RU2101354C1 - Способ получения нуклеиновых кислот bacillus anthracis - Google Patents
Способ получения нуклеиновых кислот bacillus anthracis Download PDFInfo
- Publication number
- RU2101354C1 RU2101354C1 RU95101495A RU95101495A RU2101354C1 RU 2101354 C1 RU2101354 C1 RU 2101354C1 RU 95101495 A RU95101495 A RU 95101495A RU 95101495 A RU95101495 A RU 95101495A RU 2101354 C1 RU2101354 C1 RU 2101354C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- biomass
- nucleic acids
- lysozyme
- suspension
- bacillus anthracis
- Prior art date
Links
Images
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Использование: в биохимии, бактериологии, биотехнологии. Сущность изобретения: биомассу получают с предварительным подращиванием микробных клеток Bacillus anthracis в условиях герметизации колб с культурой. Биомассу обрабатывают лизоцимом в присутствие ЭДТА в концентрации 20 мг на 1 г биомассы. Полученную суспензию трехкратно замораживают в жидком азоте с последующим оттаиванием при 60oC. Время замораживания 40-60 с. Затем проводят дополнительное лизирование ТРИС-СДС-буфером. Нуклеиновые кислоты очищают фенолом и осаждают холодным этанолом. 3 табл.
Description
Изобретение относится к биохимии и бактериологии и может быть использовано для получения нуклеиновых кислот у возбудителя сибирской язвы и других спорообразующих бацилл.
Общий принцип получения нуклеиновых кислот заключается в выращивании максимального количества биомассы, полного разрушения бактериальных клеток с последующим отделением нуклеиновых кислот от белков, полисахаридов и других клеточных элементов.
При работе с возбудителем сибирской язвы возникают трудности, связанные с высокой устойчивостью этого микроорганизма к воздействию физико-химических факторов и способностью к спорообразованию (Инструкция о противоэпидемическом режиме работы с материалом, зараженным или подозрительным на зараженность, возбудителями инфекционных заболеваний I II групп. Саратов 1979).
Для разрушения клеток существует ряд методов: замораживание и оттаивание, деструкция осмотическим шоком или с помощью ферментов, воздействие лизирующими агентами, а также механическая обработка в гомогенизаторе, ультразвуковом дезинтеграторе. Выбор метода выделения нуклеиновых кислот обуславливается в основном клеточной структурой микроорганизма (П. Зентбуш, Молекулярная и клеточная биология. М.Мир, 1982, с.50.).
Известен метод получения нуклеиновых кислот из клеток Bac. cereusthuringiensis ( Африкян Э.К. Энтомопатогенные бактерии и их значение, изд. А.Н.Армянской ССР,1973, с.418).
Свежую культуру бактерий с агаризованного косяка пересевают на мясо-пептонный бульон и выращивают на качалке в пробирках в течение 8 ч. Затем культуру пересевают в колбу с 1л бульона и инкубируют на качалке при 37oC. Через 10 ч в колбу добавляют в конечных концентрациях глицин 2,5% сахарозу 20% и культивирование продолжают в течение 3 ч при умеренном перемешивании, после чего вносят лизоцим из расчета 200 мкг/мл. Инкубацию при малых оборотах качалки продолжают еще в течение 2 ч. При микроскопии отмечают массовый лизис клеток. После центрифугирования и суспендирования осадка в цитратной смеси лизоцим в той же концентрации вновь добавляют в присутствии ЭДТА и ТРИС буфера при pH 8,0. После 30-ти минутного инкубирования добавляют 2%-ный раствор лаурилсульфата натрия, pH-8,0. Продолжают выращивание в течение 15 мин при 37oC и добавляют в 4-х кратном объеме цитратно-солевой буфер (2М хлористый натрий и 0,05М цитрат натрия) и выдерживают при 4oC 30 мин. После центрифугирования к осадку добавляют цитратно-солевой раствор, инкубируют 30 мин и после очередного центрифугирования к осадку добавляют 95% этанол. Следующий этап заключается в том, что в полученную суспензию вносят 0,9М хлористый натрий и 0,01М цитрат натрия и инкубируют при 37oC в течение 15 мин. Затем вновь добавляют лизоцим в концентрации 200 мкг/мл в сочетании с ЭДГА и ТРИС-буфером, pH 8,0 и помещают в термостат на 30 мин при 37oC. После обработки 2% -ным лаурилсульфатом натрия, pH 8,0 смесь выдерживают при 37oC 15 мин и добавляют 4 объема цитратно-солевого раствора (2М хлористый натрий и 0,05М цитрат натрия). Инкубация 30 мин при 37oC. После центрифугирования к осадку добавляют цитратно-солевой раствор и инкубируют при 30oC. Затем суспензию центрифугируют, добавляют этанол и вновь центрифугируют. Полученный осадок обрабатывают смесью хлороформа и октанола в соотношении 5 1 и вновь центрифугируют. РНК из смеси удаляют добавлением РНК-азы в концентрации 20 мкг/мл в течение 20 мин при комнатной температуре. Затем проводят депротеинизацию смесью хлороформа и октанола. После этого производят осаждение этанолом и экстракцию в цитратно-солевом растворе. Для получения очищенной ДНК проводят 4-краткую депротеинизацию смесью хлороформа и октанола.
