RU2108384C1 - Strain bacillus thuringiensis - a producer of endotoxin to coleopterus insects and a method of its culturing - Google Patents

Abstract

FIELD: microbiological industry. SUBSTANCE: invention relates to production of bacterial agents for plant protection, in part, bioinsecticide to coleopterus insects. Strain of bacterium Bacillus thuringiensis isolated from the natural environment is a producer of endotoxin for control of Colorado potato beetle. Strain has a number 16931 and deposited in VKPM at number B-6649. Cultural fluid of this strain (dilution is 1:10) causes 100% lethal effect on Colorado potato beetle larvae of I-II instars. For producing endotoxin nutrient medium is prepared, sown its with strain, cultured in fermenter up to sporulation onset. Then obtained cultural fluid is taken off (90-95% of volume), additional fermentation is carried out at the room temperature followed by centrifugation and preparing supernatant and paste. Paste is used for the end product making. Supernatant is fed to preparing new nutrient medium and residue of cultural fluid in fermenter is used as sowing material. EFFECT: strain indicated above, improved method of endotoxin preparing. 2 cl, 1 tbl

Description

Изобретение относится к микробиологической промышленности, а именно к производству бактериальных средств защиты растений. Изобретение может быть использовано при получении биоинсектицида для борьбы с жесткокрылыми насекомыми - вредителями пасленовых культур, в частности для борьбы против колорадского жука. The invention relates to the microbiological industry, in particular to the production of bacterial plant protection products. The invention can be used to obtain bioinsecticide for the control of beetle insects - pests of nightshade crops, in particular for the fight against the Colorado potato beetle.

Известен ряд веществ, применяемых против насекомых, поражающих сельскохозяйственные культуры, например химические инсектициды. Они эффективно уничтожают вредителей, но их действие, как правило, неспецифично. Кроме того, накапливаясь в окружающей среде, химические инсектициды создают неблагоприятную экологическую ситуацию. A number of substances are known for use against insects that infect crops, for example, chemical insecticides. They effectively kill pests, but their action is usually nonspecific. In addition, accumulating in the environment, chemical insecticides create an unfavorable environmental situation.

Известен ряд препаратов биологической природы, обладающих высокой инсектицидной активностью, например "Битоксибацилин" [1], "Новодор" [2]. Инсектицидная активность "Битоксибациллина" определяется термостабильным экзотоксином, который поражает сравнительно широкий спектр насекомых, а также белковым эндотоксином, токсичным только для чешуекрылых. Благодаря высокой стабильности экзотоксин слабо разлагается в почве, в связи с чем существует опасность его аккумуляции в окружающей среде. Гораздо более высокой специфичностью в отношении воздействия на жесткокрылых насекомых отличается препарат, в котором содержится белковый эндотоксин (препарат "Новодор"). Действующее начало - эндотоксин - получают методом микробиологического синтеза путем культивирования Bacillus thuringiensis (BT). Процесс ферментации проводят на питательной среде, содержащей необходимые источники питания, при фиксированной температуре, в условиях аэрирования и перемешивания. A number of preparations of biological nature with high insecticidal activity are known, for example, Bitoxibacillin [1], Novodor [2]. The insecticidal activity of Bitoxibacillin is determined by thermostable exotoxin, which affects a relatively wide range of insects, as well as protein endotoxin, toxic only to lepidoptera. Due to its high stability, exotoxin is slightly decomposed in the soil, and therefore there is a danger of its accumulation in the environment. A preparation with protein endotoxin (the drug "Novodor") is much more specific with respect to exposure to beetles. The active principle - endotoxin - is obtained by microbiological synthesis by cultivation of Bacillus thuringiensis (BT). The fermentation process is carried out on a nutrient medium containing the necessary power sources, at a fixed temperature, under conditions of aeration and mixing.

Наиболее близким техническим решением (прототипом) к изобретению является способ с использованием штамма Bacillus thuringiensis supp, tenebrionis DSM 2803 [3], синтезирующего кристаллический белковый эндотоксин, обладающий летальным действием против колорадского жука. Однако по некоторым культуральным характеристикам - время ферментации, уровень спонтанной индукции фага и других - штамм-прототип DSM 2803 обладает рядом существенных недостатков. The closest technical solution (prototype) to the invention is a method using a strain of Bacillus thuringiensis supp, tenebrionis DSM 2803 [3], synthesizing crystalline protein endotoxin, which has a lethal effect against the Colorado potato beetle. However, according to some cultural characteristics — fermentation time, level of spontaneous induction of phage and others — the DSM 2803 prototype strain has a number of significant drawbacks.

Питательная среда для штамма-прототипа обладает рядом недостатков: содержащим большое количество дорогих компонентов, сложна в изготовлении и не может быть использована в крупнотоннажном производстве биопестицидов. The nutrient medium for the prototype strain has several disadvantages: containing a large number of expensive components, is difficult to manufacture and cannot be used in large-scale production of biopesticides.

