RU2082759C1 - Штамм дрожжей saccharomyces cerevisial, содержащий рекомбинантную плазмиду yep 63/ab, - продуцент производного м-белка вируса гепатита в человека - Google Patents

Abstract

Использование: производство вакцин против вирусного гепатита B человека, разработка биотехнологических методов для диагностики и профилактики заболеваний, вызываемых вирусом гепатита В (ВГВ). Сущность: получение штамма-продуцента производного М-белка вируса гепатита B человека. Указанный штамм содержит рекомбинантную плазмиду YEp 63/АВ, обеспечивающую синтез производного М-белка ВГВ в трансформированных клетках. Синтезируемый белок собирается в частицы, подобные природным частицам вируса размером 22 нм. Уровень синтеза производного М-белка составляет 0,5-1% от суммарного белка клетки. Новый штамм-продуцент перспективен для промышленного получения производного М-белка ВГВ. 6 ил., 2 табл.

Description

Изобретение относится к биотехнологии и медицине, в частности к генетической инженерии, и представляет собой рекомбинантную плазмидную ДНК, обуславливающую синтез производного среднего поверхностного белка (М-белка) вируса гепатита B человека (hepatitis B virus HBV) и штамм дрожжей, содержащий эту плазмиду и являющийся продуцентом этого белка.

Изобретение может найти применение в производстве вакцин против вирусного гепатита B и при диагностике, профилактике заболеваний, вызываемых HBV.

Вирусный гепатит B является одной из широко распространенных болезней человека. По оценкам ВОЗ более 300 млн. человек в мире являются хроническими носителями данного вируса. В СССР ежегодно заболевают вирусными гепатитами до 1 млн. человек. Среди них доля больных гепатитом B составляет 9-10 Экономический ущерб исчисляется более чем в 500 млн. руб. ежегодно (Кондрусев, 1990, В: Итоги Науки и техники. Вирусология, т. 22, 3).

Существующие коммерческие препараты вакцины, созданные методами генетической инженерии, содержат основной поверхностный белок вируса HBV (М-белок) в качестве защитного начала. Такие вакцины по своей эффективности не уступают инактивирванным или субъединичным вакцинам (Ellis Gerety, 1990, J. Med. Virol, 31, 54-58). Однако, среди здоровых людей от 5 до 15% реципиентов не развивают иммунитета против HBV при иммунизации М-белком (Szumness et. al. 1980, New Engl. J. Med. 303, 833-841). Больные гемофилией или с нарушениями иммунной системы также слабо отвечают на иммунизацию такой вакциной. С другой стороны показано, что повторная иммунизация таких реципиентов одним из двух других поверхностных белков вируса большим (L-белком) или средним (М-белком) вызывает развитие стойкого иммунитета (Zangley et. al. 1988, 67, 229-245). Известно, что антигены HBV (HBsAg), входящие в состав оболочки вириона и так называемой 22 нм частицы, представлены основным (S, 226 а.к.о. ), средним 281 а.к.о.) и большим (389 или 400 а.к.о) (в зависимости от субтипа) поверхностными белками HBV. Эти три белка продукты одной открытой рамки считывания (ОРС) вирусного генома, разделенной тремя инициаторными кодонами ATG на три домена pre S1, pre S2 и S по направлению от 5' к 3'. Все указанные белки способны собираться в 22-нм липопротеиновые частицы со свойствами HBsAg и являются предметом интенсивных практических и теоретических разработок в плане иммунопрофилактики гепатита B. В pre S-областях выявлены многочисленные иммунодоминантные эпитопы (Milich et. al. 1986, Im manol. 137, 2703-2710, Neurath et. al. 1987, In: Modern Appr. to New Vaccines Including Prevention of AIDS. CSHL, 159). Два таких эпитопа pre S2 области, отвечающие за T- и B-клеточный ответ, картированы в положениях 14-24 а.к.о. на последовательности М-белка. C этими эпитопами перекрывается (позиции 12-18 а.к.о. ) сайт связывания с полимеризованным сывороточным альбумином человека (PAR-сайт), опосредующий прикрепление вириона HBV к гепатоцитам. Важную роль в этом процессе, видимо, играет и гликозилирование pre S2 (Xuanyong Lu et. al. 1989, In: Hepatitis B Virus CSHL. 97), сайт гликозилирования pre S2 локализован недалеко от основных эпитопов (позиции 4-6 а.к.о. фиг.1).

