RU2103693C1 - Method to predict precarious premature delivery - Google Patents

Abstract

FIELD: medicine, obstetrics. SUBSTANCE: method deals with determining in peripheral blood of pregnant women 20 weeks after gestation a relative content of T-lymphocytes which carry on their surface structures reacting with fertility alphaα₂-microglobulin and at values lower 20% precarious premature delivery is predicted. EFFECT: higher accuracy of prediction being 94%, higher efficiency to conduct earlier prophylactic measures directed to decrease the frequency of premature delivery. 1 tbl

Description

Изобретение относится к медицине, а именно к акушерству, и может быть использовано для прогнозирования угрожающих преждевременных родов, начиная с 20 недель беременности. The invention relates to medicine, namely to obstetrics, and can be used to predict threatening preterm birth, starting from 20 weeks of pregnancy.

Предлагаемый способ позволяет прогнозировать угрожающие преждевременные роды, начиная с 20 недель гестации за 10 недель до появления клинических признаков заболевания. The proposed method allows to predict threatening preterm birth, starting from 20 weeks of gestation 10 weeks before the onset of clinical signs of the disease.

Актуальность разработанного способа определяется высокой частотой преждевременных родов, которая по литературным данным составляет от 3 до 30%, и в 72 - 85% случаев они являются причиной неонатальной смертности. The relevance of the developed method is determined by the high frequency of preterm birth, which according to literature is from 3 to 30%, and in 72 - 85% of cases they are the cause of neonatal mortality.

Известен способ диагностики угрозы прерывания беременности у беременных без клинических признаков данной патологии на момент обследования, но с последующим развитием клинической картины по повышению на 75% хемилюминесценции сыворотки крови в присутствии сульфата железа и тетра-трет-бутилтетрафенилпорфина по отношению к норме. A known method for diagnosing the threat of termination of pregnancy in pregnant women without clinical signs of this pathology at the time of the examination, but with the subsequent development of the clinical picture, increases in serum chemiluminescence by 75% in the presence of iron sulfate and tetra-tert-butyltetraphenylporfin with respect to the norm.

Недостатками данного способа являются:
неспецифичность данного метода;
изменение показателей хемилюминесценции в зависимости от времени экспозиции;
отсутствие данных о том, за сколько недель до появления клинических признаков угрозы прерывания беременности действуют прогностические критерии;
применение данного способа предполагает использование дорогостоящего оборудования и реактивов.The disadvantages of this method are:
nonspecificity of this method;
change in chemiluminescence indicators depending on the exposure time;
lack of data on how many weeks before the appearance of clinical signs of the threat of termination of pregnancy prognostic criteria apply;
the application of this method involves the use of expensive equipment and reagents.

Наиболее близким к заявленному способу является способ прогнозирования угрозы прерывания беременности путем определения уровня хорионического гонадотропина (ХГ) в сыворотке крови беременных и уровня хорионических антител. (Авт. св. N 1698781, C O1 N 33/53, 1991). По данному способу угроза прерывания беременности прогнозируется при значениях угрозо-метрического коэффициента (К) более 2,0. Угрозо-метрический коэффициент вычисляется по формуле:
К = 4,87 + 7,79 {1-exp[В•(С_хг-2,45)]},
где В = 0,11 - 0,05(log₂T - 10), С_хг - кратность снижения уровня ХГ относительно нормы для данного срока беременности, T - обратный титр противохорионических антител в сыворотке крови беременных.Closest to the claimed method is a method for predicting the threat of termination of pregnancy by determining the level of chorionic gonadotropin (CH) in the blood serum of pregnant women and the level of chorionic antibodies. (Ed. St. N 1698781, C O1 N 33/53, 1991). According to this method, the threat of termination of pregnancy is predicted when the values of the threat-metric coefficient (K) of more than 2.0. Threat-metric coefficient is calculated by the formula:
K = 4.87 + 7.79 {1-exp [B • (C _x -2.45)]},
where B = 0.11 - 0.05 (log ₂ T - 10), C _xg is the multiplicity of the decrease in the level of CG relative to the norm for a given period of pregnancy, T is the inverse titer of antichorionic antibodies in the blood serum of pregnant women.