Цель изобретения - использование в качестве продуцента вновь полученного штамма Bac. thuringiensis (ВКПМ В-6649), активного против жесткокрылых насекомых, с улучшенными технологическими характеристиками, и способ его культивирования, отличающийся двухстадийностью и многократным применением в качестве компонента питательной среды фугата, полученного из культуральной жидкости. Наиболее близким техническим решением способа культивирования предложенного штамма является метод [4]. The purpose of the invention is the use as a producer of the newly obtained strain of Bac. thuringiensis (VKPM B-6649), active against beetles, with improved technological characteristics, and a method for its cultivation, characterized by two-stage and repeated use as a component of the nutrient medium of the centrate obtained from the culture fluid. The closest technical solution to the method of cultivation of the proposed strain is the method [4].

Предлагаемый способ получения эндотоксина осуществляют следующим образом. The proposed method for producing endotoxin is as follows.

Процесс микробиологического синтеза эндотоксина ведут с использованием штамма ВКМП В-6649, продуцирующего эндотоксин. Штамм культивируют в ферментере на питательной среде, содержащей необходимые компоненты. Через 18-20 ч. роста начинается спорообразование культуры. Показано, что для споруляции не требуется строго поддерживать параметры культивирования. Следовательно, можно перевести 30-95% культуральной жидкости (КЖ) в емкость, а оставшуюся в ферментере часть КЖ использовать в качестве посевного материала. Для приготовления новой питательной среды можно использовать фугат, оставшийся после центрифугирования КЖ от предыдущей ферментации. Предварительно простерилизованную новую ферментационную среду передают в ферментер с оставшимся в нем посевным материалом и начинают новый цикл культивирования. Таким образом, процесс биосинтеза эндотоксина осуществляется путем проведения последовательных циклов, каждый из которых включает две стадии. Для первой - активной стадии (рост культуры до начала споруляции) используется ферментер, а для второй - пассивной стадии (завершение споруляции культуры и образование кристаллов эндотоксина) применяется емкость без систем термостатирования и аэрирования. The microbiological synthesis of endotoxin is carried out using a strain of VKMP B-6649 producing endotoxin. The strain is cultured in a fermenter on a nutrient medium containing the necessary components. After 18-20 hours of growth, sporulation of the culture begins. It has been shown that sporulation does not require strict maintenance of cultivation parameters. Therefore, it is possible to transfer 30-95% of the culture fluid (QoL) into the container, and use the remaining part of the QoL in the fermenter as a seed. To prepare a new nutrient medium, you can use the centrate remaining after centrifugation of QOL from the previous fermentation. The pre-sterilized new fermentation medium is transferred to the fermenter with the seed left in it and a new culture cycle is started. Thus, the process of endotoxin biosynthesis is carried out by conducting sequential cycles, each of which includes two stages. For the first - active stage (growth of the culture before sporulation begins) a fermenter is used, and for the second - the passive stage (completion of sporulation of the culture and the formation of endotoxin crystals) a container is used without thermostating and aeration systems.

Установлено, что таким образом можно провести 4 последовательных цикла без ущерба накоплению конечного продукта. It was found that in this way 4 consecutive cycles can be carried out without prejudice to the accumulation of the final product.

Таким образом можно повысить производительность ферментера, используемого для биосинтеза, при одновременном снижении удельного расхода воды на приготовление питательной среды и значительном уменьшении объема сточных вод при получении целевого продукта. Thus, it is possible to increase the productivity of the fermenter used for biosynthesis, while reducing the specific consumption of water for the preparation of a nutrient medium and a significant reduction in the volume of wastewater when obtaining the target product.

Предлагаемый штамм ВКПМ В-6649, продуцент эндотоксина против жесткокрылых, и способ его культирования иллюстрируется следующими характеристиками и примерами. Заявляемый штамм имеет следующие характеристики:
1. Культурально-морфологические признаки. Грамположительные подвижные палочки размером 1,4-1,8х2,6-3,2 мкм. Образуют споры и кристаллические включения в основном, квадратной и реже- ромбической формы. На агаризованных средах через 24 роста при 30^oC образует круглые с ровными краями колонии размером 5-6 мм с матовой поверхностью.The proposed strain VKPM B-6649, a producer of endotoxin against beetles, and the method of its cultivation is illustrated by the following characteristics and examples. The inventive strain has the following characteristics:
1. Cultural and morphological characteristics. Gram-positive moving sticks with a size of 1.4-1.8x2.6-3.2 microns. They form spores and crystalline inclusions of mainly square and rhombic shape. On agarized media, after 24 growths at 30 ^° C, it forms round colonies with even edges 5-6 mm in size with a matte surface.

При культивировании в жидких питательных средах при аэрации штамм растет равномерно по всему объему. When cultivated in liquid nutrient media during aeration, the strain grows uniformly throughout the volume.