К настоящему времени известны рекомбинантные плазмидные ДНК, обеспечивающие экспрессию гена М-белка и его производных в дрожжах Sacharomyces cerevisiae (EP 0278940, EP 0312159). Показано, что синтезируемый в S. cerevisiae рекомбинантный М-белок HBV, несущий делецию по месту Arg⁴⁸, более устойчив к действию трипсиноподобных протеаз (ТПП) дрожжей, чем его природный аналог (Itoh, Y, Fujisa-wa. Y. 86, Bioch. Biophys. Res. Comm. 141, 942-948). В то же время мишени для протеазной атаки располагаются почти по всей длине области pre S2, хотя и не затрагивают основные N-концевые эпитопы (Langley at. al. 1988).

Целью изобретения является создание штамма-продуцента модифицированного М-белка HBV, более устойчивого к ТПП дрожжей по сравнению с вариантом, полученным Ито и Фудзисава (Itoh. Y. J Fujisawa, Y. 1986), способного к эффективному конститутивному синтезу целевого продукта.

Поставленная цель достигается конструированием рекомбинантной плазмидной ДНК, несущей модифицированный ген М-белка HBV с делецией размером в 15 п.о. в районе, отвечающем за чувствительность pre S2 области к ТПП и обозначенная авторами как pHBmdI. На ее основе сконструирована рекомбинантная плазмидная ДНК YEp63/AB, кодирующая синтез устойчивого к ТПП производного М-белка HBV. Полученной плазмидой трансформирован штамм дрожжей S. cerevisiae 20B12 [d trpl pep 4-3] J. gas. 1976, Genetics 85, 23-28). Наличие в плазмиде интактного промотора дрожжевого гена глицеральдегид 3-фосфат дегидрогеназы (GPD) с оптимизированной 5'-нетранслируемой областью перед инициаторным кодоном AUG (5'-НТО), позволяет достичь высокого уровня синтеза целевого продукта, не прибегая к индукции. Синтезируемый белок нормально собирается в частицу подобно природной 22 нм частице HBsAg. Уровень синтеза производного М-белка составляет 1,5-2 от суммарного белка клетки.

Рекомбинантная плазмида pllBmd1 (фиг.1) содержит репликон и ген устойчивости к ампициллину плазмиды pUC19, промотор и часть гена LACZ lac - оперона E. coli и фрагмент, кодирующий производное М-белка HBV, встроенный в состав "полилинкера" плазмиды pUC19, именно состоит из следующих элементов: EcoRI-BamHI фрагмента плазмиды pUC19 размером 2642 п.о. включающего участок начала репликации, ген устойчивости к ампициллину (bla), промотор и часть гена LACZ lac-оперона E. coli; EcoRI-BamHI-фрагмента кодирующего производное М-белка HBV размером 1350 п.о.

Размер плазмиды pHBmd15 составляет 4017 п.о. Копийность плазмиды около 50 молекул на клетку.

ДНК плазмиды pHBmd15 содержит уникальные сайты рестрикации EcoRI, BamHI SaIGI, Pst, HindIII, 2 сайта рестрикации XbaI, SphI. Положения всех перечисленных сайтов рестрикации относительно уникального EcoRI-сайта указаны в табл. 1.

Полная первичная структура плазмиды pUC19 известна. Первичная структура фрагмента, кодирующего производное М-белка, представлена на фиг.2.

