JP2644625B2 - インフルエンザ菌b型の外膜タンパク質p1およびペプチド類 - Google Patents
インフルエンザ菌b型の外膜タンパク質p1およびペプチド類Info
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Description
zae)b型から得られた外膜タンパク質P1に関する。こ
のタンパク質の遺伝子またはこの遺伝子の一時変異体
は、適切なベクターにクローニングされかつ適切な宿主
中で発現すると、前記天然のタンパク質の一部または全
ての免疫特性を保持したタンパク質類を付与する。さら
に、P1遺伝子の誘導アミノ酸配列に基づくペプチド類
は、インビトロで合成できる。これらのタンパク質類お
よびペプチド類は、結合の有無に関わらず、インフルエ
ンザ菌(Haemophilus influenzae)b型疾患に対する
ワクチンとして使用できる。前記タンパク質類は、ま
た、他のハプテン類および多糖類と結合しT細胞依存性
抗原および担体として使用できる。
が原因である疾患は、5歳以下の小児における細菌性髄
膜炎の主な原因である。本疾患に対する防御抗体類は本
細菌の莢膜多糖によって誘発され、抗原として精製ポリ
リボシルリビトールリン酸(PRP)を利用したワクチン
が、開発された。このワクチンは、成人および月齢24カ
月以上の小児において90%の防御を付与したが、24カ月
以下の小児においては効果がなかった。このPRPは、他
の多糖ワクチン類と同様、Tヘルパー細胞類の増殖を誘
発せず、再免疫しても追加免疫応答または記憶細胞の増
加のいずれも惹起できない。ジフテリア毒素に連結され
たPRPを用いる新規結合ワクチンが開発され(欧州特許
第0,098,581号参照)、本ワクチンは、T細胞依存性の
追加免疫応答およびPRP特異的IgG抗体類産生を惹起す
る。月齢2乃至6カ月群およびある高リスク群で広範囲
の防御を達成するため、ある莢膜外抗原類の取り込みが
必要であろう。インフルエンザ菌(Haemophilus influ
enzae)bの外膜タンパク質P1に対して作製されたモノ
クローナル抗体は、菌血症の乳児ラットモデルにおいて
防御活性を有することが示されている。また、精製P1に
対して作製されたウサギ抗血清も同様に前記ラットモデ
ルにおいて防御活性を有することが立証されている。本
発明者らは、単離物3種由来P1からの構造遺伝子をクロ
ーニングし、配列決定し、大腸菌(E.coli)中において
発現させた。
おり、より小さくかつより明確に規定された物質類を抗
原として使用する方向に現在向かっている。このこと
は、ある天然の免疫原による潜在的副作用を最少とする
かまたは消失させ、一方、それらの免疫原性および本疾
患に対する防御を付与する能力を維持するために進めら
れている。
ベクター発現系中で発現すると、免疫原として使用した
ときにインフルエンザ菌(Haemophilus influenzae)
b型によって産生されたタンパク質に反応性の抗体類を
誘発するタンパク質生成物を産生する。さらに、本発明
者らは、本発明のもうひとつの面に従って本遺伝子を改
良して種々のタンパク質アナログ類を発現させたが、こ
れらは、インフルエンザ菌(Haemophilus influenza
e)b型によって産生された前記タンパク質の免疫特性
の一部または全てを保持している。
原であるので、本発明の別の面に従ってそれを結合ワク
チンの一部として使用したが、前記結合物のハプテン部
分は、ヘモフィルス(Haemophislus)生物体の莢膜多糖
部分である。このことによって、ジフテリア毒素を担体
タンパク質として使用した際のジフテリアに対する免疫
過敏可能性の問題を回避し(欧州特許第0,098,581号参
照)、かつ、特に乳児における本疾患をより良好に確実
に防御する。
発明者らは、成熟P1の残基60から88,165から193,189か
ら218,226から253,248から283,307から331,339から370,
384から412および400から437までに対応する配列を有す
る10個のペプチド類を固相ペプチド合成を用いて合成
し、これらは、免疫原性でありかつ合成ワクチン中で抗
原類としておよび単独または複合していずれかで結合ワ
クチン中で潜在的担体類として作用できる。
およびペプチドは、本疾患検出のための臨床検査キッド
中で使用できる。
Pサブタイプ3L)、および8358株(OMPサブタイプ6U)由