Способ позволяет получить очищенную ДНК для дальнейшего молекулярно-генетического исследования. Недостатком его является длительность и большой набор используемых реактивов. Он не обеспечивает полного лизиса клеток Bac. antharacis и соответственно гарантированного обеззараживания культуры сибиреязвенного микроба и увеличения выхода готового продукта.
Наиболее близким по технической сущности к изобретению является выбранный в качестве прототипа способ получения бактериальных нуклеиновых кислот [1]
По этому способу свежеосажденные клетки в пробирке из нержавеющей стали смешиваются с лизоцимом в концентрации 2 мг/г и растворяются в солевом ЭДГА (1 мл/г). Полученная смесь выдерживается в термостате 20 мин при 37oC, pH доводится до 9,0 добавлением раствора едкого натра. После начала лизирования клеток их быстро замораживают в смеси сухого льда с ацетоном. При этом достигается температура -20oC. Экспозиция 20 мин. Затем проводят оттаивание при 60oC. После этого к суспензии добавляют ТРИС-СДС-буфер в концентрации 10 мл на 1г биомассы. Следующим этапом добавляют равный объем фенола pH 9,0 и полученную смесь встряхивают на холоду (ниже -4oC) в течение 20 мин в колбе со стеклянной пробкой. Полученную суспензию разделяют на 2 слоя при центрифугировании на низкоскоростной центрифуге. Водную фазу отсасывают и осветляют при центрифугировании (12000 об/мин). Нуклеиновые кислоты осаждают добавлением 3-х объемов холодного этанола. Нитевидный осадок выбирается накручиванием на стеклянную палочку. После сушки получается сухой порошок, содержащий нуклеиновые кислоты.
По этому способу свежеосажденные клетки в пробирке из нержавеющей стали смешиваются с лизоцимом в концентрации 2 мг/г и растворяются в солевом ЭДГА (1 мл/г). Полученная смесь выдерживается в термостате 20 мин при 37oC, pH доводится до 9,0 добавлением раствора едкого натра. После начала лизирования клеток их быстро замораживают в смеси сухого льда с ацетоном. При этом достигается температура -20oC. Экспозиция 20 мин. Затем проводят оттаивание при 60oC. После этого к суспензии добавляют ТРИС-СДС-буфер в концентрации 10 мл на 1г биомассы. Следующим этапом добавляют равный объем фенола pH 9,0 и полученную смесь встряхивают на холоду (ниже -4oC) в течение 20 мин в колбе со стеклянной пробкой. Полученную суспензию разделяют на 2 слоя при центрифугировании на низкоскоростной центрифуге. Водную фазу отсасывают и осветляют при центрифугировании (12000 об/мин). Нуклеиновые кислоты осаждают добавлением 3-х объемов холодного этанола. Нитевидный осадок выбирается накручиванием на стеклянную палочку. После сушки получается сухой порошок, содержащий нуклеиновые кислоты.
У прототипа и изобретения имеются следующие сходные существенные признаки.
Подготовка биомассы, обработка ее лизоцимом в присутствие ЭДТА в течение 20 мин при 37oC, pH 9,0, что необходимо для разрушения клеточной оболочки.
Замораживание и оттаивание суспензии, обеспечивающие более полный лизис клеток.
Дополнительное лизирование клеток ТРИС-СДС-буфером. Обработка клеточной суспензии фенолом в соотношении 1:1 с целью очистки нуклеиновых кислот от белков, полисахаридов и других клеточных элементов.
Осаждение нуклеиновых кислот тройным объемом холодного этанола.