Данный способ был выбран нами в качестве прототипа, однако он имеет ряд существенных недостатков:
по данным литературы уровень ХГ в сыворотке крови беременных во второй половине физиологической беременности колеблется в интервале 10000 - 70000 МЕ, а в предлагаемом способе не указывается конкретное значение в пределах данного интервала, от которого следует вычислять угрозометрический коэффициент;
определение сывороточного ХГ во второй половине беременности малоинформативно для определения угрозы прерывания беременности и совсем не информативно для прогнозирования угрожающих преждевременных родов;
отсутствуют данные о сроках гестации, в которые предлагается использовать данный способ;
отсутствуют данные о сроках появления изменений в прогностических критериях прототипа;
отсутствуют данные о точности способа-прототипа;
расчет угрозометрического коэффициента затруднен, так как не определено понятие exp, присутствующее в формуле.This method was chosen by us as a prototype, however, it has a number of significant disadvantages:
according to the literature, the level of CG in the blood serum of pregnant women in the second half of the physiological pregnancy ranges from 10,000 to 70,000 IU, and the proposed method does not indicate a specific value within this interval, from which the hazardometric coefficient should be calculated;
determination of serum CG in the second half of pregnancy is uninformative to determine the threat of abortion and not at all informative for predicting threatening preterm birth;
there are no data on gestational periods in which it is proposed to use this method;
there is no data on the timing of the appearance of changes in the prognostic criteria of the prototype;
there is no data on the accuracy of the prototype method;
Calculation of the hazardometric coefficient is difficult, since the concept of exp, which is present in the formula, is not defined.

Указанные недостатки предлагается устранить в заявляемом способе. These disadvantages are proposed to eliminate in the present method.

Целью способа является повышение точности прогнозирования угрожающих преждевременных родов, начиная с 20 недель гестации. The aim of the method is to increase the accuracy of forecasting threatening preterm birth, starting from 20 weeks of gestation.

Указанная цель достигается тем, что в периферической крови беременных женщин в сроки гестации после 20 недель в обогащенной популяции Т-клеток определяется относительное содержание лимфоцитов, несущих на своей поверхности структуры, реагирующие с альфа₂-микроглобулином фертильности (Т-АМГФ-розеткообразующие клетки - Т-АМГФ-РОК), и при значениях показателя менее 20% прогнозируются угрожающие преждевременные роды с точностью 94%.This goal is achieved by the fact that in the peripheral blood of pregnant women during gestation after 20 weeks in the enriched population of T cells, the relative content of lymphocytes that carry structures on their surface that react with alpha ₂ -microglobulin fertility (T-AMGF-rosette-forming cells - T -AMGF-ROCK), and with values of less than 20%, threatening preterm delivery is predicted with an accuracy of 94%.

Способ осуществляется следующим образом. The method is as follows.

