CN101805745B - 快速筛选高表达目的蛋白的酵母的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种快速筛选高表达目的蛋白的酵母的方法。该快速筛选高表达目的蛋白的酵母的方法基于以酸性α-淀粉酶的编码基因作为筛选标记基因。本发明还公开了以所述酸性α-淀粉酶的编码基因作为筛选标记基因的载体。本发明的快速筛选高表达目的蛋白的酵母的方法，是将所述的载体导入酵母菌中获得重组菌，所述重组菌在含有可溶性淀粉的固体培养基上培养，单克隆周围产生直径为0.3-0.5cm透明圈的重组菌为高表达目的蛋白的酵母。本发明的方法可以宏观上筛选目的蛋白高表达转化子，并且筛选方法快速便捷，可在目的蛋白生产中广泛应用。
Description
技术领域
本发明涉及快速筛选高表达目的蛋白的酵母的方法。
背景技术
甲醇营养型酵母(简称甲醇酵母)是最近十年逐渐发展起来的一种可用于表达外源基因特别是真核生物基因的理想***。这类酵母分属假丝酵母(Canda)，汉逊酵母(Hansenula)，毕赤酵母(Pichia)和球拟酵母(Torulopsis)4个属，它们都能在以甲醇为唯一碳源和能源的培养基上生长。与酿酒酵母相比，甲醇酵母具有遗传性质稳定、表达量高、分泌效率高和适于大规模发酵等优点。多形汉逊酵母(Hansenula)是这类酵母中的佼佼者，是当前国际上公认的最为理想的外源基因表达***之一。目前已构建了多种多形汉逊酵母营养型突变体菌株和相应的携带这些突变体功能互补的同源或异源基因的载体。同时，G418、腐草霉素或零霉素抗性的基因也被作为筛选标记基因应用于多形汉逊酵母表达***中。
多数蛋白质的表达存在基因剂量效应，外源基因高拷贝重组菌往往能提高外源蛋白的产量，不同筛选标记和筛选方法在多拷贝高表达重组菌的筛选中起到至关重要的作用。常用的筛选标记主要有抗性筛选(例如：G418和腐草酸素)和营养缺陷型筛选(例如：LEU2或URA3)。利用转化子对G418和腐草酸素的抗性程度筛选重组菌，虽然能够筛选高拷贝转化子。但是存在操作繁琐，成本高，基因容易丢失等缺点。利用酿酒酵母的LEU2或URA3基因作为选择标记，尽管能应用无机培养基在发酵整个过程中给予压力避免外源基因丢失，但是其拷贝数相对较低，存在操作繁琐(培养基配制)，筛选工作量大，成本高等缺点。而且有时高拷贝不一定高表达。总体来说，以上常用的筛选方法很难实现目的蛋白高表达重组菌的快速筛选。
发明内容
本发明的目的是提供一种快速筛选高表达目的蛋白的酵母的方法。
该方法是基于将酸性α-淀粉酶的编码基因作为筛选标记基因。
将酸性α-淀粉酶的编码基因作为筛选标记基因，首先需要构建以所述酸性α-淀粉酶的编码基因作为筛选标记的出发载体，然后将外源基因***到所述的出发载体中，获得以酸性α-淀粉酶的编码基因作为筛选标记的重组表达载体，将该载体导入宿主细胞中，在含有淀粉的固体培养基中培养，所述酸性α-淀粉酶水解淀粉产生的透明圈，通过淀粉显色可以直观的根据透明圈半径大小简便快捷初步筛选目的蛋白高表达阳性克隆。
以所述酸性α-淀粉酶的编码基因作为筛选标记的出发载体，包含原核复制起点、筛选标记基因表达盒和目的基因表达盒；所述外源基因表达盒自上游至下游依次含有启动子、目的基因和终止子；所述筛选标记基因表达盒自上游至下游依次含有启动子、酸性α-淀粉酶的编码基因和终止子。
其中，所述筛选标记基因表达盒还可含有两个loxP序列；所述酸性α-淀粉酶的编码基因位于所述两个loxP序列之间，在Cre重组酶的作用下可有效去除酸性α-淀粉酶的编码基因。所述载体还可含有血红蛋白基因表达盒，所述血红蛋白基因表达盒自上游至下游依次含有FMD启动子、血红蛋白基因序列和终止子，所述FMD启动子的核苷酸序列可为序列表中的序列1，所述血红蛋白基因的核苷酸序列可为序列表中的序列2。血红蛋白基因表达盒可以表达血红蛋白，在贫氧情况下，含有血红蛋白的重组菌可以高效表达目的蛋白，更利于工业生产。
所述载体还含有抗性基因表达盒，所述抗性基因表达盒自上游至下游依次含有loxP序列、抗性基因和loxP序列。所述抗性基因为Zeocin抗性基因。
所述载体的结构如图3所示。
本发明所提供的快速筛选高表达目的蛋白的酵母的方法，包括如下步骤：
将上述的载体导入酵母菌中获得重组菌，所述重组菌在含有可溶性淀粉的固体培养基上培养，单克隆周围产生直径为0.3-1.0em透明圈的重组菌为高表达目的蛋白的酵母。
其中，所述方法中，还包括将Cre重组酶基因导入所述重组菌中。
将Cre重组酶基因导入重组菌中可用本领域已知的多种方法，如将pHFMD-ZL2R1A-Cre(+)载体导入重组菌中，pHFMD-ZL2R1A-Cre(+)的结构如图5所示，Cre重组酶基因导入重组菌表达Cre重组酶，Cre重组酶可将抗性基因和酸性α-淀粉酶的编码基因去除，得到的重组菌不含有筛选标记基因，使重组菌成为食品级产品。
