RU2113111C1 - Method of plant growing from difficultly germinating seeds - Google Patents

Abstract

FIELD: agriculture. SUBSTANCE: seeds are cut at transverse plane of their section without embryo damage or seed envelopes are crushed without damage or with partial damage of embryo. Then seeds prepared by this manner are cultured on liquid or agarized medium in vitro. In the process of culturing seeds are transplanted successively for their further development on media at different concentrations of growth regulating agents and for plants obtaining from these seeds. Method is used for culturing in vitro embryos isolated from seeds and multiplication of plant species exhibiting difficultly germinating seeds. EFFECT: improved method of plant growing. 2 cl, 1 tbl, 5 dwg

Description

Изобретение относится к сельскому хозяйству, а более конкретно к культивированию in vitro, выделенных из семян зародышей и может быть использовано для размножения сортов и видов растений с плохо прорастающими семенами. Кроме размножения растений, одной из возможных областей использования предлагаемого способа является его применение в селекции для выращивания сеянцев из семян с недоразвитыми зародышем и эндоспермом, для отбора устойчивых генотипов на уровне зародышей. The invention relates to agriculture, and more particularly to in vitro cultivation isolated from germ seeds and can be used to propagate plant varieties and species with poorly germinating seeds. In addition to propagating plants, one of the possible areas of application of the proposed method is its use in breeding for growing seedlings from seeds with an underdeveloped embryo and endosperm, for the selection of resistant genotypes at the level of embryos.

Известно изобретение "Питательная среда для культивирования зародышей косточковых культур", включающее выделение из семян растений зародышей, культивирование их на питательной среде in vitro и выращивание из них растений (а. с. СССР N 1261587, 1986). Но выделение зародышей из семян требует больших затрат труда и характеризуется низким выходом растений при непосредственном воздействии питательной среды на зародыши. Питательная среда не позволяет выращивать растения из недоразвитых зародышей, так как для различных стадий развития зародышей требуется присутствие в среде разных регуляторов роста. The invention is known "Nutrient medium for the cultivation of embryos of stone fruit crops", including the isolation of seeds from plant seeds of embryos, cultivating them on a nutrient medium in vitro and growing plants from them (a. S. USSR N 1261587, 1986). But the selection of embryos from seeds requires a lot of labor and is characterized by a low yield of plants with direct exposure to the nutrient medium on the embryos. The nutrient medium does not allow growing plants from underdeveloped embryos, since for various stages of embryo development, the presence of different growth regulators in the medium is required.

Известен "Способ определения солеустойчивости растений", включающий выделение из семян растений зародышей, культивирование их на питательной среде in vitro и получение из них растений (а.с. СССР N 1166745, 1985). Но выделение зародышей из семян требует больших затрат труда и характеризуется низким выходом растений при непосредственном контакте зародышей с питательной средой. В способе выращивают растения из семян, полученных при скрещивании различных исходных форм. Но при скрещивании, например, диких видов, обладающих солеустойчивостью с культурными сортами, которые недостаточно совместимы на биохимическом уровне, образуются труднопрорастающие семена с недоразвитыми зародышами. Для получения растений из семян с недостаточно зрелыми зародышами требуется последовательное добавление в среды разных регуляторов роста, которые будут индуцировать прохождение зародышами стадий их развития вплоть до образования побегов. The well-known "Method for determining the salt tolerance of plants", including the isolation of seeds from plant seeds of embryos, cultivating them in a nutrient medium in vitro and obtaining plants from them (A.S. USSR N 1166745, 1985). But the selection of embryos from seeds requires a lot of labor and is characterized by a low yield of plants with direct contact of the embryos with the nutrient medium. In the method, plants are grown from seeds obtained by crossing various initial forms. But when, for example, wild species that have salt tolerance with cultivars that are not compatible enough at the biochemical level are crossed, difficult to germinate seeds with underdeveloped embryos are formed. To obtain plants from seeds with insufficiently mature embryos, the sequential addition of different growth regulators to the medium is required, which will induce the passage of embryos through the stages of their development up to the formation of shoots.

