RU2141527C1 - Синтетический пептид, синтетический липопептид, иммуногенный конъюгат (варианты), способ получения олигомера, защищенный твердым монометиловым эфиром полиэтиленгликоля полисахарид - Google Patents
Синтетический пептид, синтетический липопептид, иммуногенный конъюгат (варианты), способ получения олигомера, защищенный твердым монометиловым эфиром полиэтиленгликоля полисахарид Download PDFInfo
- Publication number
- RU2141527C1 RU2141527C1 RU94040386A RU94040386A RU2141527C1 RU 2141527 C1 RU2141527 C1 RU 2141527C1 RU 94040386 A RU94040386 A RU 94040386A RU 94040386 A RU94040386 A RU 94040386A RU 2141527 C1 RU2141527 C1 RU 2141527C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- synthetic
- amino acid
- protein
- peptide
- haemophilus influenzae
- Prior art date
Links
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims abstract description 183
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 31
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 title claims description 27
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 title claims description 24
- 239000007787 solid Substances 0.000 title claims description 14
- 108010028921 Lipopeptides Proteins 0.000 title claims description 13
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 title claims description 9
- -1 monomethyl ester Chemical class 0.000 title claims description 9
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 title claims description 5
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 title claims description 5
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 title claims description 5
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims abstract description 106
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 61
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 58
- 241000606768 Haemophilus influenzae Species 0.000 claims abstract description 43
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 claims abstract description 34
- 229940047650 haemophilus influenzae Drugs 0.000 claims abstract description 16
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract 30
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 45
- 101710116435 Outer membrane protein Proteins 0.000 claims description 36
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 claims description 36
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 33
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 26
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 26
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 26
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 claims description 18
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 17
- 125000006239 protecting group Chemical group 0.000 claims description 13
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 claims description 12
- 238000009739 binding Methods 0.000 claims description 12
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 11
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 10
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 claims description 9
- 150000002482 oligosaccharides Chemical class 0.000 claims description 9
- 239000002904 solvent Substances 0.000 claims description 9
- 230000028993 immune response Effects 0.000 claims description 7
- XNWFRZJHXBZDAG-UHFFFAOYSA-N 2-METHOXYETHANOL Chemical compound COCCO XNWFRZJHXBZDAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 229920001542 oligosaccharide Polymers 0.000 claims description 6
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 claims description 5
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 5
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 claims description 5
- 101000846901 Drosophila melanogaster Fat-body protein 1 Proteins 0.000 claims description 4
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 claims description 4
- PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N Ribose Natural products OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N 0.000 claims description 3
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 3
- 125000001797 benzyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])* 0.000 claims description 3
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 claims description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims description 3
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 claims description 3
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 claims description 3
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O Ammonium Chemical compound [NH4+] QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O 0.000 claims description 2
- 229940045808 haemophilus influenzae type b Drugs 0.000 claims 12
- 101000879596 Nicotiana tabacum Acidic endochitinase P Proteins 0.000 claims 10
- 125000004437 phosphorous atom Chemical group 0.000 claims 3
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 claims 2
- HMFHBZSHGGEWLO-SOOFDHNKSA-N D-ribofuranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H]1O HMFHBZSHGGEWLO-SOOFDHNKSA-N 0.000 claims 1
- LCGLNKUTAGEVQW-UHFFFAOYSA-N Dimethyl ether Chemical compound COC LCGLNKUTAGEVQW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims 1
- JVWLUVNSQYXYBE-UHFFFAOYSA-N Ribitol Natural products OCC(C)C(O)C(O)CO JVWLUVNSQYXYBE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- HMFHBZSHGGEWLO-UHFFFAOYSA-N alpha-D-Furanose-Ribose Natural products OCC1OC(O)C(O)C1O HMFHBZSHGGEWLO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 230000001588 bifunctional effect Effects 0.000 claims 1
- 229940125782 compound 2 Drugs 0.000 claims 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 claims 1
- 229920005684 linear copolymer Polymers 0.000 claims 1
- HEBKCHPVOIAQTA-UHFFFAOYSA-N meso ribitol Natural products OCC(O)C(O)C(O)CO HEBKCHPVOIAQTA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 238000006384 oligomerization reaction Methods 0.000 claims 1
- HEBKCHPVOIAQTA-ZXFHETKHSA-N ribitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO HEBKCHPVOIAQTA-ZXFHETKHSA-N 0.000 claims 1
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 abstract description 34
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 9
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 5
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 abstract 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 43
- 239000000562 conjugate Substances 0.000 description 43
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 37
- 208000000283 familial pityriasis rubra pilaris Diseases 0.000 description 28
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N Dichloromethane Chemical compound ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 27
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 21
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 20
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 20
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 19
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 18
- 239000000047 product Substances 0.000 description 18
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 15
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 15
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 14
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 14
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 13
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 12
- 230000004044 response Effects 0.000 description 11
- 108010060123 Conjugate Vaccines Proteins 0.000 description 10
- 229940031670 conjugate vaccine Drugs 0.000 description 10
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 10
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 10
- 239000013638 trimer Substances 0.000 description 10
- 101710190786 PI protein Proteins 0.000 description 9
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 9
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 9
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N Argon Chemical compound [Ar] XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 108010015899 Glycopeptides Proteins 0.000 description 8
- 102000002068 Glycopeptides Human genes 0.000 description 8
- JGFZNNIVVJXRND-UHFFFAOYSA-N N,N-Diisopropylethylamine (DIPEA) Chemical compound CCN(C(C)C)C(C)C JGFZNNIVVJXRND-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 8
- XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N aluminium Chemical compound [Al] XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 229910052782 aluminium Inorganic materials 0.000 description 7
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 7
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 7
- DQJCDTNMLBYVAY-ZXXIYAEKSA-N (2S,5R,10R,13R)-16-{[(2R,3S,4R,5R)-3-{[(2S,3R,4R,5S,6R)-3-acetamido-4,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxy}-5-(ethylamino)-6-hydroxy-2-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy}-5-(4-aminobutyl)-10-carbamoyl-2,13-dimethyl-4,7,12,15-tetraoxo-3,6,11,14-tetraazaheptadecan-1-oic acid Chemical compound NCCCC[C@H](C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)NC(=O)CC[C@H](C(N)=O)NC(=O)[C@@H](C)NC(=O)C(C)O[C@@H]1[C@@H](NCC)C(O)O[C@H](CO)[C@H]1O[C@H]1[C@H](NC(C)=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 DQJCDTNMLBYVAY-ZXXIYAEKSA-N 0.000 description 6
- WFDIJRYMOXRFFG-UHFFFAOYSA-N Acetic anhydride Chemical compound CC(=O)OC(C)=O WFDIJRYMOXRFFG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 6
- 108010068647 P2 peptide Proteins 0.000 description 6
- JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N Pyridine Chemical compound C1=CC=NC=C1 JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N Tetrahydrofuran Chemical compound C1CCOC1 WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 6
- 230000002788 anti-peptide Effects 0.000 description 6
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 6
- 239000012267 brine Substances 0.000 description 6
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 6
- 210000002443 helper t lymphocyte Anatomy 0.000 description 6
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 6
- 239000000863 peptide conjugate Substances 0.000 description 6
- 230000008569 process Effects 0.000 description 6
- 230000009696 proliferative response Effects 0.000 description 6
- HPALAKNZSZLMCH-UHFFFAOYSA-M sodium;chloride;hydrate Chemical compound O.[Na+].[Cl-] HPALAKNZSZLMCH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 6
- 238000005481 NMR spectroscopy Methods 0.000 description 5
- 241000588653 Neisseria Species 0.000 description 5
- 101800002869 PACAP-related peptide Proteins 0.000 description 5
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 5
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 5
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 5
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 5
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 5
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 5
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 5
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 5
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 5
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 5
- 239000012064 sodium phosphate buffer Substances 0.000 description 5
- 238000010532 solid phase synthesis reaction Methods 0.000 description 5
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 5
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 5
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 5
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 5
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 5
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 5
- VHYFNPMBLIVWCW-UHFFFAOYSA-N 4-Dimethylaminopyridine Chemical compound CN(C)C1=CC=NC=C1 VHYFNPMBLIVWCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000700199 Cavia porcellus Species 0.000 description 4
- 238000009007 Diagnostic Kit Methods 0.000 description 4
- 102000016607 Diphtheria Toxin Human genes 0.000 description 4
- 108010053187 Diphtheria Toxin Proteins 0.000 description 4
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 4
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 4
- DKGAVHZHDRPRBM-UHFFFAOYSA-N Tert-Butanol Chemical compound CC(C)(C)O DKGAVHZHDRPRBM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108010055044 Tetanus Toxin Proteins 0.000 description 4
- ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N Triethylamine Chemical compound CCN(CC)CC ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229910052786 argon Inorganic materials 0.000 description 4
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 4
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 4
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 4
- 239000011859 microparticle Substances 0.000 description 4
- 229940126577 synthetic vaccine Drugs 0.000 description 4
- 229940118376 tetanus toxin Drugs 0.000 description 4
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 4
- ONBQEOIKXPHGMB-VBSBHUPXSA-N 1-[2-[(2s,3r,4s,5r)-3,4-dihydroxy-5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]oxy-4,6-dihydroxyphenyl]-3-(4-hydroxyphenyl)propan-1-one Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=CC(O)=CC(O)=C1C(=O)CCC1=CC=C(O)C=C1 ONBQEOIKXPHGMB-VBSBHUPXSA-N 0.000 description 3
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 3
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 3
- KRHYYFGTRYWZRS-UHFFFAOYSA-N Fluorane Chemical compound F KRHYYFGTRYWZRS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 206010033078 Otitis media Diseases 0.000 description 3
- 101710167679 Outer membrane protein P1 Proteins 0.000 description 3
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 3
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 3
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 3
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 3
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 3
- 238000003149 assay kit Methods 0.000 description 3
- 229940126142 compound 16 Drugs 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 3
- AFQIYTIJXGTIEY-UHFFFAOYSA-N hydrogen carbonate;triethylazanium Chemical compound OC(O)=O.CCN(CC)CC AFQIYTIJXGTIEY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 3
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 3
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 3
- 210000004877 mucosa Anatomy 0.000 description 3
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 3
- KHIWWQKSHDUIBK-UHFFFAOYSA-N periodic acid Chemical compound OI(=O)(=O)=O KHIWWQKSHDUIBK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N pyridine Natural products COC1=CC=CN=C1 UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 3
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 3
- 238000010898 silica gel chromatography Methods 0.000 description 3
- 210000004988 splenocyte Anatomy 0.000 description 3
- 238000012916 structural analysis Methods 0.000 description 3
- YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N tetrahydrofuran Natural products C=1C=COC=1 YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N trichloroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(Cl)(Cl)Cl YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- SZUVGFMDDVSKSI-WIFOCOSTSA-N (1s,2s,3s,5r)-1-(carboxymethyl)-3,5-bis[(4-phenoxyphenyl)methyl-propylcarbamoyl]cyclopentane-1,2-dicarboxylic acid Chemical compound O=C([C@@H]1[C@@H]([C@](CC(O)=O)([C@H](C(=O)N(CCC)CC=2C=CC(OC=3C=CC=CC=3)=CC=2)C1)C(O)=O)C(O)=O)N(CCC)CC(C=C1)=CC=C1OC1=CC=CC=C1 SZUVGFMDDVSKSI-WIFOCOSTSA-N 0.000 description 2
- RYHBNJHYFVUHQT-UHFFFAOYSA-N 1,4-Dioxane Chemical compound C1COCCO1 RYHBNJHYFVUHQT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- UNILWMWFPHPYOR-KXEYIPSPSA-M 1-[6-[2-[3-[3-[3-[2-[2-[3-[[2-[2-[[(2r)-1-[[2-[[(2r)-1-[3-[2-[2-[3-[[2-(2-amino-2-oxoethoxy)acetyl]amino]propoxy]ethoxy]ethoxy]propylamino]-3-hydroxy-1-oxopropan-2-yl]amino]-2-oxoethyl]amino]-3-[(2r)-2,3-di(hexadecanoyloxy)propyl]sulfanyl-1-oxopropan-2-yl Chemical compound O=C1C(SCCC(=O)NCCCOCCOCCOCCCNC(=O)COCC(=O)N[C@@H](CSC[C@@H](COC(=O)CCCCCCCCCCCCCCC)OC(=O)CCCCCCCCCCCCCCC)C(=O)NCC(=O)N[C@H](CO)C(=O)NCCCOCCOCCOCCCNC(=O)COCC(N)=O)CC(=O)N1CCNC(=O)CCCCCN\1C2=CC=C(S([O-])(=O)=O)C=C2CC/1=C/C=C/C=C/C1=[N+](CC)C2=CC=C(S([O-])(=O)=O)C=C2C1 UNILWMWFPHPYOR-KXEYIPSPSA-M 0.000 description 2
- VKIGAWAEXPTIOL-UHFFFAOYSA-N 2-hydroxyhexanenitrile Chemical compound CCCCC(O)C#N VKIGAWAEXPTIOL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QWTBDIBOOIAZEF-UHFFFAOYSA-N 3-[chloro-[di(propan-2-yl)amino]phosphanyl]oxypropanenitrile Chemical compound CC(C)N(C(C)C)P(Cl)OCCC#N QWTBDIBOOIAZEF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- YRNWIFYIFSBPAU-UHFFFAOYSA-N 4-[4-(dimethylamino)phenyl]-n,n-dimethylaniline Chemical compound C1=CC(N(C)C)=CC=C1C1=CC=C(N(C)C)C=C1 YRNWIFYIFSBPAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XVMSFILGAMDHEY-UHFFFAOYSA-N 6-(4-aminophenyl)sulfonylpyridin-3-amine Chemical compound C1=CC(N)=CC=C1S(=O)(=O)C1=CC=C(N)C=N1 XVMSFILGAMDHEY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100021503 ATP-binding cassette sub-family B member 6 Human genes 0.000 description 2
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 2
- 241000700198 Cavia Species 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101710177291 Gag polyprotein Proteins 0.000 description 2
- 101000740685 Homo sapiens C4b-binding protein alpha chain Proteins 0.000 description 2
- 101001090065 Homo sapiens Peroxiredoxin-2 Proteins 0.000 description 2
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 2
- 108010004718 Lipoglycopeptides Proteins 0.000 description 2
- 101710125418 Major capsid protein Proteins 0.000 description 2
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 2
- 241001319148 Pharmacis Species 0.000 description 2
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 2
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical class [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 2
- 239000008351 acetate buffer Substances 0.000 description 2
- 125000002777 acetyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(*)=O 0.000 description 2
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 description 2
- 210000000612 antigen-presenting cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- KXZJHVJKXJLBKO-UHFFFAOYSA-N chembl1408157 Chemical compound N=1C2=CC=CC=C2C(C(=O)O)=CC=1C1=CC=C(O)C=C1 KXZJHVJKXJLBKO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000001311 chemical methods and process Methods 0.000 description 2
- 108091006116 chimeric peptides Proteins 0.000 description 2
- 229940126543 compound 14 Drugs 0.000 description 2
- 108091036078 conserved sequence Proteins 0.000 description 2
- 239000012043 crude product Substances 0.000 description 2
- 238000006642 detritylation reaction Methods 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- CZZYITDELCSZES-UHFFFAOYSA-N diphenylmethane Chemical group C=1C=CC=CC=1CC1=CC=CC=C1 CZZYITDELCSZES-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 2
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 2
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 2
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 2
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 229910052736 halogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 150000002367 halogens Chemical class 0.000 description 2
- 238000004896 high resolution mass spectrometry Methods 0.000 description 2
- 238000005984 hydrogenation reaction Methods 0.000 description 2
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 2
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 2
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 2
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 2
- 230000000984 immunochemical effect Effects 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 2
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 2
- 125000005647 linker group Chemical group 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N methanoic acid Natural products OC=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 125000006501 nitrophenyl group Chemical group 0.000 description 2
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 2
- 229960005030 other vaccine in atc Drugs 0.000 description 2
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 2
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 2
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 2
- 229940023041 peptide vaccine Drugs 0.000 description 2
- CTRLRINCMYICJO-UHFFFAOYSA-N phenyl azide Chemical compound [N-]=[N+]=NC1=CC=CC=C1 CTRLRINCMYICJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 2
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 2
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 2
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 2
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 2
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 2
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 2
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- CIHOLLKRGTVIJN-UHFFFAOYSA-N tert‐butyl hydroperoxide Chemical compound CC(C)(C)OO CIHOLLKRGTVIJN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FPGGTKZVZWFYPV-UHFFFAOYSA-M tetrabutylammonium fluoride Chemical compound [F-].CCCC[N+](CCCC)(CCCC)CCCC FPGGTKZVZWFYPV-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 150000003536 tetrazoles Chemical class 0.000 description 2
