0.086 - 48000C,
where C is the concentration of O-isobutyl-S-2- (diethylamino) ethyl methylthiophosphonate.
Анализ приведенных в табл. 4 градуировочных растворов способом-прототипом, как и следовало ожидать в соответствии с данными табл. 2, не дал положительных результатов. С учетом относительной погрешности результатов измерения по способу- прототипу (16%) чувствительность предлагаемого способа в 10 раз выше способа-прототипа по отношению к O-изобутил-S-2- (диэтиламино)этилметилтиофосфонату. The analysis given in tab. 4 calibration solutions by the prototype method, as expected in accordance with the data in table. 2, did not give positive results. Given the relative error of the measurement results by the prototype method (16%), the sensitivity of the proposed method is 10 times higher than the prototype method with respect to O-isobutyl-S-2- (diethylamino) ethyl methylthiophosphonate.
Результаты анализа представлены в табл.4. The results of the analysis are presented in table 4.
Уравнение регрессии, приведенное на странице 11, справедливо для приведенных выше условий анализа (pH, температура, природа буфера, ионная сила реакционного раствора, исходная активность холинэстеразы и т.д.). Поэтому в литературе принято определять степень угнетения фермента соединением антихолинэстеразного действия. В предлагаемом способе содержание соединения антихолинэстеразного действия в анализируемой пробе определяют по предварительно установленной зависимости степени угнетения холинэстеразы (в процентах) от концентрации ингибитора, причем степень ингибирования J вычисляют по формуле
J = (1-tgαоп/tgαкон)•100% ,
где tgαкон - тангенс угла наклона начального участка на кинетической кривой ферментативного гидролиза субстрата относительно оси абсцисс в контрольной пробе,
tgαоп - тангенс угла наклона начального участка на кинетической кривой ферментативного гидролиза субстрата относительно оси абсцисс в опытной пробе.The regression equation shown on page 11 is valid for the above analysis conditions (pH, temperature, nature of the buffer, ionic strength of the reaction solution, initial cholinesterase activity, etc.). Therefore, it is customary in the literature to determine the degree of inhibition of an enzyme by an anticholinesterase compound. In the proposed method, the content of the anticholinesterase compound in the analyzed sample is determined by a pre-determined dependence of the degree of cholinesterase inhibition (in percent) on the concentration of the inhibitor, and the degree of inhibition J is calculated by the formula
J = (1-tgα op / tgα con ) • 100%,
where tgα con is the slope of the initial portion on the kinetic curve of the enzymatic hydrolysis of the substrate relative to the abscissa axis in the control sample,
tgα op is the slope of the initial portion on the kinetic curve of the enzymatic hydrolysis of the substrate relative to the abscissa axis in the experimental sample.
Приведенные данные позволяют сделать заключение о более высокой чувствительности и меньшей трудоемкости предлагаемого способа измерения концентрации соединений антихолинэстеразного действия по сравнению со способом-прототипом. The above data allow us to conclude about a higher sensitivity and less complexity of the proposed method for measuring the concentration of anticholinesterase compounds in comparison with the prototype method.
Использованные литературные источники
1. ЕР 0533283 B1, lnt.Cl6 C 12 Q 1/46, G 01 N 33/52, G 01 N 31/22. Assay for serum cholinesterase activity. 11.12/1996, Bulletin 1996/50.Used literature
1. EP 0533283 B1, lnt.Cl 6 C 12
2. ЕР 0464388 Al Int. Cl6, C 12 Q 1/00, C 12 Q 1/46. Date of filing: 06.06.91. Detection assays having chromogenic and non chromogenic, hypo chromogenic, batho chromogenic or hypo chromogenic substrates.2. EP 0464388 Al Int. Cl 6 , C 12
3. ЕР 0176585. Int.Cl6 C 12 Q 1/46, C 12 N 11/12. Date of publication patent specification 27.07.88.3. EP 0176585. Int.Cl 6 C 12
4. Makower A. Et al. Affiniti enzymometric assay for detection of organophosphorus compouds/ Analytica Chimica acta. 1997, v.357, pp 13 - 20. 4. Makower A. Et al. Affiniti enzymometric assay for detection of organophosphorus compouds / Analytica Chimica acta. 1997, v. 357, pp 13-20.