Недостатком прототипа является неполное обеззараживание Bac. antharacis, связанное с частичным лизисом клеток, и более низкий выход нуклеиновых кислот.
Этот недостаток обусловлен высокой устойчивостью возбудителя сибирской язвы к воздействию физико-химических факторов, способностью к спорообрааованию. Поэтому обработка клеток Bac. antharacis по методу К.Миура не позволяет добиться их полного лизиса, а значит и гарантированного обеззараживания. Используемое в этом способе количество лизоцима (2 мг на 1 г биомассы) и температура замораживания (-20oC, даже при трехкратном повторе операции не позволяют выполнить вышеописанные требования, что снижает выход нуклеиновых кислот.
Целью изобретения является повышение выхода нуклеиновых кислот и обеспечение гарантированного обеззараживания патогенных бацилл.
Поставленная цель достигается тем, что подготовку биомассы проводили с предварительным подращиванием в течение 16-17 ч, с соблюдением условий герметизации колб. Биомассу обрабатывали лизоцимом в концентрации 20-25 мг на 1 г биомассы в присутствии ЭДТА, выдерживали в термостате при 37oC в течение 20 мин. Затем суспензию трехкратно замораживали в жидком азоте (-196oC) с последующим оттаиванием при 60oC. Процесс замораживания длился 40-60 с. Проводили дополнительное лизирование ТРИС-СДС-буфером. Нуклеиновые кислоты очищали фенолом и осаждали тройным объемом холодного этанола.
По отношению к прототипу у изобретения имеются следующие отличительные признаки.
Культивирование биомассы проводили с предварительным подращиванием в течение 16-17 ч с соблюдением условия герметичности колб, что обеспечивает получение максимально возможных количеств микробных клеток в логарифмической фазе роста при минимальной споруляции.
В табл.1 приведены сравнительные данные по спорообразованию и выходу биомассы при различных способах культивирования.
Увеличение количества лизоцима с 2 мг/г до 20-25 мг/г обеспечивает более полный лизис клеток Bac. antharacis, а соответственно повышение выхода нуклеиновых кислот.
В табл. 2 приведены сравнительные данные степени лизиса клеток и выхода нуклеиновых кислот от концентрации лизоцима по аналогу, прототипу и изобретению.
Снижение температуры замораживания до -196oC и сокращение времени с 20-30 мин до 40-60 с способствует полноте лизиса и повышению выхода нуклеиновых кислот, что показано в табл.3.
Возможность осуществления изобретения с использованием полной совокупности заявляемых признаков подтверждается примерами конкретного выполнения.
Пример 1. В опыте использовали вакцинный штамм Bac. antharacis СТИ-1. Посев споровой взвеси производили на 2 чашки Петри с агаром Хоттингера. Выращивали в термостате при 37oC в течение 24 ч. На следующий день отбирали типичные колонии сибиреязвенного микроба и пересевали петлей в 250 мл. колбы с бульоном. Колбы закрывали ватно-марлевыми пробками и поверх них резиновыми колпачками. Последние использовали для создания повышенного содержания CO2 в колбах, так как бикарбонат ингибирует процесс спорообразования и стимулирует чувствительность культур Bac. antharacis к лизоциму (Chatterjee B.R. Williams R. P. j. Bact. 1985. vol. 89 p.1128-1133). Колбы помещали в термостатированную качалку на 8 ч при 37oC. Через 6 ч делали контрольные мазки. Споровые формы сибиреязвенного микроба отсутствовали. Затем производили пересев 20 мл бульонной культуры в 750 мл колбы с 200 мл бульона и помещали в термокачалку на 9 ч при 37oC. Вновь использовали резиновые колпачки. Затем культуру центрифугировали и полученную биомассу трижды отмывали от среды забуференным физ. раствором. Вес влажной биомассы 12г. Ее переносили в пластмассовый центрифужный стаканчик и добавляли 240 мг лизоцима (20 мг/г) и 12 мл солевого ЭДГА (1 мд/г). Содержимое стаканчика тщательно перемешивали и оставляли в термостате на 20 мин при 37oC. Затем суспензию замораживали в жидком азоте (-196oC), а затем оттаивали в ультратермостате при 60oC в течение 7-10 мин. Эту операцию повторяли 3 раза. После последнего оттаивания добавляли ТРИС-СДС-буфер в количестве 96 мл (6 мл/г), тщательно перемешивали и оставляли в термостате на 20 мин при 37oC. Затем добавляли 120 мл свежоперегнанного фенола pH 9,0 и встряхивали на холоду 30 мин. Суспензию переносили в стеклянный центрифужный стаканчик и разделяли на два слоя на центрифуге при 5000 об/мин. Верхний слой отсасывали в стеклянный цилиндр. Объем жидкости составил 90 мл. Осторожно добавляли 270 мл холодного этанола (тройной объем) и перемешивали. Полученный нитевидный осадок извлекали накручиванием на стеклянную палочку и переносили в центрифужный стаканчик. Осадок 3 раза сушили спиртом, 3 раза смесью Никифорова (спирт + эфир) и 3 раза эфиром. Вес полученного сухого порошка составил 11,4 мг. Сухую смесь нуклеиновых кислот запаивали в ампулы и оставляли для дальнейшего исследования.