Известен "Способ выращивания растений подсолнечника in vitro", включающий выделение из семян зародышей, культивирование из на питательной среде in vitro и выращивание из них растений (прототип, а.с. СССР N 810160, 1981). Но выделение зародышей из семян способом прототипа требует больших затрат труда и характеризуется низким выходом растений при непосредственном воздействии питательной среды на зародыши. В способе прототипа не изменяют последовательно состав регулятора роста в питательной среде, что не позволяет выращивать растения из недоразвитых зародышей, находящихся на глобулярной, сердцевидной или торпедовидной стадиях развития. Кроме того, у зародышей может быть нарушен баланс эндогенных фитогормонов. Поэтому для образования семядолей у торпедовидных эмбриоидов, последующего развития гипокотилей и побегов необходимо применение питательных сред с различным содержанием экзогенных регуляторов роста. The well-known "Method of growing sunflower plants in vitro", including the selection of seeds from embryos, culturing from in vitro and growing plants from them (prototype, AS USSR N 810160, 1981). But the selection of embryos from seeds by the prototype method requires a lot of labor and is characterized by a low yield of plants under the direct influence of the nutrient medium on the embryos. In the prototype method, the composition of the growth regulator is not sequentially changed in a nutrient medium, which does not allow to grow plants from underdeveloped embryos that are at the globular, cordate or torpedo stages of development. In addition, the balance of endogenous phytohormones may be disturbed in the embryos. Therefore, for the formation of cotyledons in torpedo embryoids, the subsequent development of hypocotyls and shoots, it is necessary to use nutrient media with different contents of exogenous growth regulators.

В основу изобретения поставлена задача увеличения выхода растений из зиготических зародышей, культивируемых на питательной среде in vitro и сокращения затрат труда на выращивание растений из труднопрорастающих семян. Поставленная задача решается тем, что согласно предлагаемому нами изобретению вводится культивирование зародышей с частью оболочки семени, полученных путем поперечной разрезки семян или культивирование семян с раздавленной оболочкой без повреждения или с частичным повреждением зародыша. Необходимые затраты труда на поперечный разрез семян или частичное раздавливание их оболочки намного меньше, чем на выделение зародышей под бинокулярным микроскопом (способ прототипа). Часть оболочки семени с прилегающими к зародышу тканями защищает зародыш от резкого воздействия питательной среды, что способствует постепенной его адаптации. Питательная среда постепенно проникает к зародышу через разрез семени или в местах повреждения оболочки при раздавливании семени (в обоих случаях со стороны эндосперма), что моделирует естественный путь питания зародыша. Поэтому увеличивается процент выхода растений из высаженных зародышей. Перед высадкой на питательную среду зародыша с частью оболочки семени определяют стадию его развития в семенах различных сортов и видов растений. Недоразвитые зародыши с частями оболочек семян последовательно пересаживают для каждой следующей стадии их развития и получения из них растений на среды с разными концентрациями регуляторов роста. Для формирования сердцевидных зародышей из глобулярных в среду добавляют 6-бензиламинопурин (6-БАП), торпедовидных из сердцевидных - β -индолилуксусную кислоту ( β -ИУК). Для развития семядолей у торпедовидных эмбриоидов - 6-БАП. Для получения гипокотилия у торпедовидных эмбрионов - гибберелловую кислоту (ГАЗ). Для развития побегов у проростков - 6-БАП. Зародыши с частями оболочек семян культивируют в жидкой питательной среде, что ускоряет их развитие и дает возможность легко менять состав среды (зародыши с частями оболочек семян оседают на дно культурального сосуда, питательную среду сливают и наливают новую). В случае недоразвитости эндосперма питательная среда выполняет его функции. Культивирование зародышей с частями оболочек семян, полученных за счет поперечной разрезки или частичного раздавливания семян позволяет снизить затраты труда, так как эти операции более просты и требуют меньшей квалификации сотрудников по сравнению с вычислением зародышей из семян. The basis of the invention is the task of increasing the yield of plants from zygotic embryos cultivated on a nutrient medium in vitro and reducing labor costs for growing plants from non-germinating seeds. The problem is solved in that according to our invention, the introduction of the cultivation of embryos with part of the seed shell obtained by transverse cutting of seeds or the cultivation of seeds with a crushed shell without damage or with partial damage to the embryo. The necessary labor costs for a transverse section of the seeds or partial crushing of their shell is much less than for the selection of embryos under a binocular microscope (prototype method). A part of the seed coat with tissues adjacent to the embryo protects the embryo from a sharp influence of the nutrient medium, which contributes to its gradual adaptation. The nutrient medium gradually penetrates the embryo through a semen incision or in places of damage to the membrane during crushing of the seed (in both cases from the endosperm), which simulates the natural path of nutrition of the embryo. Therefore, the percentage of plant yield from the planted embryos increases. Before planting the embryo with a part of the seed coat, determine the stage of its development in the seeds of various varieties and species of plants. Underdeveloped embryos with parts of seed shells are sequentially transplanted for each subsequent stage of their development and production of plants from them on media with different concentrations of growth regulators. To form heart-shaped embryos from globular ones, 6-benzylaminopurin (6-BAP) is added to the medium, and β-indolylacetic acid (β-IAA) is torpedoid-shaped from heart-shaped ones. For the development of cotyledons in torpedo embryo - 6-BAP. To obtain hypocotylia in torpedo embryos - gibberellic acid (GAS). For the development of shoots from seedlings - 6-BAP. Embryos with parts of seed shells are cultivated in a liquid nutrient medium, which accelerates their development and makes it possible to easily change the composition of the medium (embryos with parts of seed shells settle to the bottom of the culture vessel, the nutrient medium is drained and poured new). In case of endosperm underdevelopment, the nutrient medium performs its functions. The cultivation of embryos with parts of the shells of seeds obtained by transverse cutting or partial crushing of seeds allows to reduce labor costs, as these operations are simpler and require less qualification of employees compared to the calculation of embryos from seeds.