本发明的快速筛选高表达目的蛋白的酵母的方法，以酸性α-淀粉酶的编码基因作为筛选标记可以宏观上筛选目的蛋白高表达转化子，并且筛选方法快速便捷，可在目的蛋白生产中广泛应用。
附图说明
图1为pHGAPZA载体结构示意图。
图2为pHAPZA-amy载体结构示意图。
图3为pHFMDZ-Hb-HBVAg-Thyα1-amy载体结构示意图。
图4为碘蒸汽熏染结果。
图5为pHFMD-ZL2R1A-Cre(+)载体结构示意图。
具体实施方式
下述实施例中所用试剂均可从商业途径获得。
下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。
下述实施例中所述百分含量，如无特别说明，均为质量百分含量。
实施例1、酸性α-淀粉酶基因作为筛选标记
1.构建以酸性α-淀粉酶基因作为筛选标记的表达载体
根据曲霉酸性α-淀粉酶基因，设计引物进行PCR扩增，模板为黑曲霉Aspergillus niger AS 3.795(购自中国普通微生物菌种保藏管理中心)所用引物的核苷酸序列如下：
S1：5’-ATAAGAATGCGGCCGCGGATGAGATTATCGACTTCGAG-3’，
S2：5’-GCTCTAGAACAGTAACCGACCACTCC-3’。
PCR扩增体系为50ul；扩增程序为94℃ 5min；94℃ 1min，56℃ 45sec，72℃，2min，30个循环；再72℃延伸10min。
PCR扩增得到5’端加上了NotI酶识别位点，3’端加上XbaI酶识别位点的黑曲霉酸性α-淀粉酶基因片段。对该产物进行测序，测序结果表明，扩增产物的核苷酸序列为序列表中的序列4，编码序列表中序列5所示的蛋白。
将该黑曲霉酸性α-淀粉酶基因片段用NotI和XbaI酶切后，***到pHGAPZA(图1)(Houhui Song，Yong Li，Weihuan Fang，Yunfeng Geng，Xu Wang，MinWang，Bingsheng Qiu，Development of a set of expression vectors inHansenula polymorpha，Biotechnology Letters，Volume 25，Issue 23，Dec 2003，Pages 1999-2006)(中国科学院微生物研究所)的NotI和XbaI酶识别位点之间，获得载体pHAPZA-amy(图2)。
将构建好的质粒载体pHAPZA-amy，用BgLII/BamHI双酶切，回收含有黑曲霉酸性α-淀粉酶基因的表达框(含有GAP启动子、黑曲霉酸性α-淀粉酶基因连接片段和终止子)，然后用BgLII酶切pHMOXZR25S-HBVAg-Thyα1后并脱磷酸化，根据BgLII与BamHI是同尾酶的原理，将回收的片段***到pHMOXZR25S-HBVAg-Thyα1中得到表达载体pHMOXZR25S-HBVAg-Thyα1-amy。
pHMOXZR25S-HBVAg-Thyα1载体的构建方法见专利ZL200610007869.4。
BgLII/BamHI酶切pHFMDZR25S-Hb后回收含有血红蛋白的表达框(该表达框含有FMD启动子、血红蛋白基因序列和终止子)；pHFMDZR25S-Hb载体的构建方法见专利ZL200610089305.X。BglII酶切pHFMDZ-HBVAg-Thyα1-amy载体脱磷酸化后与含有血红蛋白的表达框连接，得到重组载体pHFMDZR-Hb-HBVAg-Thyα1-amy(图3)，重组载体pHFMDZR-Hb-HBVAg-Thyα1-amy是以黑曲霉酸性α-淀粉酶基因作为筛选标记的表达载体。
2.pHFMDZR-Hb-HBVAg-Thyα1-amy在多形汉逊酵母菌中的表达
多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)AS2.2412(中国普通微生物菌种保藏管理中心)单克隆接种于5ml YPD液体培养基中，37℃过夜培养，取2ml菌液加入200ml预温至37℃的YPD中，37℃培养至OD600＝1.2，室温6000rpm离心5min，弃上清，用500mlTED(100mmol/L Tris-HCl；50mM EDTA；25mmol/L DTT，pH＝8.0)悬浮细胞。