При росте в богатых питательных средах - дрожже-полисахаридная среда (ДПС: кормовые дрожжи - 30 г/л, кукурузная мука - 15 г/л) споро- и кристаллообразование завершаются к 44-46 ч. культивирования при 28-34^oC. Титр термоустойчивых спор при культивировании в среде ДПС до 2,1 млрд. спор/мл, при росте в дрожжевой среде - 1,8-2,0 млрд. спор/мл. При культивировании на твердых и жидких питательных средах не наблюдается спонтанный выход фага.When growing in rich nutrient media - yeast-polysaccharide medium (DPS: feed yeast - 30 g / l, corn flour - 15 g / l) spore and crystal formation are completed by 44-46 hours of cultivation at 28-34 ^o C. heat-resistant spores during cultivation in DPS medium up to 2.1 billion spores / ml, with growth in yeast medium - 1.8-2.0 billion spores / ml. When cultured on solid and liquid nutrient media, spontaneous phage emergence is not observed.

2. Физиолого-биохимические признаки. Штамм ВТ ВКПМ В-6649 не сбраживает маннозу, салицин, эскулин; лецитиназу не образует; гидролизует крахмал; сахарозу сбраживают. Штамм усваивает ионы аммония и глутаминовую кислоту. Режим культивирования 28-34^oC, оптимум роста - 32^oC. Значения pH питательной среды для оптимального культивирования - 6,8-7,2. Штамм термостабильный экзотокин не синтезирует.2. Physiological and biochemical characteristics. Strain VT VKPM B-6649 does not ferment mannose, salicin, esculin; does not form lecithinase; hydrolyzes starch; fermented sucrose. The strain assimilates ammonium ions and glutamic acid. The cultivation mode is 28-34 ^o C, the optimum growth is 32 ^o C. The pH of the nutrient medium for optimal cultivation is 6.8-7.2. The strain does not synthesize thermostable exotokin.

3. Генетические характеристики. В клетках штамма ВТ ВКПМ В-6649 содержатся экстрахромосомальные элементы (плазмиды) с молекулярными массами (в килобазах, кв): 60, 40 и 10. Генетические детерминанты токсинообразования локализованы на плазмиде с мол. весом 60 кв. Штамм устойчив к полимиксину - 100 мкг/мл. Кристаллы штамма состоят из белков с молекулярными массами - 40, 73, 68 и 65 кDa (возможно, два последних белка являются продуктами распада белка 73 кDa). 3. Genetic characteristics. The cells of the strain VT VKPM B-6649 contain extrachromosomal elements (plasmids) with molecular masses (in kilobases, sq): 60, 40 and 10. Genetic determinants of toxin formation are localized on the plasmid with mol. weighing 60 square meters. The strain is resistant to polymyxin - 100 μg / ml. The crystals of the strain consist of proteins with molecular weights of 40, 73, 68, and 65 kDa (perhaps the last two proteins are degradation products of the 73 kDa protein).

4. Инсектицидные свойства. Штамм высоко активен против жесткокрылых насекомых, в частности против колорадского жука. Инсектицидная активность связана с кристаллическим белковым эндотоксином. Молекулярная масса белкового токсина составляет 73 кDa. Эффективность штамма определялась в лабораторных условиях на личинках колорадского жука I-II возраста. 4. Insecticidal properties. The strain is highly active against beetles, in particular against the Colorado potato beetle. Insecticidal activity is associated with crystalline protein endotoxin. The molecular weight of the protein toxin is 73 kDa. The effectiveness of the strain was determined in laboratory conditions on the larvae of a Colorado potato beetle I-II age.

5. Способ получения штамма. Штамм выделен из природной среды (из мертвой озимой совки) методом ацетатной селекции. Селекция штамма велась по следующим признакам: время спорообразования, фагоносительство, токсичность. 5. A method of obtaining a strain. The strain was isolated from the natural environment (from a dead winter scoop) by the method of acetate selection. The selection of the strain was carried out according to the following characteristics: time of spore formation, phagonosuction, toxicity.

Пример 1. Сравнительные биоиспытания штаммов ВТ в лабораторных условиях. Example 1. Comparative biological testing of BT strains in laboratory conditions.

Для сравнительной оценки проведены лабораторные испытания токсичности штамма ВТ ВКПМ В-6649 и прототипа DSM 2803 на личинках колорадского жука. Штамм культивировали в стандартных условиях (дрожже-полисахаридная среда, 60 ч. роста, аэрация, 28-32^oC). Листья картофеля одинакового размера замачивали в бюксах с различными разведениями культуральной жидкости обоих штаммов. После подсушивания листья, черенок которых был обернут влажной ватой (чтобы лист не подсыхал), переносили в чашки Петри и кисточкой помещали по 10 личинок колорадского жука I-II возраста. Каждое разведение испытывали в 3 повторностях. Чашки инкубировали при комнатной температуре 3 дня на свету. Результаты предоставлены в таблице.For a comparative assessment, laboratory tests of the toxicity of strain VT VKPM B-6649 and prototype DSM 2803 were carried out on larvae of the Colorado potato beetle. The strain was cultured under standard conditions (yeast-polysaccharide medium, 60 hours growth, aeration, 28-32 ^o C). Potato leaves of the same size were soaked in bottles with different dilutions of the culture fluid of both strains. After drying, the leaves, the stem of which was wrapped with moist cotton (so that the leaf does not dry), were transferred to Petri dishes and 10 larvae of a Colorado potato beetle I-II age were placed with a brush. Each dilution was tested in 3 replicates. The plates were incubated at room temperature for 3 days in the light. The results are presented in the table.