Рекомбинантная плазмида YEp63IAB (фиг.3) содержит кассету экспрессии гена производного М-белка HBV, встроенную в состав челночного вектора дрожжей pJDB 207, который в свою очередь содержит репликон и ген устойчивости к ампициллину плазмиды pAT153, репликон 2μ ДНК дрожжей, дрожжевые гены TRPI и Teu 2-d. В кассету экспрессии входит промотор GPD, ген М-белка с оптимизированной 5'-НТО и терминатор транскрипции гена фосфоглицерат киназы (PGK).

Плазмида YEp63/AB состоит из следующих элементов:
Hind III SaIGI ("затупленный") фрагмента известной плазмиды pJOB207 размером 6633 п.о. (J.R. Broach, Meth, Enzymol. v.101, p 307-325, 1983);
Hind III-Bam III фрагмента экспрессии гена производного М-белка HBV размером 2134 п.о.

Bam HI-Bg III ("затупленный") фрагмента с дрожжевым геном TRPI размером 1203 п.о. из известной плазмиды YRp7 (Tsclamper, G Carbon, J, 1980, Gene.10, 157-166).

Плазмида YEp63/AB содержит гены:
модифицированный ген М-белка HBV, кодирующий синтез производного этого белка с делениями по аминокислотным остаткам от Pro³⁴ до Asp⁵² и имеющий оптимизированную дрожжевую 5'-нетранслируемую область гена перед кодоном ATG и интактную последовательность терминатора транскрипции.

TRPI ген, обеспечивающий прототрофность по триптофану трансформантов реципиентного штамма дрожжей, несущего плазмиду;
LEU2-d ген, обеспечивающий прототрофность по лейцину трансформантов реципиентного штамма дрожжей, несущего плазмиду;
bla-ген, обеспечивающий синтез b-лактамазы и влияющий на устойчивость к ампициллину штаммов E. coli, несущих плазмиду.

Размер плазмиды YEp63/AB составляет 10070 п.о.

Плазмида YEp63/AB содержит уникальные сайты рестрикции BamHI, HpaI KpnI, 2 сайта рестрикции PstI и 3 сайта рестрикции XbaI, EcoRI, HinIII. Положения всех перечисленных сайтов в рестрикции относительно уникального сайта показаны в табл. 2.

Синтез производного М-белка в дрожжах осуществляется под контролем дрожжевого промотора GPD. Полная первичная структура всех элементов, из которых построена плазмида YEp63/AB, известна. Первичная структура кассеты экспрессии, начиная от места стыковки промотора с геном М-белка и кончая терминатором транскрипции PGK, представлена на фиг.2.

Плазмида YEp63/AB реплицируется в клетках E. coli за счет репликона pAT153. В клетках дрожжей репликацию плазмиды обеспечивает репликон 2μ ДНК дрожжей.

Штамм-продуцент производного М-белка HBV получен трансформацией клеток S. cerevisiae 20B12 [d trpl pep4-3] плазмидой YEp63/AB. Синтезируемый белок нормально собирается в частицу подобно природной 22 нм частице HBsAg. Уровень синтеза производного М-белка по данным иммуноферментного анализа составляет 1,6-2 от суммарного белка клетки. Митотическая стабильность плазмиды YEp63/AB в штамме S. cerevisiae 20B12 при росте в селективных условиях составляет 75-80% число копий полученной плазмиды на дрожжевую клетку от 3 до 4. Штамм депонирован во Всесоюзной коллекции микроорганизмов при ИБФМ АН СССР под номером ВКМ CR-348D. Штамм S. cerevisiae 20B12, содержащий плазмиду YEp63/AB, характеризуется следующими признаками:
Морфологические признаки: клетки имеют форму от круглой до овальной, при делении почкующиеся.