- 125000005147 toluenesulfonyl group Chemical group C=1(C(=CC=CC1)S(=O)(=O)*)C 0.000 description 2
- 125000001889 triflyl group Chemical group FC(F)(F)S(*)(=O)=O 0.000 description 2
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- GLGNXYJARSMNGJ-VKTIVEEGSA-N (1s,2s,3r,4r)-3-[[5-chloro-2-[(1-ethyl-6-methoxy-2-oxo-4,5-dihydro-3h-1-benzazepin-7-yl)amino]pyrimidin-4-yl]amino]bicyclo[2.2.1]hept-5-ene-2-carboxamide Chemical compound CCN1C(=O)CCCC2=C(OC)C(NC=3N=C(C(=CN=3)Cl)N[C@H]3[C@H]([C@@]4([H])C[C@@]3(C=C4)[H])C(N)=O)=CC=C21 GLGNXYJARSMNGJ-VKTIVEEGSA-N 0.000 description 1
- SCYULBFZEHDVBN-UHFFFAOYSA-N 1,1-Dichloroethane Chemical compound CC(Cl)Cl SCYULBFZEHDVBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ADFXKUOMJKEIND-UHFFFAOYSA-N 1,3-dicyclohexylurea Chemical compound C1CCCCC1NC(=O)NC1CCCCC1 ADFXKUOMJKEIND-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ASOKPJOREAFHNY-UHFFFAOYSA-N 1-Hydroxybenzotriazole Chemical compound C1=CC=C2N(O)N=NC2=C1 ASOKPJOREAFHNY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WAAXYLYXYLKHJZ-UHFFFAOYSA-N 1-[3-(1-hydroxy-2,5-dioxopyrrolidine-3-carbonyl)phenyl]pyrrole-2,5-dione Chemical compound O=C1N(O)C(=O)CC1C(=O)C1=CC=CC(N2C(C=CC2=O)=O)=C1 WAAXYLYXYLKHJZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JBWYRBLDOOOJEU-UHFFFAOYSA-N 1-[chloro-(4-methoxyphenyl)-phenylmethyl]-4-methoxybenzene Chemical compound C1=CC(OC)=CC=C1C(Cl)(C=1C=CC(OC)=CC=1)C1=CC=CC=C1 JBWYRBLDOOOJEU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MCTWTZJPVLRJOU-UHFFFAOYSA-N 1-methyl-1H-imidazole Chemical compound CN1C=CN=C1 MCTWTZJPVLRJOU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FALRKNHUBBKYCC-UHFFFAOYSA-N 2-(chloromethyl)pyridine-3-carbonitrile Chemical compound ClCC1=NC=CC=C1C#N FALRKNHUBBKYCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LBLYYCQCTBFVLH-UHFFFAOYSA-N 2-Methylbenzenesulfonic acid Chemical compound CC1=CC=CC=C1S(O)(=O)=O LBLYYCQCTBFVLH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YRDYYONEONLQLH-UHFFFAOYSA-N 2-cyanoethoxy-N,N-diethylphosphonamidous acid Chemical compound CCN(CC)P(O)OCCC#N YRDYYONEONLQLH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000001731 2-cyanoethyl group Chemical group [H]C([H])(*)C([H])([H])C#N 0.000 description 1
- 125000003903 2-propenyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])=C([H])[H] 0.000 description 1
- OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 4-(3-methoxyphenyl)aniline Chemical compound COC1=CC=CC(C=2C=CC(N)=CC=2)=C1 OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KKADPXVIOXHVKN-UHFFFAOYSA-N 4-hydroxyphenylpyruvic acid Chemical compound OC(=O)C(=O)CC1=CC=C(O)C=C1 KKADPXVIOXHVKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BPWSLGHKOIBSOC-UHFFFAOYSA-N 8-(methoxyamino)-1,1,1-triphenyloctan-2-ol Chemical compound C=1C=CC=CC=1C(C=1C=CC=CC=1)(C(O)CCCCCCNOC)C1=CC=CC=C1 BPWSLGHKOIBSOC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000019260 B-Cell Antigen Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010012919 B-Cell Antigen Receptors Proteins 0.000 description 1
- 208000031729 Bacteremia Diseases 0.000 description 1
- 108010077805 Bacterial Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108700031361 Brachyury Proteins 0.000 description 1
- 108010071134 CRM197 (non-toxic variant of diphtheria toxin) Proteins 0.000 description 1
- XJUZRXYOEPSWMB-UHFFFAOYSA-N Chloromethyl methyl ether Chemical compound COCCl XJUZRXYOEPSWMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QOSSAOTZNIDXMA-UHFFFAOYSA-N Dicylcohexylcarbodiimide Chemical compound C1CCCCC1N=C=NC1CCCCC1 QOSSAOTZNIDXMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000991587 Enterovirus C Species 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 102100036242 HLA class II histocompatibility antigen, DQ alpha 2 chain Human genes 0.000 description 1
- 108700042042 Haemophilus P6 outer membrane Proteins 0.000 description 1
- 206010061190 Haemophilus infection Diseases 0.000 description 1
- 101000930801 Homo sapiens HLA class II histocompatibility antigen, DQ alpha 2 chain Proteins 0.000 description 1
- 241000713772 Human immunodeficiency virus 1 Species 0.000 description 1
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 1
- 241000588748 Klebsiella Species 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 1
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 1
- 206010027202 Meningitis bacterial Diseases 0.000 description 1
- 206010065838 Middle ear inflammation Diseases 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 101710167677 Outer membrane protein P2 Proteins 0.000 description 1
- 101150103068 P2 gene Proteins 0.000 description 1
- KDLHZDBZIXYQEI-UHFFFAOYSA-N Palladium Chemical compound [Pd] KDLHZDBZIXYQEI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- 206010057249 Phagocytosis Diseases 0.000 description 1
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000000474 Poliomyelitis Diseases 0.000 description 1
- 108010013381 Porins Proteins 0.000 description 1
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000607142 Salmonella Species 0.000 description 1
- PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L Sodium Sulfate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])(=O)=O PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 241000191967 Staphylococcus aureus Species 0.000 description 1
- 241000193998 Streptococcus pneumoniae Species 0.000 description 1
- 230000024932 T cell mediated immunity Effects 0.000 description 1
- 230000037453 T cell priming Effects 0.000 description 1
- 108010067390 Viral Proteins Proteins 0.000 description 1
- 229910021536 Zeolite Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K aluminium hydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[OH-].[Al+3] WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000003863 ammonium salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000005915 ammonolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012435 analytical chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 1
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 1
- PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N arabinose Natural products OCC(O)C(O)C(O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 201000009904 bacterial meningitis Diseases 0.000 description 1
- SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N beta-D-Pyranose-Lyxose Natural products OC1COC(O)C(O)C1O SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 1
- 239000012867 bioactive agent Substances 0.000 description 1
- 239000013060 biological fluid Substances 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 description 1
- 238000001516 cell proliferation assay Methods 0.000 description 1
- 108091092356 cellular DNA Proteins 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000003610 charcoal Substances 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 230000000973 chemotherapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 239000012230 colorless oil Substances 0.000 description 1
- 229940001442 combination vaccine Drugs 0.000 description 1
- 238000010835 comparative analysis Methods 0.000 description 1
- 229940125758 compound 15 Drugs 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 230000009260 cross reactivity Effects 0.000 description 1
- 238000002425 crystallisation Methods 0.000 description 1
- 230000008025 crystallization Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 239000002027 dichloromethane extract Substances 0.000 description 1
- NPOMSUOUAZCMBL-UHFFFAOYSA-N dichloromethane;ethoxyethane Chemical compound ClCCl.CCOCC NPOMSUOUAZCMBL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HNPSIPDUKPIQMN-UHFFFAOYSA-N dioxosilane;oxo(oxoalumanyloxy)alumane Chemical compound O=[Si]=O.O=[Al]O[Al]=O HNPSIPDUKPIQMN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 1
- 229940023064 escherichia coli Drugs 0.000 description 1
- 239000012259 ether extract Substances 0.000 description 1
- 125000004705 ethylthio group Chemical group C(C)S* 0.000 description 1
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 1
- 239000011152 fibreglass Substances 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- 235000019253 formic acid Nutrition 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 230000005021 gait Effects 0.000 description 1
- 102000054766 genetic haplotypes Human genes 0.000 description 1
- 229960004443 hemophilus influenzae b vaccines Drugs 0.000 description 1
- VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N hexane Substances CCCCCC VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000005745 host immune response Effects 0.000 description 1
- 238000007327 hydrogenolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 1
- NPZTUJOABDZTLV-UHFFFAOYSA-N hydroxybenzotriazole Substances O=C1C=CC=C2NNN=C12 NPZTUJOABDZTLV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005457 ice water Substances 0.000 description 1
- 230000009851 immunogenic response Effects 0.000 description 1
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 1
- 230000003308 immunostimulating effect Effects 0.000 description 1
- 238000000099 in vitro assay Methods 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 description 1
- 239000013067 intermediate product Substances 0.000 description 1
- 229920006008 lipopolysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000012280 lithium aluminium hydride Substances 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 125000005439 maleimidyl group Chemical group C1(C=CC(N1*)=O)=O 0.000 description 1
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 1
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 1
- 125000004170 methylsulfonyl group Chemical group [H]C([H])([H])S(*)(=O)=O 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 210000004400 mucous membrane Anatomy 0.000 description 1
- 229940031348 multivalent vaccine Drugs 0.000 description 1
- QPJSUIGXIBEQAC-UHFFFAOYSA-N n-(2,4-dichloro-5-propan-2-yloxyphenyl)acetamide Chemical compound CC(C)OC1=CC(NC(C)=O)=C(Cl)C=C1Cl QPJSUIGXIBEQAC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- 239000012074 organic phase Substances 0.000 description 1
- 239000007800 oxidant agent Substances 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 230000002085 persistent effect Effects 0.000 description 1
- 230000008782 phagocytosis Effects 0.000 description 1
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 1
- 150000008300 phosphoramidites Chemical class 0.000 description 1
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 description 1
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 1
- 102000007739 porin activity proteins Human genes 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 230000037452 priming Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 239000013014 purified material Substances 0.000 description 1
- 239000012264 purified product Substances 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 description 1
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- BEOOHQFXGBMRKU-UHFFFAOYSA-N sodium cyanoborohydride Chemical compound [Na+].[B-]C#N BEOOHQFXGBMRKU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910001415 sodium ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012265 solid product Substances 0.000 description 1
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 229940031000 streptococcus pneumoniae Drugs 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 229940014800 succinic anhydride Drugs 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000010189 synthetic method Methods 0.000 description 1
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 1
- 125000005931 tert-butyloxycarbonyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(OC(*)=O)(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- WROMPOXWARCANT-UHFFFAOYSA-N tfa trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F.OC(=O)C(F)(F)F WROMPOXWARCANT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 1
- 125000002221 trityl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C([H])C([H])=C1C([*])(C1=C(C(=C(C(=C1[H])[H])[H])[H])[H])C1=C([H])C([H])=C([H])C([H])=C1[H] 0.000 description 1
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 1
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 1
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 1
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 1
- 239000010457 zeolite Substances 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H15/00—Compounds containing hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals directly attached to hetero atoms of saccharide radicals
- C07H15/02—Acyclic radicals, not substituted by cyclic structures
- C07H15/04—Acyclic radicals, not substituted by cyclic structures attached to an oxygen atom of the saccharide radical
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
- A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
- A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
- A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
- A61K47/646—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent the entire peptide or protein drug conjugate elicits an immune response, e.g. conjugate vaccines
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/04—Antibacterial agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/04—Immunostimulants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H15/00—Compounds containing hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals directly attached to hetero atoms of saccharide radicals
- C07H15/02—Acyclic radicals, not substituted by cyclic structures
- C07H15/04—Acyclic radicals, not substituted by cyclic structures attached to an oxygen atom of the saccharide radical
- C07H15/08—Polyoxyalkylene derivatives
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H15/00—Compounds containing hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals directly attached to hetero atoms of saccharide radicals
- C07H15/18—Acyclic radicals, substituted by carbocyclic rings
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/285—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Pasteurellaceae (F), e.g. Haemophilus influenza
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/55—Design of synthesis routes, e.g. reducing the use of auxiliary or protecting groups
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/8215—Microorganisms
- Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
- Y10S435/851—Haemophilus
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Oncology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Virology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
Abstract
Синтетический пептид имеет аминокислотную последовательность, относящуюся по крайней мере к одной антигенной детерминанте по крайней мере одного белка, обычно структурного, в особенности, Р1, Р2 и Р6-белкам Halmophilus influenzae (Нi), в частности типа В. Его используют в виде химерной липофильной Т-В формы, привязанной к молекуле носителя, например синтетической РRР-молекуле и/или полимеризованного и образующего молекулярные агрегаты, как вакцина против Нi. 6 с. и 29 з.п.ф-лы, 12 табл., 17 ил.
Description
Изобретение относится к синтетическим вакцинам против инфекции Haemophilus influenzae (Hi). В частности, изобретение относится к использованию потенциальных T-хелперных детерминант (THDs), и B-клеточных эпитопов (BE) белков внешней мембраны Hi (OMP) P1, P2 и P6, ковалентно связанных с синтетическим олигосахаридом, содержащим повторяющиеся фрагменты полирибозилрибитол-фосфата (sPRP), образуя таким образом иммуногенные синтетические PRP-пептидные конъюгатные вакцины, которые вызывают в млекопитающих образование анти-PRP и анти-OMP антител с высоким титром.
Haemoph ilus influenzae типа в (Hib)-основная причина бактериального менингита у детей в возрасте до пяти лет [1,2]. Ссылки указаны в конце описания. От фагоцитоза бактерии защищены полисахаридной капсулой, которая представляет собой полимер полирибозилрибитол-фосфата (PRP). Антитела, продуцируемые на капсульный полисахарид этого организма, обладают защитным свойством [3] . Были получены эффективные конъюгатные вакцины, в которых PRP связан с различными белками-носителями, такими как дифтерийный токсин (PRP-D), тетанусный токсин (PRP-T), CRM197 (HbOC) Neisseria meningidis и белок внешней мембраны Neisseria meningidis [4,5]. Однако эти конъюгатные вакцины не являются защитой от других распространенных инкапсулированных H.influenzae - типа a- и c-штаммов и, что более важно, от не имеющих капсулы неклассифицированных разновидностей H. influenzae, которые являются причиной воспаления среднего уха, против которого нет вакцины. Следовательно, необходимо включение отобранных неинкапсулированных H.influenzae-иммуногенов в существующие Hib - вакцины, чтобы разработать универсальную Hi вакцину.
Granoff и Munson [6] показали, что антитела против внешних мембранных белков (OMP) Hib PI, P2 и P6 обладают защитным свойством при модельном заражении новорожденных крыс бактериемией. Значит многообещающей стратегией для получения универсальной вакцины с усиленной защитной способностью против H. influenzae было бы использование в качестве дополнительных иммуногенов и носителей для PRP либо очищенных OMP, либо их защитных эпитопов. Кодирующий ген Р1 был клонирован из различных подтипов Hib [7,8]. Сравнительный анализ последовательностей Pi-белков из этих Hib показал существование трех гипервариабельных участков. В действительности Pi-специфичные MA, о которых сообщал Hansen, узнают только 50% тестированных Hib [7,9] изолятов. Что касается Р2-белка, хотя нуклеотидные последовательности P2 гена, выделенного из двух различных подтипов Hib (1Н и 3L), оказались идентичны [10,11], найдена некоторая вариабельность аминокислот в Р2-последовательностях двух других подтипов (2L и 6U) [II]. Напротив, анализ антигенных детерминант, генных последовательностей и длин рестрикционных фрагментов показал, что P6 белок высоко консервативен из штаммов Hib [12].
Недавние исследования показали, что мышиные Pl-специфичные моноклональные антитела (MAB 7C8) и кроличьи антитела на очищенный PI белок из определенной и из неопределенной разновидностей H.influenzae имели защитный эффект в животных моделях [9, 13, 14]. Murphy и Bartos [15] также показали, что моноклональные антитела, узнающие экспонированную на клеточной поверхности неопределенного H.influenzae, имеют бактерицидную активность in Vitro. Для анти-Р1 и анти P2 моноклональных антител было найдено, что они перекрестно реагируют с определяемыми и неопределяемыми H.influenzae [16-18]. В действительности все еще существуют серьезные сомнения относительно использования всех нативных ОМР Hib как эффективной универсальной вакцины против обеих ветвей H. influenzae. Во-первых, у детей, выздоравливающих от отита, вызванного неопределяемыми Hi, вырабатываются бактерицидные антитела к различным антигенам, таким как Р2 и липополисахариды. Во-вторых, Р1- и Р2-кросс-реагирующие эпитопы, описанные выше, еще не идентифицированы. В-третьих, сообщалось, что [12] эпитоп(ы), которые узнаются анти-Р6 бактерицидными антителами, экспрессируются в малых количествах на клеточной поверхности и возможно таким образом возобновление инфекции. В-четвертых, недостаточно известно пока о роли клеточного иммунного ответа на ОМР. Иммунодоминантные Т-хелперные клеточные эпитопы ОМР Hi пока не охарактеризованы. Значит необходима идентификация функциональных T-хелперных клеточных эпитопов и сохраняющихся экспонированных на поверхности и/или защитных B-клеточных эпитопов Р1, Р2 и Р6-белков, чтобы определить, могут ли они вызывать иммунный ответ против Hi инфекции.
Методы индукции иммунности к болезням постоянно улучшаются и в настоящее время основное направление - использовать в качестве антигена меньший и хорошо очищенный материал. Цель - устранить возможные побочные эффекты определенных природных иммуногенов, сохраняя их иммунногенность и способность к защите от болезней. Последние исследования показали, что иммунизация экспериментальных животных синтетическими пептидами, представляющими собой определенные участки вирусных и бактериальных белков, могут вызывать иммунный ответ на родительские белки и нейтрализовать их функции [19-22]. Так что синтетические пептиды являются потенциальными антигенами для производства недорогих и надежных вакцин против инфекционных возбудителей. Недавний прогресс в фундаментальной иммунологии свидетельствует о том, что хорошие и эффективные иммуногены должны содержать две различные функциональные антигенные детерминанты (эпитопы). Один эпитоп (Т-клеточный) служит для того, чтобы представлять комплекс соответствующего МНС II класса антигена иммунной системе и вызывать активизацию Т-хелперных клеток. Другой эпитоп (В-клеточный) должен узнаваться В-клеточным антигенным рецептором, чтобы вызывать продукцию антител [23-26]. Таким образом, чтобы получить сильнодействующую и эффективную синтетическую вакцину, в синтетическую конструкцию должны включаться оба функциональных эпитопа: Т-хелперный и В-клеточный.
Синтетические PRP-димер, тример и тетрамер были синтезированы, очищены и конъюгированы с белками-носителями для изучения иммуногенности в животных. Эти исследования показали, что конъюгаты из -тримеров PRP-белка в присутствии сильных добавок таких, как полный адъювант Фрейнда (CFA), могут вызвать в экспериментальных животных отклик анти-PRP антител.