Пример 2. Определение концентрации токсического белка ВТ, активного против жесткокрылых насекомых, методом иммуноферментного анализа (ИФА). Example 2. Determination of the concentration of toxic BT protein active against beetles, by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA).

Метод основан на избирательном связывании токсичного белка ВТ поликлональными антителами (АТ), полученными из кроличьих антисывороток к очищенному белку и иммобилизованными на пластиковой основе. Комплекс антиген-антитело окрашивается в результате реакции пероксидазы с o-фенилендиамином с образованием цветного комплекса, по оптической плотности которого определяют концентрацию белка в испытуемых образцах (по сравнению со стандартными растворами антигена - от 2 мг до 2 нг с кратностью 10) [5]. The method is based on the selective binding of toxic BT protein by polyclonal antibodies (AT) obtained from rabbit antisera to a purified protein and immobilized on a plastic basis. The antigen-antibody complex stains as a result of the reaction of peroxidase with o-phenylenediamine to form a color complex, the optical density of which determines the protein concentration in the test samples (compared to standard antigen solutions, from 2 mg to 2 ng with a multiplicity of 10) [5].

Пробу КЖ объемом 1 мл центрифугировали на центрифуге "Эппендорф" в течение 10 мин при комнатной температуре. Осадок растворяли тем же количеством 0,5 н. NaOH, тщательно размешивали и выдерживали при комнатной температуре 1 ч. Далее центрифугировали 10 мин и работали с надосадком. A 1 ml QL sample was centrifuged on an Eppendorf centrifuge for 10 min at room temperature. The precipitate was dissolved in the same amount of 0.5 N. NaOH was thoroughly stirred and kept at room temperature for 1 h. Then it was centrifuged for 10 min and worked with the supernatant.

Поликлональные АТ (с известной заранее концентрацией) разводили в боратном буфере до 5 мкг/мл и ими заполняли плоскодонный планшет 12-канальными пипетманом по 50 мкл, закрывали крышкой и инкубировали 4 ч. при комнатной температуре или ночь в холодильнике. Отмывали в водопроводной воде 5 раз и добавляли по 100 мл 1% раствор БСА в боратном буфере, инкубировали 2 ч. при комнатной температуре, отмывали водопроводной водой 5 раз. Образцы и разводки стандартного антигена (2 нг, 20 нг, 200 нг, 2 мкг, 20 мкг, 200 мкг, 2 мг) наносили в 2 повторах на планшет по 50 мкл и добавляли туда же такое же количество АТ (концентрация 250 нг/мл). Инкубировали 1 ч. при 37^oC, отмывали 5 раз водопроводной водой и производили скрашивание свежеприготовленным раствором o-фенилендиамина в фосфатно-цитратном буфере с добавлением перекиси водорода (4 мг o-фенилендиамина, 10 мл буфера, 4 мкл H₂O₂) по 100 мкл. В течение нескольких минут происходило окрашивание бесцветного комплекса АГ/АТ в желто-коричневый цвет, который фиксировали добавлением 10% H₂SO₄. Измерение оптической плотности проводили на мультискане при 492 нм.Polyclonal antibodies (with a known concentration) were diluted in borate buffer to 5 μg / ml and they were filled into a flat-bottomed plate with 12-channel pipetman of 50 μl, closed with a lid and incubated for 4 hours at room temperature or overnight in the refrigerator. Washed in tap water 5 times and 100 ml of 1% BSA solution in borate buffer was added, incubated for 2 hours at room temperature, washed with tap water 5 times. Samples and distributions of the standard antigen (2 ng, 20 ng, 200 ng, 2 μg, 20 μg, 200 μg, 2 mg) were applied in 2 replicates on a 50 μl plate and the same amount of AT was added there (concentration of 250 ng / ml ) Incubated for 1 h at 37 ^o C, washed 5 times with tap water and brightened with freshly prepared solution of o-phenylenediamine in phosphate-citrate buffer with the addition of hydrogen peroxide (4 mg of o-phenylenediamine, 10 ml of buffer, 4 μl of H ₂ O ₂ ) 100 μl Within a few minutes, the colorless AG / AT complex was stained yellow-brown, which was fixed by the addition of 10% H ₂ SO ₄ . The optical density was measured on a multiscan at 492 nm.