在37℃摇床，200rpm摇15min，4℃离心6000rpm，5min，弃上清，用200ml预冷的270mmol/L的蔗糖轻轻悬浮细胞，4℃离心6000rpm，5min，弃上清，用100ml预冷的270mmol/L的蔗糖轻轻悬浮细胞，4℃离心6000rpm，5min，弃上清，用1ml预冷的270mmol/L的蔗糖轻轻悬浮细胞，分装成100ul/管，在100ul的感受态细胞中加入100ng质粒DNA(pHFMDZR-Hb-HBVAg-Thyα1-amy)，轻轻混匀后加入2mm孔径的电击杯中，电击参数：50u F，100Ω，1.5KV，电击后立即加入940ul的YPDTM(1g/100ml酵母提取物；1g/100ml蛋白胨；2g/100ml葡萄糖；1mmol/L MgCL2)，吸取至5ml的小管中，37℃摇床，200rpm培养1h，取100ul涂于含有Zeocin抗生素(终浓度100ug/ml)的YPDS(1g/100ml酵母粉，2g/100ml葡萄糖，2g/100ml蛋白胨，1g/100ml可溶性淀粉)平板，37℃培养2-3天，在平板上出现大、中、小三种不同类型的菌落。用碘蒸汽熏染。以转pHMOXZR25S-HBVAg-Thyα载体的多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)AS2.2412作为对照。
碘蒸汽熏染结果见图4，转pHFMDZR-Hb-HBVAg-Thyα1-amy载体的平板上产生大小不相同的透明水解圈，对照平板上未出现透明水解圈。
用下述两对引物对产生透明水解圈的菌落进行PCR鉴定，引物为HBsAg-up-EcoRI和TA4，HBsAg-up-EcoRI和TA4的核苷酸序列如下：
HBsAg-up-EcoRI：5’CGGAATTCATGGAGAACATCACATCAGG3’；
TA4：5’cgggatccgcggccgcgttctcagcctcctcaacaacctccttcttc3’。
反应程序为94℃ 5min；94℃ 1min，56℃ 45sec，72℃，1min，30个循环；再72℃延伸10min。
以序列3所示的DNA片段为探针进行Southern杂交。
PCR和Southern杂交鉴定结果表明，透明圈较大的菌落都是含有乙肝表面抗原融合蛋白基因的拷贝数高的克隆。
提取透明圈大的菌落和小的菌落酵母的基因组DNA利用PCR方法检测黑曲霉酸性α-淀粉酶基因是否***，引物为S1和S2。PCR的反应程序为：94℃ 5min；94℃1min，56℃ 45sec，72℃，1min，30个循环；再72℃延伸10min。
PCR扩增得到1.6kb的产物为黑曲霉酸性α-淀粉酶基因***到酵母基因组中。
PCR扩增结果表明，产生透明水解圈的菌落的基因组DNA中都能扩增出1.6kb的片段。
分别挑取透明圈大(直径为0.3-0.5cm)的单克隆1个和透明圈小(直径为0.1-0.2cm)的单克隆2个进行发酵培养，方法如下：
将单克隆接入YPD液体培养基中37℃培养12h后，按照5％比例(体积百分含量比)接种到新鲜的YPD发酵培养基中，培养48小时，加入甲醇，使其终浓度为0.5％(体积百分含量比)，再培养48小时后，收获发酵液，4℃ 12000rpm离心3min收集上清，得到HBVAg-Thyα1融合蛋白，对HBVAg-Thyα1融合蛋白进行ELISA分析和乙肝表面抗原免疫活性的检测。ELISA分析所用的抗体为乙肝表面抗原检测试剂盒中的酶标结合液，用乙肝表面试剂盒(乙肝表面抗原实试剂盒购买于华美生物工程公司)进行乙肝表面抗原免疫活性的检测。实验重复3次，结果为3次重复实验的平均值。
表2：pHFMDZR-Hb-HBVAg-Thyα1-amy发酵产物检测结果
| 克隆A(直径为0.3-0.5cm) | OD4500.174 |
| 克隆B(直径为0.1-0.2cm) | OD4500.071 |
| 克隆C(直径为0.1-0.2cm) | OD4500.078 |
上述实验结果表明，透明圈的大小与乙肝表面抗原基因的表达量的高低相关联。形成透明圈比较大的转化子目的蛋白的表达量较高。黑曲霉酸性α-淀粉酶基因可以作为宏观上筛选目的蛋白高表达转化子的快速便捷的方法。
三、α-淀粉酶基因和Zeocin抗性基因的去除
步骤一获得的512bp的HARS，用SalI酶切后连接到同样酶切的载体pHFMDZ-A上获得质粒pHFMDZ-RA。
pHFMDZ-A的构建过程见文献Houhui Song，Yong Li，Weihuan Fang，Yunfeng Geng，Xu Wang，Min Wang，Bingsheng Qiu，Development of a setof expression vectors in Hansenula polymorpha，Biotechnology Letters，Volume 25，Issue 23，Dec 2003，1999-2006。
其次，用EcoRI和XhoI分别双酶切pSH47(Güldener，U.，Heck，S.，Fiedler，T.，Beinhauer，J.，and Hegemann，J.H.A new efficient gene disruptioncassette for repeated use in budding yeast.Nucleic Acids Research，1996，24：2519-2524.)(购自德国EUROSCARF)和pHFMDZ-RA质粒，回收Cre重组酶基因片段和pHFMDZ-RA载体片段后进行连接，获得载体pHFMD-ZR1A-Cre。