来P1遺伝子類のDANおよび誘導アミノ酸配列類を示して
いる。これらのデータは、先に報告されている(Munson
ら、インフェクション・エンド・イミュニティ(Infec
t.Immun.),57,3300(1989)); 第2図は、組換えP1産生のために構築された2個の発
現プラスミド類の構造を示している。Inouyおよび共同
研究者らによって記載されたベクター類pINIIIA3および
共通1ppプロモータを含有するこのベクターの一時変異
体を使用した。P1遺伝子は、MunsonおよびGrassによっ
て記載されたように(インフェクション・エンド・イミ
ュニティ(Infect.Immun.)56,2235(1988))、pRSM18
8からサブクローニングした。pRSM227およびpRSM291中
の合成リーダーペプチド類のDNAおよび誘導アミノ酸配
列を示してある。この構築体の詳細については、下記の
実施例Iに示してある; 第3図は、界面活性剤に不溶で外膜タンパク質類を高
含量とした調製物のクーマシーブルー(Coomassie−blu
e)染色SDS PAGEゲルを示している。レーン1は、イン
フルエンザ菌(Haemophilus influenzae)由来調製物
を含んでいる。レーン2および3は、それぞれP1を発現
しない大腸菌(E.coli)および発現する大腸菌(E.col
i)由来調製物を含有している。別の実験では、大腸菌
(E.coli)のcmpA遺伝子が変異を受け、外膜からompaタ
ンパク質を除去する。
acZ ompP1融合遺伝子(pRSM734)、およびP1遺伝子の
3′部分を含有する遺伝子融合物(pRSM793)を示して
いる。本構築体の詳細については、下記の実施例IIに示
してある。リーダーペプチドをコードするP1遺伝子の配
列類は、 としてあり、および前記のCRO−lacZ遺伝子は、 としてある; 第5図は、MinnA株由来P1遺伝子の部分配列およびpRS
M793中におけるompP1遺伝子とcro−lacZとの融合の結合
点を示している。融合点は、矢印によって示してある;
矢印に対する配列3′は、前記融合タンパク質の部分と
して発現される;および 第6図は、組換えP1タンパク質類のマウス単一特異生
抗血清のウェスタンブロット分析を示している。マウス
を下記に詳細に述べたように組換えP1または融合タンパ
ク質類で免疫して、血清をヘモフィルス(Haemophilu
s)によって産生されたP1に対する反応性を試験した。
本方法は、下記の実施例IXに示してある。レーン1は、
免疫マウスと同一コロニーから由来するマウスから得た
正常マウス血清;レーン2は、組換えP1に対する抗血
清;レーン3は、大腸菌(E.coli)/pRSM734によって産
生されたCRO−lacZ−P1融合タンパク質に対する抗血
清;レーン4は、大腸菌(E.coli)/pRSM793によって産
生されたCRO−lacZ−P1融合タンパク質に対する抗血
清;レーン5は、陽性対照である;膜は、モノクローナ
ル抗P1抗体類を含有する組織培養上清によってプロービ
ングした。
の外膜タンパク質P1をコードする遺伝子、MinnA株、161
3株および8358株をクローニングし、それらのヌクレオ
チド配列類は先に決定されている。P1の部分を含有する
組換えP1および融合タンパク質類は、大腸菌(E.coli)
中で産生された。部分精製組換え融合タンパク質類に対
して調製した抗血清はインフルエンザ菌(Haemophilus
influenzae)b中で産生されたP1タンパク質と反応し
た。このことは、組換えP1および融合タンパク質類が、
天然のP1を認識する抗体類を誘発することを示唆してい
る。
制御下に大腸菌(E.coli)中で発現でき、リーダーペプ
チドがなくても発現でき、または他のクローニング系中
で発現できる。グラム陽性細菌発現系、ワクチニアウイ
ルス、アデノウィルス、バキュロウイルス、酵母、真
菌、BCGまたは哺乳類発現系中における発現は、別の適
切な発現系となることができる。
よびLoeb(インフェクション・エンド・イミュニティ
(Infect.Immun.)55,2612(1987))によって報告され
ている。下記の実施例IIIでは、P1の精製改良法を詳細
に示している。本物質は、結合ワクチンの合成のために
使用した。ヘモフィルス(Haemophilus)オリゴ糖(HPR
P)は、制御下の酸加水分解によって調製されかつ臭化
シアン活性化によって精製P1タンパク質と結合させた。