По калибровочной кривой определяли содержание токсического белка ВТ в мг/мл. The content of toxic BT protein in mg / ml was determined from the calibration curve.

Содержание целевого токсина в последующих примерах и циклах определяли методом ИФА. The content of the target toxin in the following examples and cycles was determined by ELISA.

Пример 3. Культивирование штамма. Example 3. Cultivation of the strain.

Для культивирования штамма-продуцента использовали ферментер вместимостью 1,2 л. Ферментационную среду готовили, используя водопроводную воду. Компоненты среды брали в расчете на 0,8 л среды. For the cultivation of the producer strain, a fermenter with a capacity of 1.2 L was used. A fermentation medium was prepared using tap water. The components of the medium were taken based on 0.8 l of medium.

Состав среды, г/л:
Кормовые дрожжи (ВВК) - 15
Хлористый кальций - 0,5
Пропинол Б400 - 1,0
Вода - Остальное
Величина pH среды перед стерилизацией составляла 6,.8-7,2. Среду стерилизовали в автоклаве при давлении 0,8 МПа в течение 45 мин. После стерилизации среду охлаждали до 30-35^oC. Засев среды производили в асептических условиях при помощи стерильной петли. Объем посевного материала составлял 1% объема питательной среды. Затем среду загружали в простерилизованный ферментер (ферментер стерилизовали при тех же условиях, что и ферментационную среду) через посевную колбу. Процесс ферментации - активная стадия - вели при следующих условиях:
Температура - 33+1^oC
Скорость вращения мешалки - 500 об/мин
Расход воздуха - 0,8 л/мин
pH - статирование - Нет
Через 26-30 ч. роста КЖ через пробоотборник сливали в емкость. При этом в ферментере оставляли КЖ, которая служила в качестве посевного материала для следующего цикла. Выдержка в емкости - пассивная стадия велась в течение 24 ч. при комнатной температуре. Содержание белка в КЖ составляло 2,0 г/л. Далее КЖ центрифугировали при 6000 об/мин в течение 30 мин. Полученную пасту использовали для приготовления конечного продукта, а фугат - для приготовления новой питательной среды.The composition of the medium, g / l:
Fodder Yeast (VVK) - 15
Calcium Chloride - 0.5
Propinol B400 - 1.0
Water - Else
The pH of the medium before sterilization was 6, .8-7.2. The medium was autoclaved at a pressure of 0.8 MPa for 45 minutes. After sterilization, the medium was cooled to 30-35 ^o C. Inoculation of the medium was carried out under aseptic conditions using a sterile loop. The amount of seed was 1% of the volume of the nutrient medium. Then the medium was loaded into a sterilized fermenter (the fermenter was sterilized under the same conditions as the fermentation medium) through a seed flask. The fermentation process - the active stage - was conducted under the following conditions:
Temperature - 33 + 1 ^o C
Mixer rotation speed - 500 rpm
Air consumption - 0.8 l / min
pH - Statization - No
After 26-30 hours of growth, QOL through a sampler was poured into a container. At the same time, QOL was left in the fermenter, which served as seed for the next cycle. Exposure in the tank - the passive stage was carried out for 24 hours at room temperature. The protein content in QOL was 2.0 g / L. Next, QOL was centrifuged at 6000 rpm for 30 minutes. The resulting paste was used to prepare the final product, and the centrate was used to prepare a new nutrient medium.

Пример 4. Использование КЖ в качестве посевного материала. Example 4. The use of QOL as seed.

Данный пример аналогичен предыдущему, за исключением того, что в качестве посевного материала использовали КЖ, которая была оставлена в ферментере в предыдущем цикле, при этом ферментер повторно не стерилизовали. Оптимальным количеством оставляемой КЖ являлось 5-10% от начального объема. This example is similar to the previous one, except that QL was used as seed, which was left in the fermenter in the previous cycle, and the fermenter was not sterilized again. The optimal amount of QoL left was 5-10% of the initial volume.

Пример 5. Использование фугата для приготовления новой питательной среды. Example 5. The use of centrate for the preparation of a new nutrient medium.

Данный пример аналогичен предыдущему, за исключением того, что для приготовления питательной среды использовали полученный ранее фугат. Если количество фугата недостаточно для проведения нужного объема среды, тогда объем доводили водопроводной водой. Показано, что при однократном использовании фугата в КЖ накапливалось не менее 2,0 г/л белка. This example is similar to the previous one, except that the previously obtained centrate was used to prepare the nutrient medium. If the amount of centrate is not enough to carry out the desired volume of medium, then the volume was adjusted with tap water. It was shown that with a single use of the centrate, at least 2.0 g / l of protein was accumulated in the QOL.

Пример 6. Способ ферментации. Example 6. The method of fermentation.

Ферментация состояла из 4 циклов. Компоненты питательной среды, условия стерилизации и культивирования (активной и пассивной стадии), центрифугирования одинаковы для всех циклов. Fermentation consisted of 4 cycles. The components of the nutrient medium, sterilization and culture conditions (active and passive stages), centrifugation are the same for all cycles.