Выход нуклеиновых кислот составил 0,95 мг на 1 г биомассы. Контрольный высев через 30 мин после обработки лизоцимом показал отсутствие роста, т.е. полный лизис клеток.
Пример 2. Выполняется аналогично примеру 1, за исключением того, что культивирование с предварительным подращиванием микробных клеток производили в течение 16 ч, концентрация лизоцима составила 22 мг/г биомассы и замораживание суспензии клеток проводили в течение 40 с. Выход нуклеиновых кислот также составил 0,95 мг на 1г биомассы, а контрольный высев показал отсутствие роста.
Пример 3. Выполнялся аналогично примерам 1 и 2. Отличие заключалось в том, что время культивирования составляло 16,5 ч, для лизирования использовали 22 мг лизоцима на 1 г биомассы, а замораживание суспензии проводили в течение 45 с. Выход нуклеиновых кислот составил 0,95 мг/г биомассы. Отмечено отсутствие роста при контрольном высеве.
Как показали экспериментальные испытания, уменьшение времени культивирования ниже 16 ч не обеспечивает получения максимально возможных количеств микробных клеток, а следовательно, снижает выход готового продукта. Увеличение же этого времени приводит к образованию спор и соответственно не обеспечивает гарантированного обеззараживания Bac. anthracis.
Уменьшение концентрации лизоцима менее 20 мг/г биомассы не обеспечивает полноты лизиса клеток, что снижает выход готового продукта и не гарантирует обеззараживание клеток. Увеличение количества лизоцима более 25 мг/г биомассы нецелесообразно.
Заявленные интервалы времени замораживания клеточной суспензии в жидком азоте необходимы и достаточны в совокупности с остальными признаками изобретения для достижения поставленной цели.
Таким образом, изобретение практически осуществимо, его использование позволяет осуществлять получение нуклеиновых кислот из различных спорообразующих микроорганизмов при гарантированном их обеззараживании и увеличить выход готового продукта более чем на 70% по сравнению с прототипом.
Claims (1)
- Способ получения нуклеиновых кислот Bacillus anthracis, включающий подготовку биомассы, обработку ее лизоцимом в присутствии ЭДТА в течение 20 мин при 37oС и рН 9,0, трехкратное замораживание и оттаивание суспензии, дополнительное лизирование ТРИС-СDС-буфером, обработку фенолом в соотношении 1 1 и осаждение нуклеиновых кислот тройным объемом холодного этанола, отличающийся тем, что подготовку биомассы проводят с предварительным подращиванием микробных клеток с соблюдением условий герметизации колб с культурой в течение 16 17 ч, обработку лизоцином в концентрации 20 25 мг/г биомассы, замораживание осуществляют в жидком азоте в течение 40 60 с.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU95101495A RU2101354C1 (ru) | 1995-01-31 | 1995-01-31 | Способ получения нуклеиновых кислот bacillus anthracis |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU95101495A RU2101354C1 (ru) | 1995-01-31 | 1995-01-31 | Способ получения нуклеиновых кислот bacillus anthracis |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU95101495A RU95101495A (ru) | 1997-03-20 |
RU2101354C1 true RU2101354C1 (ru) | 1998-01-10 |
Family
ID=20164486
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU95101495A RU2101354C1 (ru) | 1995-01-31 | 1995-01-31 | Способ получения нуклеиновых кислот bacillus anthracis |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