Вместо использования условных гетерологичных белковых носителей наша стратегия использует синтетические пептиды, которые содержат иммунодоминантные эпитопы из ОМР Hi как дополнительные антигены и в качестве носителей PRP, чтобы разработать первое поколение полностью синтетических PRP-пептидных конъюгатных вакцин с усиленной защитной способностью и аутологичным Т- клеточным примированием. Подобные вакцины имеют и другие возможные преимущества перед существующими вакцинами, в которых PRP связан с чужеродным белком (дифтерийным токсином (PRP-D), тетанусным токсином (PRP-T) или CRM197 (Hb OC или OMP Neisseria meningidis). Во-первых, использование синтетических Hi должно сократить количество D или Т в любой будущей мультивалентной комбинированной вакцине, уменьшая таким образом риск гипериммунизации против этих белков-носителей. Во-вторых, PRP может быть привязан к сохранившемуся защитному эпитопу для получения вакцины против Hi-заболевания и отита.
Сокращения и определения:
CRM197 - нетоксичный белок антигенно кросс-реагирующий с дифтерийным токсином
Hi - Н.influenzae
Hib - Н.influenzae типа В
MAP - множественный антигенный пептид
MBS - малеимидобензоил-N-гидроксилсукцинимид
OMP - белок внешней мембраны
PEG - полиэтиленгликоль монометиловый эфир
PRP - полирибозирибитол фосфат
Один из аспектов настоящего изобретения направлен на обеспечение иммунногенных синтетических конъюгантных вакцин, включающих синтетические PRP-олигомеры и антигенные детерминанты белков внешней мембраны Hi.
CRM197 - нетоксичный белок антигенно кросс-реагирующий с дифтерийным токсином
Hi - Н.influenzae
Hib - Н.influenzae типа В
MAP - множественный антигенный пептид
MBS - малеимидобензоил-N-гидроксилсукцинимид
OMP - белок внешней мембраны
PEG - полиэтиленгликоль монометиловый эфир
PRP - полирибозирибитол фосфат
Один из аспектов настоящего изобретения направлен на обеспечение иммунногенных синтетических конъюгантных вакцин, включающих синтетические PRP-олигомеры и антигенные детерминанты белков внешней мембраны Hi.
Настоящее изобретение, с другой стороны, направлено на обеспечение вакцин на основе конъюгатов синтетических PRP с пептидами, включающих олигомеры синтетических PRP определенной длины.
Следующий аспект настоящего изобретения состоит в обеспечении химического процесса, в котором эффективно ведется производство синтетических PRP с химически реакционными функциональными группами, позволяющими сайт-направленно конъюгировать с антигенными детерминантами наружной мембраны Hi с использованием полиэтиленгликольмонометилового эфира (PEG) в качестве твердого носителя.
Следующий аспект настоящего изобретения состоит и в обеспечении метода, который может быть использован для улучшения иммуногенности конъюгатов синтетических PRP с пептидами путем выбора правильной ориентации сахарной части по отношению к Т-клеточному эпитопу.
Дополнительным аспектом настоящего изобретения является обеспечение такого химического процесса, который может усилить иммуногенность углеводов, используя множественные антигенные пептидные системы (MAP), содержащие антигенные детерминанты Hib как носители, чтобы увеличить плотность углеводной части в конъюгатах с синтетическими PRP.
Настоящее изобретение в дополнительном аспекте состоит в обеспечении универсальной вакцины против Hi, которая включает иммуногенные конъюгаты PRP с пептидами и обладающие кроссзащитными свойствами Hi антигены.
Следующий аспект настоящего изобретения состоит в получении нового поколения поливалентных вакцин, в составе которых иммуногенные конъюгаты PRP с пептидами и Hi антигенами, комбинированными с другими вакцинами, такими, как DTP -polio, Neisseria meningidis типа A, B, C, abd W и S. pneumoniae серотипа 6B, 14, I9F и 23F.
Настоящее изобретение в следующем аспекте направлено на получение конъюгатов синтетического PRP с пептидами, которые могут быть использованы в диагностических иммунотестах для определения присутствия анти- Hib антител, например, анти-PRP и анти-ОМР антител.
И следующий аспект этого изобретения состоит в получении смеси PRP-специфичных и ОМР-специфичных антител как компонента в наборе для диагностического иммуноанализа для определения присутствия в биологических образцах определяемых и неопределяемых штаммов Hi.
Краткая сущность изобретения.
Настоящее изобретение относится к обеспечению иммуногенов и возможных вакцин на основе пептидов, содержащих аминокислотные последовательности разнообразных антигенных детерминант (Т-хелперных и В-клеточных эпитопов) белков внешней мембраны (Р1, Р2 и Р6)Hib. Открыты синтетические вакцины, включающие один или больше таких пептидов, которые могут быть введены как свободные пептиды или ковалентно связанные с синтетическими PRP-олигомерами в качестве синтетических гликоконъюгатных вакцин и/или привязанные к липидной части с целью увеличения их иммуногенности.
В одном из аспектов настоящего внедрения обеспечивается синтетический пептид с аминокислотной последовательностью, соответствующей по крайней мере одной антигенной детерминанте по крайней мере одного белка H.influenzae, предпочтительно белка внешней мембраны H.unfluenzae b.
С одной стороны, настоящее изобретение включает значительно очищенную форму пептида, содержащего по крайней мере одну аминокислотную последовательность, относящуюся к сохранившейся антигенной детерминанте PI белка Hi, пептид которого может вызывать образование поликлональных антител, которые узнают Hi in vitro в млекопитающих. Эти PI-специфичные поликлональные антитела могут быть использованы в качестве компонентов тест-наборов для определения Hi в биологических образцах. Пептиды могут содержать, например, аминокислотные последовательности из следующих аминокислот: с 1 по 29, 39-64, 103-137, 165-193, 189- 218, 226-253, 248-283, 307-331, 400-437 и 179-218 зрелого PI- белка Hib MinnA-штамма в соответствии, как показано в табл. 1 (SEQ ID NOS : 1, 12, 3, 4, 5, 6, 7, 9, 13 или 14 и 15 соответственно) или же любая часть или комбинация из них сохраняющая иммуногенность.
С другой стороны, настоящее изобретение включает существенно очищенную форму пептида, содержащего по крайней мере одну аминокислотную последовательность, относящуюся к консервативной последовательности P2-белка, пептид которой способен вызывать у млекопитающих образование поликлональных антител, которые узнают Hi in vitro. Эти P2-специфичные поликлональные антитела могут быть использованы в качестве компонентов тест-наборов для определения Hi в биологических образцах. Пептиды могут содержать, например, аминокислотные последовательности из следующих аминокислот: с 1 по 14, 125-150, 241-265, 263-289, 285-306, 302-319, 314-341 зрелого P2-белка Hib MinnA-штамма, как показано соответственно в табл. 2 (SEQ ID NOS : 16, 23, 28, 29, 30, 31 и 32 соответственно) или же любая часть, или их вариация их, сохраняющая иммуногенность.
Другим воплощением настоящего изобретения является наличие существенно очищенной формы пептида, содержащего по крайней мере одну аминокислотную последовательность, относящуюся к консервативной последовательности P6-белка, пептид которой способен вызывать у млекопитающих образование поликлональных антител, которые узнают Hi vitro. Эти P6-специфичные поликлональные антитела могли бы быть использованы в качестве компонентов тест-наборов для определения H в любых биологических образцах. Пептиды могут содержать, например, аминокислотные последовательности из следующих аминокислот: с 1 по 22, 19-41, 35- 58, 54-77, 73-96, 90-114, и 109-134 зрелого P6-белка Hib MinnA штамма, как показано соответственно в табл. 3 (SEQ ID NOS : 35-41 соответственно) или же любая часть, или комбинация из этого, обладающая иммуногенностью.
Другим воплощением настоящего изобретения является наличие по крайней мере одного PI-пептида, который содержит по крайней мере одну аминокислотную последовательность, относящуюся к иммунодоминантному линейному В-клеточному эпитопу PI-белка. Эти эпитопы можно использовать в качестве антигенов-мишеней в диагностических наборах для определения анти-Hi антител, к примеру, защитных антител. Пептиды могут содержать, например, аминокислотные последовательности из следующих аминокислот: с 39 по 64, 103-137, 165-193, 248-283, 307-331, 400- 437 и 179-218 зрелого PI-белка Hib MinnA- штамма, как показано в табл. 1 (SEQ ID NOS : 12, 3, 4, 7, 9, 13 или 14 и 15, соответственно) или же любая часть, или комбинация их, обладающая иммуногенностью.
Другое воплощение настоящего изобретения включает наличие по крайней мере одного P2-пептида, который содержит по крайней мере одну аминокислотную последовательность, относящуюся к иммунодоминантному линейному B-клеточному эпитопу Р2-белка. Эти эпитопы можно использовать в качестве антигенов-мишеней в диагностических наборах для определения анти-Hi антител, к примеру, защитных антител. Пептиды могут содержать, например, аминокислотные последовательности из следующих аминокислот: с 53 по 81, 148-174, 241-265 и 314-342 зрелого P2-белка Hib MinnA-штамма, как показано в табл. 2 (SEQ ID NOS) : 20, 24, 28 и 32 соответственно) или же любая часть, или комбинация их, обладающая иммуногенностью.
Другим аспектом настоящего изобретения является наличие по крайней мере одного P6-пептида, который содержит по крайней мере одну аминокислотную последовательность, относящуюся к иммунодоминантному линейному B-клеточному эпитопу P6-белка. Эти эпитопы можно использовать в качестве исследуемых антигенов в диагностических наборах для определения анти-Hi антител, к примеру, защитных антител. Пептиды могут содержать, например, аминокислотные последовательности из следующих аминокислот: с 73 по 96, 90-114 и 109-134 зрелого P6-белка Hib MinnA-штамма, как показано в табл. 3 (SEQ ID NOS: 39, 40 и 41 соответственно) или же любая их часть, или комбинация, обладающая иммуногенностью.
Другим аспектом настоящего изобретения является наличие пептидов, которые можно определить как иммунодоминантные Т- клеточные эпитопы PI. Эти пептиды могут быть использованы в качестве аутологичных носителей для PRP, или как носители для аутологичных и гетерологичных B-клеточных эпитопов. Пептиды могут содержать, например, аминокислотные последовательности из следующих аминокислот: с 39 по 64, 226-253, 339-370 и 400-437 и 179-218 зрелого PI-белка Hib MinnA-штамма в соответствии, как показано в табл. 1 (SEQ ID NOS : 12, 6, 10 и 13 или 14 соответственно) или же любая часть, или комбинация их, обладающая иммуногенностью.
Другим свойством настоящего изобретения является наличие пептидов, которые можно определить как иммунодоминантные Т-клеточные эпитопы Р2. Эти пептиды могут быть использованы в качестве аутологичных носителей для PRP, или как носители для аутологичных и гетерологичных В-клеточных эпитопов. Пептиды могут содержать, например, аминокислотные последовательности из следующих аминокислот: с 125 по 150, 193-219, 219-244 и 241-265, зрелого Р2-белка Hib MinnA-штамма, как показано в табл. 2 (SEQ ID NOS : 26, 27 и 28 соответственно) или же любая часть, или их комбинация, обладающая иммуногенностью.
Другим свойством настоящего изобретения является наличие пептидов, которые можно определить как иммунодоминантные Т-клеточные эпитопы Р6. Эти пептиды могут быть использованы в качестве аутологичных носителей для PRP, или как носители для аутологичных и гетерологичных B-клеточных эпитопов. Пептиды могут содержать, например, аминокислотные последовательности из следующих аминокислот: с 19 по 41, 35-58, 73-96 и 109-134, зрелого P6-белка Hib MinnA-штамма в соответствии, как показано в табл. 2 (SEQ ID NOS: 36, 37, 39 и 41, соответственно) или же любая часть, или их комбинация, сохраняющая иммуногенность.
Следующий аспект, следовательно, это то, что настоящее изобретение предлагает иммуногенный конъюгат, включающий синтетический пептид, который имеет аминокислотную последовательность, относящуюся по крайней мере к одному T-клеточному эпитопу по крайней мере одного белка Haemophilus influenzae, привязанного по крайней мере к одному B-клеточному эпитопу.
Другой чертой изобретения является то, что здесь обеспечивается высокоэффективный химический синтетический способ получения синтетических PRP-олигомеров. Этот процесс является комбинацией твердофазного синтеза с использованием полиэтиленгликольмонометилового эфира (PEG) в качестве твердой подложки. Твердофазная подложка содержит большое количество химически активных функциональных групп, в диапазоне от приблизительно 200 до 500 мкмоль/г носителя в сравнении с от 30 до 35 мкмоль реакционных групп на 1 г традиционных подложек, таких как стекло с контролируемым размером пор. Только стехиометрические количества синтетического PRP повторяющегося звена в каждом цикле связывания в сравнении с 5-10-кратным молярным избытком в обычном твердофазном синтезе. Кроме того, настоящий новый способ является быстрым и эффективным в коммерческих целях, в противоположность твердофазному синтезу, который представляет собой трудоемкий, дорогостоящий и занимающий время процесс.
Продукт этого аспекта изобретения включает химически реактивный синтетический PRP олигосахарид, представленный следующей формулой:
где n - целое число, предпочтительно от 3 до 20, и R - связующий фрагмент, определяемый -CH2-((CH2)-m -X, где m - целое число, предпочтительно от 3 до 5, а X - химически реактивная функциональная группа, такая как -CH2NH2, -CH2 SH2 или аминоактивная группа, такая как галоген, метаносульфонил, трифторметаносульфонил, или толуол-сульфонил и т.п. или фотоактивируемая группировка, такая как фенилазид, нитрофенил, бензилфенил и т.п. Реактивная функциональная группа позволяет синтетическому PRP связываться с другими молекулами.
где n - целое число, предпочтительно от 3 до 20, и R - связующий фрагмент, определяемый -CH2-((CH2)-m -X, где m - целое число, предпочтительно от 3 до 5, а X - химически реактивная функциональная группа, такая как -CH2NH2, -CH2 SH2 или аминоактивная группа, такая как галоген, метаносульфонил, трифторметаносульфонил, или толуол-сульфонил и т.п. или фотоактивируемая группировка, такая как фенилазид, нитрофенил, бензилфенил и т.п. Реактивная функциональная группа позволяет синтетическому PRP связываться с другими молекулами.
Следующей чертой изобретения является то, что предложен иммуногенный конъюгат, куда входит синтетический углеводный антиген, связанный с по крайней мере одним синтетическим Т-клеточным эпитопом. Углеводный антиген может быть получен из бактериального материала, в частности синтетический рибозорибитолфосфат (PRP) олигомер.
Следующим воплощением настоящее изобретение обеспечивает иммуногенный конъюгат синтетического PRP и пептида, который способен вызывать образование анти-PRP антител с высоким титром у млекопитающих. Вакцина на основе конъюгата синтетического PRP с носителем имеет в составе вещество следующей формулы
где n и m определены выше и R' - синтетический пептид, который содержит по крайней мере один Т-хелперный эпитоп, включающий последовательность GPKEPFRDYVDRFYK (SEQ ID NO 50) из HIV-I gag-белка P2 или Т-клеточный эпитоп из Hi OMP. Носитель может быть пептидом, который содержит Т-хелперный и В-клеточный эпитопы.
где n и m определены выше и R' - синтетический пептид, который содержит по крайней мере один Т-хелперный эпитоп, включающий последовательность GPKEPFRDYVDRFYK (SEQ ID NO 50) из HIV-I gag-белка P2 или Т-клеточный эпитоп из Hi OMP. Носитель может быть пептидом, который содержит Т-хелперный и В-клеточный эпитопы.
Следующим аспектом является то, что настоящее изобретение включает иммуногеный синтетический гликоконъюгат синтетического PRP-олигомера определенной длины и Hib PI-пептида, содержащего Т- и/или Т-В эпитопы. Размер синтетического PRP-олигомера составляет по крайней мере три повторяющихся звена PRP, но предпочтительным является повтор из шести звеньев. Пептиды могут содержать, например, аминокислотные последовательности из следующих аминокислот: с 39 по 64, 165-193, 189-218, 226-253, 339-370, 4OO-437, PI-белка Hib MinnA-штамма, как показано в табл. 1 (SEQ ID NOS : 12, 4, 5, 6, 10, 13 или 14 соответственно) или же любая часть, или их вариант, сохраняющий иммуногенность.
Один из аспектов настоящего изобретения состоит в том, что оно включает в себя иммуногенный синтетический гликоконъюгат синтетического PRP-олигомера определенной длины и P2-пептида, содержащего T- и/или T-B эпитопы. Размер синтетического PRP- олигомера составляет по крайней мере три повторяющихся звена PRP, но предпочтительным является повтор из шести звеньев. Пептиды могут содержать, например, аминокислотные последовательности из следующих аминокислот: с 125 по 150, 193-219, 219-244 и 241-265 зрелого P2-белка Hib MinnA-штамма, как показано в табл. 2 (SEQ ID NOS : 23, 26, 27 и 28 соответственно) или же любая часть, или вариант из них, проявляющий иммуногенность.
Один из аспектов настоящего изобретения состоит в том, что оно включает в себя иммуногенный синтетический гликоконъюгат синтетического PRP-олигомера определенной длины и P6-пептида, несущего T- и/или T-B-эпитопы. Размер синтетического PRP-олигомера составляет по крайней мере три повторяющихся звена PRP, но предпочтительным является повтор из шести звеньев. Пептиды могут содержать, например, аминокислотные последовательности из следующих аминокислот: с 19 по 41, 35-58, 73-96 и 109-134 зрелого P6-белка Hib MinnA-штамма в соответствии, как показано в табл. 3 (SEQ ID NOS : 36, 37, 39 и 41 соответственно) или же любая часть, или вариант из них, проявляющий иммуногенность.
Другое воплощение настоящего изобретения состоит в том, что предлагает концепцию того, что иммуногенность углеводного антигена, например, синтетического PRP может усиливаться при использовании множественной антигенной пептидной системы (MAP), в составе которой содержатся функциональные T-хелперные эпитопы как носитель для увеличения углеводной плотности внутри синтетического гликопептидного конъюгата. MAP могут содержать, например, (фиг. 1) последовательность
DIVAKIAYGRTNYKYNESDEHKQQLNG
(SEQ ID NO : 26),
которая относится к аминокислотам 193-219 P2-белка Hib MinnA-штамма или их любой фрагмент.