結合に用いたPRP分子の平均分子径は、約20,000ダルト
ンと決定された。本結合にリンカー分子は、全く用いな
かった。本結合物の免疫原性をウサギで検定し、(下記
の第1表に記載のように)1次および2次抗PRP免疫応
答を観察した。さらに、ウサギ抗PRP−P1抗血清は、イ
ムノブロット分析においてP1に対して強い反応を示し
た。本データは、P1が結合ワクチン中において担体タン
パク質として使用できること、従って、ジフテリアまた
は破傷風毒素類を結合タンパク質として使用した際にジ
フテリアまたは破傷風に対する免疫過敏可能性の問題が
回避されることを示唆している。さらに、ワクチンとし
てのPRP−P1は、前記P1タンパク質に対する抗体類によ
って付与されたホモタイピック防御の結果として、特に
乳児におけるインフルエンザ菌(Haemophilus influen
zae)b型疾患に対してより連続的な防御を確実とする
と見なされる。
性であるので、本発明者らは、P1の免疫優性抗原決定基
(類)を同定することを決定しかつP1を基礎としたイン
フルエンザ菌(Haemophilus influenzae)b型ワクチ
ンに取り込まれるP1機能性領域を局在化しかつ特性解析
するためのプローブ類と作製した。ペプチド類14種がP1
タンパク質のカイト・ドーリットル(Kyte−Doolittl
e)プロット(ジャーナル・オブ・モレキュラーバイオ
ロジー(J.Mol.Biol.)、157,105(1982))において親
水性であると予測されており、従って、最初に調べるこ
とにした(下記の第2表を参照)。合成ペプチド類HIBI
1−1(残基1から29)、HIBI1−2(残基60から88)、
HIBI1−3(残基103から137)、HIBI1−4(残基165か
ら193)、HIBI1−5(残基189から218)、HIBI1−6
(残基226から253)、HIBI1−7(残基248から283)、H
IBI1−8(残基279から312)、HIBI1−9(残基307から
331)、HIBI1−10(残基339から370)、HIBI1−11(残
基384から412)、HIBI1−12(残基39から64)、HIBI1−
13(残基400から437)、およびHIBI1−14(6U株の残基4
00から433)をC末端またはN末端のいずれかにおいて
さらにシステンを添加して化学的に合成した。このペプ
チドの1端におけるこの特徴的なシステインは、特異的
な1方向において担体タンパク質に対するその結合を可
能とする。
統)およびモルモットにおいて天然のP1に対して作製さ
れた抗血清に対するそれらの反応性をペプチド特異的EL
ISA類で評価した。下記の第3表に示したように、全て
のマウス抗P1抗血清は、HIBI1−3、HIBI1−7、HIBI1
−9、およびHIBI1−13ペプチド類を極めてよく認識
し、一方、モルモット抗P1抗血清は、同一アッセイによ
ってHIBI1−13以外の全ての上記ペプチド類を認識し
た。このデータは、主な免疫優性のP1 B細胞抗原決定
基類がHIBI1−3(残基103から137)、HIBI1−7(残基
248から283)、HIBI1−9(残基307から331)、およびH
IBI1−13(残基400から437)内部に局在していることを
示唆している。
るかどうかを決定するため、遊離のペプチド類およびペ
プチドKLH結合物類をそれらの免疫原性についてそれぞ
れ評価した。ウサギを検疫し、ELISA、二重免疫拡散お
よびイムノブロット法によって抗ペプチド抗血清を検査
した。下記の第4表に示したように、HIBI1−8またはH
IBI1−8−KLH結合物に対して作製したものを除く全て
のウサギ抗血清が、それらのそれぞれの免疫ペプチド類
に対して単一特異性であることがELISAによって示され
た。遊離ペプチドによるぺプチド特異的抗体類の誘発
は、このペプチドが、Tヘルパー決定基およびB細胞抗
原決定基(類)の両方からなることを示唆している。さ
らに、抗HIBI1−4、抗HIBI1−5、抗HIBI1−7、抗HIB
I1−9、抗HIBI1−10、抗HIBI1−11、および抗HIBI1−1
4抗血清が、使用した全てのアッセイでP1を認識し、こ
のことは、これらの領域が露出しかつ遊離しており、抗
体類と相互作用することを示唆している。これらのペプ
チド類は潜在的Tヘルパー決定基を含有しておりかつペ
プチド−KLH結合物細胞がウサギにおいて強力な抗体反
応を誘発したので、それらがワクチン調製物中において
