RU2074249C1 - Method of preparing enzyme hydrolyzate from the web-footed muscle tissue and nutrient medium "celat" for eucaryotic cell cultivation - Google Patents

Abstract

FIELD: medicinal biotechnology, veterinary science. SUBSTANCE: method involves milling web-footed muscle tissue, mixing with distilled water at mass ratio = 1:2, hydrolysis in the presence of enzyme-containing web-footed organs at 40-42 C, at pH = 7.6-7.8 for 4-5 days in the presence of chloroform followed by heating biomass at 80-90 C for 5-10 min, precipitation of high-molecular compounds firstly in the presence of 20-22% calcium chloride solution and then - at protein isoelectric point, filtration and drying preparation. Nutrient medium "Celat" for eucaryotic cell cultivation has enzyme hydrolyzate of web-footed muscle tissue, cattle serum blood and Henx solution at the following ratio of components, vol.%: enzyme hydrolyzate of web-footed muscle tissue 0.15-0.20; cattle serum blood 5-10, and Henx solution - the rest. EFFECT: improved method of preparing. 2 cl, 4 tbl

Description

Изобретение относится к медицинской биотехнологии и биологической промышленности, ветеринарии и касается усовершенствованного способа получения ферментативного гидролизата, а также питательной среды на его основе, предназначенной для выращивания клеток эукариотов продуцентов биологически активных веществ, диагностических и профилактических биологических и медицинских препаратов. The invention relates to medical biotechnology and the biological industry, veterinary medicine and relates to an improved method for producing an enzymatic hydrolyzate, as well as a nutrient medium based on it, intended for growing eukaryotic cells of producers of biologically active substances, diagnostic and preventive biological and medical preparations.

Известен способ получения ферментативного гидролизата путем гидролиза в водопроводной воде измельченных органов и тканей ластоногих в присутствии ферментсодержащих органов животных того же вида при нагревании до 50^oC [1] Полученный продукт предназначен для культивирования только микроорганизмов и, соответственно, содержит высокомолекулярные полипептиды. Следовательно, он не может служить основой питательных сред для культивирования изолированных клеток человека и животных.A known method of producing an enzymatic hydrolyzate by hydrolysis of ground organs and pinnipeds in tap water in the presence of enzyme-containing organs of animals of the same species when heated to 50 ^o C [1] The resulting product is intended for cultivation of microorganisms only and, accordingly, contains high molecular weight polypeptides. Therefore, it cannot serve as the basis of nutrient media for the cultivation of isolated human and animal cells.

Известна питательная среда (ПС), полученная из продуктов ферментативного гидролиза полноценного белка молока (ГЛА), которая используется главным образом для первично-трипсинизированных культур клеток. Однако, в связи с тем, что ГЛА изготавливается фирмой ДИФКО (США) и импортируется в Российскую Федерацию, резко возрастает стоимость вирусных вакцин и других препаратов, сырьем для которых является ГЛА. A known nutrient medium (PS) obtained from the products of enzymatic hydrolysis of high-grade milk protein (GLA), which is used mainly for primary trypsinized cell cultures. However, due to the fact that GLA is manufactured by DIFCO (USA) and imported into the Russian Federation, the cost of viral vaccines and other drugs for which GLA is the raw material increases sharply.

Известна также ПС 199 для культивирования различных гетероплоидных перевиваемых клеток человека и животных [2] Питательная среда 199 содержит более 60 компонентов, в том числе 20 аминокислот, 17 витаминов, коэнзимы, глюкозу, минеральные соли и некоторые другие вещества; среда полностью синтетическая. ПС 199 используется для длительного культивирования перевиваемых клеточных культур и обеспечивает высокую степень стандартности исследования. Недостатком является сложная технология ее изготовления из дорогостоящих, главным образом импортных реагентов. В условиях биотехнологического производства, где требуется большое количество питательной среды для получения клеточной биомассы, ПС 199 нерентабельна. PS 199 is also known for the cultivation of various heteroploid transplantable human and animal cells [2] Nutrient medium 199 contains more than 60 components, including 20 amino acids, 17 vitamins, coenzymes, glucose, mineral salts and some other substances; the environment is completely synthetic. PS 199 is used for long-term cultivation of transplantable cell cultures and provides a high degree of standard research. The disadvantage is the complex technology of its manufacture from expensive, mainly imported reagents. In conditions of biotechnological production, where a large amount of nutrient medium is required to obtain cell biomass, PS 199 is unprofitable.