В пробирку, содержащую 25 ед гепарина, забирают 1 мл крови из локтевой вены и добавляют 1 мл среды 199, подслаивают 1 мл фиколл-верографина с градиентом плотности 1,078. Клеточную фракцию лимфоцитов получают методом скоростного центрифугирования при 200 g в течение 20 мин. Лимфоциты собирают в интерфазе среда 199-фиколл-верографин и отмывают 2 раза средой 199 центрифугированием при 200 g в течение 10 мин. К суспензии клеток в концентрации 2•10⁶ кл/мл добавляют равный объем диагностикума, содержащего 1% эритроцитов барана, обработанных стандартным методом папаином и цистеином. Полученная смесь инкубируется 10 мин при 37^oC, центрифугируется 10 мин при 200 g и инкубируется 1 ч при 4^oC. Клеточная суспензия ресуспендируется в 0,5 мл среды 199 и наслаивается на 0,3 мл фиколл-верографина с плотностью 1,078. Т-лимфоциты, образовавшие розетки с эритроцитами барана, отделяют от В-клеток центрифугированием при 200 g в течение 10 мин. Надосадочная жидкость сливается, а эритроциты барана в осадке лизируются методом осмотического шока в 1 мл воды с последующим добавлением 10 мл среды 199 и отмыванием в центрифуге при 200 g в течение 10 мин. Клетки, содержащиеся в осадке, разводятся в 0,1 мл среды 199 и смешиваются с 0,1 мл диагностикума, содержащего 1% взвесь эритроцитов быка, проинкубированных с раствором препарата АМГФ в концентрации 100 нг/мл в течение 1 ч при комнатной температуре. Клетки с диагностикумом инкубируют 5 мин при 37^oC, центрифугируют 5 мин при 200 g и инкубируют 1 ч при 4^oC. Образовавшиеся розетки фиксируются в 0,05 мл 3% раствора глютарового альдегида и делается мазок на предметном стекле. Высушенный мазок окрашивается по Романовскому, подсчет клеток производится методом светового микроскопирования на 100 клеток, положительными считаются лимфоциты, прикрепившие 3 и более эритроцитов диагностикума.In a test tube containing 25 units of heparin, 1 ml of blood is taken from the cubital vein and 1 ml of medium 199 is added, 1 ml of ficoll-verographin with a density gradient of 1.078 is layered. The cell fraction of lymphocytes is obtained by high-speed centrifugation at 200 g for 20 minutes. Lymphocytes are collected in an interphase medium 199-ficoll-verographin and washed 2 times with medium 199 by centrifugation at 200 g for 10 minutes. An equal volume of diagnosticum containing 1% sheep erythrocytes treated with the standard method of papain and cysteine is added to the cell suspension at a concentration of 2 • 10 ⁶ cells / ml. The resulting mixture was incubated for 10 min at 37 ^o C, centrifuged for 10 min at 200 g and incubated for 1 h at 4 ^o C. The cell suspension was resuspended in 0.5 ml of medium 199 and layered on 0.3 ml of ficoll-verographin with a density of 1,078. T-lymphocytes that formed rosette erythrocyte rosettes are separated from B cells by centrifugation at 200 g for 10 minutes. The supernatant is drained, and the sheep erythrocytes in the sediment are lysed by osmotic shock in 1 ml of water, followed by the addition of 10 ml of medium 199 and washing in a centrifuge at 200 g for 10 min. The cells contained in the sediment are diluted in 0.1 ml of medium 199 and mixed with 0.1 ml of diagnosticum containing 1% suspension of bovine erythrocytes incubated with a solution of AMHF at a concentration of 100 ng / ml for 1 h at room temperature. Cells with a diagnosticum are incubated for 5 min at 37 ^o C, centrifuged for 5 min at 200 g and incubated for 1 h at 4 ^o C. The resulting rosettes are fixed in 0.05 ml of a 3% solution of glutaraldehyde and a smear is made on a glass slide. The dried smear is stained according to Romanovsky, the cells are counted by light microscopy per 100 cells, lymphocytes that attach 3 or more red blood cells of the diagnosticum are considered positive.

Новизна заявляемого способа заключается в том, что впервые предлагается прогнозировать угрожающие преждевременные роды у женщин с отсутствием клинической картины данной патологии после 20 недель гестации по определению в обогащенной фракции Т-лимфоцитов относительного содержания клеток, несущих на своей поверхности структуры, реагирующие с АМГФ. The novelty of the proposed method lies in the fact that it is proposed for the first time to predict threatening preterm labor in women with no clinical picture of this pathology after 20 weeks of gestation by determining in the enriched fraction of T-lymphocytes the relative content of cells bearing structures reacting with AMHF on their surface.

Ранее показатель содержания АМГФ в сыворотке крови беременной женщины и в семенной плазме мужа использовался для диагностики осложнений беременности и прогнозирования состояния плода. Однако, показатель содержания иммунокомпетентных клеток, реагирующих с АМГФ, для прогнозирования угрожающих преждевременных родов используется впервые. Вероятно значительное уменьшение пула клеток, реагирующих с АМГФ, отражает снижение супрессорной активности, что приводит к постепенному усилению материнского ответа на антигены плода и проявлению цитотоксических реакций, направленных на его отторжение. Earlier, the AMHF content in the blood serum of a pregnant woman and in the seminal plasma of a husband was used to diagnose pregnancy complications and predict the condition of the fetus. However, an indicator of the content of immunocompetent cells that react with AMHF is used for the first time to predict threatening preterm delivery. Probably a significant decrease in the pool of cells reacting with AMHF reflects a decrease in suppressor activity, which leads to a gradual increase in the maternal response to fetal antigens and the manifestation of cytotoxic reactions aimed at its rejection.