抗原として作用できることが明らかである。
ブリドーマ法の方法を使用したが、本開示およびこれら
の実施例には詳細には説明しておらず、これらは、化学
文献に詳細に報告されておりかつ十分当業者の能力の範
囲にある。
た発現系の構築を示している。
NIIIA3を使用した。このベクターは、タンデム(tando
m)プロモータ類(lppおよびlac)を含有している。本
系中では、遺伝子の発現は、ラクトース制御系によって
制御されている。我々の構築では、このP1遺伝子は、Mu
nsonおよびGrass(同上)によって記載のようにプラス
ミドpRSM188のPstIからEcoRIまでの断片として前記ベク
ターのEcoRI部位にクローニングされた。このベクター
のEcoRI部位とPstI部位の間のリーダーペプチドをコー
ドするセグメントは、合成オリゴヌクレオチド類によっ
て再構築された。このプラスミドは、pRSM227と命名さ
れた。P1の発現は、さらに、a)前記lppプロモータを
共通に変化させること(Inouyeら)、b)部位特異的変
異によって前記リーダーペプチドの配列を改変するこ
と、およびc)カナマイシンカセットを前記構築体中に
クローニングして前記プラスミドを安定させること、に
よって、さらに増強させた。最終構築体は、pRSM291と
命名される。P1の合成がlac制御系の制御下にあるの
で、P1合成は、イソプロピルチオガラクトシドの培地へ
の添加によって誘発された。
例示している。
築された。プラスミドpRSM188はP1遺伝子を含有し、P1
遺伝子の下流部位でEcoRIによって消化された(第2図
参照)。このEcoRI末端は平滑末端であり、P1遺伝子
は、PstI−EcoRI平滑末端断片として単離された。順番
にHind IIIによって消化し、平滑末端として、かつPstI
によって消化したpEx2ベクター中にこの断片をクローニ
ングした。この構築体を、pRSM734と命名した(第4
図)。成熟P1の配列類の全てを含む融合タンパク質は、
42℃への温度移行後大腸菌(E.coli)pop2136/pRSM734
によって産生される。
によって消化し(XbaIは、P1遺伝子中で一回切断す
る)、Exo IIIによって消化した。平滑末端化、連結お
よび形質転換後、前記融合タンパク質の部分として前記
P1遺伝子の3′部分のみを発現するクローンを単離しか
つ特性解析した。組換え融合が、イムノブロット分析で
ウサギまたはモルモットP1特異的抗血清によって認識さ
れることが判明した。このプラスミドを、pRSM793と命
名した(第4図および第5図参照)。
enzae)b型培養物由来タンパク質P1の精製を例示して
いる。
ロン(Cetavlon)(0.1%)沈澱物から精製した。培養
ペーストを、0.4M NaCl存在下ポリトロンによってホモ
ジナイズし、この懸濁物を室温で2時間、撹拌した。8,
000gで30分間遠心分離後、このペレットを10mM EDTA/
0.5%トリトン(Triton)/50mM トリス(Tris)塩酸、
pH8.0を含む緩衝液で抽出した。この抽出物は、細胞膜
からP1を優先的に可溶化した。粗P1抽出物をさらにエタ
ノール沈澱、DEAEおよびハイドロキシアパタイトクロマ
トグラフィによって精製した。これらの操作後、このP1
調製物は、さらにSDS PAGE分析および走査レーザーデ
ンシトメトリで決定した純度が95%以上であった。
る。
由来精製多糖(PRP)(米国特許第4,496,538号)を80−
90℃に十分な時間加熱して、セファロースCL−4Bカラム
によるゲルろ過によって決定した分子量範囲20,000−2,
000,000ダルトンを達成した。
し、このpHを1N NaOHによって10.5に調整した。氷浴中
で撹拌し、総量で容量0.1の濃縮臭化シアン溶液(5mM
NaHCO3,pH10.8中10%w/v)を添加した。このpHは、1.0N
水酸化ナトリウム溶液の添加によって10.0と11.0の間
に維持した。最終添加60分後、反応混合物のpHを1.0N塩
化水素酸によって6.0に低下させた。この活性化多糖
を、4℃で0.85%塩化ナトリウムに対する透析ろ過によ
って精製し、低分子量の反応物を除去した。PRP濃度
は、25mg/mLに保持した。
%トリトン(Triton)X−100含有0.85%塩化ナトリウ
ムに対して透析し、トリスを除去した。1容量の透析精
製P1タンパク質、0.1容量の透析ろ過活性化PRPおよび0.