На фиг. 1 (а и б) схематично показан поперечный разрез семени на две части: с зародышем и без зародыша; на фиг. 2 - прорастание семядолей зародыша через поперечный разрез семени, развитие корня и побега; на фиг. 3 представлено развитие семядолей и гипокотиля проростков из зародышей винограда в жидкой среде: на фиг. 4 (а и б) - проростки винограда высажены на агаризованную среду для развития побегов; на фиг. 5 (а и б) - развитие побегов и растений с корнями на агаризованной среде. In FIG. 1 (a and b) schematically shows a transverse section of the seed into two parts: with the embryo and without the embryo; in FIG. 2 - germination of the cotyledons of the embryo through a transverse incision of the seed, root and shoot development; in FIG. 3 shows the development of cotyledons and hypocotyls of seedlings from grape germ in a liquid medium: in FIG. 4 (a and b) - grape seedlings are planted on an agar medium for the development of shoots; in FIG. 5 (a and b) - the development of shoots and plants with roots on an agar medium.

Способ выращивания растений из труднопрорастающих семян, например, некоторых сортов винограда, которые содержат рудименты семян, или из быстро теряющих всхожесть семян полыни лимонной (Artemisia balchanorum Krasch. , всхожесть через год от момента сбора приближается к 0 - 1%), или из труднопрорастающих семян секвойядендрона гигантского (Sequojadendron giganteum Lindl. , в естественных условиях всхожесть 1 - 2%, в лаборатории - 10%), фисташки туполистной (Pistacia mutica Fich et May, в естественных условиях всхожесть меньше 1%, в лаборатории - 9%) осуществляют следующим образом. A method of growing plants from difficult-growing seeds, for example, some grape varieties that contain rudiments of seeds, or from quickly losing germination seeds of wormwood lemon (Artemisia balchanorum Krasch., Germination in a year from the time of collection approaches 0-1%), or from difficult-growing seeds giant sequoiadendron (Sequojadendron giganteum Lindl., in vivo germination of 1 - 2%, in the laboratory - 10%), blunt pistachios (Pistacia mutica Fich et May, in vivo germination of less than 1%, in the laboratory - 9%) as follows .