5.Chmelarova M. Et al. Coil. Czech. Chem Comm. 1966, v.31, 1886. 5.Chmelarova M. Et al. Coil. Czech Chem Comm. 1966, v.31, 1886.
6. Руководство по работе в автомобильной радиометрической и химической лаборатории АЛ-4М. Москва, Военное издательство. 1988. 6. Manual for work in the automotive radiometric and chemical laboratory AL-4M. Moscow, Military Publishing House. 1988.
7. Лаборатория переносная для водоочистительных станций ПЛВС. Техническое описание и инструкция по эксплуатации. МО СССР. 1987. 7. Portable laboratory for water treatment plants PLVS. Technical description and instruction manual. USSR Ministry of Defense. 1987.
8. Методики определения микроконцентраций фосфорорганических отравляющих веществ вероятного противника с использованием препаратов холинэстеразы из различных источников. Главное управление по производству бактерийных и вирусных препаратов. Министерство здравоохранения СССР. Пермь 1978 год. 8. Methods for determining the micro-concentrations of organophosphorus toxic substances of a probable adversary using cholinesterase preparations from various sources. General Directorate for the Production of Bacterial and Viral Preparations. USSR Ministry of Health. Perm 1978 year.
9. Технические условия изготовления препаратов холинэстеразы TV-5765/42.14-42-76. Министерство здравоохранения СССР. 9. Technical conditions for the manufacture of cholinesterase preparations TV-5765 / 42.14-42-76. USSR Ministry of Health.
10. Яковлев В.А. Кинетика ферментативного катализа. Москва. Наука. 1965, стр.162. 10. Yakovlev V.A. Kinetics of enzymatic catalysis. Moscow. The science. 1965, p. 162.
11. Ridless P.W. et al. Analyt. Biochem. 1979. V 94, N 1, pp.75 - 81. 11. Ridless P.W. et al. Analyt. Biochem. 1979. V 94,
Claims (3)
J = (1-tgαоп/tgαкон)•100,
где tgαкон - тангенс угла наклона начального участка на кинетической кривой ферментативного гидролиза субстрата относительно оси абсцисс в контрольной пробе;
tgαоп - тангенс угла наклона начального участка на кинетической кривой ферментативного гидролиза субстрата относительно оси абсцисс в опытной пробе.3. The method according to claim 1, characterized in that the concentration of the anticholinesterase compound is determined by the pre-established dependence of the degree of inhibition of cholinesterase J (in%) on the concentration of the analyte, and the degree of inhibition of cholinesterase J is determined by the formula
J = (1-tgα op / tgα con ) • 100,
where tgα con is the tangent of the slope of the initial portion on the kinetic curve of the enzymatic hydrolysis of the substrate relative to the abscissa axis in the control sample;
tgα op is the slope of the initial portion on the kinetic curve of the enzymatic hydrolysis of the substrate relative to the abscissa axis in the experimental sample.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU99110551A RU2157850C1 (en) | 1999-05-21 | 1999-05-21 | Method of determination of anticholine esterase compounds in water and aqueous extracts |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU99110551A RU2157850C1 (en) | 1999-05-21 | 1999-05-21 | Method of determination of anticholine esterase compounds in water and aqueous extracts |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2157850C1 true RU2157850C1 (en) | 2000-10-20 |
Family
ID=20220071
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU99110551A RU2157850C1 (en) | 1999-05-21 | 1999-05-21 | Method of determination of anticholine esterase compounds in water and aqueous extracts |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2157850C1 (en) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2478950C2 (en) * | 2007-05-31 | 2013-04-10 | Дженерал Электрик Компани | Method of determining polymer concentration in water systems |
| RU2526817C1 (en) * | 2013-04-02 | 2014-08-27 | Войсковая Часть 41598 | Method for assessing toxicity hazard of anticholinesterase compounds |