以pHIPX4质粒(Klass Nico Faber，Peter Haima，Christine Gietl，et al.The methylotrophic yeast Hansenula polymorpha contains an inducible importpathway for peroxisomal matrix proteins with an N-terminal targeting signal(PTS2 proteins).Cell Biology，1994，91：12985-12989.)(中国科学院微生物研究所)(Eukaryotic Mirobiology，GBB，University of Groningen，J.A.K.W.Kiel教授惠赠)为模板，设计一对引物PCR获得LEU2基因片段，引物的核苷酸序列如下：
LEU2-up-BamHI：CGGGATCCagcttcgaggagaacttctag；
LEU2-down-BamHI：CGGGATCCcgctatttcagcttttcatc。
PCR产物用BamHI进行酶切并回收，然后与BglII单酶切并去磷酸化的pHFMD-ZR1A-Cre载体相连接，将LEU2基因片段正向***载体命名为pHFMD-ZL2R1A-Cre(+)，pHFMD-ZL2R1A-Cre(+)载体的结构示意图如图5所示。
按照步骤二的转化方法将pHFMD-ZL2R1A-Cre(+)转入步骤二的高表达乙肝表面抗原的多形汉逊酵母中，转化后的菌涂布于SC筛选平皿[0.67g/100ml YNB，2g/100ml葡萄糖，相应的嗜好氨基酸混合物(2.0g/L硫酸腺嘌呤，2.0g/L L-精氨酸盐酸盐，2.0g/L L-组氨酸盐酸盐，2.0g/L异亮氨酸，2.0g/L L-赖氨酸盐酸盐，2.0g/L蛋氨酸，3.0g/L苯丙氨酸，6.0g/L L-高丝氨酸，3.0g/L色氨酸，2.0g/L酪氨酸，1.2g/L尿嘧啶，9.0g/L缬氨酸)]上，37℃培养3天，得到单克隆。挑取SC平皿上的克隆接种YPD培养基37℃过夜培养，24h后加入甲醇诱导，加入量为10μl甲醇/mL培养基，诱导24h后，菌体涂布YPD和YPD+Zeocin(100μg/mL)培养基上，37℃培养3天，比较两块平皿的菌落数可以看出抗性的丢失程度，选择丢失率较高的YPD平皿上部分单菌落分别点种到YPD和YPD+Zeocin(100μg/mL)平皿上面进行培养。引物S1和S2进行PCR验证α-淀粉酶基因的丢失，最终得到不含筛选标记的乙肝表面抗原融合蛋白基因高表达阳性克隆。
序列表
<110>中国科学院微生物研究所
<120>快速筛选高表达目的蛋白的酵母的方法
<130>CGGNARW92084
<160>5
<210>1
<211>643
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<230>
<400>1
aatgtatcta aacgcaaact ccgagctgga aaaatgttac cggcgatgcg cggacaattt 60
agaggcggcg aatcaagaaa cacctgctgg gcgagcagtc tggagcacag tcttcgatgg 120
gcccgagatc ccaccgcgtt cctgggtacc gggacgtgag gcagcgcgac atccatcaaa 180
tataccaggc gccaaccgag tctctcggaa aacagcttct ggatatcttc cgctggcggc 240
gcaacgacga ataatagtcc ctggaggtga cggaatatat atgtgtggag ggtaaatctg 300
acagggtgta gcaaaggtaa tattttccta aaacatgcaa tcggctgccc cgcgacggga 360
aaaagaatga ctttggcact cttcaccaga gtggggtgtc ccgctcgtgt gtgcaaatag 420
gctcccactg gtcaccccgg attttgcaga aaaatagcaa gttccggggt gtctcactgg 480
tgtccgccaa taagaggagc cggcaggcac ggagtctaca tcaagctgtc tccgatacac 540
tcgactacca tccgggtctc tcagaggggg gaatggcact ataaataccg cctccttgcg 600
