RU2073016C1

RU2073016C1 - Method of low-molecular water-soluble chitosan preparing

Info

Publication number: RU2073016C1
Application number: RU92015867A
Authority: RU
Inventors: В.П. Варламов; И.А. Стояченко; М.В. Буданов
Original assignee: Центр "Биоинженерия" Ран
Priority date: 1992-12-31
Filing date: 1992-12-31
Publication date: 1997-02-10

Abstract

FIELD: biotechnology. SUBSTANCE: chitosan dissolved in acetate buffer is subjected for enzymatic cleavage using chitinase complex immobilized on the inert carrier. Process is carried out for two stages - firstly at pH = 4.5-5.0, at 45-50 C for 16 h, at mass ratio of chitosan : chitinase complex immobilized on the inert carrier = 1:10, then at pH = 6.0-6.5, at 37 C for 8-12 h at mass ratio chitosan : chitinase complex immobilized on the inert carrier = 1:10. EFFECT: improved method of chitosan preparing.

Description

Изобретение относится к олигосахаридным соединениям, конкретно к олигомерам хитозана (олигомерам Д-глюкозамина). The invention relates to oligosaccharide compounds, specifically to chitosan oligomers (D-glucosamine oligomers).

Хитозан низкомолекулярный водорастворимый, представляющий собой смесь таких олигомеров, может быть использован в качестве противовирусного и противоопухолевого препарата, в качестве радиопротектора и может быть использован для конъюгации с биологически активными соединениями различного спектра действия. Low molecular weight water-soluble chitosan, which is a mixture of such oligomers, can be used as an antiviral and antitumor drug, as a radioprotector, and can be used for conjugation with biologically active compounds of various spectrum of action.

Известен способ получения олигомеров хитозана химическим гидролизом с помощью соляной кислоты [1] Однако выход водорастворимых продуктов, получаемых этой процедурой очень низок, условия проведения реакции жесткие и в гидролизате получается большой процент мономера (глюкозамина). A known method of producing chitosan oligomers by chemical hydrolysis using hydrochloric acid [1] However, the yield of water-soluble products obtained by this procedure is very low, the reaction conditions are stringent and a large percentage of the monomer (glucosamine) is obtained in the hydrolyzate.

Наиболее близкими по составу и строению к предполагаемому решению являются олигомеры хитозана, получаемые с помощью очищенной хитозаназы Bacillus sp. N 7-М. Однако получаемый по данному способу хитозан низкомолекулярный водорастворимый вследствие проведения гомогенного катализа загрязнен хитозаназой, что недопустимо для медицинских препаратов. К тому же фермент может быть использован только один раз, что несомненно повышает себестоимость продукта и снижает технологичность схемы получения. The closest in composition and structure to the proposed solution are chitosan oligomers obtained using purified chitosanase Bacillus sp. N 7-M. However, the low molecular weight water-soluble chitosan obtained by this method due to homogeneous catalysis is contaminated with chitosanase, which is unacceptable for medications. In addition, the enzyme can be used only once, which undoubtedly increases the cost of the product and reduces the manufacturability of the production scheme.

Задачей настоящего изобретения является получение хитозана низкомолекулярного водорастворимого, который может быть использован в качестве носителя биологически активных соединений при получении противовирусных и противоопухолевых препаратов, а также в качестве иммуномодулятора. The objective of the present invention is to obtain chitosan of low molecular weight water-soluble, which can be used as a carrier of biologically active compounds in the preparation of antiviral and antitumor drugs, as well as an immunomodulator.

Поставленная задача решается тем, что 1% раствор хитозана в ацетатном буфере подвергают ферментативному расщеплению иммобилизованным на носителе хитиназным комплексом Streptomyces Kurssanovii при рН 4,5-5,0 до средневязкостной молекулярной массы около 20000-30000 дальтон при 45-50^oC в течение 16 часов, а затем таким же иммобилизованным препаратом хитиназ при рН 6,0-6,5 при 37^oC в течение 8-12 часов до получения целевых продуктов. В качестве источника хитиназного комплекса могут быть использованы и другие культуры, например: Serratia marcescens, Trichoderma harzianum, Streptomyces griseus, Bacillus thuringiensis и др.The problem is solved in that a 1% solution of chitosan in acetate buffer is subjected to enzymatic digestion with a Streptomyces Kurssanovii chitinase complex immobilized on a carrier at pH 4.5-5.0 to a medium viscosity molecular weight of about 20,000-30000 Daltons at 45-50 ^° C for 16 hours, and then the same immobilized drug chitinases at pH 6.0-6.5 at 37 ^o C for 8-12 hours to obtain the target products. Other cultures can be used as a source of chitinase complex, for example: Serratia marcescens, Trichoderma harzianum, Streptomyces griseus, Bacillus thuringiensis, etc.