Задачей изобретения является упрощение технологии получения ферментативного гидролизата и снижение себестоимости конечного продукта - основы питательной среды, а также создание новой питательной среды Целат для культивирования клеток эукариотов. The objective of the invention is to simplify the technology for producing enzymatic hydrolyzate and reduce the cost of the final product - the basis of the nutrient medium, as well as the creation of a new nutrient medium Celat for the cultivation of eukaryotic cells.

Сущность изобретения заключается в том, что измельченную мышечную ткань ластоногих, смешанную с дистиллированной водой в массовом соотношении 1:2, подвергают гидролизу в присутствии 15 об. ферментсодержащих органов животных того же вида при температуре 40 42^oC в щелочной зоне рН 7,6 7,8 в течение 4 5 суток в присутствии хлороформа (1 1,5 об.), с последующим прогреванием биомассы при температуре 80 90^oC в течение 5 10 минут, осаждением высокомолекулярных соединений 20 22%-ным раствором хлористого кальция, затем в изоэлектрической точке белка, фильтрованием препарата и высушиванием.The essence of the invention lies in the fact that the crushed muscle tissue of pinnipeds, mixed with distilled water in a mass ratio of 1: 2, is subjected to hydrolysis in the presence of 15 vol. enzyme-containing organs of animals of the same species at a temperature of 40 42 ^o C in the alkaline zone pH 7.6 7.8 for 4 5 days in the presence of chloroform (1 1.5 vol.), followed by heating of the biomass at a temperature of 80 90 ^o C for 5 to 10 minutes, by precipitation of high molecular weight compounds 20 22% solution of calcium chloride, then at the isoelectric point of the protein, filtering the drug and drying.

В качестве сырья для получения ферментативного гидролизата используют непищевой белоксодержащий продукт зверобойного промысла. As a raw material for obtaining an enzymatic hydrolyzate, a non-food protein-containing product of St. John's wort is used.

Сущность изобретения заключается в том, что питательная среда "Целат для" культивирования клеток эукариотов содержит ферментативный гидролизат (ФГ) мышечной ткани ластоногих при следующем соотношении компонентов (об.):
ФГ мышечной ткани ластоногих 0,15 0,20
Сыворотка крови КРС 5 10
Раствор Хенкса Остальное
Полученный описываемым способом ферментативный гидролизат мышечной ткани ластоногих дешевый полноценный продукт, не требующий для своего изготовления дорогостоящего оборудования, а ПС на его основеобеспечивает в достаточной степени стандартные условия культивирования клеток эукариотов.The essence of the invention lies in the fact that the nutrient medium "Celat for" culturing eukaryotic cells contains an enzymatic hydrolyzate (FG) of pinniped muscle tissue in the following ratio of components (vol.):
FG of pinniped muscle tissue 0.15 0.20
Serum of cattle 5 10
Hanks Solution Else
Obtained by the described method, the enzymatic hydrolyzate of pinniped muscle tissue is a cheap high-grade product that does not require expensive equipment for its manufacture, and PS based on it provides sufficiently standard conditions for the cultivation of eukaryotic cells.

Пример 1. Получение ферментативного гидролизата. Example 1. Obtaining an enzymatic hydrolyzate.