Культуральные признаки: клетки хорошо растут на обычно используемых питательных средах. Время генерации около 90 мин в жидкой среде YNB (0,67% "Yeast Nitrogen Base", "Difco", 2% глюкозы). На 2-2,5% питательном агаре "Difco" образуются круглые, гладкие, белые колонии с ровными краями. При выращивании на жидких средах YNB и YEPD (1% дрожжевого экстракта, 2% пептона, 2% глюкозы) образуется интенсивная гомогенная взвесь.

Физиолого-биохимические признаки: оптимальная температура культивирования: от 28 до 30^oC, оптимум pH 6,0. В качестве источника углерода служит главным образом глюкоза, в некоторых случаях этанол. Источником азота служат органические соединения (пептон, аминокислоты).

Пример 1.

Конструирование рекомбинантной плазмидной ДНК pHBmdl.

Конструирование осуществляли в соответствии со схемой, представленной на фиг.4.

Для получения мутаций в гене М-белка HBV, защищающих кодируемый белок от действия протеаз дрожжей, с помощью нуклеазы S1 удаляли "лишние" нуклеотиды вокруг сайта XhoI плазмиды pSMpre S2-S (Эльдаров и др. 1987, Биотехнология, 3 19-26). Гидролизованную XhoI плазмидную ДНК последовательно обрабатывали нуклеазой SI, фрагментом Кленова и лигазой фага Т4. Скрининг полученных клонов проводили прямым секвенированием выделенных плазмид.

10 мкг плазмиды pSMpre S2-S гидролизовали 2 ед. рестриктазы XhoI в 30 мкл инкубационной смеси 2 ч при 37^oC в высокосолевом буфере следующего состава: 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 100 mM NaCl, 10 mM MDCl₂, 1 mM DTT. После инкубации добавляли 70 мкл дистиллированной воды и обрабатывали 100 мкл смеси фенол/хлороформ (1 часть фенола, насыщенного Tris-HCl pH 7,5, и 1 часть хлороформа) путем перемешивания с помощью встряхивателя (15 с) и центрифугировали 5 мин в настольной центрифуге "Eppendorf". Верхнюю фазу переносили в новую пробирку и осаждали 3 объемами этанола в присутствии 0,3 М NaOAc pH 5,0 (замораживание при -70^oC и центрифугирование 10 мин при 10 тыс. об/мин в настольной центрифуге "Eppendorf"). Осадок ДНК промывали 70% этанолом и после высушивания растворяли в 5 мкл ТЕ-буфера (10 мМ Tris-HCl, pH 0,1 mM EDTA).

Затем добавляли 5 мкл 10 х S1-буфера (500 mM NaOAc pH 5,0, 300 mM NACl, 10 mM ZnSO₄), 40 мкл бидистиллированной воды и 3 ед. S1 экзонуклеазы (Amersham). Инкубировали 30 мин при 30^oC, экстрагировали препарат смесью фенол/хлороформ, переосаждали ДНК спиртом, растворяли в TE и легировали в объеме 100 мкл в смеси с 10 мкл 10 х лигазного буфера (500 mM Tris-HCl pH 7,5, 100 mM DTE, 100 mM MgCl₂, 10 mM ATP, 1 mM BSA) и 1 ед. Т4-лигазы (Amersham) и инкубировали 3 ч при 15^oC. Затем реакционную смесь прогревали 10 мин при 70^oC. Наконец, добавляли 10 мкл 1 M NaCl и 3 ед. XhoI (Amersham) и инкубировали при 37^oC час 200 мкл компетентных клеток штамма E. coli TGI, приготовленных стандартным способом (Маниатис Т. и др. Молекулярное клонирование. Методы генетической инженерии. М. Мир, 1984), трансформировали 20 мкл лигазной смеси и трансформанты отбирали на чашках с питательным агаром, содержащим 50 мкг/мл ампициллина.