Семена подвергают поверхностной стерилизации. В стерильных условиях делают поперечный разрез семени (фиг. 1) на две части: на часть семени с зародышем 1 и на часть семени без зародыша 2. Поперечный разрез семени делают в такой плоскости A, которая исключает повреждение зародыша 3. Части семян 1, с находящимися в них зародышами 3, в стерильных условиях высаживают на агаризованную или в жидкую среду и культивируют in vitro до развития сеянцев (фиг. 2). Через разрез в части семени с зародышем проникает питательная среда. В случае дефектности семян из-за недоразвитости эндосперма питательная среда выполняет функции эндосперма и способствует развитию зародышей, а в случае недоразвитости зародышей в семенах регуляторы роста, находящиеся в среде, способствуют созреванию зародышей и взвывают развитие проростков (сеянцев). Seeds are surface sterilized. Under sterile conditions, a transverse section of the seed is made (Fig. 1) into two parts: a part of the seed with an embryo 1 and a part of the seed without an embryo 2. A transverse incision of the seed is made in a plane A that prevents damage to the embryo 3. Parts of the seed 1, s the embryos 3 located in them are planted under sterile conditions on an agarized or liquid medium and cultured in vitro until seedlings develop (Fig. 2). A nutrient medium penetrates through the incision in parts of the seed with the embryo. In the case of defective seeds due to the underdevelopment of the endosperm, the nutrient medium functions as an endosperm and promotes the development of embryos, and in the case of underdevelopment of the embryos in the seeds, growth regulators located in the medium promote the maturation of embryos and induce the development of seedlings.

У видов растений с мелкими семенами, например, Artemicia balchanorum трудно сделать поперечный разрез семени. Для таких видов может применяться раздавливание оболочки семян без повреждения или с частичным повреждением зародыша. In plant species with small seeds, for example, Artemicia balchanorum, it is difficult to make a transverse section of the seed. For such species, crushing of the seed coat without damage or with partial damage to the embryo can be used.

Кроме размножения растений одной из возможных областей использования предлагаемого способа является его применение в селекции растений. Так, например, при выведении новых бессемянных сортов винограда в ягодах образуются недоразвитые семена, которые к моменту созревания ягод атрофируются. При выведении устойчивых к милдью, оидиуму, серой гнили, филлоксере сортов винограда делают скрещивание устойчивого винограда Vitis rotundifolia, с неустойчивыми, но с хорошим качеством урожая сортами Vitis vinifera, с последующим насыщающими скрещиваниями. Однако при таких скрещиваниях образуются недоразвитые, непрорастающие семена. Из таких семян получают растения культивированием изолированных зародышей на питательной среде in vitro. Выделение зародышей - очень трудоемкий процесс, что делает массовое выращивание сеянцев практически невозможным. Предлагаемый нами способ позволяет высаживать на питательные среды большое количество зародышей с частью оболочки семени. Кроме того, оболочка семени обеспечивает постепенную адаптацию зародышей к питательной среде, что увеличивает процент их приживаемости. Частным случаем использования предлагаемого способа в селекции растений является его применение для отбора генотипов на уровне зародышей. Отрезанные части семян с зародышами, с целью отбора устойчивых генотипов к селективному фактору высаживают на среды, содержащие, например, повышенную концентрацию NaCl (солеустойчивость), маннит (засухоустойчивость), токсины патогенов (устойчивость к грибным болезням), гербициды (устойчивость к гербицидам) и т.д. Концентрации селективных факторов подбирают путем культивирования зародышей с частями оболочек семян устойчивых сортов или отбирают единичные, развивающиеся сеянцы, генотипы которых оказались устойчивы к селективному фактору, при ингибировании прорастания большинства зародышей. При применении предлагаемого нами способа (фиг. 2) гипокотиль 4 с семядолями 5 прорастает через поперечный разрез семени. Из "носика" семени вырастает корешок 6. После прорастания семядолей развивается побег 7. In addition to plant propagation, one of the possible areas of use of the proposed method is its use in plant breeding. So, for example, when new seedless grape varieties are bred, underdeveloped seeds are formed in the berries, which atrophy when the berries ripen. When cultivating grape varieties resistant to mildew, oidium, gray rot, and phylloxera, the resistant Vitis rotundifolia grapes are crossed with the unstable but good quality varieties Vitis vinifera, followed by satiating crosses. However, with such crosses, underdeveloped, non-germinating seeds are formed. From such seeds, plants are obtained by culturing isolated embryos on an in vitro growth medium. Germ isolation is a very time-consuming process, which makes the mass cultivation of seedlings almost impossible. Our proposed method allows you to plant on a nutrient medium a large number of embryos with part of the seed coat. In addition, the seed coat provides a gradual adaptation of the embryos to the nutrient medium, which increases the percentage of their survival. A special case of using the proposed method in plant breeding is its application for the selection of genotypes at the level of embryos. In order to select resistant genotypes for the selective factor, the cut off parts of seeds with embryos are planted on media containing, for example, an increased concentration of NaCl (salt tolerance), mannitol (drought tolerance), pathogen toxins (resistance to fungal diseases), herbicides (resistance to herbicides) and etc. Concentrations of selective factors are selected by cultivating the embryos with parts of the seed coat of resistant varieties or single, developing seedlings whose genotypes are resistant to the selective factor are selected when inhibiting the germination of most embryos. When applying our proposed method (Fig. 2), hypocotyl 4 with cotyledons 5 grows through a transverse incision of the seed. The root 6 grows from the "nose" of the seed. After germination of the cotyledons, an shoot 7 develops.