ctctctgcct tcatcaatca aatcatgaag gttgtactag ttc 643
<210>2
<211>466
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<230>
<400>2
ccatggacca acaaactatt aacattatta aggctactgt tccagttttg aaggagcacg 60
gtgttactat tactactact ttctacaaga acttgttcgc taagcaccca gaggttagac 120
cattgttcga catgggtaga caagagtctt tggagcaacc aaaggctttg gctatgactg 180
ttttggctgc tgctcaaaac attgagaact tgccagctat tttgccagct gttaagaaga 240
ttgctgttaa gcactgtcaa gctggtgttg ctgctgctca ctacccaatt gttggtcaag 300
agttgttggg tgctattaag gaggttttgg gtgacgctgc tactgacgac attttggacg 360
cttggggtaa ggcttacggt gttattgctg acgttttcat tcaagttgag gctgacttgt 420
acgctcaagc tgttgagcac caccaccacc accactgagc ggccgc 466
<210>3
<211>783
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<230>
<400>3
atggagaaca tcacatcagg attcctagga cccctgctcg tgttacaggc ggggtttttc 60
ttgttgacaa gaatcctcac aataccgcag agtctagact cgtggtggac ttctctcaat 120
tttctagggg gatcacccgt gtgtcttggc caaaattcgc agtccccaac ctccaatcac 180
tcaccaacct cctgtcctcc aatttgtcct ggttatcgct ggatgtgtct gcggcgtttt 240
atcatattcc tcttcatcct gctgctatgc ctcatcttct tattggttct tctggattat 300
caaggtatgt tgcccgtttg tcctctaatt ccaggatcaa caacaaccag tacgggacca 360
tgcaaaacct gcacgactcc tgctcaaggc aactctatgt ttccctcatg ttgctgtaca 420
aaacctacgg atggaaattg cacctgtatt cccatcccat cgtcctgggc tttcgcaaaa 480
tacctatggg agtgggcctc agtccgtttc tcttggctca gtttactagt gccatttgtt 540
cagtggttcg tagggctttc ccccactgtt tggctttcag ctatatggat gatgtggtat 600
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tcttctgaga ttactactaa ggacttgaag gagaagaagg aggttgttga ggaggctgag 780
aac 783
<210>4
<211>1518
<212>DNA
<213>黑曲霉(Aspergillus niger)
<400>4
atgagattat cgacttcgag tctcttcctt tccgtgtctc tgctggggaa gctggccctc 60
gggctgtcgg ctgcagaatg gcgcactcag tcgatttact tcctattgac ggatcggttc 120
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tgcccatacc agaaggtcct ggacggcgtc ctcaactatc cgatctactg gcaactcctc 840
tacgccttcg aatcctccag cggcagcatc agcaacctct acaacatgat caaatccgtc 900
gcaagcgact gctccgatcc gacactactc ggcaacttca tcgaaaacca cgacaatccc 960