DIVAKIAYGRTNYKYNESDEHKQQLNG
(SEQ ID NO : 26),
которая относится к аминокислотам 193-219 P2-белка Hib MinnA-штамма или их любой фрагмент.
В другом аспекте настоящее внедрение включает конъюгат синтетического PRP-и липопептида (или смесь синтетических PRP и липопептидов), который способен вызывать клеточный и гуморальный иммуногенный отклик против Hi у млекопитающих. Липопептиды могут иметь, например, последовательность Трипальметил
CSSYAKAQVERNAGLIADSVKDNQITSALSTQC
(SEQ ID NO: 43),
которая относится к аминокислотам 165-193 PI-белка Hib MinnA-штамма или его любого фрагмента.
CSSYAKAQVERNAGLIADSVKDNQITSALSTQC
(SEQ ID NO: 43),
которая относится к аминокислотам 165-193 PI-белка Hib MinnA-штамма или его любого фрагмента.
Следующая черта изобретения состоит в том, что оно включает иммуногенные химерные пептидные вакцины, которые состоят из идентифицированных T-B-эпитопов Р1, Р2 или Р6 Hib, и могут быть использованы для иммунизации против Hi-инфекции. Пептиды содержат, например, последовательности I (см в конце текста) или любую часть, или вариант, являющийся иммуногенным. Пептиды изобретения могут также иметь последовательность, соответствующую фрагментам, аналогичным изомерам штаммов Hi, отличных от MinnA.
Предложенные здесь новые синтетические пептиды и конъюгаты могут сформировать вакцину против заболевания, индуцированного патогеном, в частности, Н. influenzae, включающую по крайней мере один синтетический пептид и/или по меньшей мере один синтетический конъюгат, как описывается здесь, и физиологический носитель. Вакцину можно использовать для иммунизации хозяйского организма против патогенного заболевания путем введения ему эффективного количества вакцины. Далее вакцина может включать по крайней мере еще одну иммуногенную и/или иммуностимулирующую молекулу. B изобретении также предлагается метод иммунизации хозяйского организма против Hi-инфекции путем введения эффективного количества вакцины.
Пептиды, описанные в изобретении, могут быть далее модифицированы липидами подобно липопептидам или пришиты к синтетическим PRP (и/или полимеризованы) как синтетические липогликопептидные конъюгаты для производства модифицированных вакцин. Вакцины могут использоваться для иммунизации против инфекции путем введения млекопитающим, например, внутримышечно или перорально, или когда доставляются на слизистую с использованием микрочастиц, капсул, липосом и молекул, имеющих мишень, таких, как токсины и антитела.
Настоящее изобретение включает далее жизнеспособный вектор для доставки антигена, содержащий ген, кодирующий аминокислотную последовательность любого из синтетических пептидов, представленных здесь. Природный вектор может быть вирусного происхождения, например, поксовирусным, аденовирусным, полиовирусным или ретровирусным вектором. Также может быть бактериальным вектором, допустим, из сальмонеллы и микобактерий. Природный вектор может быть включен в вакцину, куда входит также и физиологически приемлемый носитель.
Как отмечено ранее, синтетические пептиды, предлагаемые здесь, могут быть использованы как диагностические реагенты в методах, определения заражения Haemophilus influenzae.
Антитела, которые вырабатываются против любого синтетического пептида и конъюгатов, описываемых здесь, включены в изобретение.
На фиг. 1 показаны аминокислотные последовательности пептидных носителей, использованных в исследовании конъюгатов синтетических PRP и пептидов, о которых здесь говорится. Как следует из фиг. 1, синтетические пептиды, обозначенные там, имеют следующие SED ID NOS :
Пептид - SEQ ID NOS:
HIBP-4 - 51
CHIBPI-4 - 52
COMP2-8 - 53
MAP (COMP2-8) - 54
CPC-6 - 55
PZ4EC - 56
На фиг. 2 представлена предсказанная по общепринятому алгоритму структурного анализа структура OMP P1.
Пептид - SEQ ID NOS:
HIBP-4 - 51
CHIBPI-4 - 52
COMP2-8 - 53
MAP (COMP2-8) - 54
CPC-6 - 55
PZ4EC - 56
На фиг. 2 представлена предсказанная по общепринятому алгоритму структурного анализа структура OMP P1.
Профиль гидрофобности предсказан Hopp [30]. Значения получены из средних для гептапептидных фрагментов и обозначены в центре каждого сегмента.
На фиг. 3 и 4 показаны соответственно предсказанные структуры Р2 и Р6 OMP, полученные по традиционному алгоритму структурного анализа. Верхняя часть, структурный анализ вторичной структуры по локальным средним потенциалам альфа-спирали и бета-слоев по Chou и Fasman [29]. Нижняя часть - профили гидрофобности, предсказанные Hopp и Woods (30). Значения получены из средних для гептапептидных фрагментов и обозначены в центре каждого сегмента.
На фиг. 5 представлено диаграммное воспроизведение иммунодоминантных B- и T-клеточных эпитопов Hib OMP P1;
на фиг. 6 - диаграммное воспроизведение иммунодоминантных B- и T-клеточных эпитопов Hib OMP P2;
на фиг. 7 - диаграммное воспроизведение иммунодоминантных B- и T-клеточных эпитопов Hi OMP Р6;
на фиг. 8 показана активность P6-пептидов в отношении анти-P6 антител морской свинки, крысы и кролика в ELISA;
на фиг. 9 показана активность P1-пептидов в отношении сывороток от трех выздоравливающих человек в ELISA;
на фиг. 10 - активность Р2-пептидов в отношении сывороток от трех выздоравливающих человек в ELISA;
на фиг. 11 представлен пролиферативный ответ у Р1-специфичной мышиной T-клеточной линии на P1-пептиды с иммунодоминантными T-клеточными эпитопами, выделенными звездочкой;
на фиг. 12 представлен пролиферативный ответ в Р2-спе- нифичной мышиной T-клеточной линии на Р2-пептиды с иммунодоминантными T-клеточными эпитопами, выделенными звездочкой;
на фиг. 13 представлена последовательная схема синтеза PRP с использованием PEG как твердой фазы;
на фиг. 14 представлена последовательная схема синтеза PRP-интермедиатов (Br, бензил; Ac, ацетил; ETS, этилтио; AIIye, аллил; Me, метил; DMT, 4,4'-деметоксилтритил; NCE, цианоэтил; MMT, 4-метокситритил;
на фиг. 15 показан иммунный ответ кролика на конъюгат синтетических PRP-димера и тримера с тетанусным токсином;
на фиг. 16 - иммунный ответ кролика на различные типы конъюгатов PRP с носителями;
на фиг. 17 - иммунный ответ кролика на различные типы конъюгатов синтетических пентамеров и гексамеров с HibP1-4 и MAP OMP.
на фиг. 6 - диаграммное воспроизведение иммунодоминантных B- и T-клеточных эпитопов Hib OMP P2;
на фиг. 7 - диаграммное воспроизведение иммунодоминантных B- и T-клеточных эпитопов Hi OMP Р6;
на фиг. 8 показана активность P6-пептидов в отношении анти-P6 антител морской свинки, крысы и кролика в ELISA;
на фиг. 9 показана активность P1-пептидов в отношении сывороток от трех выздоравливающих человек в ELISA;
на фиг. 10 - активность Р2-пептидов в отношении сывороток от трех выздоравливающих человек в ELISA;
на фиг. 11 представлен пролиферативный ответ у Р1-специфичной мышиной T-клеточной линии на P1-пептиды с иммунодоминантными T-клеточными эпитопами, выделенными звездочкой;
на фиг. 12 представлен пролиферативный ответ в Р2-спе- нифичной мышиной T-клеточной линии на Р2-пептиды с иммунодоминантными T-клеточными эпитопами, выделенными звездочкой;
на фиг. 13 представлена последовательная схема синтеза PRP с использованием PEG как твердой фазы;
на фиг. 14 представлена последовательная схема синтеза PRP-интермедиатов (Br, бензил; Ac, ацетил; ETS, этилтио; AIIye, аллил; Me, метил; DMT, 4,4'-деметоксилтритил; NCE, цианоэтил; MMT, 4-метокситритил;
на фиг. 15 показан иммунный ответ кролика на конъюгат синтетических PRP-димера и тримера с тетанусным токсином;
на фиг. 16 - иммунный ответ кролика на различные типы конъюгатов PRP с носителями;
на фиг. 17 - иммунный ответ кролика на различные типы конъюгатов синтетических пентамеров и гексамеров с HibP1-4 и MAP OMP.
Детальное описание изобретения.
Настоящее изобретение относится к идентификации иммуногенных эпитопов OMP Hib, новых конъюгатов синтетических PRP с пептидами и приготовленных таким образом вакцин. Эти новые иммуногенные агенты подготавливаются путем химического синтеза пептидов, имеющих общие антигенные детерминанты с OMP Hib P1, P2 и P6. Пептиды или липопептиды используются либо независимо, либо привязанными к синтетическим PRP-олигомерам в качестве вакцин. Также они могут быть полимеризованы для производства других вакцин. Такие вакцины могут использоваться для иммунизации против в Hi -инфекции, если их вводить млекопитающим, например, внутримышечно или парентерально или доставлять к слизистой оболочке, используя микрочастицы, капсулы, липосомы и молекулы имеющие мишень, такие как токсины и антитела.
Первоочередные черты изобретения, которые наряду с последующими примерами служат для объяснения принципов внедрения. Для ясности изложения, но не для ограничения изобретение разделено на следующие пункты:
(i) предсказание эпитопов и пептидный синтез;
(ii) идентификация и характеристика иммунодоминантных B-клеточных эпитопов OMP Hib P1, P2 и P6 с использованием синтетических пептидов;
(iii) идентификация и характеристика иммунодоминантных T-клеточных эпитопов OMP Hib Р1, Р2 и Р6 с использованием синтетических пептидов;
(iv) иммуногенность OMP пептидов Hib;
(v) твердофазный углеводный синтез PRP-олигомеров с использованием PEG как подложки;
(vi) конъюгация синтетических PRP-олигомеров с пептидами и иммунохимическая характеристика гликоконъюгатов;
(vii) использование Hi конъюгатных PRP-пептидных вакцин.
(i) предсказание эпитопов и пептидный синтез;
(ii) идентификация и характеристика иммунодоминантных B-клеточных эпитопов OMP Hib P1, P2 и P6 с использованием синтетических пептидов;
(iii) идентификация и характеристика иммунодоминантных T-клеточных эпитопов OMP Hib Р1, Р2 и Р6 с использованием синтетических пептидов;
(iv) иммуногенность OMP пептидов Hib;
(v) твердофазный углеводный синтез PRP-олигомеров с использованием PEG как подложки;
(vi) конъюгация синтетических PRP-олигомеров с пептидами и иммунохимическая характеристика гликоконъюгатов;
(vii) использование Hi конъюгатных PRP-пептидных вакцин.
Предсказание эпитопов и пептидный синтез.
Чтобы картировать иммунодоминантные T-клеточные или B-клеточные эпитопы Hi OMP, 13, 17 и 7, перекрывающиеся пептиды, охватывающие большую часть последовательностей Р1, Р2 и Р6-белков (табл. 1, 263), соответственно были синтезированы с использованием t-Вос твердофазного пептидного синтеза, как подробно описано в примере 12. Длина пептидов была выбрана на основании высокого показателя гидрофильных бета-слоев, оцененного из предсказательного анализа вторичной структуры согласно принятым алгоритмам (29-31) (фиг. 2, 3 и 4). Вероятно эти пептиды Van экспонированы на поверхности и являются антигенными. Пептиды длиной более 25 остатков были выбраны, чтобы маскировать нативные эпитопы как предлагалось в работе Regenmortel [32]. Иногда в целях сайт-специфической конъюгации к цепи добавлялся дополнительный цистеиновый остаток либо к N-концу, либо к C-концу пептида.
Идентификация и характеризация иммунодоминантных эпитопов OMP Hi Р1, Р2 и Р6 с использованием синтетических пептидов.
Чтобы идентифицировать иммунодоминантные B-клеточные эпитопы OMP Hib кроликов, морских свинок и мышей различных гаплотипов (H-2, H-2, H-2, H-2, H-2, H-2), иммунизировали очищенным Р1, Р2 или P6-белком в присутствии адъюванта Фрейнда. После первичной и вторичной иммунизации у всех животных развивался сильный и специфичный ответ анти-OMP антителами как было проверено в Р1-, Р2- и Р6-спепифичном ELISA (табл. 4, 5, 6) и иммуноблотном анализе. Как ранее показано Granoff Munson [6] , кроличьи Анти- PI, анти-Р2 и анти-P6 антитела постоянно защищают новорожденных крыс от заражения неубитыми Hib. Анти-Р2 антитела морской свинки также обладали защитными свойствами в этой модели.
Чтобы картировать линейные B-клеточные эпитопы OMP Hib, перекрывающиеся пептиды, охватывающие большую часть последовательностей Р1, Р2 и Р6, были нанесены на планку ELISA и протестированы с различными анти-P1, анти-Р2 и анти-Р6 антисыворотками, как описано в примере 17. На фиг. 5, 6, 7 суммированы результаты. Было найдено, что иммунодоминантные линейные B-клеточные эпитопы Р1 локализованы среди пептидных последовательностей, относящихся к аминокислотным остаткам 39-64, 103-137, 165-193, 248-283, 307-331, 400-437 и 179-218 зрелого P1-белка Hib MA-штамма (см. табл. 1). Иммунодоминантные линейные B-клеточные эпитопы Р2 локализованы среди пептидных последовательностей, относящихся к аминокислотным остаткам 53-81, 148-174, 241-265 и 314-342 зрелого Р2-белка Hib MA штамма (см. табл. 2). Аналогично, P6-пептиды, содержащие иммунодоминантные линейные B-клеточные эпитопы есть аминокислотные остатки 73-96, 90-114 и 109-134 зрелого Р6-белка Hib MA-штамма (см. табл. 3). Интересно, что сыворотки трех выздоравливающих человек стабильно реагировали с Р1 и Р2 иммунодоминантными эпитопами, описанными выше (фиг. 9 и 10). Кроме того, штамм-специфичные протективные в отношении Р1 B-клеточные эпитопы были картированы в районе, относящемся к 165-193 остаткам P1-белка. Эти результаты свидетельствуют, что B-клеточные эпитопы, описываемые выше, могут использоваться как антигены-мишени в диагностических наборах для определения анти-Hi антител в биологических жидкостях.
Идентификация и характеристика иммунодоминантных T-клеточных эпитопов OMP Hib Р1, Р2 и Р6 с использованием синтетических пептидов.
Специфичные к OMP Hib T-клеточные эпитопы были определены с использованием Р1, Р2 и Р6 пептидов и T-клеточных линий из панели с различных мышей, иммунизированных нативными OMP. Лимфоцитные пролиферативные ответы OMP-специфичных Т-клеточных линий на перекрывающиеся Р1-пептиды (13 пептидов), Р2-пептиды (17 пептидов), и Р6- пептиды (7 пептидов) были определены в обычном анализе пролиферации, как описывается в примере 19. Результаты (фиг. 11 и 12 и табл. 7) показали, что определенные синтетические пептиды только вызывают пролиферативный ответ и узнавание E-клеточных эпитопов, рестриктированных MHC. Синтетические пептиды, которые относятся к остаткам 33-64, 226-253, 339-370 и 400-437 Р1; остаткам 125-150, 193-219, 219-244 и 241-264 Р2; остаткам 19-41, 35-58, 73-96 и 109-134 Р6, при представлении в составе соответствующего мышиного MHC, являются, как показано, высокостимуляторными для всех соответствующих OMP-специфичных мышиных T-клеточных линий. Следовательно, эти иммунодоминантные T-клеточные эпитопы могут быть использованы как аутологичные носители для PRP и/или OMP B- клеточных и T-клеточных эпитопов для увеличения их иммуногенности.
Иммуногенность OMP пептидов Hib.
Чтобы определить, могут ли синтетические OMP-пептиды служить возможными вакцинами, на иммуногенность оценивались раздельно свободные пептиды и KLH-конъюгаты. Кроличьи антипептидные сыворотки были тестированы на реактивность в отношении иммунизирующих пептидов и их родительских белков в ELISA и иммуноблотном анализе. Как показано в табл. 8, все анти-PI пептид-сыворотки, кроме тех, которые получены в ответ на HIBPI-8 или конъюгат HIBPI-8-KIH, специфичны по отношению к соответствующим иммунизирующим пептидам в ELISA. Индукция высокого титра пептидспецифичных lgG-антител свободными пентидами свидетельствует в пользу того, что пептид включает и функциональную T-хелперную детерминанту и B-клеточный эпитоп(в). В дополнение, анти-HIBPI-4, анти-HIBPI-5, анти-HIBPI-7, анти-HIBPI-9, анти-HIBPI-10, анти-NIBPI-11, анти-HIBPI-14-антитела узнавали Р1, во всех использованных методах, которые указывают на антигенность этих районов, и свободны при взаимодействии с антителами. Поскольку для этих пептидов показано, что они содержат потенциальные T-хелперные детерминанты и пептид-KLH-конъюгаты индуцируют сильный lgG ответ у кроликов, очевидно, что они могут действовать как антигены в приготовлении вакцин.
Представляло интерес определить, будут ли P1 Hib -специфичные антитела кроссреагировать с нативным Р1 из неопределяемого штамма Н.influenzae. Кроличьи антитела, образующиеся на синтетические пептиды HIBPI-1, HIBPI-3, HIBPI-5, HIBPI-6, HIBPI-7, HIBPI-9, HIBPI-12, HIBPI-13, узнают Р1-белок из дефинированных и недефинированных культур Н. influenzae. Эти результаты предполагают, что пептиды, относящиеся к аминокислотным остаткам 39-64, 103-137, 165-193, 248-283, 307-331, 400-437 и 179-218 зрелого Pi-белка, содержат высококонсервативные среди дефенированных и недефинированных культур Н. influenzae эпитопы.