RU (1) | RU2101354C1 (ru) |
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP3464589A4 (en) * | 2016-05-31 | 2020-02-26 | DNA Genotek Inc. | COMPOSITION, SYSTEM AND METHOD FOR REMOVING DETERGENTS FROM AQUEOUS SOLUTIONS |
US11002646B2 (en) | 2011-06-19 | 2021-05-11 | DNA Genotek, Inc. | Devices, solutions and methods for sample collection |
US11572581B2 (en) | 2002-06-07 | 2023-02-07 | DNA Genotek, Inc. | Compositions and methods for obtaining nucleic acids from sputum |
-
1995
- 1995-01-31 RU RU95101495A patent/RU2101354C1/ru active
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
Miura K. Meth. Enzymol, 1967, р. 343. * |
Cited By (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US11572581B2 (en) | 2002-06-07 | 2023-02-07 | DNA Genotek, Inc. | Compositions and methods for obtaining nucleic acids from sputum |
US11002646B2 (en) | 2011-06-19 | 2021-05-11 | DNA Genotek, Inc. | Devices, solutions and methods for sample collection |
US11536632B2 (en) | 2011-06-19 | 2022-12-27 | DNA Genotek, Inc. | Biological collection system |
US11549870B2 (en) | 2011-06-19 | 2023-01-10 | DNA Genotek, Inc. | Cell preserving solution |
US11592368B2 (en) | 2011-06-19 | 2023-02-28 | DNA Genotek, Inc. | Method for collecting and preserving a biological sample |
EP3464589A4 (en) * | 2016-05-31 | 2020-02-26 | DNA Genotek Inc. | COMPOSITION, SYSTEM AND METHOD FOR REMOVING DETERGENTS FROM AQUEOUS SOLUTIONS |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
RU95101495A (ru) | 1997-03-20 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
AU2020100853A4 (en) | Proteus mirabilis phage rdp-sa-16033 and industrial production process thereof | |
CN115044505A (zh) | 一株贝莱斯芽孢杆菌产抗菌脂肽及其在化妆品和食品的应用 | |
Reilly et al. | An actinophage for Streptomyces griseus | |
RU2101354C1 (ru) | Способ получения нуклеиновых кислот bacillus anthracis | |
CN107446853B (zh) | 延长赖氨酸芽孢杆菌菌株、酶制剂及其降解农药残留的应用 | |
JPS61135583A (ja) | ストレプトミセス科の菌から得られる溶菌性酵素生成物、その製法およびそれに適する菌株 | |
CN114736846B (zh) | 一种提高腺病毒生产的wayne293 lvpro细胞培养基添加物及制作方法 | |
RU2532227C1 (ru) | Штамм enterоcoccus mundtii, продуцирующий субстанцию пептидной природы с антилистериозной активностью | |
Jansson | Isolation of fastidious mycoplasma from human sources | |
CZ308157B6 (cs) | Kmen bakterie Clostridium histolyticum, kolagenáza připravená s použitím tohoto kmene a její použití | |
JPH07246097A (ja) | トレハロースの製造方法 | |
CN117546873B (zh) | 极端东方假单胞菌在防治辣椒轻斑驳病毒中的应用 | |
CN113564073B (zh) | 一种捕食爬管菌及其在制备抑制耐甲氧西林金黄色葡萄球菌药物中的应用 | |
RU2158302C2 (ru) | Питательная среда для роста бифидо- и лактобактерий | |
Karube et al. | Bacteriolysis by immobilized enzymes | |
CN116004750B (zh) | 桃色欧文氏菌产安吉菌素的方法 | |
CN113215111B (zh) | 一种噬菌体及在防治肉鸡心内膜炎中的医用用途 | |
RU2384619C1 (ru) | СТРЕПТОМИЦИНУСТОЙЧИВЫЙ ШТАММ Bacillus sp. ВКПМ В-9862 - ПРОДУЦЕНТ ВНЕКЛЕТОЧНОЙ ЩЕЛОЧНОЙ РИБОНУКЛЕАЗЫ | |
NZ221455A (en) | Microbial production of cellulose | |
SU1395676A1 (ru) | Способ выделени облигатных анаэробных кокков | |
CN117925405A (zh) | 一种蛭弧菌冻干粉及其制备方法 | |
SU1123293A1 (ru) | Средства дл активации роста и повышени титра клубеньковых бактерий | |
CN116769660A (zh) | 一株原囊菌属黏细菌及其在制备耐甲氧西林金黄色葡萄球菌生物膜清除药物中的应用 | |
CN116948986A (zh) | 一种抗细菌耐受的多价溶藻弧菌噬菌体vap230304及其应用 | |
US4562070A (en) | Method of enhancement of piliated phase of Bordetella bronchiseptica |