cgtttcgcct cctacacctc cgactactcg caagccaaaa acgtcctcag ctacatcttc 1020
ctctccgacg gcatccccat cgtctacgcc ggcgaagaac agcactactc cggcggcaag 1080
gtgccctaca accgcgaagc gacctggctt tcaggctacg acacctccgc agagctgtac 1140
acctggatag ccaccacgaa cgcgatccgc aaactagcca tctcagctga ctcggcctac 1200
attacctacg cgaatgatgc attctacact gacagcaaca ccatcgcaat gcgcaaaggc 1260
acctcaggga gccaagtcat caccgtcctc tccaacaaag gctcctcagg aagcagctac 1320
accctgaccc tcagcggaag cggctacaca tccggcacga agctgatcga agcgtacaca 1380
tgcacatccg tgaccgtgga ctcgagcggc gatattcccg tgccgatggc gtcgggatta 1440
ccgagagttc ttctgcccgc gtccgtcgtc gatagctctt cgctctgtgg cgggagcgga 1500
agattatacg tcgagtaa 1518
<210>5
<211>505
<212>PRT
<213>黑曲霉(Aspergillus niger)
<400>5
Met Arg Leu Ser Thr Ser Ser Leu Phe Leu Ser Val Ser Leu Leu Gly
1 5 10 15
Lys Leu Ala Leu Gly Leu Ser Ala Ala Glu Trp Arg Thr Gln Ser Ile
20 25 30
Tyr Phe Leu Leu Thr Asp Arg Phe Gly Arg Thr Asp Asn Ser Thr Thr
35 40 45
Ala Thr Cys Asp Thr Gly Asp Gln Ile Tyr Cys Gly Gly Ser Trp Gln
50 55 60
Gly Ile Ile Asn His Leu Asp Tyr Ile Gln Gly Met Gly Phe Thr Ala
65 70 75 80
Ile Trp Ile Ser Pro Ile Thr Glu Gln Leu Pro Gln Asp Thr Ala Asp
85 90 95
Gly Glu Ala Tyr His Gly Tyr Trp Gln Gln Lys Ile Tyr Asp Val Asn
100 105 110
Ser Asn Phe Gly Thr Ala Asp Asp Leu Lys Ser Leu Ser Asp Ala Leu
115 120 125
His Ala Arg Gly Met Tyr Leu Met Val Asp Val Val Pro Asn His Met
130 135 140
Gly Tyr Ala Gly Asn Gly Asn Asp Val Asp Tyr Ser Val Phe Asp Pro
145 150 155 160
Phe Asp Ser Ser Ser Tyr Phe His Pro Tyr Cys Leu Ile Thr Asp Trp
165 170 175
Asp Asn Leu Thr Met Val Gln Asp Cys Trp Glu Gly Asp Thr Ile Val
180 185 190
Ser Leu Pro Asp Leu Asn Thr Thr Glu Thr Ala Val Arg Thr Ile Trp
195 200 205
Tyr Asp Trp Val Ala Asp Leu Val Ser Asn Tyr Ser Val Asp Gly Leu
210 215 220
Arg Ile Asp Ser Val Leu Glu Val Glu Pro Asp Phe Phe Pro Gly Tyr
225 230 235 240
Gln Glu Ala Ala Gly Val Tyr Cys Val Gly Glu Val Asp Asn Gly Asn
245 250 255
Pro Ala Leu Asp Cys Pro Tyr Gln Lys Val Leu Asp Gly Val Leu Asn
260 265 270
Tyr Pro Ile Tyr Trp Gln Leu Leu Tyr Ala Phe Glu Ser Ser Ser Gly