Пример. Берут зеленые ягоды от растений винограда через 20 - 75 дней после оплодотворения, моют в мыльной воде, промывают от мыльной воды. Ягоды стерилизуют 40 сек 90%-ным этиловым спиртом, затем 8 мин 0,1%-ным диоцидом или 10 мин 5%-ным гипохлоритом натрия и промывают стерильной дистиллированной водой 3 - 4 раза на протяжении 10 мин. В стерильных условиях из ягод выделяют семена, промывают в стерильной дистиллированной воде и производят поперечный разрез семян. В случае использования вызревших семян из зрелых ягод операции по стерилизации производят непосредственно с семенами. Предварительно определяют стадии развития зародышей в семенах, рассматривая их под бинокулярной лупой (глобулярная, сердцевидная, торпедовидная или с развитыми семядолями). Части семян с зародышами высаживают в жидкую среду таким образом, чтобы они или по крайней мере место среза были погружены в питательную среду (фиг. 2), содержащую минеральные элементы Nitsch, Nitsch (1969) (в мг/л): 950 KNO₃; 720 NH₄NO₃; 185 MgSO₄ • 7H₂O; 166 CaCl₂; 85 KH₂PO₄, 28 FeSO₄ • 7H₂O; 37 Na₂ ЭДТА • 2H₂O; 25 MnSO₄ • 4H₂O; 10 H₃BO₃; 10 ZnSO₄ • 7H₂O; 0,25 Na₂MoO₄ • 2H₂O; 0,025 CuSO₄ • 5H₂O; витамины: 0,5 никотиновой кислоты, 5,5 пиридоксина-HCl, 5,5 тиамина-HCl; 100 мезо-инозита; 20000 сахарозы; 7000 агар-агара (для агаризованной среды). pH устанавливают перед автоклавированием на значении 5, 6. В зависимости от того, на какой стадии находятся зародыши в среду добавляют необходимые для их дальнейшего развития регуляторы роста. Затем последовательно осуществляют пересадки этих зародышей с частями оболочек семян для прохождения ими каждой последующей стадии своего развития. Глобулярные зародыши высаживают в жидкую среду с цитокинином 6-бензиламинопуурином (6-БАП) в концентрации 0,5 мг/л. Образующиеся на этой среде через 10 - 15 дней сердцевидные зародыши пересаживают в жидкую среду с β -индолилуксусной кислотой ( β -ИУК) (0,1 мг/л). Формирующиеся затем через 15 - 20 дней торпедовидные зародыши для развития семядолей помещают в жидкую среду с 6-БАП (0,5 мг/л) и культивируют при освещенности 1000 - 3000 лк с фотопериодом 16 ч при температуре 25 - 27^oC. Через 20 - 30 дней развиваются проростки с зелеными семядолями, гипокотилями и в нижней части с белым зачаточным корешком (фиг. 3). Проростки, развившиеся в жидкой среде, в большинстве случаев освобождаются от оболочек семян (выходят через разрезы семян) и плавают отдельно. Хотя иногда можно увидеть и проростки с частями оболочек семян (фиг. 3, на проростке, находящемся с правой стороны, сохранилась часть оболочки семени, от которой его легко можно освободить пинцетом). Далее, проростки высаживают на агаризованную среду с 0,2 - 0,5 мг/л 6-БАП для развития побегов (фиг. 4а). Так, у проростка, находящегося в стакане с правой стороны, начал развиваться побег (фиг. 4а). В случае слабого развития гипокотиля проростки высаживают в жидкую или на агаризованную среду с гибберелловой кислотой (ГА₃) в концентрации 0,5 - 2 мг/л (ГА₃ добавляют в среду перед автоклавированием) (фиг. 4б), а затем пересаживают на агаризованную среду с 0,2 - 0,5 мг/л 6-БАП. Через 30 - 40 дней у проростков развиваются побеги (фиг. 5а). Побеги черенкуют на одноглазковые экспланты, содержащие лист, пазушную почку и части междоузлий с обеих сторон узла и высаживают на среду без регуляторов роста следующего состава (Зленко, Трошин, 1993), в мг/л: 308 NH₄NO₃; 922 KNO₃; 597 MgSO₄ • 7H₂O; 122 KH₂PO₄; 331 CaCl₂; Fe - хеллат по Мурасиге, Скугу (1962): 28 FeSO₄ • 7H₂O; 37 Na₂ ЭДТА; микроэлементы по Мурасиге, Скугу (1962): 22,3 MnSO₄ • 4H₂O; 6,2 H₃BO₃; 8,6 ZnSO₄ • 7H₂O; 0,25 Na₂MoO₄ • 2H₂O; 0,025 CuSO₄ • 5H₂O; 0,025 CoCl₂ • 6H₂O; 0,83 KJ; витамины: 20 мезо-инозита, 0,1 тиамина-HCl, 0,2 пиридоксина-HCl, 0,5 никотиновой кислоты; другие добавки: 1 феррулловой кислоты, 10000 сахарозы, 7000 агар-агара (для агаризованной среды). pH до автоклавирования среды - 5,6. Через 30 - 40 дней из одноглазковых эксплантов с листьями вырастают растения с хорошо развитой корневой системой (фиг. 5б).Example. Take green berries from grape plants 20 to 75 days after fertilization, washed