Использование предлагаемого способа позволяет выявить угрозу преждевременных родов за 10 недель до появления клинических признаков, что дает возможность осуществить раннюю профилактику данной акушерской патологии. Using the proposed method allows to identify the threat of preterm birth 10 weeks before the onset of clinical signs, which makes it possible to carry out early prevention of this obstetric pathology.

Существенным отличием способа является установление прогностического параметра содержания Т-лимфоцитов, несущих на своей поверхности структуры, реагирующие с АМГФ, при количественном значении которого менее 20% прогнозируются угрожающие преждевременные роды. A significant difference of the method is the establishment of a prognostic parameter for the content of T-lymphocytes bearing structures on their surface that react with AMHF, with a quantitative value of less than 20% threatening preterm delivery is predicted.

Сущность заявляемого способа поясняется следующими примерами:
Пример 1. Пациентка П., 23 лет. Беременность первая, желательная, наступила на первом году регулярной половой жизни. Из анамнеза - нарушений менструальной функции, гинекологических и экстрагенитальных заболеваний не выявлено. На учете в женской консультации состоит с 7 недель беременности, беременность протекала благоприятно. При обследовании в 25 недель беременности жалоб не предъявляла, при наружном осмотре матка овиидной формы, в нормальном тонусе, возбудимость ее не повышена. Головка придлежит над входом в малый таз. Сердцебиение плода ясное, ритмичное, 140 ударов в минуту. При влагалищном исследовании: наружные половые органы развиты правильно, влагалище нерожавшей, шейка матки цилиндрической формы, без дефектов слизистой оболочки, плотной консистенции, длиной до 3 см, наружный зев сомкнут. Матка в нормальном тонусе, безболезненная при пальпации. Через передний свод пальпируется головка плода, высоко над входом в малый таз, костные контуры таза не изменены, крестцовая впадина емкая, мыс не достигается. Своды свободные, выделения молочного цвета, в умеренном количестве. По данным УЗИ патологии не выявлено. Содержание ТБГ в крови, эстриола и прегнандиола в моче в пределах нормы. Диагноз: беременность 25 недель.The essence of the proposed method is illustrated by the following examples:
Example 1. Patient P., 23 years old. The first pregnancy, desired, occurred in the first year of regular sexual activity. From the anamnesis - menstrual dysfunction, gynecological and extragenital diseases were not detected. Registered in the antenatal clinic is from 7 weeks of pregnancy, the pregnancy proceeded favorably. When examining at 25 weeks of pregnancy, she did not show any complaints, during external examination, the uterus is ovoid in normal tone, her excitability is not increased. The head lies above the entrance to the pelvis. The fetal heartbeat is clear, rhythmic, 140 beats per minute. When a vaginal examination: the external genitalia are developed correctly, the vagina is nulliparous, the cervix is cylindrical, without defects in the mucous membrane, dense consistency, up to 3 cm long, the external pharynx is closed. The uterus is in a normal tone, painless on palpation. The fetal head is palpated through the anterior arch, high above the entrance to the small pelvis, the bony contours of the pelvis are not changed, the sacral cavity is capacious, the cape is not reached. The vaults are free, milky discharge, in moderation. According to ultrasound, no pathology was detected. The content of TBH in the blood, estriol and pregnandiol in the urine is within normal limits. Diagnosis: 25 weeks pregnancy.

Содержание ХГ в крови 20000 МЕ/л (при норме 10000 - 30000 МЕ/л). Заключение: прогнозируется физиологическое течение беременности. The content of CG in the blood of 20,000 IU / L (at a rate of 10,000 - 30,000 IU / L). Conclusion: the physiological course of pregnancy is predicted.

Обследование по заявляемому способу: содержание Т-АМГФ-РОК 16% (при норме 20% и более). Заключение: прогнозируется угроза недонашивания беременности. Examination according to the claimed method: the content of T-AMGF-ROCK 16% (at a rate of 20% or more). Conclusion: the threat of preterm pregnancy is predicted.