Измельченную мышечную ткань ластоногих (например, нерпы), разведенную дистиллированной водой в массовом соотношении 1:2, подвергают гидролизу ферментсодержащими органами животных того же вида, взятыми в количестве 15 об. Процесс ведут при температуре 40^oC в щелочной зоне рН 7,6 в течение 5 суток в присутствии 1,0 1,5 об. хлороформа. Гидролиз прекращают прогреванием при температуре 80^oC в течение 10 минут. Осадок удаляют центрифугированием. Оставшиеся в надосадочной жидкости высокомолекулярные соединения осаждают сначала в присутствии 20%-ного раствора хлористого кальция, а затем в изоэлектрической точке белка. Надосадочную жидкость фильтруют и подвергают высушиванию в потоке горячего воздуха методом распыления.The crushed muscle tissue of pinnipeds (for example, seals), diluted with distilled water in a mass ratio of 1: 2, is subjected to hydrolysis by enzyme-containing organs of animals of the same species, taken in an amount of 15 vol. The process is carried out at a temperature of 40 ^o C in the alkaline zone of pH 7.6 for 5 days in the presence of 1.0 to 1.5 vol. chloroform. The hydrolysis is stopped by heating at a temperature of 80 ^o C for 10 minutes. The precipitate is removed by centrifugation. High-molecular compounds remaining in the supernatant are first precipitated in the presence of a 20% solution of calcium chloride, and then at the isoelectric point of the protein. The supernatant is filtered and spray dried in a stream of hot air.

Полученный ферментативный гидролизат мышечной ткани ластоногих имеет следующие физико-химические характеристики:
Концентрация водородных ионов 1%-ного раствора 6,8 7,2
Растворимость, не менее 5,0
Массовая доля влаги, не более 4,0 5,0
Массовая доля общего азота, в пределах 10,0 11,0
Массовая доля аминного азота, в пределах 5,5 6,0
Содержание аминокислот в 1%-ном растворе (мг):
Изолейцин 19,5±0,05
Лейцин 43,5±0,09
Валин 22,0±0,04
Треонин 18,0±0,05
Серин 17,5±0,08
Метионин 14,3±0,07
Тирозин 21,0±0,1
Фенилаланин 24,5±0,1
Цистин 10,5±0,05
Аспарагиновая кислота 19,0±0,1
Глутаминовая кислота 36,5±0,1
Пролин 20,0±0,06
Глицин 7,5±0,05
Аланин 16,5±0,05
Лизин 25,0±0,15
Гистидин 11,0±0,12
Аргинин 29,0±0,05
Пример 2.The resulting enzymatic hydrolyzate of pinniped muscle tissue has the following physicochemical characteristics:
The concentration of hydrogen ions of a 1% solution of 6.8 7.2
Solubility, not less than 5.0
Mass fraction of moisture, not more than 4.0 5.0
Mass fraction of total nitrogen, in the range of 10.0 11.0
Mass fraction of amine nitrogen, within 5.5 6.0
The amino acid content in a 1% solution (mg):
Isoleucine 19.5 ± 0.05
Leucine 43.5 ± 0.09
Valine 22.0 ± 0.04
Threonine 18.0 ± 0.05
Serine 17.5 ± 0.08
Methionine 14.3 ± 0.07
Tyrosine 21.0 ± 0.1
Phenylalanine 24.5 ± 0.1
Cystine 10.5 ± 0.05
Aspartic acid 19.0 ± 0.1
Glutamic acid 36.5 ± 0.1
Proline 20.0 ± 0.06
Glycine 7.5 ± 0.05
Alanine 16.5 ± 0.05
Lysine 25.0 ± 0.15
Histidine 11.0 ± 0.12
Arginine 29.0 ± 0.05
Example 2

Ферментативный гидролиз мышечной ткани ластоногих проводят аналогично примеру 1 с тем отличием, что процесс ведут при температуре 42^oC в щелочной зоне 7,8 в течение 4 суток. Гидролиз прекращают прогреванием биомассы при температуре 90^oC в течение 5 минут. Для осаждения высокомолекулярных соединений используют 22%-ный раствор хлористого кальция.Enzymatic hydrolysis of pinniped muscle tissue is carried out analogously to example 1 with the difference that the process is carried out at a temperature of 42 ^o C in the alkaline zone of 7.8 for 4 days. The hydrolysis is stopped by heating the biomass at a temperature of 90 ^o C for 5 minutes. For the precipitation of high molecular weight compounds using a 22% solution of calcium chloride.

Физико-химические характеристики высушенного ферментативного гидролизата ластоногих находятся в пределах, указанных для продукта, полученного в примере 1. Physico-chemical characteristics of the dried enzymatic hydrolyzate of pinnipeds are within the limits specified for the product obtained in example 1.