Выделенную стандартным щелочным методом (Маниатис и др. 1984) плазмидную ДНК из полученных клонов анализировали путем гидролиза рестриктазой XhoI. Те плазмиды, которые не содержали сайта XHoI, анализировали долее секвенированием preS2-области по методу Сэнгера (Hattori SaKaKi. 1986, Anal, Biochem. 152, 232-238) с использованием "универсального" праймера. В результате была отобрана плазмида, кодирующая производное М-белка с делецией в 18 а.к.о. в районе Arg⁴⁸ preS2 области (фиг.2) и обозначенная pHBmdI.

Пример 2.

Конструирование рекомбинантной плазмидной ДНК YEp63/AB
Схема конструирования представлена на фиг.5 (А-Г).

А/ Конструирование плазмиды 56/АВ (фиг.5).

Для создания "кассеты экспрессии" гена М-белка в дрожжах S. cerevisiae сначала ген производного М-белка HBV плазмиды pHBmdI клонировали под контролем GPD промотора плазмиды GPD/Ba131N2 по сайту рестрикции EcoRI. Для этого 5 мкг ДНК плазмиды pHBmdI гидролизовали совместно рестриктазами EcoRI и BamHI (по 10 ед. каждой) в объеме 25 мкл в высокосолевом буфере (пример 1) 2 ч при 37^oC. Смесь фракционировали в 1% агарозном геле. Нужный фрагмент ДНК размером около 1400 пн элюировали из легкоплавкой агарозы с помощью стандартной процедуры (Маниатис и др. 1984). ДНК осаждали этанолом и растворяли в 5 мкл воды.

Для получения вектора из плазмиды GPD/Ba131N2 5 мкг ДНК гидролизовали в 30 мкл смеси совместно рестриктазами EcoRI и BamHI и элюировали фрагмент ДНК размером около 3700 пн из легкоплвкой агарозы. ДНК осаждали спиртом, высушивали и растворяли в 5 мкл ТЕ буфера.

0,5 мкл гидролизованной EcoRI и BamHI ДНК GPD/Ba131N2 смешивали с 1 мкл Eco-Bam HIфрагмента ДНК, кодирующего производное М-белка HBV плазмиды pHBmdI, и смешивали с 2 мкл 10х лигазного буфера (пример 1). Объем раствора доводили до 20 мкл бидистиллированной водой, добавляли 1 ед. Т4-лигазы (Amersham) и инкубировали 3 ч при 15^oC. Затем реакционную смесь прогревали 10 мин при 70^oC. Выделенные плазмидные ДНК из трансформаторов штамма E. coli TG1 анализировали соответствующими рестриктазами. В результате была отобрана плазмида 56/АВ с указанной ниже первичной структурой области стыковки промотора GPD и гена М-белка:
5'-НТП/GPDI/⁺1 линкер ⁺1/preS2 область/
TAACAAACAAA ATG AGA GAATTCC GGCC ATG CAG TGG
Б/ Конструирование плазмиды 28-56/АС (фиг.6).

Для удаления "лишних" нуклеотидов в месте соединения промотора GPD и гена М-белка проводили обработку линеаризованной рестриктазой EcoRI ДНК GPDIV нуклеазов Ba131 с последующим субклонированием.

10 мкг ДНК 56/АБ гидролизовали рестриктазой EcoRI в стандартных условиях в объеме 40 мкл. После депротеинизации смесью фенол/хлороформ ДНК осаждали спиртом и осадок высушивали. ДНК растворяли в 15 мкл раствора бычьего сывороточного альбумина (500 мгк/мл) и смешивали с 15 мкл 2хBa131 буфера (1,2 М NaCl, 24 mM CaCl₂, 24 mM MgCl₂, 40 mM TrisHCl, pH 8,0, 2 mM EDTA). Смесь инкубировали 10 с при 30^oC с 1 ед. Ba131. Реакции останавливали, добавляли 0,5 мкл раствора 0,2 M EGTA, далее обрабатывали смесью фенол/хлороформ. ДНК осаждали этанолом. Осадок ДНК растворяли в 5 мкл TE буфера, обрабатывали фрагментом Кленова ДНК полимеразы 1 в присутствии dNTP, как описано в руководстве Маниатиса, и легировали в 100 мкл смеси вышеописанным способом. Лигазу инактивировали нагреванием при 70^oC 10 мин. Добавляли 10 мкл 1 М NaCl и 10 ед. EcoRI и инкубировали 2 ч при 37^oC. Плазмиды из полученных клонов анализировали методом секвенирования по Сэнгеру (Hattori Sakaki, 1986, Anal, Biochem, 152, 232-238) с использованием праймера, специфичного к последовательности промотора GPDI. Отобранный клон 28-56/АС содержал интактную 5'-нетранслируемую последовательность промотора GPD вместе с инициаторным кодоном ATG и двумя первыми кодонами гена глицеральдегид фосфатдегидрогеназы, состыкованную в рамку, начиная с третьей аминокислоты, с кодирующей последовательностью гена М-белка (фиг.6).