Для культивирования продуцента использовали ферментер объемом 1,2 л. Компоненты среды брались в расчете на объем среды 0,8 л. For the cultivation of the producer, a 1.2 L fermenter was used. The components of the medium were taken based on the volume of the medium of 0.8 liters.

Состав среды, г/л
Кормовые дрожжи (БВК) - 15
Хлористый кальций - 0,5
Пропинол Б400 - 1,0
Посевной материал выращивали в пробирке на качалке в течение 8-12 ч. при температуре 30-33^oC. Состав среды для посевного материала аналогичен ферментационной среде.The composition of the medium, g / l
Fodder Yeast (BVK) - 15
Calcium Chloride - 0.5
Propinol B400 - 1.0
The seed was grown in a test tube on a rocking chair for 8-12 hours at a temperature of 30-33 ^o C. The composition of the medium for the seed is similar to the fermentation medium.

1-й цикл. Среду готовили на водопроводной воде, pH доводили до 6,8-7,2 40% раствором NaOH. Ферментационную среду и ферментер стерилизовали в автоклаве при давлении 0,8 МПа в течение 45 мин. 1st cycle. The medium was prepared in tap water, the pH was adjusted to 6.8-7.2 with 40% NaOH solution. The fermentation medium and the fermenter were autoclaved at a pressure of 0.8 MPa for 45 minutes.

Простерилизованную ферментационную среду охлаждали до температуры 30-45^oC и после этого в асептических условиях при помощи стерильной пипетки засевали посевным материалом в количестве 1,0% от объема среды. Затем среду в асептических условиях через посевную колбу заливали в ферментер. Процесс вели при следующих условиях:
Температура - 33+1^oC
Скорость вращения мешалки - 500 об/мин
Расход воздуха - 0,8 л/мин
pH-статирование - Нет
После 26-30 ч. роста КЖ сливали в емкость, при этом в ферментере оставляли приблизительно 5-10% КЖ в качестве посевного материала для следующего цикла. Слитую КЖ выдерживали в емкости при температуре окружающей среды. После выдерживания КЖ содержала 2,0 г/л белка эндотоксина. Далее КЖ центрифугировали при 6000 об/мин в течении 30 мин. Полученную пасту направляли на дальнейшую обработку, а фугат использовали для приготовления питательной среды 3-го цикла.The sterilized fermentation medium was cooled to a temperature of 30-45 ^o C and then under aseptic conditions using a sterile pipette seeded with seed in an amount of 1.0% of the volume of medium. Then the medium under aseptic conditions through a seed flask was poured into the fermenter. The process was conducted under the following conditions:
Temperature - 33 + 1 ^o C
Mixer rotation speed - 500 rpm
Air consumption - 0.8 l / min
pH stating - No
After 26-30 hours of growth, QOL was poured into a container, while approximately 5-10% QL was left in the fermenter as seed for the next cycle. The fused QOL was kept in a container at ambient temperature. After aging, the QOL contained 2.0 g / l of endotoxin protein. Next, QOL was centrifuged at 6000 rpm for 30 minutes. The resulting paste was sent for further processing, and the centrate was used to prepare a nutrient medium of the 3rd cycle.

2-й цикл. После того как КЖ от 1-го цикла слили из ферментера в емкость, в ферментер в асептических условиях заливали свежую простерилизованную питательную среду, приготовленную на водопроводной воде. При этом ферментер заново не стерилизовали, а в качестве посевного материала использовали КЖ, оставленную в ферментере от 1-го цикла. Культивирование в ферментере велось в течение 26-30 ч. , после чего КЖ сливали в емкость, оставляя в ферментере 5-10% КЖ в качестве посевного материала для следующего цикла. После выдерживания содержание белка в КЖ - 2,0 г/л. Затем КЖ центрифугировали, полученную пасту направляли на дальнейшую обработку, а фугат использовали на приготовления питательной среды 4-го цикла. 2nd cycle. After QL from the 1st cycle was drained from the fermenter into a container, fresh sterilized growth medium prepared with tap water was poured into the fermenter under aseptic conditions. At the same time, the fermenter was not sterilized again, and QL left in the fermenter from the 1st cycle was used as seed. Cultivation in the fermenter was carried out for 26-30 hours, after which the QOL was poured into the tank, leaving 5-10% QL in the fermenter as seed for the next cycle. After aging, the protein content in QOL is 2.0 g / l. Then, QL was centrifuged, the resulting paste was sent for further processing, and the centrate was used to prepare the 4th cycle nutrient medium.