1容量の1.0M 炭酸ナトリウムを密封可能な容器中で混
合した。このpHを9.4に調節し、この反応混合物を4℃
で15−18時間倒立させた。この時点では、未反応タパク
質またはPRPから結合物を精製除去しなかった。本混合
物中の多糖およびタンパク質濃度を標準的試験によって
決定した。PRP−P1結合物を、次に、ウサギ免疫化にお
ける免疫原として用いた。PRP−P1結合物の免疫原性を
下記の第1表に示した。
類の調整を例示した。
チドシンセサイザー中で合成し(下記の第2表参照)、
さらに、その後、フッ化水素酸を用いてレジンから切断
し、バイダック(Vydac)C4カラムおよび0.1%トリフル
オロ酢酸中のアセトニトリル直線勾配(0−40%)を用
いて逆相HPLCによって精製した。免疫原性試験のために
使用した全ての合成ペプチド類は、HPLC分析によって求
めた純度が95%を越えていた。ペプチドヒドロライゼー
ト類のアミン酸分析は、それらの理論的組成と良好に一
致していた。
トヘモシアニン)またはBSA(ウシ血清アルブミン)に
対して、担体タンパク質に対するペプチドのモル比10:1
で下記のように改良した標準的方法(Lieら、バイオケ
ミストリ(Biochemistry)、18、690(1979))によっ
て結合した。担体タンパク質は、最初にスルホサクシニ
ミル(4−ヨードアセチル)−アミノベンゾアート(Su
lfo−SIAB)によって改質された。さらに、この改質タ
ンパク質をゲルろ過HPLCによって精製した。このペプチ
ドは、その後、改質タンパク質担体と4−6時間混合
し、前記ペプチド−担体結合物をゲルろ過によって単離
した。
たプロトコール類を例示している。
のようにして調製した。ウサギ、モルモットまたはマウ
スを、完全フロインドアジュバンド中に乳化したP1、PR
P−P1またはそれぞれのペプチド−KLH結合物類を筋注し
て免疫した。100−500μlのリン酸緩衝生理食塩水(PB
S)中20乃至500μgの間の物質類を各注射に用いた。追
加免疫投与量(不完全フロインドアジュバンド中の免疫
原量の半分)を2週おきに投与した。血液を第1回注射
後2週おきに動物から採取した。遠心分離によって血清
を凝集血液試料から分離して、56℃で30分間加熱して不
活化後、−20℃で保存した。
例示している。
6時間インキュベーションすることによって、直接、マ
イクロタイタープレートに塗布した。このウェルを次に
リン酸緩衝液生理食塩水、7.4(PBS)中3%ウシ血清ア
ルブミン(BSA)によってブロックした。ペプチド特異
的抗血清に特異的な順次希釈したウサギ、モルモットま
たはマウスP1をウェルに添加して、このプレートを2時
間、室温でインキュベーションした。過剰の抗体を洗浄
緩衝液(PBS中0.1%ツウィーン(Tween)20)で3回洗
浄して除去した。市販のタンパク質A−アルカリホスフ
ァーゼ(phosphase)結合物を各ウェルに添加し、本プ
レートをさらに室温で1時間インキュベーションした。
この過剰のタンパク質A・パーオキシダーゼ結合物を除
去後、本プレートを洗浄緩衝液で4回洗浄して、テトラ
メチルベンチジン(TMB)基質0.2mlをH2O2とともに各ウ
ェルに添加した。本プレートを発色するまで暗所でイン
キュベーションした。本反応を1N硫酸50μlを添加して
停止させ、ウェルを450nmでELISAリーダーで読み取っ
た。得られた結果を下記の第3表に示した。
P1抗血清の特性解析を例示した。
合物類またはPRP−P1結合物類に対してウサギで調製し
た抗体類の特異性を、イムノブロッティング法を用いて