| RU2557535C1 (en) * | 2014-02-19 | 2015-07-20 | Войсковая Часть 41598 | Method of biochemical identification of highly-toxic anticholinesterase poisons |
-
1999
- 1999-05-21 RU RU99110551A patent/RU2157850C1/en active
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Методики определения микроконцентрацией фосфорорганических отравляющих веществ с использованием препаратов холинэстераз из различных биологических источников. - Пермь, 1978, с.4-14. * |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2478950C2 (en) * | 2007-05-31 | 2013-04-10 | Дженерал Электрик Компани | Method of determining polymer concentration in water systems |
| RU2526817C1 (en) * | 2013-04-02 | 2014-08-27 | Войсковая Часть 41598 | Method for assessing toxicity hazard of anticholinesterase compounds |
| RU2557535C1 (en) * | 2014-02-19 | 2015-07-20 | Войсковая Часть 41598 | Method of biochemical identification of highly-toxic anticholinesterase poisons |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US3950226A (en) | Novel reagent and method for the determination of urea in biological fluids | |
| Naik et al. | Development and validation of a simple assay for the determination of cholinesterase activity in whole blood of laboratory animals | |
| US10458916B2 (en) | Rapid tests for the detection of inhibitors of enzymes and human exposure to the same | |
| JPH06505880A (en) | Kits and methods for measuring pesticides | |
| US8642273B2 (en) | Ligand sensing fluorescent acetylcholinesterase for detection of organophosphate activity | |
| CN106399457B (en) | The method that visualization based on nanometer analogue enztme quickly detects biological enzyme, protein and its inhibitor | |
| US6746850B2 (en) | Assay for detecting, measuring and monitoring the activities and concentrations of proteins and methods of use thereof | |
| RU2157850C1 (en) | Method of determination of anticholine esterase compounds in water and aqueous extracts | |
| Vidilaseris et al. | A high-throughput method for orthophosphate determination of thermostable membrane-bound pyrophosphatase activity | |
| Kurz et al. | Protein structural changes accompanying formation of enzymic transition states: tryptophan environment in ground-state and transition-state analog complexes of adenosine deaminase | |
| Alfthan et al. | Characterization and semiquantitative estimation of organophosphorus compounds based on inhibition of cholinesterases | |
| JP5800830B2 (en) | Phosphatidylserine quantitative method and quantitative kit | |
| RU2704264C1 (en) | Rapid method of detecting butyrylcholinesterase inhibitors in water and aqueous extracts | |
| Shingles et al. | Measurement of carbonic anhydrase activity using a sensitive fluorometric assay | |
| Pickering et al. | Modifications of the Michel Δ pH method for the estimation of plasma, erythrocyte and brain cholinesterase activities of various species of laboratory animals | |
| US4983512A (en) | Reagent for determination of acid phosphatase | |
| US4151043A (en) | Enzyme determination method | |
| RU2153675C2 (en) | Method for determining blood cholinesterase activity | |
| KR20040073539A (en) | Highly sensitive and continuous protein-tyrosine-phosphatase(PTPase) test using 6,8-difluoro-4-methyl-umbelliferylphosphate | |
| Bannister et al. | Buffer‐Induced Activation of Calf Intestinal Alkaline Phosphate | |
| Blazheyevskіy et al. | The determination of the cholinesterase activity using 3, 3′, 5, 5′-tetramethylbenzidine as an indicator | |
| EA028030B1 (en) | Method for quantification of biological activity in extracts of young antlers | |
| SU1745769A1 (en) | Method of determination of pesticides and drugs with anticholinesterase effect | |
| St Omer et al. | cholinesterase activity in biological fluids | |
| RU2081411C1 (en) | Composition for detecting sodium ions |