3-й цикл. Ферментационную среду готовили, используя фугат, полученный в 1-й цикле. Простерилизованную среду в асептических условиях заливали в ферментер после его освобождения от КЖ 2-го цикла. Культивирование в ферментере велось в течение 26-30 ч. , после чего КЖ сливали в емкость, оставляли в ферментере 5-10% КЖ. После выдерживания содержания белка в КЖ 2,0 г/л. КЖ центрифугировали, полученную пасту направляли на дальнейшую обработку, а фугат сливали в канализацию. 3rd cycle. The fermentation medium was prepared using the centrate obtained in the 1st cycle. The sterilized medium under aseptic conditions was poured into the fermenter after it was released from the QOL of the 2nd cycle. Cultivation in the fermenter was carried out for 26-30 hours, after which the QOL was poured into a container, 5-10% QL was left in the fermenter. After maintaining the protein content in QOL 2.0 g / L. QL was centrifuged, the resulting paste was sent for further processing, and the centrate was poured into the sewer.

4-й цикл. Ферментационную среду готовили, используя фугат, полученный во 2-м цикле. Простерилизованную среду в асептических условиях заливали в ферментер после его освобождения от КЖ 3-го цикла. Культивирование в ферметере велось в течение 26-30 ч., после чего КЖ сливали в емкость. После выдерживания содержание белка в КЖ - 2,0 г/л. Далее КЖ центрифугировали, полученную пасту направляли на дальнейшую обработку, а фугат сливали в канализацию. 4th cycle. A fermentation medium was prepared using the centrate obtained in the 2nd cycle. The sterilized medium under aseptic conditions was poured into the fermenter after it was released from the QOL of the 3rd cycle. Cultivation in the fermeter was carried out for 26-30 hours, after which the QOL was poured into a container. After aging, the protein content in QOL is 2.0 g / l. Next, the QOL was centrifuged, the resulting paste was sent for further processing, and the centrate was poured into the sewer.

Как видно из приведенных примеров, предложенный способ культивирования позволял провести не менее четырех последовательных циклов биосинтеза без ущерба уровню накопления эндотоксина в КЖ. Уровень накопления эндотоксина в КЖ на стадии выдерживания в емкости не уступали содержанию эндотоксина, достигаемому при культивировании продуцента в ферментере в течение всей ферментации (без выдерживания). Наконец можно, по крайней мере один раз, использовать фугат для повторного приготовления ферментационной среды. As can be seen from the above examples, the proposed cultivation method made it possible to conduct at least four consecutive biosynthesis cycles without compromising the level of endotoxin accumulation in QOL. The level of endotoxin accumulation in QOL at the stage of aging in the vessel was not inferior to the endotoxin content achieved by culturing the producer in the fermenter during the entire fermentation (without aging). Finally, you can use the centrate at least once to re-prepare the fermentation medium.

Сравним производительность предлагаемого способа культивирования с изложенным в прототипе. Для определения примем, что время подготовки и стерилизации пустого ферментера составляло не менее 3 ч., время выгрузки КЖ и загрузки новой ферментационной среды - 3 ч. Тогда время 1-го цикла составило суммарно 3+3+30=36 ч., продолжительность каждого последующего цикла - 3+30= 33 ч. Общая продолжительность четырех циклов составляла 36+33•3=135 ч. Если принять полный объем КЖ в ферментере за 100% и учесть, что от первых трех циклов в ферментере в качестве посевного материала оставалось каждый раз по 5-10% КЖ, суммарный съем КЖ с ферментера за 4 цикла составил 90•3+100=370% сут. Производительность процесса составляет 370%/сут/135 ч.•24 ч=65,7%/сут. Аналогичная величина, рассчитанная для прототипа, в лучшем варианте (48 ч. культивирования) составляла 100%/сут/(3+3+48)•24=44,5%/сут. Таким образом, производительность предлагаемого способа культивирования повышается на 20%. Compare the performance of the proposed method of cultivation with that described in the prototype. To determine, we assume that the preparation and sterilization time of an empty fermenter was at least 3 hours, the time of unloading QOL and loading of a new fermentation medium was 3 hours. Then, the time of the 1st cycle amounted to 3 + 3 + 30 = 36 hours, each the next cycle - 3 + 30 = 33 hours. The total duration of the four cycles was 36 + 33 • 3 = 135 hours. If we take the full amount of QOL in the fermenter as 100% and take into account that each of the first three cycles in the fermenter was left as seed times of 5-10% QOL, the total QL removal from the fermenter for 4 cycles was 90 • 3 + 100 = 370% day The productivity of the process is 370% / day / 135 hours. • 24 hours = 65.7% / day. A similar value calculated for the prototype, in the best case (48 hours of cultivation) was 100% / day / (3 + 3 + 48) • 24 = 44.5% / day. Thus, the productivity of the proposed method of cultivation is increased by 20%.