Антитела кролика, вырабатывающиеся на конъюгат Р2-пептида и KIH, были исследованы на активность против нативных Р2 в Р2-специфичных ELISA и в иммуноблоттинге. Хотя все пептидспецифичные сыворотки, кроме сывороток, вырабатывающихся на HIBP2- 26-КIH- и ОМР2-13 KIH конъюгаты узнавали Р2 в иммуноблотах, только для Porin-1, ОМР2-5, -7, -8, -10-12 и CHIBP2 пептид конъюгатов с KLH было найдено, что они вызывают образование антител, которые кросс-реагируют с нативным Р2 в Р2-спепифичном ELISA (табл. 9). Все неконъюгированные пептиды, кроме Porin -1 и HIBP2-26, эмульсифицированные полным адъювантом Фрейнда, вызывали сильный пептид-специфичный ответ антителами против Р2 в иммуноблотах (табл. 3). Также, антисыворотка на неконъюгированные пептиды ОМР2-5, -8, -10, 11, -12 и -13 строго реагировала с очищенным Р2 в Р2-спепифичном ELISA. Эти данные указывают на то, что эти пептиды несут потенциальные функциональные T-хелперные эпитопы и B-клеточные эпитопы. Далее, Р2, выделенный из трех различных неидентифицируемых культур SB30, SB32 SB33, был использован как мишень-антиген в иммуноблотах. Кроличьи анти- Porin-1, OMP2-5, -8, -8, -10, -11, -12 и -13 антисыворотки четко реагировали с Р2 из всех неопределяемых штаммов. Эти результаты предполагают, что пептиды, относящиеся к аминокислотным остаткам 1-19, 125-150, 183-219, 241-265, 263-289, 285-306 и 302-319 зрелого Р2-белка, содержат высококонсервативные среди дефинированных и недефинированных культур Н. influenzae эпитопы.
Антисыворотка кролика, полученная на Р6-пептиды, была проверена на активность против Р6 в Р6-специфичном ELISA и в иммуноблотном анализе. Все пептидспецифичные антисыворотки, кроме тех, которые образовались в ответ на Р6-4, узнавали нативный Р6 в Р6-специфичном ELISA и обнаруживали кроссреактивность и с определяемым и неопределяемым Р6 в иммуноблотах (табл. 10). Эти данные свидетельствуют о том, что Р6-пептиды несут потенциальные T-хелперные эпитопы и иммуногенные B-клеточные эпитопы. Далее эти результаты подтверждают, что Р6-белок высококонсервативен среди дефинированных и недефинированных штаммов H.influenzae. Следовательно, эти консервативные эпитопы Р1, Р2 и Р6 можно использовать либо по отдельности, либо в комбинации для приготовления кроссреагирующих синтетических вакцин.
Пептиды, описанные выше, могут в дальнейшем быть полимеризованы или модифицированы липидами подобно липопептидам или привязаны к синтетическому PRP как синтетический гликопептид, либо липогликопептидный конъюгат для производства дополнительных вакцин. Эти вакцины могут использоваться для иммунизации против Hi-инфекции при введении их млекопитающим, например, внутримышечно или парентерально, или когда доставляются на слизистую, с использованием микрочастиц, капсул, липосом и молекул, имеющих мишень, таких, как токсины и антитела.
Дальнейшие эксперименты были произведены, чтобы определить, могут ли синтетические пептиды, несущие идентифицированные иммунодоминантные Т- и B-клеточные эпитопы из либо P1, либо P2 или P6, сшитые в тандеме, вызывать сильный ответ в виде пролиферации защитных от Hi- инфекции антител.
Пептиды, имеющие аминокислотную последовательность II (см. в конце описания).
(SEQ ID NOS : 42-49 соответственно) были синтезированы, очищены и использованы для иммунизации кроликов в присутствии CFA или алюминия. Итоги подведены в табл. 11. Все антипептидные сыворотки достоверно реагировали с соответствующими иммунизирующими пептидами, но не все химерные пептиды вызывали образование антител на нативные OMP. Наилучшими иммуногенами являлись 1P13-2Р8 и 2Р6-IРI3, которые вызывали образование антител, узнающих нативные Р1 и Р2-белки, при введении с алюминием. Поскольку эти пептиды содержали консервативные среди штаммов Hi-эпитопы, они могут быть использованы как дополнительные антигены или модифицированные как липопептиды, или сшитые с синтетическими PRP-олигомерами в качестве вакцин. Эти вакцины можно использовать для иммунизации против Hi-инфекции при введении их млекопитающим, например, внутримышечно или парентерально, или, когда доставляются на слизистую, с использованием микрочастиц, капсул, липосом и молекул, имеющих мишень, таких, как токсины и антитела.
Синтез PRP-олигосахаридных фрагментов с использованием PEG.
Синтетический PRP приготовлен путем комбинации жидкотвердофазного синтеза и высокоэффективного фосфорамидитного метода, как схематически показано на фиг. 13 и 14. Это новый процесс, в котором используется полиэтиленгликоль монометиловый эфир (PEG) в качестве твердого носителя. Твердофазный носитель содержит большое количество химически активных функциональных групп в диапазоне от приблизительно 200 до 500 мкмоль/г носителя в сравнении с от 30 до 35 мкмоль реакционных групп на грамм традиционных носителей, таких, как стекло с контролируемым размером пор только стехиометрические количества синтетического PRP повторяющегося звена в каждом цикле связывания, сравнивая с 5-10-кратным молярным избытком в обычном твердофазном синтезе. Далее PEG растворим в реакционных растворах, так что эффективность связывания в каждом цикле 35-98%. В конце цикла PEG-связанный, синтезированный PRP, осаждается эфиром, чтобы убрать все побочные продукты. Для синтетического PRP-гексамера конечный выход составил около 70%. Таким образом, настоящий синтез является очень быстрым, недорогим и простым для масштабирования в коммерческих целях в противоположность твердофазному синтезу, который представляет собой трудоемкий, дорогостоящий и занимающий время процесс.
Далее процесс синтеза описывается более подробно. PRP-мономер для инициации полимеризации представляет собой соединение, формула которого
где Вn и DMT это бензил и диметокситритиловые группы соответственно. Этот мономер привязан к PEG, как описано в примере 10, детритилирование производится трихлоруксусной кислотой (TCA) и затем связывается с еще одним PRP-мономером для элонгации цепи, как представлено формулой
Конечное соединение затем детритилируется TCA. В каждом цикле элонгация цени сопровождается связыванием детритилированной цепи в присутствии катализатора, главным образом, тетразола. После каждого шага связывания происходит окисление фосфора окислительным агентом, обычно t-бутил гидроперекисью. Цикл синтеза (стадии детритилирования, связывания, окисления) повторяется до тех пор, пока не получен олигомер нужной длины. Терминация PRP-олигомера происходит в результате реакции с терминатором цепи, имеющего следующую формулу:
где m-целое число, обычно от 4 до 6 и MMT-монометокситритил. После терминации цепи конечный олигомер на PEG-носителе, который является одной из характеристик данного изобретения, снимается с твердого носителя, главным образом, путем аммонолиза. Получаемый материал представлен следующей формулой:
где n- это целое число, обычно от 3 до 20 и m-целое число, обычно от 4 до 6. Вn-бензил, MMT-монометокситритил. Вещество ассоциировано с заряженным ионом. Главным образом, это ион аммония, как на иллюстрации, или замещенный аммоний.
где Вn и DMT это бензил и диметокситритиловые группы соответственно. Этот мономер привязан к PEG, как описано в примере 10, детритилирование производится трихлоруксусной кислотой (TCA) и затем связывается с еще одним PRP-мономером для элонгации цепи, как представлено формулой
Конечное соединение затем детритилируется TCA. В каждом цикле элонгация цени сопровождается связыванием детритилированной цепи в присутствии катализатора, главным образом, тетразола. После каждого шага связывания происходит окисление фосфора окислительным агентом, обычно t-бутил гидроперекисью. Цикл синтеза (стадии детритилирования, связывания, окисления) повторяется до тех пор, пока не получен олигомер нужной длины. Терминация PRP-олигомера происходит в результате реакции с терминатором цепи, имеющего следующую формулу:
где m-целое число, обычно от 4 до 6 и MMT-монометокситритил. После терминации цепи конечный олигомер на PEG-носителе, который является одной из характеристик данного изобретения, снимается с твердого носителя, главным образом, путем аммонолиза. Получаемый материал представлен следующей формулой:
где n- это целое число, обычно от 3 до 20 и m-целое число, обычно от 4 до 6. Вn-бензил, MMT-монометокситритил. Вещество ассоциировано с заряженным ионом. Главным образом, это ион аммония, как на иллюстрации, или замещенный аммоний.
Боковые защитные группировки удаляются гидрогенированием палладием на древесном угле в присутствии воды/ацетиловой кислоты/ t-бутилового спирта как описывается в примере 10. Конечный олигомер может быть очищен стандартными методами, обычно, комбинированием гель-ион-обменной хроматографией.
Как описано выше, при связывании веществ в X6 (фиг. 14) на последнем шаге перед терминацией цепи очень легко превратить синтезированный PRP-олигомер в соединение, несущее химически активные группы, воспроизведеном следующей формулой:
где n- это целое число обычно от 3 до 20 и R-линкерный фрагмент, определяемый как -CH2- (CH2)m-X), где m - целое число обычно от 3 до 5 включительно и X-химически активная функциональная группа подобно- CHY2NH2, - CH2 SH2, или аминореактивные группы, как галоген, метансульфонил, трифторметансуфонил или толуенсульфонил или фотоактивируемые группы, как фенилазид, нитрофенил, бензилфенил и им подобные.
где n- это целое число обычно от 3 до 20 и R-линкерный фрагмент, определяемый как -CH2- (CH2)m-X), где m - целое число обычно от 3 до 5 включительно и X-химически активная функциональная группа подобно- CHY2NH2, - CH2 SH2, или аминореактивные группы, как галоген, метансульфонил, трифторметансуфонил или толуенсульфонил или фотоактивируемые группы, как фенилазид, нитрофенил, бензилфенил и им подобные.
Соединение, в котором присутствует функциональная группа, может быть сформировано как конъюгат, что является одной из главных черт изобретения, конъюгат представлен формулой:
где n - целое число, обычно от 3 до 20, и m - целое число, обычно от 3 до 5, и R' - это (CH2-носитель), где Y-линкерная молекула, которая может быть m -малеимидибензоил-N-гидроксисукциимид и носитель- Hi -пептид или MAP-система из того. Конъюгат будет ассоциирован с заряженным ионом. Главным образом, ионом Na, как на иллюстрации.
где n - целое число, обычно от 3 до 20, и m - целое число, обычно от 3 до 5, и R' - это (CH2-носитель), где Y-линкерная молекула, которая может быть m -малеимидибензоил-N-гидроксисукциимид и носитель- Hi -пептид или MAP-система из того. Конъюгат будет ассоциирован с заряженным ионом. Главным образом, ионом Na, как на иллюстрации.
Очевидно, что существует множество путей получения синтетического PRP. Технология, которая включает те, что известны, например Публикации Европейского Патентного Бюро 0 320 942 [28] и 0 276 516 [27] так же, как и те, которые могли использоваться в связи с настоящим изобретением, лежат в рамках изобретения.
Иммунохимическая характеристика синтезированного PRP-олигосахарида, конъюгированного с пептидом, содержащим T-хелперный эпитоп(ы).
Пептиды, которые можно использовать согласно изобретению, включают любой пептид, который сохраняется при введении молодым млекопитающим, и может служить эффективным T-клеточным эпитопом, например, Р24Е, человеческий T-клеточный эпитоп из gag-белка р24 HIV-1 (фиг. 1). В данном случае были использованы белки внешней мембраны Hib, технология конъюгации подробно описана в примерах 11 и 13. Чтобы определить минимальное число мономеров, требующихся для генерации анти-PRP lgG ответа, синтезированные олигомеры (димер и тример) привязывались к тетанусному токсину и делали инъекцию гликоконъюгата в присутствии алюминия кроликам. Результаты, представленные на фиг. 15, показывают, что для иммуногенности систетический олигомер должен состоять по крайней мере из трех мономеров.
Согласно изобретению кандидаты в конъюгатные вакцины: на основе полностью синтетических PRP-олигомеров были получены путем связывания синтезированных PRP-олигомеров с хорошо охарактеризованными синтетическими T-клеточными эпитопами Hib OMP через цистеиновый остаток, добавляемый либо к N-концу, либо C- концу пептидов, например пептида HIBPI-4 (остатки 165-193 Р1-белка), который был идентифицирован как Hib-штамм-специфичный B-клеточный защитный эпитоп и по крайней мере один функциональный T-хелперный эпитоп.
Чтобы получить эффективную PRP-пептид конъюгатную вакцину, поскольку несколько факторов могут действовать на иммуногенность углевода, антиген должен быть тщательно проверен. К этим факторам относятся: (i) длина цепи олигосахарида; (ii) сайт конъюгации сахаридной части по отношению к Т-клеточным эпитопам; (iii) плотность углеводного антигена на пептиде; (iv) методология конъюгации, которая влияет на стабильность гликоконъюгата; (v) необходимость линкеров или спейсеров между углеводной частью и пептидным носителем для оптимальной антигенной презентации и процессинга. С этими целями два пептида, HIBPI-4 CHIBPI-4 (фиг. 1), которые различались дополнительными цистеиновыми остатками, добавленными к N-концу (HIBPI-4 и SEQ ID NO: 51) и к C-концу (CHIBPI-4 - SEQ ID N0:52), соответственно были синтезированы, очищены и использованы как носители T-клеточных эпитопов для проверки эффекта ориентации сахаристой части относительно T-клеточного эпитопа на конструированную иммуногенность. Синтетический PRP-тример использовался как углеводный антиген. Были приготовлены два PRP-пептидных конъюгата (PRP-CHIBPI-4 и НIВРI-4-PRP) и инъектированы кроликам в присутствии алюминия. После трех иммунизаций исследовали титры анти-PRP и антипептидных IgG антитела кроличьей антисыворотки. Оба конъюгата вызывали сильное образование антипептидных и анти-PPP антител в ответ, но только синтетический HIBPI-4-PRP вызывал анти-PRP lqG ответ. Эти результаты предполагают, что ориентация сахаристой части относительно T-клеточного эпитопа может значительно влиять на хозяйский иммунный ответ на углеводный антиген. Чтобы определить все ли пептиды, несущие функциональные T-клеточные эпитоп(ы) могут эффективно представлять синтезированные PRP-олигомеры иммунной системе, еще два пептида (СОМР2-8- SEQ ID NO: 53 и Р24ЕС ID N0:56), о которых известно, что они несут функциональные T-клеточные эпитоп(ы), были конъюгированы с синтетическим PRP-тримером. Гликопептидные конъюгаты были адсорбированы на алюминии и ими иммунизировали кроликов. Результаты представлены в табл. 12. Оба гликопептидных конъюгата (СОМР2-8-PRP и P24EC-PRP) вызывали образование анти-PRP lgG антител.
Чтобы определить эффект углеводной плотности на иммунногенность гликопептидных конъюгатных вакцин, синтезированный PRP-тример был конъюгирован с множественной антигенной пептидной системой (MAP), содержащей восемь разветвленных ОМР2-8 пептидов (остатки 193-219 Р2-белка) (фиг. 1 - SEQ ID N0:54). Хотя для конъюгации были доступны девять цистеиновых остатков, было обнаружено только пять PRP-тримеров с одной MAP-молекулой. Тем не менее после трех инъекций по 50 мг синтетического гликопептидного конъюгата в присутствии алюминия, у обоих кроликов наблюдался сильный анти-PRP lgG-ответ. Титр анти-PRP IgG был в четыре раза выше, чем полученный с конъюгатом линейного пептида с PRP (табл. 12). Более того ответ антипептидными и анти-Р2 антителами был на 1-2 порядка выше, чем таковой, полученный на конъюгат линейного пептида с PRP. Дальнейший анализ результатов, представленных на фиг. 16, показал, что MAP Hib, конъюгированные с синтетическими PRP-олигомерами, хороши в качестве вакцин, на которые образуются высокие титры анти-PRP lqG антител, сравнимые с полученными на нативный PRP, пришитый к дифтерийному токсину или Р1 или Р2-белкам.
Чтобы определить влияет ли длина углеводного мономера на иммуногенность углеводного антигена в гликоконъюгате, синтезированные PRP-димер, тример, пентамер, гексамер и нативный PRP (молекулярная масса 30 кДа) связывались или к линейному пептиду HIBPI-4 или ОМР2-8 MAP соответственно. Удивительно, что оба пептида, конъюгированные с нативным PRP, не вызывали образования анти-PRP IgG антител. Напротив, PRP-пентамер и гексамер, конъюгированные с линейным пептидом НIВРI-4 вызывали стойкое и продолжительное образование анти-PRP lqG антител в ответ (фиг. 17). ОМР2-8 MAP, конъюгированные с синтетическим PRP-гексамером, также оказались высокоиммуногенными. Синтетический PRP-димер был неиммуногенным, что согласовалось с результатами, полученными ранее.
Использование технологии конъюгации синтетических гликопептидов.
В основных чертах настоящего изобретения технология гликоконъюгации в общем может использоваться для получения конъюгатных вакцин против патогенных инкапсулированных бактерий. Таким образом, технология гликоконъюгации в настоящем изобретении может применяться в вакцинации, чтобы обеспечивать защиту от инфекции от любого микроорганизма, у которого выражены возможные протективные полисахаридные антигены, включая Haemophilus influenzae, Streptococcus pneumoniae, Escherichia coli, Neisseria meningidis, Salmonellantyphi, Streptococcus mutans, Cryptococcus neoformans, Klebsiella, Staphilococcus aureus и Rseudomonas aerogenosa.