Иммобилизованные препараты хитиназ были стабильны при использовании 10 и более раз. При хранении они сохраняли ферментативную активность не менее двух лет. Immobilized chitinase preparations were stable when used 10 or more times. During storage, they retained enzymatic activity for at least two years.

Полученный продукт в лиофильно высушенном виде представляет собой белый аморфный порошок хорошо растворимый в воде и физиологическом растворе. Содержание основного вещества в продукте не менее 95% Его молекулярная масса по данным гельпроникающей хроматографии и по вискозиметрическим измерениям составляла около 1000-3000 дальтон. В продукте отсутствовал примесный белок и липиды. Он являлся нетоксичным и апирогенным веществом. The resulting product in freeze-dried form is a white amorphous powder readily soluble in water and physiological saline. The content of the main substance in the product is not less than 95%. Its molecular weight according to gel permeation chromatography and viscometric measurements was about 1000-3000 daltons. There was no impurity protein and lipids in the product. It was a non-toxic and pyrogen-free substance.

Пример 1. Силикагель МСА-2500 (10 г) суспендируют в 50 мл 0,1 М фосфатного буфера, рН 7,2 и добавляют 35 мл 25% водного раствора глутарового альдегида, перемешивают 30 минут при комнатной температуре, отмывают на фильтре этим же буфером (1000 мл) и суспендируют в 100 мл (массовое соотношение к носителю 10: 1) фильтрата культуральной жидкости Streptomyces kurssanovii в течение 16 часов при комнатной температуре. Затем отмывают на фильтре 2М хлористым натрием (1000 мл), водой (500 мл), суспендируют в 100 мл фосфатного буфера (рН 7,2) и добавляют 100 мг NaBH₄, перемешивают 30 минут и отмывают на пористом фильтре до отсутствия поглощения при Д₂₈₀. Полученный катализатор суспендируют в 100 мл 1% раствора хитозана в 0,1 М ацетатном буфере при рН 4,5 (массовое соотношение катализатор хитозан - 10:1) и перемешивают при 50^oC в течение 16 часов. Затем катализатор отделяют от раствора хитозана, имеющего средневязкостную ММ около 20000 Да, подщелачивают раствор до рН 6,5, добавляют 10 г иммобилизованного хитиназного комплекса (массовое соотношение катализатор хитозан 10:1) и перемешивают при 37^oC в течение 8 часов. Катализатор отфильтровывают и получают раствор низкомолекулярного водорастворимого хитозана со средневязкостной молекулярной массой около 1000-2000 Да. По данным гельпроникающей хроматографии на колонке с акрилексом Р-2 (размер 1100х35 мм) молекулярная масса получающегося продукта около 2000 Да. Продукт обессоливают и лиофильно высушивают. Содержание основного вещества не менее 95% Выход на исходный хитозан около 90% Содержание белка менее 0,05%
Пример 2. Аналогично примеру 1, но рН на первой стадии гидролиза был 5,0, а на второй стадии гидролиза рН 6,0 и время проведения второй стадии составляет 12 часов. Получаемый низкомолекулярный хитозан имел средневязкостную молекулярную массу не более 1000 Да. Данные гельпроникающей хроматографии на акрилексе Р-2 (1100х35 мм) дают значение молекулярной массы около 1500 Да.Example 1. Silica gel MCA-2500 (10 g) is suspended in 50 ml of 0.1 M phosphate buffer, pH 7.2 and add 35 ml of a 25% aqueous solution of glutaraldehyde, stirred for 30 minutes at room temperature, washed on the filter with the same buffer (1000 ml) and suspended in 100 ml (mass ratio to the carrier 10: 1) of the filtrate of the culture fluid Streptomyces kurssanovii for 16 hours at room temperature. Then it was washed on a filter with 2M sodium chloride (1000 ml), water (500 ml), suspended in 100 ml of phosphate buffer (pH 7.2) and 100 mg of NaBH _{4 was} added, stirred for 30 minutes and washed on a porous filter until no absorption at D ₂₈₀ . The resulting catalyst is suspended in 100 ml of a 1% solution of chitosan in 0.1 M acetate buffer at pH 4.5 (mass ratio of chitosan catalyst is 10: 1) and stirred at 50 ^o C for 16 hours. Then the catalyst is separated from a chitosan solution having a medium viscosity MM of about 20,000 Da, the solution is alkalinized to pH 6.5, 10 g of immobilized chitinase complex are added (mass ratio of chitosan catalyst 10: 1) and stirred at 37 ^° C for 8 hours. The catalyst is filtered off and a solution of low molecular weight water-soluble chitosan with a medium viscosity molecular weight of about 1000-2000 Da is obtained. According to gel permeation chromatography on a column with acrylic P-2 (size 1100x35 mm), the molecular weight of the resulting product is about 2000 Da. The product is desalted and freeze-dried. The content of the basic substance is not less than 95%. The yield on the starting chitosan is about 90%. The protein content is less than 0.05%.
Example 2. Analogously to example 1, but the pH in the first stage of hydrolysis was 5.0, and in the second stage of hydrolysis, pH 6.0 and the time for the second stage is 12 hours. The resulting low molecular weight chitosan had a viscosity average molecular weight of not more than 1000 Da. The data of gel permeation chromatography on acrylic P-2 (1100x35 mm) give a molecular weight of about 1500 Da.