in soapy water, washed from soapy water. The berries are sterilized for 40 seconds with 90% ethanol, then for 8 minutes with 0.1% diocide or 10 minutes with 5% sodium hypochlorite and washed with sterile distilled water 3-4 times for 10 minutes. In sterile conditions, seeds are extracted from berries, washed in sterile distilled water and a transverse section of the seeds is made. In the case of using ripened seeds from ripe berries, sterilization operations are carried out directly with the seeds. The stages of development of embryos in seeds are preliminarily determined by examining them under a binocular magnifying glass (globular, cordate, torpedo-shaped or with developed cotyledons). Parts of seeds with embryos are planted in a liquid medium so that they, or at least the cut-off point, are immersed in a nutrient medium (Fig. 2) containing mineral elements Nitsch, Nitsch (1969) (in mg / l): 950 KNO ₃ ; 720 NH ₄ NO ₃ ; 185 MgSO ₄ • 7H ₂ O; 166 CaCl ₂ ; 85 KH ₂ PO ₄ , 28 FeSO ₄ • 7H ₂ O; 37 Na ₂ EDTA • 2H ₂ O; 25 MnSO ₄ • 4H ₂ O; 10 H ₃ BO ₃ ; 10 ZnSO ₄ • 7H ₂ O; 0.25 Na ₂ MoO ₄ • 2H ₂ O; 0.025 CuSO ₄ • 5H ₂ O; vitamins: 0.5 nicotinic acid, 5.5 pyridoxine-HCl, 5.5 thiamine-HCl; 100 meso-inositol; 20,000 sucrose; 7000 agar-agar (for agar medium). The pH is set before autoclaving at a value of 5, 6. Depending on what stage the embryos are in, growth regulators necessary for their further development are added. Then, these embryos are transplanted sequentially with parts of the seed coat for each subsequent stage of their development. Globular embryos are planted in a liquid medium with cytokinin 6-benzylaminopuurine (6-BAP) at a concentration of 0.5 mg / L. The heart-shaped embryos formed on this medium after 10-15 days are transplanted into a liquid medium with β-indolylacetic acid (β-IAA) (0.1 mg / L). Then, torpedoid embryos formed after 15 to 20 days for the development of cotyledons are placed in a liquid medium with 6-BAP (0.5 mg / l) and cultivated under illumination of 1000 - 3000 lux with a photoperiod of 16 hours at a temperature of 25 - 27 ^o C. After 20 - 30 days, seedlings develop with green cotyledons, hypocotyls and in the lower part with a white rudimentary root (Fig. 3). The seedlings that developed in a liquid medium, in most cases, are released from the shells of the seeds (exit through the cuts of the seeds) and swim separately. Although sometimes you can see seedlings with parts of the seed shells (Fig. 3, on the seedling located on the right side, a part of the seed shell is preserved from which it can be easily freed with tweezers). Further, the seedlings are planted on an agar medium with 0.2-0.5 mg / L 6-BAP for the development of shoots (Fig. 4a). So, in a seedling located in a glass on the right side, an shoot began to develop (Fig. 4a). In the case of poor development of hypocotyl, seedlings are planted in a liquid or on an agar medium with gibberellic acid (HA ₃ ) at a concentration of 0.5 - 2 mg / l (GA _{3 is} added to the medium before autoclaving) (Fig. 4b), and then transplanted on agar medium with 0.2 - 0.5 mg / l 6-BAP. After 30 to 40 days, shoots develop shoots (Fig. 5a). Shoots are cut on one-eyed explants containing a leaf, axillary kidney and parts of internodes on both sides of the node and planted on medium without growth regulators of the following composition (Zlenko, Troshin, 1993), in mg / l: 308 NH ₄ NO ₃ ; 922 KNO ₃ ; 597 MgSO ₄ • 7H ₂ O; 122 KH ₂ PO ₄ ; 331 CaCl ₂ ; Fe — hellate according to Murasiga, Skoog (1962): 28 FeSO ₄ • 7H ₂ O; 37 Na ₂ EDTA; trace elements according to Murashige, Skoog (1962): 22.3 MnSO ₄ • 4H ₂ O; 6.2 H ₃ BO ₃ ; 8.6 ZnSO ₄ • 7H ₂ O; 0.25 Na ₂ MoO ₄ • 2H ₂ O; 0.025 CuSO ₄ • 5H ₂ O; 0.025 CoCl ₂ · 6H ₂ O; 0.83 KJ; vitamins: 20 meso-inositol, 0.1 thiamine-HCl, 0.2 pyridoxine-HCl, 0.5 nicotinic acid; other additives: 1 ferrulic acid, 10,000 sucrose, 7000 agar-agar (for agar medium). pH before autoclaving the medium is 5.6. After 30 to 40 days, plants with a well-developed root system grow from one-eyed explants with leaves (Fig. 5b).