Как частное применение, технология конъюгации синтетических гликопептидов может использоваться для получения вакцин, вызывающих образование антител на белки или олигосахариды. Такие вакцины можно использовать, например, для обеспечения иммунности в отношении опухолевых клеток или для получения антиопухолевых антител, которые могут быть конъюгированы с химотерапевтическими или биоактивными агентами.
Понятно, что применение методик настоящего изобретения не выходит за пределы возможностей тех, кто владеет обычной технологией в данной области. Продукты и методы их получения и использования в настоящем изобретении приводятся в последующем разделе "примеры".
Также ясно, что в рамках этой разработки существуют разнообразные варианты или функционально эквивалентные варианты указанных выше пептидов. Термины "варианты" или "функционально эквивалентные варианты", использованные выше, означают, что если пептид модифицирован путем добавления, удаления или изменения одного или больше аминокислотных остатков в любом отношении и тем не менее действует сходным образом с таковыми Р1, Р2 и Р6-пептидами для любого штамма Haemophilus influenzae, то он попадает в объем изобретения.
Приведенные аминокислотные последовательности этих пептидов (табл. 1 - 3 и 11), а также любого подобного пептида, могут быть легко синтезированы на коммерчески доступных пептидных синтезаторах, таких как Applied Biosystems Model 430А, или могут быть получены с использованием техники рекомбинантной ДНК.
Описание, в общем, раскрывает настоящее изобретение. Более полное понимание можно получить, обратившись к последующим примерам. Эти примеры описываются только в иллюстративных целях и не ограничивают рамок рассмотрения изобретения. Изменения по форме и эквивалентные замены не исключаются, если это диктуется обстоятельствами и является подходящим. Несмотря на применение здесь специфических терминов, эти термины применяются в целях описательных, а не ограничительных. Иммунологические методы могут быть не абсолютно четко описаны здесь в описании, но они полностью соответствуют обычным техническим умениям в данной сфере.
Пример 1.
Получение 2,3,4-три-0-бензил-1-0-[2,5,-ди-0-бензил- -β-D- рибофуранозил] -5-0-(4,4'-диметокситритил)-D-рибитол (соединение 14, фиг. 14).
При комнатной температуре 4, 4'-диметокситритилхлорид (6.2 г) добавили к 200 мл раствора дихлорметана, содержавшего 10.2 г 2, 5,-ди-0-бензил- -β-D- рибофуранозил-2, 3, 4-три 0-бензил-D-рибитола (соединение 13, фиг.14), полученного из D-рибозы: через 12 промежуточных продуктов, как описано ранее [33-36] , пиридин (3.4 мл) и 4-диметиламинопиридин (860 мг). После перемешивания 18 - 24 часов реакционную смесь вылили в насыщенный раствор бикарбоната натрия. Водную фазу экстрагировали дихлорметаном, высушивали и растворители выпаривали. Продукт очищали хроматографией на силикагеле, его структура подтверждена ЯМР.
Пример 2.
Получение-2,3,4-три-0-бензил-D-рибитол[2,5-ди-0-бензил-3- 0-)сукцинил- -β-D -рибофуранозил]-5-0-(4,4'-диметокситритил)-D- рибитола (соединение 16, фиг. 13).
К раствору 1.34 г продукта из примера 1 в безводном пиридине (4.5 мл) был добавлен янтарный ангидрид (390 мг) и 4-диметиламинопиридин (240 мг). Реакционную смесь перемешивали на водяной бане от 50 до 80oC от 3 до 10 ч. После добавления воды реакционную смесь концентрировали на роторном испарителе. Хроматографией на колонке силикагеля с использованием дихлорметана: метанола: триэтиламина в отношении 95:5:2.5 (об/об/об) получен продукт в виде триэтиламмониевой соли, структура подтверждена ЯМР.
Пример 3.
Получение рибозилрибитолфосфорамидита.
К раствору соединения 16 (1.2 г в 5 мл безводного диоксана) были добавлены N,N-диизопропилэтиламин (1.4 мл) и 2-циано-этил- N,N-диизопропил хлорофосфорамидит (640 мл). После перемешивания 1- 3 ч, дополнительное количество N, N-диизопропилэтиламина (430 мл) и 2-цианоэтил-N,N-диизопропил хлорофосфорамидита (250 мл) было добавлено. Реакционная смесь была разбавлена в три раза дихлорметаном и экстрагирована равным объемом IM триэтиламмония бикарбоната, рассолом и высушена безводным сульфатом натрия. Продукт был очищен на силикагеле и его структура была подтверждена ЯМР.
Пример 4.
Получение I-t-бутилдиметилсилилокси-6-циано-гексана (соединение Х2, фиг. 14)
Цианид натрия (1.2 г) растворили в диметилсулфоксиде и нагревали 30 мин при 90oC. Твердый I-t-бутилдиметилсилилокси- 6-бромгексан (5.8 г, соединение XI) полученный методом, описанным ранее [37], добавляли к раствору цианида натрия. После нагревания при 120-130oC в течение 20-180 мин, реакционную смесь выливали в ледяную воду и водную фазу экстрагировали эфиром, промывали рассолом, высушивали и концентрировали. Продукт перегоняли при 0.5 Topp (мм рт.ст.) и 107oC для получения бесцветного масла. Масс-спектрометрией высокого разрешения для C12H24ONSi получено 226.1624 при вычисленном 226.1627.
Цианид натрия (1.2 г) растворили в диметилсулфоксиде и нагревали 30 мин при 90oC. Твердый I-t-бутилдиметилсилилокси- 6-бромгексан (5.8 г, соединение XI) полученный методом, описанным ранее [37], добавляли к раствору цианида натрия. После нагревания при 120-130oC в течение 20-180 мин, реакционную смесь выливали в ледяную воду и водную фазу экстрагировали эфиром, промывали рассолом, высушивали и концентрировали. Продукт перегоняли при 0.5 Topp (мм рт.ст.) и 107oC для получения бесцветного масла. Масс-спектрометрией высокого разрешения для C12H24ONSi получено 226.1624 при вычисленном 226.1627.
Пример 5.
Получение 7-амино-1- t-бутилдиметилсилилокси-6-циано-гептана (соединение 13, фиг. 14).
К раствору алюмогидрида лития (600 г, AIdrich) в эфире (50 мл) по каплям добавляли продукт (3.7 г) из примера 4 в эфире (50 мл). После 1-3 ч смесь перелили в воду и перемешивали 30 мин. Нерастворимый гидроксид алюминия отфильтровали через цеолитную прокладку, водную фазу экстрагировали трижды эфиром. Эфирный экстракт промывали раствором соли, обезвоживали и концентрировали. Неочищенный продукт перегоняли при 0.25 Topp и 82oC. Масс-спектрометрией высокого разрешения для C13H31ONSi получено 245.2175 при вычисленном 245.2159.
Пример 6.
Получение (N-Монометокситритил)-7-амино-I-t-бутилдиметилсилилокси- 6-гептана (соединение Х4 фиг. 14).
Монометоксиметил хлорид (3.7 г, AIdrich) добавляли к раствору продукта (2.3 г) из примера 5 в дихлорэтане (40 мл). После перемешивания при комнатной температуре в течение 10-24 ч, раствор перелили в насыщенный раствор бикарбоната натрия. Водную фазу экстрагировали дихлорметаном. Дихлорметановый экстракт промывали раствором соли и высушивали. Растворитель испаряли и продукт был очищен хроматографией на силикагеле. Очищенное соединение X4 анализировали на масс-спектрометре высокого разрешения. C33H47O2NSi получено 517.3355 при вычисленном 517.3376.
Пример 7.
Синтез (N-Монометокситритил)-7-аминогептанола (соединение 15, фиг. 14).
IМ раствор тетрабутиламмоний фторида (25.8 мл) медленно добавляли к раствору соединения 14 (4.3 г) в тетрагидрофуране (46 мл). После перемешивания при комнатной температуре в течение 4-18 ч раствор перелили в 100 мл воды и перемешивали еще 30 мин. Органическую фазу экстрагировали раствором соли и высушили. Неочищенный продукт затем был очищен на силикагеле. Очищенный продукт был анализирован на масс-спектрометре высокого разрешения. C27H33O2N, получено 403.2514 при вычисленном 403.2511.
Пример 8.
Получение (N-Монометокситритил)-7-аминогептил (2-цианоэтил)- N-диэтилфосфорамидита (соединение X6, фиг. 14).
К раствору соединение X5 (240 мг) в диоксане (10 мл) был добавлен диизопропилэтиламин (840 мкл) и цианоэтил-N, N-диэтилфосфорамидит (270 мкл). После перемешивания в течение 1 ч, реакционная смесь была разбавлена дихлорметаном и ее промывали IM раствором триэтиламмония бикарбоната и, наконец, раствором соли. После высушивания и концентрирования осадок был очищен хроматографией на силикагеле. Продукт был анализирован на масс-спектрометре высокого разрешения. C36H50N3O3 получено 603.3620 при вычисленном 603.3620. Структура продукта также подтверждена ЯМР-анализом.
Пример 9.
Получение сукцинилрибозилрибитол-PEG- (фиг. 14).
К раствору соединения 16 (1.8 г) в дихлорметане (18 мл) были добавлены N-гидроксибензотриазол (295 мл) и дициклогексилкарбодиимид (450 мл). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре. После 2-8 ч дициклогексимочевину удаляли фильтрацией. Фильтрат, N-метилимидазол (522 мкл) и диизопропилэтиламин (600 мкл) были добавлены к полиэтиленгликольмонометиловому эфиру, PEG (средняя Мг 5000; 2.1 г, Fluka). Смесь перемешивали ночь под аргоном при комнатной температуре. Функциональный PEG был осажден холодным эфиром и отфильтрован. Емкость носителя была определена спектрофотометрически по методу Gait и др [36] и составила около 200 ммоль/г. Свободные остаточные гидроксильные группы были закрыты смесью 20%-ного уксусного ангидрида/пиридина в дихлорметане в течение 1-3 ч при комнатной температуре. Носитель осаждали холодным эфиром, фильтровали и промывали холодным эфиром.
Пример 10.
Получение синтетического PRP с использованием растворимого полимерного носителя (фиг. 13).
1 г PEG-PRP-DMT (продукт примера 9) выпаривали дважды с пиридином и растворяли в ацетонитриле под аргоном. Удлинение PRP-олигосахарида проходило в цикле из четырех стадий, каждому шагу (стадии) предшествовала преципитация функционального PEG-холодным эфиром для освобождения от побочных продуктов с последующей кристаллизацией из дихлорметана эфира.
Первый шаг синтеза включал снятие диметокситретиловой группировки с использованием 3%-ного толуолсульфоновой кислоты в хлороформе/муравьиной кислоте, сопровождавшееся рибозилрибитол фосфорамидитным продуктом из примера 3 в присутствии тетразола (180 мин). Эффективность связывания определена как 95%. Окисление (3 стадия) проводилось с использованием 70% раствора t-бутил гидропероксида (120 мин) и конечное кэппирование (стадия 4) в 20%-ном уксусном ангидриде/пиридин в дихлорметане (60 мин). Было проведено два цикла синтеза, которые сопровождались связыванием спейсерного фосфорамидитного продукта из примера 8. Смолу нагревали с водным концентрированным аммиаком и тетрагидрофураном в течение 17 - 24 ч при 500-100oC. Смесь фильтровали чтобы отделить PEG, промывали и выпаривали растворители. Гидрогенолиз продукта в присутствии 10%-ного Pd/древесный уголь в t-бутиловый спирт/вода/уксусная кислота (4:4:1) с использованием аппарата гидрогенации среднего давления при 40 psi обеспечивает чистый продукт после фильтрации. Продукт был лиофилизирован, затем очищен комбинацией гель-фильтрации на колонке Sephadex G-25 в 0.01 М триэтиламмоний бикарбонате, pH 7.0 и последующей ионобменной хроматографией на Sephadex G-25 с использованием воды. После лиофилизации соответствующих фракций получен твердый продукт, структура которого анализирована ЯМР. Спектр рибозилрибитолфосфатного тримера был получен и оказался сходным с таковым, полученным Hoogerhout (J. Carbohydr. Chem. 7,399, 1988).
Пример 11.
Модификация синтетического (PRP)3.
m -Малеимидобензоил-N-гидроксисукцинимид (20 мг, 63.3 мкмоль) в тетрагидрофуране (1 мл) был добавлен к раствору синтезированного (PRP) (5.2 мг, 4.3 мкмоль) в 0.1 М фосфатном буфере (1 мл) pH 7.5. После перемешивания раствора 30 мин при комнатной температуре под аргоном реакционную смесь экстрагировали эфиром (4х5 мл) и образовавшуюся водную фазу нанесли на колонку Sephadex G-25 (Pharmaci а) (2х30 см), уравновешенную 0.1 M триэтиламмонийацетатным буфером, pH 7.2, и элюировали тем же буфером. Элюирование контролировали спектрофотометрически при 254 нм. Первый пик элюиции был собран и лиофилизирован. Количество малеимидных групп, включившихся в (PRP)3, определялось путем модифицированного метода Эдмана [39] и составило 90% включения.
Пример 12.
Пептидный синтез.
Пептиды из OMP Р1, Р2 и Р6 (табл. 1 - 3) были синтезированы с использованием пептидного синтезатора АВ1 430А и оптимимизированной t-ВОС химии, как описано производителем, затем очищены от смолы фтористоводородной кислотой (HF). Пептиды были очищены обратно-фазной жидкостной хроматографией высокого давления (RP-HPLC) на полупрепаративной колонке Yydac С4 (1х30 см) в 15-55%-ном градиенте ацетонитрила в 0.1%-ной трифторуксусной кислоте (TFA) за 40 мин при скорости 2 мл/мин. Все синтетические пептиды (табл. 1 - 3), использовавшиеся в биохимических и иммунологических исследованиях, были > 95% очищены, как показала аналитическая хроматография. Аминокислотный анализ производился на Waters Pico-Tag - системе и хорошо согласовался с теоретическими составами. Синтетические MAP (ОМР2-8) были получены вручную с использованием t-ВОС химии твердофазного пептидного синтеза по методу, описанному ранее Tam и др. [40]. Цистеиновые остатки были добавлены к C- и N-концам пептидов в целях конъюгации с PRP. MAP - пептиды были очищены как ранее описано RP-HPLC.
Пример 13.
Получение полностью синтетических пептид-PRP-конъюгатов.
От одного до двух миллиграммов индивидуальных синтетических пептидов (ОМР2-8) и HIBPI-4 растворяли в 0.5 мл хорошо дегазированной воды, затем добавляли 0.8 мл MBS -(PRP)3 (1.6 мг) хорошо дегазированной воды. Полученную смесь перемешивали в течение ночи при комнатной температуре под аргоном. Нерастворимый осадок удаляли центрифугированием, и супернатант наносили на колонку Saphadex G-50 (2х30 см), уравновешенную 0.1М триэтиламмоний ацетатным буфером, pH 7.2, чтобы удалить избыточный MBS - (PRP)3 гель-фильтрацией. Синтетические пептид- (PRP)3 конъюгаты были собраны и анализированы обратно-фазной HPLC в тесте OrcinoI и аминокислотном анализе. Молярное отношение пептида к PRP было 1:1 и 1:5 для HIBPI-4 и MAP пептидных конъюгатов соответственно. Синтетические пептид-PRP конъюгаты затем адсорбировались на алюминии для исследования иммуногенности.
Пример 14.
0.5 мл окисленного перийодатом PRP (25 мг в 1 мл 0.1М натрий фосфатном буфере, pH 6.0), полученного из нативного PRP, обработанного водной перийодной кислотой (4), добавили к бычьему сывороточному альбумину (BSA) (1.32 мг, 0.02 мкмоль в 0.5 мл 0.2 М натрий фосфатного буфера, pH 8.0) с последующим добавлением цианоборгидрида натрия (14 мг, 0.22 мкмоль; 10 экв. к В А). После инкубации при 37oC 5 дней реакционную смесь диализовали против 0.1 М фосфатного буфера (4х1 л), pH 7.5, и получившийся раствор нанесли на аналитическую колонку Syperose 12 (15х300 мм, Pharmaci a), уравновешенную 0.2М натрийфосфатным буфером, pH 7.2, и элюировали тем же буфером. Выход фракций определялся по поглощению в 230 нм. Главный пик белка собран и сконцентрирован в Centriprep 30 (Pierce) до 2.2 мл. Количество белка было определено в Bio Rad и составило 300 мкг/м. Подтверждение производного PRP получено в тесте OrcinoI.
Пример 15.
Получение антипептид и анти-OMP антисывороток.
Кролик, мыши (Balb/C и морские свинки были иммунизированы внутримышечно нативными Р1 или Р2 или Р6 или индивидуальными пептидами, эмульгированными в полном адъюванте Фрейнда и затем двумя. booster дозами (половинное количество того же иммуногена в неполном адъюванте Фрейнда) с интервалом в две недели. Антисыворотки были собраны и сохранялись, как описано выше.
Пример 16.
Получение анти-PRP антител.
Кролики были иммунизированы внутримышечно индивидуальными конъюгатами PRP-носитель (5-50 мкг PRP эквивалента), смешанными с 3 мг AIPO4 (в мл) с последующими boozter дозами (половинное количество того же иммуногена) с интервалом в две недели. Антисыворотку отбирали каждые две недели первой инъекции, инактивировали нагреванием при 56oC 30 мин и хранили при -20oC.
Пример 17.
P1-, Р2-, Р6- и пептид-специфичный ELISA.