Пример 3. Аналогично примеру 1, но вторую стадию гидролиза проводили при рН 6,2 и получали продукт по средневязкостной молекулярной массой не более 1000 Да. Данные гельпроникающей хроматографии на колонке с акрилексом Р-2 дают значение молекулярной массы около не более 1500 Да. Example 3. Analogously to example 1, but the second stage of hydrolysis was carried out at a pH of 6.2 and the product was obtained by medium viscosity molecular weight of not more than 1000 Da. The data of gel permeation chromatography on a column with acrylic P-2 give a molecular weight of about no more than 1500 Da.

Пример 4. Аналогично примеру 1, но первую стадию гидролиза проводили при рН 4,7 и температуре 45^oC. Получали продукт со средневязкостной молекулярной массой около 1500 Да. Данные гельпроникающей хроматографии на колонке с акрилексом Р-2 дают значение молекулярной массы около 2000 Да.Example 4. Analogously to example 1, but the first stage of hydrolysis was carried out at a pH of 4.7 and a temperature of 45 ^o C. A product was obtained with a medium viscosity molecular weight of about 1500 Da. The data of gel permeation chromatography on a column with acrylic P-2 give a molecular weight of about 2000 Da.

Пример 5. Аналогично примеру 1, но был использован хитиназный комплекс из фильтрата культуральной жидкости Serratia marcescens. Получали продукт со средневязкостной молекулярной массой около 3000 Да. Данные гельпроникающей хроматографии на колонке с акрилексом Р-2 дают значение молекулярной массы около 3000 Да. Example 5. Analogously to example 1, but was used chitinase complex from the filtrate of the culture fluid Serratia marcescens. Received a product with a medium viscosity molecular weight of about 3000 Da. The data of gel permeation chromatography on a column with acrylic P-2 give a molecular weight of about 3000 Da.

Пример 6. Аналогично примеру 1, но в качестве водонерастворимого носителя для иммобилизации хитиназного комплекса был использован силохром С-80 в количестве 10 г. Получали продукт со средневязкостной молекулярной массой около 2500 Да. Результаты гельпроникающей хроматографии с акрилексом Р-2 дают значение молекулярной массы около 3000 Да. Example 6. Analogously to example 1, but as a water-insoluble carrier for immobilization of the chitinase complex was used silochrome C-80 in an amount of 10 g. A product was obtained with a medium viscosity molecular weight of about 2500 Da. The results of gel permeation chromatography with acrylic P-2 give a molecular weight of about 3000 Da.