275 280 285
Ser Ile Ser Asn Leu Tyr Asn Met Ile Lys Ser Val Ala Ser Asp Cys
290 295 300
Ser Asp Pro Thr Leu Leu Gly Asn Phe Ile Glu Asn His Asp Asn Pro
305 310 315 320
Arg Phe Ala Ser Tyr Thr Ser Asp Tyr Ser Gln Ala Lys Asn Val Leu
325 330 335
Ser Tyr Ile Phe Leu Ser Asp Gly Ile Pro Ile Val Tyr Ala Gly Glu
340 345 350
Glu Gln His Tyr Ser Gly Gly Lys Val Pro Tyr Asn Arg Glu Ala Thr
355 360 365
Trp Leu Ser Gly Tyr Asp Thr Ser Ala Glu Leu Tyr Thr Trp Ile Ala
370 375 380
Thr Thr Asn Ala Ile Arg Lys Leu Ala Ile Ser Ala Asp Ser Ala Tyr
385 390 395 400
Ile Thr Tyr Ala Asn Asp Ala Phe Tyr Thr Asp Ser Asn Thr Ile Ala
405 410 415
Met Arg Lys Gly Thr Ser Gly Ser Gln Val Ile Thr Val Leu Ser Asn
420 425 430
Lys Gly Ser Ser Gly Ser Ser Tyr Thr Leu Thr Leu Ser Gly Ser Gly
435 440 445
Tyr Thr Ser Gly Thr Lys Leu Ile Glu Ala Tyr Thr Cys Thr Ser Val
450 455 460
Thr Val Asp Ser Ser Gly Asp Ile Pro Val Pro Met Ala Ser Gly Leu
465 470 475 480
Pro Arg Val Leu Leu Pro Ala Ser Val Val Asp Ser Ser Ser Leu Cys
485 490 495
Gly Gly Ser Gly Arg Leu Tyr Val Glu
500 505
Claims (7)
1.筛选高表达目的蛋白的酵母的方法，包括如下步骤：是将载体导入酵母菌中获得重组菌，所述重组菌在含有可溶性淀粉的固体培养基上培养，单克隆周围产生直径为0.3-1.0cm透明圈的重组菌为高表达目的蛋白的酵母；所述载体包含原核复制起点、筛选标记基因表达盒和目的基因表达盒；所述目的基因表达盒自上游至下游依次含有启动子、目的基因和终止子；所述筛选标记基因表达盒自上游至下游依次含有启动子、酸性α-淀粉酶的编码基因和终止子。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述筛选标记基因表达盒还含有两个loxP序列；所述酸性α-淀粉酶的编码基因位于所述两个loxP序列之间。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述载体还含有血红蛋白基因表达盒，所述血红蛋白基因表达盒自上游至下游依次含有FMD启动子、血红蛋白基因和终止子。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述载体还含有抗性基因表达盒，所述抗性基因表达盒自上游至下游依次含有loxP序列、抗性基因和loxP序列。
5.根据权利要求1至4中任一所述的方法，其特征在于：所述方法中，还包括将Cre重组酶基因导入所述重组菌中的步骤。
6.根据权利要求1至4中任一所述的方法，其特征在于：所述酸性α-淀粉酶是由序列表中序列5所示的氨基酸序列组成的蛋白质。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述酸性α-淀粉酶的编码基因的核苷酸序列是序列表中序列4。
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Non-Patent Citations (4)
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| 何晨阳.以淀粉酶为标记选择水稻白叶枯病菌毒性基因突变体.《南京农业大学学报》.1992,第15卷(第3期),30－34. * |
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