Оценим снижение удельного расхода воды на приготовление питательной среды. Примем расход воды на приготовление ферментационной среды для первого цикла ферментации равным 100%. Для второго цикла используется фугат, полученный при обработке 90% КЖ. Если принять во внимание, что выход фугата равен примерно 0,9 от обработанной КЖ, то его количество составит примерно 80%. Это означает, что при приготовлении среды для следующего цикла ферментации будет израсходовано дополнительно только 20% воды; на два цикла - 120%. Следовательно, удельный расход воды в расчете на 1 цикл составит 120% : 2= 60%, т. е. на 40% ниже, чем в прототипе. Соответственно снижается удельный объем сточных вод. Let us evaluate the decrease in the specific consumption of water for preparing the nutrient medium. We take the water consumption for the preparation of the fermentation medium for the first fermentation cycle to be equal to 100%. For the second cycle, the centrate obtained by processing 90% QOL is used. If we take into account that the yield of the centrate is approximately 0.9 of the treated QOL, then its amount will be approximately 80%. This means that when preparing the medium for the next fermentation cycle, only 20% additional water will be consumed; for two cycles - 120%. Therefore, the specific water consumption per 1 cycle will be 120%: 2 = 60%, i.e., 40% lower than in the prototype. Accordingly, the specific volume of wastewater is reduced.

Проведенный анализ показывает, что предложенный способ получения эндотоксина позволяет достичь поставленную цель - повысить производительность ферментеров при проведении процесса биосинтеза эндотоксина и снизить удельный расход воды на приготовление ферментационной среды. The analysis shows that the proposed method for producing endotoxin allows to achieve the goal - to increase the productivity of fermenters during the biosynthesis of endotoxin and to reduce the specific consumption of water for preparing the fermentation medium.

Источники информации
1. Кандыбин Н.В. с соавт. Новые экзотоксигенные штаммы Bacillus thuringiensis. В сб.: Бактериальные средства и методы борьбы с вредными насекомыми и грызунами. - Л.: Колос, 1972, с.20-23.Sources of information
1. Kandybin N.V. et al. New exotoxigenic strains of Bacillus thuringiensis. In: Bacterial agents and methods of controlling harmful insects and rodents. - L .: Kolos, 1972, p.20-23.

2. Rugh S. Use of a Coleopteran active Bacillus thuringiensis for controlling the cereal leaf beetke Oulema melanopa. WO 91/14369. 2. Rugh S. Use of a Coleopteran active Bacillus thuringiensis for controlling the cereal leaf beetke Oulema melanopa. WO 91/14369.

3. Krieg V. A. at al. Bacillus thuringiensis var. tenebrionis: a new pathotype effective against larvae of Coleoptera. Z. Ang. Entomol., 1983, 96:500-508. 3. Krieg V. A. at al. Bacillus thuringiensis var. tenebrionis: a new pathotype effective against larvae of Coleoptera. Z. Ang. Entomol., 1983, 96: 500-508.

4. Быков В. А. , Крылов И.А., Манаков М.Н. с соавт. Микробиологическое производство биологически активных веществ и препаратов. -М.: Высшая школа, 1987, с.66-72. 4. Bulls V. A., Krylov I. A., Manakov M. N. et al. Microbiological production of biologically active substances and preparations. -M .: Higher school, 1987, p.66-72.

5. Дубейковская З. А. , Франк Р.И. с соавт. Количественное определение белка энтомоцидных кристаллов Bac. thuringiensis с помощью иммунохимических методов. - "Биотехнология", 1990, 5, с.89-92.2 5. Dubeykovskaya Z. A., Frank R.I. et al. Quantification of Protein of Bac Entomocidal Crystals. thuringiensis using immunochemical methods. - "Biotechnology", 1990, 5, pp. 89-92.2

Claims (2)

1. Штамм Bacillus thuringiensis ВКПМ В-6649 - продуцент эндотоксина против жесткокрылых насекомых. 1. The strain Bacillus thuringiensis VKPM B-6649 - producer of endotoxin against beetles. 2. Способ культивирования продуцента эндотоксина против жесткокрылых насекомых, предусматривающий приготовление питательной среды, засев среды продуцентом эндотоксина, культивирование его в ферментере, отбор культуральной жидкости в емкость с последующим центрифугированием ее и получением фугата и целевого продукта и направлением фугата на стадию приготовления среды, отличающийся тем, что культивирование продуцента в ферментере осуществляют до начала споруляции, культуральную жидкость в емкость отбирают в количестве 90 - 95% от объема, дображивают ее при комнатной температуре, а оставшуюся часть культуральной жидкости используют в качестве посевного материала на следующей стадии культивирования. 2. A method of cultivating an endotoxin producer against hard-winged insects, which involves preparing a nutrient medium, inoculating the medium with an endotoxin producer, cultivating it in a fermenter, taking culture liquid into a container, then centrifuging it and producing a centrate and target product and directing the centrate to the medium preparation stage, characterized in that the cultivation of the producer in the fermenter is carried out before sporulation begins, the culture fluid in the container is taken in an amount of 90 - 95% by volume , Dobrazhivayut at room temperature and the remainder of the culture fluid is used as a seed culture in the following step.

Images