Катамнез. В сроке 34 недели беременности появились признаки угрозы преждевременных родов. Пациентка предъявляла жалобы на тянущие схваткообразные боли внизу живота. При осмотре определялось повышение тонуса и возбудимости матки. При влагалищном исследовании шейка матки до 2 см длинной, мягкая, цервикальный канал пропускает 1 исследующий палец до середины его длины. По УЗИ определялось повышение тонуса матки. Женщина госпитализирована в специализированный стационар, где проводилась попытка пролонгирования беременности, однако, в сроке 35 недель беременности произошло преждевременное излитие околоплодовых вод, и спонтанно развилась родовая деятельность. Беременность закончилась преждевременными родами в сроке 35 недель и рождением ребенка с оценкой 6 - 7 баллов по шкале Апгар с признаками недоношенности и хронической внутриутробной гипоксии. Catamnesis. At 34 weeks of gestation, there were signs of a threat of premature birth. The patient complained of pulling cramping pains in the lower abdomen. On examination, an increase in the tone and excitability of the uterus was determined. When a vaginal examination of the cervix is up to 2 cm long, a soft, cervical canal passes 1 examining finger to the middle of its length. Ultrasound determined an increase in uterine tone. The woman was hospitalized in a specialized hospital, where an attempt was made to prolong pregnancy, however, premature discharge of amniotic fluid occurred during the period of 35 weeks of pregnancy, and labor activity spontaneously developed. Pregnancy ended in premature birth at 35 weeks and the birth of a baby with a rating of 6 - 7 on the Apgar scale with signs of prematurity and chronic intrauterine hypoxia.

Пример 2. Пациентка К., 21 год. Настоящая беременность вторая, желательная, в первом браке. Первая беременность закончилась самопроизвольным выкидышем в сроке 7 - 8 недель. Менструальная функция не нарушена. Из перенесенных заболеваний отмечает ветряную оспу в детстве. Гинекологических и экстрагенитальных заболеваний не выявлено. На учете в женской консультации состоит с 12 недель беременности, беременность протекала благоприятно. При обследовании в 22 недели беременности жалоб не предъявляла. При наружном осмотре матка в нормальном тонусе, сердцебиения плода выслушиваются, ритмичные, 140 уд/мин. При влагалищном исследовании патологии не выявлено. Содержание ТБГ в крови, эстриола и прегнандиола в моче в пределах нормы. По данным УЗИ патологии не выявлено. Диагноз: беременность 22 недели. Example 2. Patient K., 21 years old. Real pregnancy is second, desirable, in the first marriage. The first pregnancy ended in a miscarriage in the period of 7-8 weeks. Menstrual function is not impaired. Of the illnesses noted chickenpox in childhood. Gynecological and extragenital diseases were not detected. Registered in the antenatal clinic is from 12 weeks of pregnancy, the pregnancy proceeded favorably. When examined at 22 weeks of gestation, she did not show any complaints. During external examination of the uterus in normal tone, fetal heartbeats are heard, rhythmic, 140 beats / min. An intravaginal examination revealed no pathology. The content of TBH in the blood, estriol and pregnandiol in the urine is within normal limits. According to ultrasound, no pathology was detected. Diagnosis: pregnancy 22 weeks.

Содержание ХГ в крови 22000 МЕ/л. Заключение: прогнозируется физиологическое течение беременности. The content of CG in the blood is 22,000 IU / l. Conclusion: the physiological course of pregnancy is predicted.

Обследование по заявляемому способу: содержание Т-АМГФ-РОК - 20%. Заключение: прогнозируется физиологическое течение беременности. Examination according to the claimed method: the content of T-AMGF-ROCK - 20%. Conclusion: the physiological course of pregnancy is predicted.

Катамнез. Беременность в дальнейшем протекала благоприятно, закончилась своевременными родами и рождением ребенка с оценкой по шкале Апгар 8 - 9 баллов. Мать и ребенок выписаны домой на 5 сутки после родов в удовлетворительном состоянии. Catamnesis. Pregnancy later proceeded favorably, ended with timely childbirth and the birth of a child with an Apgar score of 8 - 9 points. Mother and baby were discharged home on the 5th day after birth in satisfactory condition.