Таким образом заявленный способ позволяет получить хитозан водорастворимый низкомолекулярный, обладающий хорошей растворимостью и высокой степенью чистоты. Полученный продукт очень перспективен для применения в качестве потенциального противоопухолевого и противовирусного препарата и в еще большей степени проявляющий эти свойства как носитель соответствующих биологически активных соединений. Thus, the claimed method allows to obtain chitosan water-soluble low molecular weight, with good solubility and a high degree of purity. The resulting product is very promising for use as a potential antitumor and antiviral drug and even more manifesting these properties as a carrier of the corresponding biologically active compounds.

В частности, для фотодинамической терапии опухолей были получены ковалентные конъюгаты между водорастворимым хитозаном и гематопорфирином, являющимся фотосенсибилизатором. Присоединение проводили с помощью конденсирующих агентов между аминогруппами хитозана и карбоксигруппами ди-0-метилгематопорфирина (димегина). Полученный ковалентный конъюгат содержал до 25% димегина и обладал свойствами как димегина, так и хитозана и был использован в медико-биологических испытаниях в качестве противоопухолевого препарата. In particular, covalent conjugates between water-soluble chitosan and hematoporphyrin, which is a photosensitizer, were obtained for photodynamic therapy of tumors. The addition was carried out using condensing agents between the amino groups of chitosan and the carboxy groups of di-0-methylhematoporphyrin (dimegin). The obtained covalent conjugate contained up to 25% dimegin and possessed the properties of both dimegin and chitosan and was used in biomedical tests as an antitumor drug.

Также была изучена антивирусная активность конъюгата бактериальной рибонуклеазы с водорастворимым хитозаном. Для получения конъюгата водорастворимый хитозан подвергали исчерпывающему сукцинилированию с последующей активацией карбоксильных групп с помощью N,N^'-дисукцинимидилсульфита. Взаимодействие активированной формы хитозана и рибонуклеазы проводили при соотношении фермент хитозан от 1:2 до 1:4. При медико-биологических испытаниях была показана ингибирующая активность конъюгата в отношении вирусов гриппа А и В, а также арбовируса Синдбис в культурах ткани. Эффективность препарата при внутримышечном и интраназальном введении наблюдалась и при экспериментальной гриппозной инфекции белых мышей.The antiviral activity of a bacterial ribonuclease conjugate with water-soluble chitosan has also been studied. To obtain the conjugate, water-soluble chitosan was subjected to exhaustive succinylation followed by activation of carboxyl groups with N, N ^' -disuccinimidyl sulfite. The interaction of the activated form of chitosan and ribonuclease was carried out at a chitosan enzyme ratio of from 1: 2 to 1: 4. In biomedical tests, the inhibitory activity of the conjugate against influenza A and B viruses, as well as Sindbis arbovirus in tissue cultures, was shown. The effectiveness of the drug with intramuscular and intranasal administration was observed with experimental influenza infection of white mice.

Claims

Способ получения низкомолекулярного водорастворимого хитозана путем ферментативного расщепления хитозана, отличающийся тем, что ферментативное расщепление проводят с использованием иммобилизованного на инертном носителе хитиназного комплекса в две стадии: сначала при рН 4,5 5,0, температуре 45 - 50^oС в течение 16 ч и при массовом соотношении хитозан: иммобилизованный на инертном носителе хитиназный комплекс 1 10, а затем при рН 6,0 6,5, температуре 37^oС в течение 8 12 ч и массовом соотношении хитозан иммобилизованный на инертном носителе хитиназный комплекс 1 10.A method of obtaining a low molecular weight water-soluble chitosan by enzymatic cleavage of chitosan, characterized in that the enzymatic cleavage is carried out using a chitinase complex immobilized on an inert carrier in two stages: first at pH 4.5 5.0, temperature 45-50 ^° C for 16 hours and at a weight ratio chitosan: immobilized on an inert carrier chitinase complex January 10, then at pH 6.0 6.5, temperature of 37 ^o C for 8 12 hours and the weight ratio of chitosan immobilized on an inert carrier chitinase th complex January 10.