Строгое соблюдение условий гидролиза и регулярный контроль физико-химических параметров гидролизата в процессе гидролиза позволяет получать в достаточной степени стандартный продукт, имеющий разбросколичетвенных показателей аминокислот не более 5 6%
Пример 3.Strict adherence to hydrolysis conditions and regular monitoring of the physicochemical parameters of the hydrolyzate during the hydrolysis process allows a sufficiently standard product to be obtained having scattered multiple amino acid indices of not more than 5 6%
Example 3

Подобрана концентрация ферментативного гидролизата мышечной ткани ластоногих, обеспечивающая оптимальные условия жизнедеятельности перевиваемой линии клеток почки человека RH-PA. Результаты представлены в табл. 1. The concentration of the enzymatic hydrolyzate of pinniped muscle tissue was selected, which provides optimal living conditions for the transplanted human kidney cell line RH-PA. The results are presented in table. one.

Из приведенных в табл. 1 данных следует, что оптимальные условия для роста и развития клеток обеспечивает ПС, содержащая 0,15 0,20 об. ферментативного гидролизата мышечной ткани ластоногих (что соответствует содержанию аминного азота 14 15 мг соответственно содержанию аминного азота в ПС 199). From the above table. 1 data suggests that the optimal conditions for the growth and development of cells provides PS containing 0.15 0.20 vol. enzymatic hydrolyzate of pinniped muscle tissue (which corresponds to the content of amino nitrogen 14 15 mg, respectively, the content of amine nitrogen in PS 199).

Пример 4. Example 4

Биологические ростовые свойства предлагаемой ПС испытывали при культивировании гетероплоидных перевиваемых линий клеток: почки человека RH-PA и СПЭВ в сравнении с ПС 199 производства ИПМ и ВЭ АМН РФ и дополненной 5% сыворотки КРС (табл. 2). Из представленных в табл. 2 данных следует, что ПС "Целат" (0,2 об. ферментативного гидролизаата мышечной ткани ластоногих на растворе Хенкса) с 5% сыворотки КРС обладает ростстимулирующими свойствами, идентичными ростстимулирующим свойствам ПС 199 производства ИПМ и ВЭ АМН РФ. The biological growth properties of the proposed PS were tested during the cultivation of heteroploid transplantable cell lines: human kidney RH-PA and SPEV in comparison with PS 199 produced by IPM and VE AMS RF and supplemented with 5% cattle serum (Table 2). Of the presented in table. 2 data it follows that the Celat PS (0.2 vol.% Enzymatic hydrolyzate of pinniped muscle tissue in Hanks solution) with 5% cattle serum has growth-promoting properties identical to the growth-promoting properties of PS 199 produced by IPM and VE AMS RF.

Пример 5. Example 5

Проведена оценка ростстимулирующих свойств ПС "Целат" в процессе длительного пассирования на ней перевиваемой линии клеток почки человека RH-PA в сравнении с синтетической ПС 199. Концентрация клеток при засеве 1,0 - 1,5•10⁵ кл/мл, концентрация сыворотки КРС 5% коэффициент пересева 1:3. Сроки формирования монослоя 3 4 сутки. Данные представлены в табл. 3.The growth-promoting properties of Celat PS were assessed during prolonged passage of the transplantable human kidney cell line RH-PA on it in comparison with synthetic PS 199. Cell concentration during inoculation was 1.0 - 1.5 • 10 ⁵ cells / ml, cattle serum concentration 5% reseeding ratio 1: 3. The timing of the formation of a monolayer 3 4 days. The data are presented in table. 3.

Полученные данные свидетельствуют о том, что при длительном пассировании перевиваемой культуры клеток почки человека RH-PA ростстимулирующая активность ПС "Целат" аналогична ростстимулирующей активности ПС 199. The data obtained indicate that with prolonged passage of the transplanted human kidney cell culture RH-PA, the growth-promoting activity of PS “Celat” is similar to the growth-promoting activity of PS 199.