В/ Конструирование плазмиды 3-28-56/АВ (фиг.7)
Для конструирования "кассеты экспрессии" гена М-белка HBV к 3'-концу этого гена, содержащегося в плазмиде 28-56/АС, присоединяли последовательность терминатора транскрипции гена PGK дрожжей с таким расчетом, чтобы в конечной конструкции отсутствовали как кодирующие участки гена PGK, так и 3'-НТО гена S-белка.

Плазмида YEp64/AB (заявка на изобретение N 4025079/13 от 2.12.85) представляет собой вектор экспрессии производного М-белка HBV, 20 мкг ДНК YEp64/AB гидролизовали совместно рестриктазами XbaI и BamHI из легкоплавкой агарозы выделяли 870 п. о. фрагмент ДНК, содержащий 590 п.о. 3'-концевой кодирующей области М-белка с присоединенным к стоп-кодону интактным терминатором транскрипции гена PGKI S. cerevisiae.

Аналогично выделяли XbaI/BamHI вектор 28-56/АС и легировали с XbaI-BamHI фрагментом в стандартных условиях. Селекцию трансформантов E. coli TGI на присутствие нужного клона проводили, анализируя выделенные плазмидные ДНК с помощью гидролиза рестриктазами, одна из полученных плазмид с нужной структурой была обозначена 3-28-56/AB и отобрана для дальнейшей работы.

Г/ Конструирование плазмиды YEp63/АВ (фиг.8).

Для получения вектора, обеспечивающего биосинтез М-белка HBV в клетках дрожжей, экспрессионную кассету из плазмиды 3-28-56/АВ клонировали в универсальный челночный вектор дрожжей 38/АВ (Б. Арьяа, Канд. дисс. Москва, 1991), который в свою очередь представляет собой плазмиду pJDB207 со встроенным по сайту BamHI геном TRPI дрожжей (в виде BamHI-BgIII фрагмента плазмиды YRp7).

10 мкг ДНК 38/АВ дигидролизовали рестриктазой BamHI в стандартных условиях. ДНК переосаждали спиртом, растворяли в 30 мкл раствора 50 mM Tris-HCl pH 8,5, инкубировали с 1 ед. бактериальной щелочной фосфатазы (Amersham) 30 мин при 50^oC. Линейную форму ДНК с дефосфорилированными 5'-выступающими BamHI-концами выделяли из легкоплавкой агарозы.

10 мкг ДНК плазмиды 3-28-56/АВ гидролизовали рестриктазой HindII к "затупленным" с помощью фрагмента Кленова ДНК полимеразы 1 к концам ДНК присоединения BamHI-линкер в стандартных условиях и после гидролиза рестриктазой BamHI "кассету экспрессии" М-белка HBV выделяли в виде BamHI - фрагмента ДНК размером около 2000 п.н.