Перед высадкой на адаптацию растения-сеянцы культивируют в объемных лабораторных сосудах (например, химических стаканах на 150 мл) с диаметром горлышка не менее 4 см. После 2 - 4 недель культивирования крышки из фольги заменяют на целлофановые (где целлофановая пленка прижата резиновым кольцом) и культивируют еще 2 - 3 недели. Через целлофановую пленку происходит газообмен и растения адаптируются к пониженной влажности, процессам дыхания и фотосинтеза. Полученные сеянцы пересаживают в теплицу и первые 20 - 30 дней их притеняют от попадания прямых солнечных лучей. Before planting for adaptation, seedlings are cultivated in volumetric laboratory vessels (for example, 150 ml beakers) with a neck diameter of at least 4 cm. After 2 to 4 weeks of cultivation, the foil caps are replaced by cellophane (where the cellophane film is pressed with a rubber ring) and cultivated another 2 to 3 weeks. Gas exchange occurs through the cellophane film and the plants adapt to low humidity, respiration and photosynthesis. The resulting seedlings are transplanted into the greenhouse and the first 20 to 30 days they are shaded from direct sunlight.

При высадке растений-сеянцев винограда в теплицу в июле-августе до конца вегетации не вырастают стандартные саженцы (длина вызревшей лозы не меньше 50 см), в то время как при высадке в марте-мае к концу вегетации вырастают саженцы, пригодные для высадки на постоянное место в поле для агробиологического излучения и выделения сеянцев - кандидатов в новые сорта. When planting grape seedlings in a greenhouse in July-August until the end of the growing season, standard seedlings do not grow (the length of the matured vine is not less than 50 cm), while when planting in March-May by the end of the growing season, seedlings are suitable for permanent planting place in the field for agrobiological radiation and allocation of seedlings - candidates for new varieties.