На микротитровые плашки (чашки с лунками) (Nunc-immunoplate, Nunc, Denmark) были нанесены 200 нг очищенных OMP или 500 нг индивидуальных пептидов в 50 мкл в буфере нанесения (15 мМ Na2CO3, 35 мM NaHCO3, pH 9.6) и оставлены при комнатной температуре на 16 ч. Затем панели блокировали 0.1% (w/v) BSA в натрийфосфатном буфере (PBS) в течение 30 мин при комнатной температуре. Последовательно разведенные антитела были добавлены к лункам и инкубированы 1 ч при комнатной температуре. После удаления антисыворотки плашки промывали пять раз PBS, содержащим 0.1% (w/v) Twееп-20 и 0.1% (w/v) BSA. Козлиные, антикроличьи, мышиные и морской свинки F(ab')2, человеческие IgG были конъюгированы с пероксидазой хрена (Jackson Immunoresearch Labs Inc., PA), разведены буфером промывки (1/8000), нанесены на микротитровые плашки. После 1 ч инкубации при комнатной температуре плашки промывали пять раз буфером промывки. Затем их проявляли с использованием тетраметилбензидина (TMB) в H2O2 (ADI, Toronto) в качестве субстрата. Реакцию останавливали IN H2SO4, оптическую плотность измеряли при 450 нм на Ti retek MuItis can II (Flow L abs., Virginia). Два не имеющих отношения пептида токсина пертусис NAD-SI (19 аминокислот) и S3 (123-154) (32 остатка) были использованы как негативные контроли в пептидспецифических ELISA. Эксперименты были проведены трижды, и реактивный титр антител определялся по мере разбавления в соответствии с двукратным увеличением оптической плотности по сравнению с величиной, полученной в преиммунной сыворотке.
Пример 18.
Измерение анти-PRP антител.
На микротитровые чашки с лунками (Nunc-Immunoplate, Nunc, Denmark) было нанесено 200 нг очищенного PRP-BSA в 200 мкл буфера нанесения (15 мм Na2CO3, 35 мM NaHCO3, pH 9.6) и оставлены при комнатной температуре на 16 ч. Затем панели блокировали 0.1% (w/v) BSA в натрийфосфатном буфере (PBS) в течение 30 мин при комнатной температуре. Последовательно разведенные антитела на PRP-носитель были добавлены к лункам и инкубированы 1 ч при комнатной температуре. После удаления антисыворотки плашки промывали пять раз PBS, содержащим 0.1% (w/v) Tween-20 и 0.1% (w/v) BSA. Козлиные, антикроличьи, мышиные и морской свинки F (ab')2, человеческие lqG были конъюгированы с пероксидазой хрена (Jackson ImmunoResearch Labs Inc., PA), разведены буфером промывки (1/8000), нанесены на микротитровые плашки. После 1 ч инкубации при комнатной температуре плашки промывали пять раз буфером промывки. Затем их проявляли с использованием тетраметилбензидина (TMB) в Н202 (ADI, Toronto) в качестве субстрата. Реакцию останавливали IN H2SO4, оптическую плотность измеряли при 450 нм на Titretek MuItiscan II (Flow Labs., Virginia). Стандартная анти-PRP антисыворотка использовалась как позитивный контроль. Эксперименты были проведены трижды, и реактивный титр антител определялся по мере разбавления в соответствии с двукратным увеличением оптической плотности по сравнению с величиной, полученной в преиммунной сыворотке.
Пример 19.
Пролиферативный тест для синтетических T-клеточных эпитопов.
Картирование T-клеточных эпитопов было проведено путем праймирования Balb/c, С57B1/6 и A/J мышей 5 мг индивидуальных OMP (Р1, Р2 или Р6). Через три недели селезенку удаляли и культивировали спленоциты в RPMI 1640 (Flow Lab) в 10%-ной телячьей фетальной сыворотке, инактивированной нагреванием (Gibco) 2мМ L-глутамине (Flow Lab), 100 U/мл пенициллина (FIow Lab), 100 мг/мл стрептомицина (Flow Lab), 10 ед/мл rlL-2 и 50 мкМ 2-меркаптоэтанола (Sigma) в течение 5-7 дней. Пролиферативный ответ в праймированных спленоцитах на ОМР-пептиды определялся в стандартном анализе in vitro [41]. Кратко, 104 спленоцитов были помещены на 96-луночную микротитровую плашку вместе с 5х10 (1700 Rad) свежими сингенными клетками селезенки, которые использовались как антигенпрезентирующие клетки (АРС) в присутствии повышающихся молярных концентраций (0.03-3 мкМ пептида, растворенного в культуральной среде без IL-2). Культуры выдерживались 40 ч в увлажняемом инкубаторе в 5% СО2/воздух при 37oC. Во время последних 16 ч инкубирования в каждую лунку добавляли 0.5 мкКи [H3] -Tdr (5 Ки/ммоль, NEN). Содержимое лунок перенесли на фильтры из волоконного стекла, включение H3-тимидина в клеточную ДНК измерялось сцинцилляционным счетчиком β- излучения (Beckman). Результат как среднее из трех показаний для каждой пептидной концентрации. Стандартное отклонение было всегда < 15%. Пролиферативный ответ считался позитивным, когда включение было в три раза выше, чем полученное с неотносящимися пептидами или культуральной средой.
Пример 20.
Иммуноблотный анализ.
Иммуноспецифичность антисыворотки, вырабатывающейся на пептиды или конъюгаты PRP с носителем, определялись иммуноблотным анализом, как описано ранее [42].
Настоящим изобретением предлагаются иммуногенные синтетические пептиды, которые могут быть использованы индивидуально или в PRP-конъюгатах, в вакцинах против инфекции Hi. В рамках изобретения возможны модификации.
Claims (34)
1. Синтетический пептид, отличающийся тем, что он содержит аминокислотную последовательность, включающую по крайней мере одну антигенную детерминанту по крайней мере одного белка внешней мембраны Haemophilus influenzae, где указанный белок внешней мембраны выбран из группы, состоящей из P1-белка Haemophilus influenzae типа b, причем указанная аминокислотная последовательность выбрана из аминокислотных последовательностей 39-64 и 179-218, приведенных в табл. 1, P2-белка Haemophilus influenzae типа b, причем указанная аминокислотная последовательность выбрана из аминокислотных последовательностей 1-14, 53-81, 125-150, 148-174, 193-219, 219-244, 241-265, 263-289, 285-306, 302-319 и 314-341, приведенных в табл. 2, P6-белка Haemophilus influenzae типа b, причем указанная аминокислотная последовательность выбрана из аминокислотных последовательностей, приведенных в табл. 3, или часть или вариант любой из указанных последовательностей, сохраняющих иммуногенность.
2. Пептид по п.1, отличающийся тем, что он содержит аминокислотную последовательность, соответствующую по меньшей мере одной антигенной детерминанте B-клеток белка внешней мембраны Haemophilus influenzae.
3. Пептид по п.2, отличающийся тем, что белок внешней мембраны представляет собой Р2-белок Haemophilus influenzae типа b, причем указанная аминокислотная последовательность выбрана из аминокислотных последовательностей 53-81, 148-174, 241-265 и 314-341, приведенных в табл. 2, или часть, или вариант любой из выбранных последовательностей, сохраняющих иммуногенность.
4. Пептид по п.2, отличающийся тем, что белок внешней мембраны представляет собой P6-белок Haemophilus influenzae типа b, причем указанная аминокислотная последовательность выбрана из аминокислотных последовательностей 73-96, 90-114 и 109-134, приведенных в табл. 3, или часть, или вариант любой из выбранных последовательностей, сохраняющих иммуногенность.
5. Пептид по п.1, отличающийся тем, что он содержит аминокислотную последовательность, соответствующую по крайней мере одной иммунодоминантной Т-клеточной антигенной детерминанте белка внешней мембраны Haemophilus influenzae.
6. Пептид по п.5, отличающийся тем, что белок внешней мембраны представляет собой P2-белок Haemophilus influenzae типа b, причем указанная аминокислотная последовательность выбрана из аминокислотных последовательностей 125-150, 193-219, 219-244 и 241-265, приведенных в табл.2, или часть, или вариант любой из выбранных последовательностей, сохраняющих иммуногенность.
7. Пептид по п.5, отличающийся тем, что белок внешней мембраны представляет собой P6-белок Haemophilus influenzae типа b, причем указанная аминокислотная последовательность выбрана из аминокислотных последовательностей 19-41, 35-58, 73-96 и 109-134, приведенных в табл. 3, или часть, или вариант любой из выбранных последовательностей, сохраняющих иммуногенность.
8. Пептид по любому из пп.2 или 5, отличающийся тем, что он содержит по крайней мере одну Т-клеточную антигенную детерминанту Т и по крайней мере одну В-клеточную антигенную детерминанту нейтрализации В.
9. Синтетический липопептид, отличающийся тем, что он содержит синтетический пептид, имеющий аминокислотную последовательность, соответствующую по крайней мере одной антигенной детерминанте по крайней мере одного белка Haemophilus influenzae, модифицированного липидом.
10. Липопептид по п.9, отличающийся тем, что он содержит синтетический пептид по п.1.
11. Липопептид по любому из п.9 или 10, отличающийся тем, что он выполнен в форме синтетического липопептида или смеси синтетических липопептидов, образующих при комбинировании молекулярные агрегаты, способные вызывать у млекопитающих иммунный ответ на Haemophilus influenzae.
12. Иммуногенный коньюгат, отличающийся тем, что он содержит синтетический пептид, включающий аминокислотную последовательность, соответствующую по крайней мере одной иммунодоминантной Т-клеточной антигенной детерминанте по крайней мере одного белка Haemophilus influenzae, связанной по крайней мере с одной синтетической В-клеточной антигенной детерминантой.
13. Коньюгат по п.12, отличающийся тем, что указанный белок Haemophilus influenzae представляет собой P-1 белок Haemophilus influenzae типа b, а указанная аминокислотная последовательность выбрана из аминокислотных последовательностей 39-64, 165-193, 189-218, 226-253,339-370 и 400-437, приведенных в табл. 1, или часть, или вариант любой из выбранных последовательностей, сохраняющих иммуногенность.
14. Коньюгат по п.12, отличающийся тем, что указанный белок Haemophilus influenzae представляет собой P2-белок Haemophilus influenzae типа b, а указанная аминокислотная последовательность выбрана из аминокислотных последовательностей 125-150, 193-219, 219-244 и 241-265, приведенных в табл. 9, или часть, или вариант любой из выбранных последовательностей, сохраняющих иммуногенность.
15. Коньюгат по п.12, отличающийся тем, что указанный белок Haemophilus influenzae представляет собой P6-белок Haemophilus influenzae типа b, а указанная аминокислотная последовательность выбрана из аминокислотных последовательностей 19-41, 35-58, 73-96 и 109-134, приведенных в табл. 3, или часть, или вариант любой из выбранных последовательностей, сохраняющих иммуногенность.
16. Коньюгат по п.12, отличающийся тем, что он содержит по крайней мере одну Т-клеточную детерминанту P1, P2 или P6-белка Haemophilus influenzae типа b и по крайней мере одну В-клеточную антигенную детерминанту нейтрализации P1, P2 или P6-белка Haemophilus influenzae типа b.
17. Коньюгат по п.12, отличающийся тем, что он выбран из P1-P2химерных синтетических пептидов, имеющих аминокислотную последовательность, выбранную из аминокислотных последовательностей, приведенных в табл. 11.
18. Коньюгат по любому из пп.12 - 17, отличающийся тем, что указанный синтетический пептид представляет собой множественный антигенный пептид, в котором каждый пептид содержит по крайней мере одну Т-клеточную антигенную детерминанту.
19. Иммуногенный коньюгат, отличающийся тем, что он содержит синтетический углеводный антиген, связанный по крайней мере с синтетической Т-клеточной антигенной детерминантой.
20. Коньюгат по п.19, отличающийся тем, что указанный антиген выбран по крайней мере из части бактериальных вирусных или опухолевых олигосахаридов.
21. Коньюгат по п.20, отличающийся тем, что указанный углеводный антиген представляет собой рибозорибитол фосфатный (RP R) олигомер.
22. Коньюгат по п.21, отличающийся тем, что указанный олигомер представляет собой линейный сополимер чередующихся молекул рибозы и рибитола, соединенных фосфодиэфирными связями, и имеющий формулу
где n - целое число;
m - целое число;
R1 - синтетический пептид, содержащий по крайней мере один Т-клеточный эпитоп.
где n - целое число;
m - целое число;
R1 - синтетический пептид, содержащий по крайней мере один Т-клеточный эпитоп.
23. Коньюгат по п. 22, отличающийся тем, что указанный синтетический пептид содержит -(CH2-Y-носитель) и обладает способностью усиливать иммунный ответ хозяина на олигосахаридный фрагмент, где в качестве носителя использован пептид, содержащий по крайней мере одну Т-хелперную антигенную детерминанту и Y-остаток бифункционального реактивного соединения
2. 24. Коньюгат по п.22, отличающийся тем, что указанный синтетический пептид содержит аминокислотную последовательность GPKEPFRDYVDRFYK из gag p24 белка HIV-I.
2. 24. Коньюгат по п.22, отличающийся тем, что указанный синтетический пептид содержит аминокислотную последовательность GPKEPFRDYVDRFYK из gag p24 белка HIV-I.
25. Коньюгат по п.22, отличающийся тем, что указанный синтетический пептид содержит аминокислотную последовательность, соответствующую по крайней мере одной Т-клеточной антигенной детерминанте или Т-В пептидной антигенной детерминанте по крайней мере одного белка внешней мембраны Haemophilus influenzae.
26. Коньюгат по любому из пп.18 - 25, отличающийся тем, что упомянутый синтетический пептид представляет собой множественный антигенный пептид, в котором каждый пептид содержит по крайней мере одну Т-клеточную антигенную детерминанту.
27. Способ получения олигомера полирибозилрибитолфосфата (PR P), отличающийся тем, что осуществляют присоединение соединения, имеющего формулу
где R1 - первая защитная группа;
R2 - вторая защитная группа,
к твердой подложке монометилового эфира полиэтиленгликоля (REG) с образованием соединения, связанного с REG, растворения указанного связанного с REG соединения в растворителе, удаления указанной первой защитной группы из связанного с REG соединения с образованием незащищенного связанного с REG соединения, связывания незащищенного, связанного с PEG соединения с повторяющимся фрагментом, в целях элонгации цепи, имеющего формулу:
удаления защитных групп с атома фосфора с образованием синтетического, связанного с REG PR P, удаления указанного синтетического связанного с REG PR P в твердой форме из указанного растворителя для разделения REG - связанного синтетического PR P от побочных продуктов, повторное растворение REG - связанного синтетического PR P в твердой форме в растворителе, повторения указанных стадий снятия указанной первой защитной группы, связывания с повторяющимся фрагментом, удаления защитной группы от атома фосфора, удаления REG - связанного синтетического PR P в твердой форме из растворителя и повторного растворителя REG - связанного синтетического PR P в твердой форме до тех пор, пока в олигомере P R P не соединится желаемое число повторяющихся фрагментов, терминацию олигомеризации цепи терминирующей молекулой с формулой
где m - целое число от 4 до 6;
R3 - третья защитная группа,
для получения PEG - связанного защищенного олигомера PR P, удаления защитной группы от атома фосфора и удаление указанного PEG - связанного защищенного олигомера PR P в твердой форме из указанного растворителя для разделения PEG - связанного защищенного олигомера PR P, имеющего формулу
где n является целым числом от 3 до 20;
X+ является контрионом.
где R1 - первая защитная группа;
R2 - вторая защитная группа,
к твердой подложке монометилового эфира полиэтиленгликоля (REG) с образованием соединения, связанного с REG, растворения указанного связанного с REG соединения в растворителе, удаления указанной первой защитной группы из связанного с REG соединения с образованием незащищенного связанного с REG соединения, связывания незащищенного, связанного с PEG соединения с повторяющимся фрагментом, в целях элонгации цепи, имеющего формулу:
удаления защитных групп с атома фосфора с образованием синтетического, связанного с REG PR P, удаления указанного синтетического связанного с REG PR P в твердой форме из указанного растворителя для разделения REG - связанного синтетического PR P от побочных продуктов, повторное растворение REG - связанного синтетического PR P в твердой форме в растворителе, повторения указанных стадий снятия указанной первой защитной группы, связывания с повторяющимся фрагментом, удаления защитной группы от атома фосфора, удаления REG - связанного синтетического PR P в твердой форме из растворителя и повторного растворителя REG - связанного синтетического PR P в твердой форме до тех пор, пока в олигомере P R P не соединится желаемое число повторяющихся фрагментов, терминацию олигомеризации цепи терминирующей молекулой с формулой
где m - целое число от 4 до 6;
R3 - третья защитная группа,
для получения PEG - связанного защищенного олигомера PR P, удаления защитной группы от атома фосфора и удаление указанного PEG - связанного защищенного олигомера PR P в твердой форме из указанного растворителя для разделения PEG - связанного защищенного олигомера PR P, имеющего формулу
где n является целым числом от 3 до 20;
X+ является контрионом.
29. Способ по п. 27, отличающийся тем, что n - число от 3 до 20 и m - число от 4 до 6.
30. Способ по п. 27, отличающийся тем, что R2 - бензил, R1 - диметокситритил, R3 - монометокситретил.
31. Способ по п.30, отличающийся тем, что противоион - ион аммония.
33. Способ по п.32, отличающийся тем, что указанный связанный фрагмент имеет формулу
-CH2(CH2)m -X,
где m - целое число;
X - химически активная функциональная группа, аминореактивная или фотоактивируемая группа.
-CH2(CH2)m -X,
где m - целое число;
X - химически активная функциональная группа, аминореактивная или фотоактивируемая группа.
34. Способ по любому из пп. 27 - 33, отличающийся тем, что указанный полиэтиленгликоль имеет емкость загрузки порядка 200 - 500 мкМоль/г носителя.