Пример 6. Example 6

Определена способность ПС "Целат" обеспечивать восстановление жизнеспособности перевиваемой линии клеток почки человека RH-PA, замороженных на 30-ом пассаже после криоконсервации. Полученные данные представлены в табл. 4. The ability of PS Celat to restore the viability of the transplanted human kidney cell line RH-PA, frozen at passage 30 after cryopreservation, was determined. The data obtained are presented in table. 4.

Данные, представленные в табл. 4, свидетельствуют о том, что клетки, выращенные в ПС "Целат", сохраняют хорошую жизнеспособность и к 5-му пассажу после размораживания полностью восстанавливают свои свойства. The data presented in table. 4, indicate that the cells grown in the PS “Celat” retain good viability and completely restore their properties by the 5th passage after thawing.

Таким образом, описываемый способ получения ферментативного гидролиза позволяет упростить технологию процесса и снизить себестоимость конечного продукта за счет использования отходов зверобойного промысла мышечной ткани ластоногих, а в качестве фермента неутилизируемых отходов того же промысла - ферментсодержащих органов ластоногих. Thus, the described method for the production of enzymatic hydrolysis allows us to simplify the process technology and reduce the cost of the final product through the use of wastes of the St. John’s Hypericum muscular tissue, and enzyme-containing organs of the pinnipeds as an enzyme of non-utilizable waste from the same field.

Питательная среда "Целат" на основе полученного ферментативного гидролизата мышечной ткани ластоногих обладает высокими ростстимулирующими свойствами для некоторых первичных, а также перевиваемых гетероплоидных линий клеток животных и человека, что позволяет применять ее для получения больших количеств клеточной биомассы в биотехнологических производствах вместо многокомпонентной синтетической питательной среды 199, аминокислоты для получения которой закупаются за рубежом. Nutrient medium “Celat” based on the obtained enzymatic hydrolyzate of pinniped muscle tissue has high growth-promoting properties for some primary as well as transplantable heteroploid cell lines of animals and humans, which allows it to be used to obtain large amounts of cellular biomass in biotechnological industries instead of a multicomponent synthetic nutrient medium 199 , the amino acids for which are purchased abroad.

Claims (2)

1. Способ получения ферментативного гидролизата из мышечной ткани ластоногих, включающий измельчение мышечной ткани, разведение ее водой, гидролиз ферментсодержащими органами, осаждение биомассы, высушивание, отличающийся тем, что разведение мышечной ткани осуществляют дистиллированной водой, гидролиз проводят при 40 42^oС, рН 7,6 7,8 в течение 4 5 суток в присутствии хлороформа, а осаждение биомассы проводят сначала в присутствии раствора хлористого кальция, а затем в изоэлектрической точке белка.1. A method of obtaining an enzymatic hydrolyzate from pinniped muscle tissue, including grinding muscle tissue, diluting it with water, hydrolysis by enzyme-containing organs, sedimentation of biomass, drying, characterized in that the dilution of muscle tissue is carried out with distilled water, hydrolysis is carried out at 40 42 ^o C, pH 7 , 6 7.8 for 4 to 5 days in the presence of chloroform, and biomass precipitation is carried out first in the presence of a solution of calcium chloride, and then at the isoelectric point of the protein. 2. Питательная среда для культивирования клеток эукариотов, содержащая источник питательных веществ и ростстимулирующих факторов, отличающаяся тем, что в качестве источника питательных веществ и ростстимулирующих факторов она содержит ферментативный гидролизат мышечной ткани ластоногих, сыворотку крови крупного рогатого скота и дополнительно раствор Хэнкса при следующем соотношении компонентов, об. 2. Nutrient medium for culturing eukaryotic cells, containing a source of nutrients and growth-promoting factors, characterized in that as a source of nutrients and growth-promoting factors, it contains an enzymatic hydrolyzate of pinniped muscle tissue, bovine serum and an additional Hanks solution in the following ratio of components about Ферментативный гидролизат мышечной ткани ластоногих 0,15 0,20
Сыворотка крови крупного рогатого скота 5 10
Раствор Хэнкса ОстальноерFermentative hydrolyzate of pinniped muscle tissue 0.15 0.20
Cattle blood serum 5 10
Hanks Solution

Images