Проводили сшивку дефосфорилированного вектора 38/АВ и фрагмента с помощью ДНК фага Т4, отбирали трансформанты штамма E. coli TG1 с фенотипом A $\genfrac{}{}{0ex}{}{\text{R}}{\text{p}}$ T $\genfrac{}{}{0ex}{}{\text{S}}{\text{c}}$ . Наличие вставки и ее ориентацию определяли, анализируя из полученных клонов плазмиды с помощью гидролиза рестриктазами. В результате была отобрана плазмида YEp63/АВ, в которой 3'-конец "кассеты экспрессии" был присоединен к 5'-концу гена TRP1 плазмиды 38/АВ и между маркерным геном и экспрессируемым геном М-белка располагался терминатор PGK.

Пример 3.

Получение штамма S. cerevisiae 20B12 продуцента производного М-белка HBV.

Клетки реципиентного штамма S. cerevisiae 20B12 (α trpl pep4-3) трансформировали плазмидной ДНК YEp63/АВ по методу Ито и др. (Ito et al. 1983, J. Bacteriol, 153, 163-168). Колонию дрожжей с пластинки агара переносили в 50 мл жидкой YEPD-среды и инкубировали в течение ночи при 30^oC. Культуру центрифугировали, и осадок промывали буфером следующего состава: 10 mM Tris-HCl pH 7,5, 0,1 mM EDTA (TE-буфер). Промытые клетки ресуспендировали в 50 мл ТЕ-буфера, содержащего 0,1 М LiAC, и инкубировали 2 ч при 30^oC. После центрифугирования клетки суспендировали в 0,5 мл LiOAc/TE-буфера, добавляли 10-20 мкг плазмидной ДНК YEp63/АВ, и смесь инкубировали 30 мин при 30^oC. Затем добавляли 1 мл 50% PEG 4000, перемешивали, инкубировали при 30^oC 1 ч и подвергали тепловому шоку 5 мин при 42^oC. Клетки центрифугировали и промывали ТЕ-буфером. Промытые клетки ресуспендировали в 500 мкл воды и высевали по 100 мкл на чашки Петри с селективным агаром (0,67% YNB, 2% глюкозы, 2% агара). Через 2-4 дня инкубации при 30^oC наблюдали рост трансформантов.

Для анализа экспрессии производного М-белка в трансформантах штамма 20B12 параллельно выращивали клоны 20B12/YEp63/АВ и в качестве отрицательного контроля штамм 20B12, содержащий челночный вектор 38/АВ в 4 мл минимальной YNB-среды, содержащей 1% гидролизат казеина (Difco). После культивирования в течение 72 ч при 30^oC из выращенных культур получали осадок клеток. Белковый экстракт из промытых водой клеток дрожжей получали встряхиванием с периодическим охлаждением на льду ресуспендированных осадков со стеклянными бусами (0,5 мм диам.) в 3 мл буфера, содержащего 50 mM Tris-HCl, pH 8,0, 0,1 M NaCl, 0,5% Triton X-100, 1 mM PMSF (10 раз по 30 с при максимальной скорости настольного встряхивателя типа "Vortex").

Для удаления остатков клеток и шариков гомогенаты центрифугировали и суспернатант осветляли повторным центрифугированием. Концентрацию общего белка в лизатах определяли по методу Брэдфорда (Bradford M.M. 1976, Anal. Biochem. 72, 248-254). Определение содержания белка со свойствами HBsAg в лизатах проводили методом иммуноферментного анализа. Определенный таким образом уровень экспрессии производного М-белка HBV в трансформантах 20B12/YEp63/АВ составлял 300 мкг/л культуральной среды при плотности культуры 0,5•10⁷ кл/мл. Один из отобранных клонов депонирован как штамм-продуцент производного М-белка HBV во Всесоюзной коллекции микроорганизмов при ИБФМ АН СССР под номером ВКМ CR-347D.

Claims (1)

1. Штамм дрожжей Saccharomyces cerevisial ВКМ NCR-347D, содержащий рекомбинантную плазмиду YEP 63/AB продуцент производного М-белка вируса гепатита В человека.

Images