Применение предлагаемого способа (таблица) позволит значительно сократить затраты труда, а также увеличить выход растений при выращивании их из труднопроизрастающих семян путем культивирования зародышей по вышеуказанной схеме. The application of the proposed method (table) will significantly reduce labor costs, as well as increase the yield of plants when growing them from seeds that are difficult to grow by cultivating the embryos according to the above scheme.

Источники информации:
1. А.с. СССР N 810160, кл. A 01 H 1/04, 1981.Sources of information:
1. A.S. USSR N 810160, class A 01 H 1/04, 1981.

2. А.с. СССР N 1166745, кл. A 01 H 1/04, 1985. 2. A.S. USSR N 1166745, class A 01 H 1/04, 1985.

3. А.с. СССР N 1261587, кл. A 01 H 3/00, 1986. 3. A.S. USSR N 1261587, class A 01 H 3/00, 1986.

4. Murashige T., Skoog F.A. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures // Physiol. Plant., 1962. - V. 15. - p. 473 - 497. 4. Murashige T., Skoog F.A. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures // Physiol. Plant., 1962. - V. 15. - p. 473 - 497.

5. Nitsch J.P., Nitsch C. Haploid plants from pollen grains // Science, 1969. - V. 163. - N 3862. - p. 85 - 87. 5. Nitsch J.P., Nitsch C. Haploid plants from pollen grains // Science, 1969. - V. 163. - N 3862. - p. 85 - 87.

6. Зленко В. А. , Трошин Л.П. Соматический эмбриогенез в суспензионной культуре винограда in vitro // Цитология и генетика. - 1993. - Т. 27. - N 3. - с. 53 - 63. 6. Zlenko V. A., Troshin L. P. Somatic embryogenesis in suspension in vitro grape suspension culture // Cytology and Genetics. - 1993. - T. 27. - N 3. - p. 53 - 63.

Claims (2)

1. Способ выращивания растений труднопрорастающих семян, включающий культивирование зародышей в (на) питательной среде in vitro, отличающийся тем, что семена разрезают в плоскости их поперечного сечения без повреждения зародыша и часть семени с зародышем высаживают на питательную среду, а у сортов и видов растений с мелкими семенами оболочку семени раздавливают без повреждения или с частичным повреждением зародыша и высаживают in vitro, при этом недоразвитые зародыши с частью оболочки семени последовательно пересаживают для дальнейшего их развития и получения из них растений на среды с разными концентрациями регуляторов роста. 1. A method of growing plants of non-germinating seeds, including the cultivation of embryos in (on) a nutrient medium in vitro, characterized in that the seeds are cut in the plane of their cross section without damaging the embryo and part of the seed with the germ is planted on a nutrient medium, and in plant varieties and species with small seeds, the seed coat is crushed without damage or with partial damage to the embryo and planted in vitro, while the underdeveloped embryos with a part of the seed coat are successively transplanted for their further development. of vitium and the production of plants from them on media with different concentrations of growth regulators. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что для культивирования зародышей с частью оболочки семени в питательную среду добавляют регуляторы роста в зависимости от стадии развития зародышей и осуществляют дальнейшие пересадки для получения каждой последующей стадии и в конечном итоге - растений; для развития сердцевидных зародышей из глобулярных в среду добавляют 6 - бензиламинопурин (6-БАП), торпедовидных зародышей из сердцевидных - бета - индолилуксусную кислоту, для формирования семядолей у торпедовидных эмбриоидов - 6 - БАП, для получения гипокотилей у проростков - гибберелловую кислоту (ГА₃), для развития побегов у проростков - 6 - БАП.2. The method according to claim 1, characterized in that for the cultivation of embryos with part of the seed coat, growth regulators are added to the nutrient medium depending on the stage of development of the embryos and further transplants are carried out to obtain each subsequent stage and, ultimately, the plants; for the development of heart-shaped embryos from globular added to the medium 6 - benzylaminopurine (6-BAP), torpedo embryos from the heart-shaped - beta - indoleacetic acid, to form the cotyledons at torpedo embryoids - 6 - BAP to obtain hypocotyl in seedlings - gibberellic acid (GA ₃ ), for the development of shoots in seedlings - 6 - BAP.

Images