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
GB929202219A GB9202219D0 (en) | 1992-02-03 | 1992-02-03 | A synthetic heamophilus influenzae conjugate vaccine |
GB9202219.3 | 1992-02-03 | ||
PCT/CA1993/000041 WO1993015205A2 (en) | 1992-02-03 | 1993-02-03 | Synthetic haemophilus influenzae conjugate vaccine |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU94040386A RU94040386A (ru) | 1996-05-10 |
RU2141527C1 true RU2141527C1 (ru) | 1999-11-20 |
Family
ID=10709711
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU94040386A RU2141527C1 (ru) | 1992-02-03 | 1993-02-03 | Синтетический пептид, синтетический липопептид, иммуногенный конъюгат (варианты), способ получения олигомера, защищенный твердым монометиловым эфиром полиэтиленгликоля полисахарид |
Country Status (11)
Country | Link |
---|---|
US (3) | US6018019A (ru) |
EP (1) | EP0625203A1 (ru) |
JP (4) | JP3421337B2 (ru) |
KR (1) | KR100246122B1 (ru) |
AU (1) | AU669354B2 (ru) |
CA (1) | CA2129101C (ru) |
FI (1) | FI943591A (ru) |
GB (1) | GB9202219D0 (ru) |
NO (1) | NO942867L (ru) |
RU (1) | RU2141527C1 (ru) |
WO (1) | WO1993015205A2 (ru) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2737638C2 (ru) * | 2013-12-03 | 2020-12-01 | Вирометикс Аг | ПРОЛИН-БОГАТЫЕ ПЕПТИДЫ, ЗАЩИЩАЮЩИЕ ОТ S.pneumoniae |
Families Citing this family (56)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
GB8924473D0 (en) * | 1989-10-31 | 1989-12-20 | Connaught Lab | Outer membrane protein p1 and peptides of haemophilus influenzae b |
GB9202219D0 (en) * | 1992-02-03 | 1992-03-18 | Connaught Lab | A synthetic heamophilus influenzae conjugate vaccine |
US6242578B1 (en) * | 1994-02-17 | 2001-06-05 | Samuel Bogoch | Aglyco products and methods of use |
US5532405A (en) * | 1994-04-29 | 1996-07-02 | Exxon Chemical Patents Inc. | Preparation of plasticizer or polyol esters by the staged addition of the lower boiling point reactant |
GB9422096D0 (en) * | 1994-11-02 | 1994-12-21 | Biocine Spa | Combined meningitis vaccine |
US5681570A (en) * | 1995-01-12 | 1997-10-28 | Connaught Laboratories Limited | Immunogenic conjugate molecules |
KR19990007858A (ko) * | 1995-04-17 | 1999-01-25 | 존 더블유.로우 | 박테리아의 리포프로테인으로 폴리사카라이드에 대한 면역반응의 유도및 강화 |
FR2734484B1 (fr) * | 1995-05-24 | 1997-06-27 | Pasteur Merieux Serums Vacc | Composition vaccinale liquide et procede de fabrication |
US20030157129A1 (en) * | 1995-06-23 | 2003-08-21 | Smithkline Beecham Biologicals S.A. | Vaccine comprising a polysaccharide antigen - carrier protein conjugate and free carrier protein |
US6761892B1 (en) * | 1995-08-18 | 2004-07-13 | Sloan-Kettering Institute For Cancer Research | Heat shock protein-based vaccines and immunotherapies |
US6267961B1 (en) * | 1996-11-22 | 2001-07-31 | Baxter International Inc. | Direct methods for molar-mass determination of fragments of Haemophilus influenzae type b capsular polysaccharides and vaccine preparation |
US6299881B1 (en) * | 1997-03-24 | 2001-10-09 | Henry M. Jackson Foundation For The Advancement Of Military Medicine | Uronium salts for activating hydroxyls, carboxyls, and polysaccharides, and conjugate vaccines, immunogens, and other useful immunological reagents produced using uronium salts |
ATE328611T1 (de) * | 1997-03-27 | 2006-06-15 | Pasteur Institut | Multiple,kohlenhydrathaltige glycopeptid-antigene,daraus entwickelte impfstoffe sowie deren verwendung |
US6676946B2 (en) * | 1997-03-27 | 2004-01-13 | Institut Pasteur | Multiple antigen glycopeptide carbohydrate vaccine comprising the same and use thereof |
US20070237785A1 (en) * | 1997-03-27 | 2007-10-11 | Institut Pasteur | Multiple antigen glycopeptide carbohydrate, vaccine comprising the same and use thereof |
US5972339A (en) * | 1997-11-13 | 1999-10-26 | The General Hospital Corporation | Method of eliciting anti-HIV-1 helper T cell responses |
US6582700B1 (en) * | 1997-11-18 | 2003-06-24 | Medical University Of South Carolina | Linear antigen supporting units |
WO1999052561A1 (en) * | 1998-04-15 | 1999-10-21 | Baxter International Inc. | Inhibition of xenoreactive antibodies |
CZ20011896A3 (cs) * | 1998-12-19 | 2002-01-16 | Ml Laboratories Plc | Imunogenní prostředek a protilátka |
US7384640B1 (en) * | 1999-09-30 | 2008-06-10 | Wyeth Holdings Corporation | Mutant cholera holotoxin as an adjuvant |
EP1259249B1 (en) * | 2000-03-01 | 2009-07-15 | Binax, Inc. | Method for detecting the presence of target bacteria or a target component carbohydrate antigen thereof |
US7556807B2 (en) | 2001-02-20 | 2009-07-07 | Kane Biotech, Inc. | Signal peptides, nucleic acid molecules and methods for treatment of caries |
US7597895B2 (en) * | 2001-02-20 | 2009-10-06 | The Governing Council Of The University Of Toronto | Signal peptides, nucleic acid molecules and methods for treatment of caries |
US7452963B2 (en) * | 2001-03-27 | 2008-11-18 | Samuel Bogoch | Replikin peptides and antibodies therefore |
KR100906102B1 (ko) | 2001-03-27 | 2009-07-07 | 사무엘 보고치 | 레플리킨 펩타이드 및 그의 이용 |
US7420028B2 (en) * | 2001-03-27 | 2008-09-02 | Samuel Bogoch | Replikins and methods of identifying replikin-containing sequences |
US7189800B2 (en) * | 2001-03-27 | 2007-03-13 | Samuel Bogoch | Replikin peptides in rapid replication of glioma cells and in influenza epidemics |
US7894999B2 (en) | 2001-03-27 | 2011-02-22 | Samuel Bogoch | Systems and methods for identifying Replikin Scaffolds and uses of said Replikin Scaffolds |
US7774144B2 (en) * | 2001-10-26 | 2010-08-10 | Samuel Bogoch | System and method for identifying complex patterns of amino acids |
US7442761B2 (en) | 2003-06-06 | 2008-10-28 | Samuel Bogoch | Replikin peptides and uses thereof |
US20040043419A1 (en) * | 2001-04-17 | 2004-03-04 | Rothman James E. | Javelinization of protein antigens to heat shock proteins |
IL159209A0 (en) | 2001-06-07 | 2004-06-01 | Wyeth Corp | Mutant forms of cholera holotoxin as an adjuvant |
CN1977971A (zh) * | 2001-06-07 | 2007-06-13 | 惠氏控股有限公司 | 作为佐剂的霍乱全毒素的突变体形式 |
CN101121754B (zh) * | 2002-08-12 | 2012-02-29 | 昆士兰医学研究所理事会 | 含有辅助t细胞和b细胞表位的新的免疫原性脂肽 |
EP2314630A1 (en) | 2002-08-12 | 2011-04-27 | The Council Of The Queensland Institute Of Medical Research | Method of producing immunogenic lipopeptides comprising T-helper and Cytotoxic T Lymphocyte (CTL) epitopes |
US7420037B2 (en) * | 2003-02-13 | 2008-09-02 | Antigenics Inc. | Heat shock protein-based vaccines and immunotherapies |
JP2007525448A (ja) * | 2003-04-11 | 2007-09-06 | アンティジェニクス インコーポレーテッド | 改良された熱ショックタンパク質に基づくワクチンおよび免疫治療 |
US7309491B2 (en) * | 2003-04-11 | 2007-12-18 | Antigenics Inc. | Heat shock protein-based vaccines and immunotherapies |
US8494781B2 (en) | 2003-06-06 | 2013-07-23 | Samuel Bogoch | Systems and methods for identifying replikin scaffolds and uses of said replikin scaffolds |
US9254315B2 (en) | 2004-04-28 | 2016-02-09 | Samuel Bogoch | Systems and methods for identifying replikin scaffolds and uses of said replikin scaffolds |
WO2008140557A2 (en) * | 2006-10-24 | 2008-11-20 | Samuel Bogoch | A method of predicting influenza outbreaks |
EP2126140A4 (en) * | 2007-01-18 | 2012-03-28 | Samuel Bogoch | METHOD FOR DETERMINING THE MORTALITY OF PATHOGENS AND MALIGNOMAS WITH REPLICINE TIPS |
MX2009013091A (es) * | 2007-05-30 | 2010-07-30 | Bogoch Samuel | Peptidos de repliquina sinteticos contra infeccion patogenica de invertebrados en acuicultura. |
US20090269367A1 (en) * | 2008-04-23 | 2009-10-29 | Samuel Bogoch | Methods and compounds for mitigating pathogenic outbreaks using replikin count cycles |
US20100144589A1 (en) * | 2008-08-08 | 2010-06-10 | Samuel Bogoch | Methods of predicting cancer lethality using replikin counts |
AU2010204066B2 (en) * | 2009-01-07 | 2015-03-19 | Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd. | Method for detecting all Haemophilus influenzae |
US9233148B2 (en) | 2009-01-09 | 2016-01-12 | Samuel Bogoch | Replikin-based compounds for prevention and treatment of influenza and methods of differentiating infectivity and lethality in influenza |
WO2010086512A2 (en) * | 2009-02-02 | 2010-08-05 | Valio Ltd | Novel peptides and methods for producing them |
WO2010114136A1 (ja) * | 2009-03-30 | 2010-10-07 | 第一三共株式会社 | 多能性幹細胞及び心筋細胞以外の分化細胞に対する細胞死誘導方法 |
AU2010320031B2 (en) * | 2009-11-16 | 2015-07-16 | The Henry M. Jackson Foundation For The Advancement Of Military Medicine, Inc. | (Poly)-glycerolphosphate-based anti-gram positive bacterial vaccine |
CA2838188C (en) * | 2011-06-04 | 2017-04-18 | Rochester General Hospital Research Institute | Compositions and methods related to p6 of haemophilus influenzae |
BR112015023024B1 (pt) * | 2013-03-15 | 2022-04-19 | The Board Of Trustees Of The University Of Arkansas | Vetor de vacina e composições farmacêuticas compreendendo o mesmo |
CN105585633B (zh) * | 2016-03-08 | 2019-06-21 | 湖北工业大学 | 抗人流感嗜血杆菌p6蛋白抗体及应用该抗体的免疫层析试剂盒 |
EP3717632B1 (en) | 2017-11-30 | 2022-10-26 | F. Hoffmann-La Roche AG | B-cell cultivation method |
US11530432B2 (en) | 2018-03-19 | 2022-12-20 | Northwestern University | Compositions and methods for rapid in vitro synthesis of bioconjugate vaccines in vitro via production and N-glycosylation of protein carriers in detoxified prokaryotic cell lysates |
JP2023542141A (ja) * | 2020-09-15 | 2023-10-05 | ザ ユニバーシティー オブ モンタナ | 繊維状バクテリオファージを標的化する組成物および方法 |
Family Cites Families (13)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
GB8610983D0 (en) * | 1986-05-06 | 1986-06-11 | Connaught Lab | Enhancement of antigen immunogenicity |
JP2534529B2 (ja) * | 1986-07-24 | 1996-09-18 | ブリティシュ・テレコミュニケ−ションズ・パブリック・リミテッド・カンパニ | 放射発生器 |
US5173294A (en) * | 1986-11-18 | 1992-12-22 | Research Foundation Of State University Of New York | Dna probe for the identification of haemophilus influenzae |
NZ223009A (en) * | 1986-12-31 | 1990-06-26 | Nl Rivm Of Thoven | Oligosaccharides containing d-ribose d-ribitol and phosphate units mimicing haemophilus influenzae type b antigens |
AU623353B2 (en) * | 1987-12-10 | 1992-05-14 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Methods and compositions for the production of haemophilus influenzae type b major outer membrane protein antigens |
EP0320942A3 (en) * | 1987-12-18 | 1989-10-04 | American Cyanamid Company | Novel polysaccharides novel macromolecular conjugates of the polysaccharides |
CA1340888C (en) * | 1988-09-01 | 2000-02-01 | Algis Anilionis | Vaccines and diagnostic assays for haemophilus influenzae |
CA2006587C (en) * | 1988-12-23 | 2000-01-18 | Robert W. Tolan | Membrane proteins and peptides of haemophilus influenzae type b |
DE69024392T2 (de) * | 1989-03-29 | 1996-07-25 | Univ New York | Verfahren zur Reinigungbvon Aussenmembran-Protein von Haemophilus influenzae |
CA2031197A1 (en) * | 1989-04-12 | 1990-10-13 | James P. Tam | Dendritic polymer of multiple antigen peptide system useful as anti-malarial vaccine |
GB8924473D0 (en) * | 1989-10-31 | 1989-12-20 | Connaught Lab | Outer membrane protein p1 and peptides of haemophilus influenzae b |
GB9202219D0 (en) * | 1992-02-03 | 1992-03-18 | Connaught Lab | A synthetic heamophilus influenzae conjugate vaccine |
US6153406A (en) * | 1993-07-23 | 2000-11-28 | North American Vaccine, Inc. | Method for the high level expression, purification and refolding of the outer membrane protein P2 from Haemophilus influenzae type B |
-
1992
- 1992-02-03 GB GB929202219A patent/GB9202219D0/en active Pending
-
1993
- 1993-02-03 EP EP93903129A patent/EP0625203A1/en not_active Withdrawn
- 1993-02-03 KR KR1019940702655A patent/KR100246122B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1993-02-03 JP JP51282493A patent/JP3421337B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1993-02-03 WO PCT/CA1993/000041 patent/WO1993015205A2/en active Application Filing
- 1993-02-03 CA CA002129101A patent/CA2129101C/en not_active Expired - Fee Related
- 1993-02-03 US US08/256,839 patent/US6018019A/en not_active Expired - Fee Related
- 1993-02-03 AU AU34469/93A patent/AU669354B2/en not_active Ceased
- 1993-02-03 RU RU94040386A patent/RU2141527C1/ru not_active IP Right Cessation
-
1994
- 1994-08-02 NO NO942867A patent/NO942867L/no not_active Application Discontinuation
- 1994-08-02 FI FI943591A patent/FI943591A/fi not_active Application Discontinuation
-
1995
- 1995-06-07 US US08/475,985 patent/US5972349A/en not_active Expired - Fee Related
- 1995-06-07 US US08/475,989 patent/US5679352A/en not_active Expired - Fee Related
-
1998
- 1998-10-21 JP JP10336442A patent/JPH11269188A/ja not_active Withdrawn
-
2000
- 2000-05-29 JP JP2000197292A patent/JP2001064201A/ja not_active Withdrawn
-
2006
- 2006-01-12 JP JP2006005426A patent/JP2006131642A/ja not_active Withdrawn
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2737638C2 (ru) * | 2013-12-03 | 2020-12-01 | Вирометикс Аг | ПРОЛИН-БОГАТЫЕ ПЕПТИДЫ, ЗАЩИЩАЮЩИЕ ОТ S.pneumoniae |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
AU669354B2 (en) | 1996-06-06 |
CA2129101C (en) | 2004-08-10 |
CA2129101A1 (en) | 1993-08-05 |
US6018019A (en) | 2000-01-25 |
NO942867D0 (ru) | 1994-08-02 |
JPH11269188A (ja) | 1999-10-05 |
KR950700416A (ko) | 1995-01-16 |
AU3446993A (en) | 1993-09-01 |
JP2006131642A (ja) | 2006-05-25 |
EP0625203A1 (en) | 1994-11-23 |
JP2001064201A (ja) | 2001-03-13 |
WO1993015205A3 (en) | 1994-03-03 |
JP3421337B2 (ja) | 2003-06-30 |
WO1993015205A2 (en) | 1993-08-05 |
FI943591A0 (fi) | 1994-08-02 |
GB9202219D0 (en) | 1992-03-18 |
JPH07505522A (ja) | 1995-06-22 |
US5679352A (en) | 1997-10-21 |
US5972349A (en) | 1999-10-26 |
KR100246122B1 (ko) | 2000-03-15 |
NO942867L (no) | 1994-10-03 |
RU94040386A (ru) | 1996-05-10 |
FI943591A (fi) | 1994-09-28 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
RU2141527C1 (ru) | Синтетический пептид, синтетический липопептид, иммуногенный конъюгат (варианты), способ получения олигомера, защищенный твердым монометиловым эфиром полиэтиленгликоля полисахарид | |
Lowell et al. | Peptides bound to proteosomes via hydrophobic feet become highly immunogenic without adjuvants. | |
EP0652896B1 (en) | Peptide compounds | |
CA1340956C (en) | Synthetic peptides representing a t-cell epitope as a carrier molecule for conjugate vaccines | |
US4950480A (en) | Enhancement of antigen immunogenicity | |
JP4754689B2 (ja) | 複数種オリゴ糖の糖接合体型の細菌性髄膜炎ワクチン | |
US5785973A (en) | Synthetic peptides representing a T-cell epitope as a carrier molecule for conjugate vaccines | |
US6673905B2 (en) | Conjugation of biomolecules using Diels-Alder cycloaddition | |
JP7277459B2 (ja) | クレブシエラ ニューモニエ(Klebsiella pneumoniae)に対するワクチン | |
CA1327096C (en) | Peptides corresponding to antigenic and immunogenic determinants of major neutralizing proteins of rotaviruses | |
Reichel et al. | Synthetic carbohydrate-based vaccines: synthesis of an L-glycero-D-manno-heptose antigen–T-epitope–lipopeptide conjugate | |
JP2644625B2 (ja) | インフルエンザ菌b型の外膜タンパク質p1およびペプチド類 | |
KR100233805B1 (ko) | 올리고머의 제조공정 | |
KR100887591B1 (ko) | 특정의 교차 반응성을 증가시키는 항원성 구조들의 제조방법 | |
AU2010320031B2 (en) | (Poly)-glycerolphosphate-based anti-gram positive bacterial vaccine | |
WO1995000540A1 (en) | Synthetic carrier and immunogen | |
US20020068818A1 (en) | Conjugation of biomolecules using diels-alder cycloaddition | |
Lacheny et al. | Identification of B-and T-Cell Epitopes of |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20090204 |