Пример 3. Пациентка М. , 22 год. На учете в женской консультации с 8 недель беременности. Беременность вторая, желательная, в первом браке. Первая беременность закончилась самопроизвольным выкидышем в сроке 7 недель. Из анамнеза: менструальная функция не нарушена, гинекологических и экстрагенитальных заболеваний не выявлено. Беременность протекала благоприятно. При обследовании в 32 недели беременности жалоб не предъявляла. Шевеления плода ощущает с 20 недель беременности. При наружном осмотре матка в нормальном тонусе, сердцебиения плода выслушиваются, ритмичные, 140 уд/мин. При влагалищном исследовании патологии не выявлено. Содержание ТБГ в крови, эстриола и прегнандиола в моче в пределах нормы. По данным УЗИ патологии не выявлено. Диагноз: беременность 32 недели. Example 3. Patient M., 22 years old. Registered in the antenatal clinic from 8 weeks of pregnancy. Pregnancy second, desirable, in the first marriage. The first pregnancy ended in a miscarriage in the period of 7 weeks. From the anamnesis: menstrual function is not impaired, gynecological and extragenital diseases were not detected. Pregnancy proceeded favorably. When examined at 32 weeks of pregnancy, no complaints. Feels the fetal movements from 20 weeks of pregnancy. During external examination of the uterus in normal tone, fetal heartbeats are heard, rhythmic, 140 beats / min. An intravaginal examination revealed no pathology. The content of TBH in the blood, estriol and pregnandiol in the urine is within normal limits. According to ultrasound, no pathology was detected. Diagnosis: pregnancy 32 weeks.

Содержание ХГ в крови - 29000 МЕ/л. (при норме 14000 - 70000 МЕ/л). Заключение: прогнозируется физиологическое течение беременности. The content of chronic hepatitis C in the blood is 29,000 IU / l. (at a rate of 14,000 - 70,000 IU / L). Conclusion: the physiological course of pregnancy is predicted.

Обследование по заявляемому способу: Т-АМГ-РОК - 32%. Заключение: прогнозируется физиологическое течение беременности. Examination according to the claimed method: T-AMG-ROCK - 32%. Conclusion: the physiological course of pregnancy is predicted.

Катамнез. Беременность закончилась своевременными родами и рождением ребенка с оценкой по шкале Апгар 9 - 10 баллов. Мать и ребенок выписаны домой на 5 сутки после родов в удовлетворительном состоянии. Catamnesis. Pregnancy ended in timely childbirth and the birth of a child with an Apgar score of 9 - 10 points. Mother and baby were discharged home on the 5th day after birth in satisfactory condition.

Данные исследований приведены в таблице. Research data are given in the table.

Преимущества заявляемого способа:
1. Высокая точность - 94%, чувствительность - 100%, специфичность - 92%.The advantages of the proposed method:
1. High accuracy - 94%, sensitivity - 100%, specificity - 92%.

2. Прогнозирование угрожающих преждевременных родов за несколько недель до появления клинических признаков акушерской патологии. 2. Prediction of threatening preterm birth a few weeks before the onset of clinical signs of obstetric pathology.

3. Малое количество крови (1 мл), необходимое для проведения исследования. 3. A small amount of blood (1 ml) required for the study.

4. Доступность проведения методики в любой клинической лаборатории, так как исследование не требует специального оборудования. 4. The availability of the methodology in any clinical laboratory, since the study does not require special equipment.

5. Взятие крови в декретированные сроки, при посещении женской консультации. 5. Blood sampling on maternity leave, when visiting a antenatal clinic.

Claims (1)

Способ прогнозирования угрожающих преждевременных родов по исследованию клеток периферической крови, отличающийся тем, что в крови беременной женщины после 20 недель гестации определяют относительное содержание Т-лимфоцитов, несущих на своей поверхности структуры, реагирующие с альфа₂-микроглобулином фертильности, и при показателях менее 20% прогнозируют угрощающие преждевременные роды.A method for predicting threatening preterm birth by examining peripheral blood cells, characterized in that in the blood of a pregnant woman after 20 weeks of gestation they determine the relative content of T-lymphocytes that carry structures on their surface that react with alpha ₂ -microglobulin fertility, and with rates less than 20% predicting treating preterm birth.

Images