試験した。文献(Towbinら、プロシーディングズ・オブ
・ナショナルアカデミー・オブ・サイエンシズ(Proc.N
atl.Acad.Sci.),76,4350(1979))に記載のように、
精製した天然のP1または組換えP1を電気泳動して、その
後、SDS−PAGEゲルから電気的にニトロセルロース片に
移行した。次に、このニトロセルロース片を天然のタン
パク質P1,組換えP1,合成KLH−ペプチド結合物類またはP
RP−P1結合物類に対してウサギで調製し適当に希釈した
種々のウサギ抗血清と2乃至4時間インキュベーション
した。この抗血清を洗浄緩衝液(0.1%トリトンX−100
含有リン酸緩衝生理食塩水)で1:500に希釈した。過剰
の抗体は、前記の洗浄緩衝液で3乃至5回洗浄すること
によって除去した。アルカリホスファターゼに結合した
ヤギ抗ウサギIgG抗体は商業源から購入して、製造業者
の支持に従って第2抗体として使用した。
いる。
物をマウスの免疫に用いた。注射3回を行った。第1回
は、フロインド完全アジュバントとともに投与して、そ
の後の2回の免疫は、フロインド不完全アジュバンドと
ともに投与した。CRO−lacZ−P1融合タンパク質類は、p
RSM734またはpRSM793を含有する大腸菌(E.coli)株pop
2136)中で産生された(上記実施例II参照)。この融合
タンパク質類はSDS−PAGEによって精製し、ニトロセル
ロース上に電気ブロットした。マウスは、電気ブロット
免疫原含有ニトロセルロース片を移植することによって
皮下で2回免疫した。ウェスタンブロット分析は、界面
活性剤不溶性のインフルエンザ菌(Haemophilus influ
enzae)MinnA株調製物のSDS−PAGE、ニトロセルロース
片への電気的移行後、マウス抗血清(免疫マウス3匹か
らプールし、最終希釈1/100)およびアルカリホスファ
ターゼ結合ヤギ抗マウスIgGとともに順次インキュベー
ションした。前記ブロットおよび展開条件は、Munsonお
よびTolan(Infect.Immun.57,88(1989))によって記
載のように行った。得られた結果を第6図に示した。
s influenzae)b型のP1タンパク質を、前記成熟P1タ
ンパク質の特異的配列に対応する合成ペプチドを産生し
たのと同様に、P1遺伝子から組換え法によって産生し
た。これらの材料類は、ヘモフィルス(Haemophilus)
生物体が原因の疾患に対するワクチン調製およびタンパ
ク質−オリゴ糖結合物類の提供において有用である。本
発明の範囲内で、改良も可能である。
した。
Claims (3)
- 【請求項1】b型インフルエンザ菌(Haemophilus inf
luenzae)のP1タンパクの一部分のアミノ酸配列を含む
合成ペプチドであって、そのペプチドはそのタンパクの
表面露出領域に含まれる抗原性決定基の少くとも一つを
含むアミノ酸配列であって、その菌のMinnA株のP1タン
パクについて表2に示されたアミノ酸配列の残基で165
から193、189から218、248から283、307から331、339か
ら370、384から412、または400から437のアミノ酸配列
であるもの。 - 【請求項2】請求項1に記載のペプチドと担体分子から
なることを特徴とする複合体。 - 【請求項3】担体分子がヘモフィルス(Haemophilus)
生物体の被膜多糖類であることを特徴とする特許請求の
範囲第2項に記載の複合体。
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