RU2071501C1 - Vector pel5a designated for foreign dna expression - Google Patents

Abstract

FIELD: biotechnology, genetic engineering. SUBSTANCE: vector $$$ has operon consisting of gene encoding recombinant protein and gene encoding lysozyme. Simultaneously with synthesis of recombinant protein lysozyme is synthesized that decomposes polysaccharide envelope of E. coli cells. Vector can be used for plasmid and the corresponding strain-producers of recombinant proteins construction and for proteins purification. EFFECT: simplified purification of water-insoluble recombinant protein agglomerate. 1 dwg

Description

Изобретение относится к области биотехнологии, генетической инженерии и может быть использовано для получения плазмид, синтезирующих рекомбинантные белки. The invention relates to the field of biotechnology, genetic engineering and can be used to obtain plasmids synthesizing recombinant proteins.

Большие количества рекомбинантных белков можно синтезировать в клетках Escherichia coli, несущих системы экспрессии рекомбинантных генов на основе промоторов фага лямбда (см. например, Н. Bernard and D. R. Helinski. Methods Enzymol. vol. 68, рр. 482-492, 1979). Транскрипция в таких системах регулируется связыванием температурочувствительного репрессора фага лямбда, кодируемого мутантным геном с Its857, с операторным участком. Когда клетки растут при температуре 30-32^oС, репрессор связывается с оператором и блокирует экспрессию. При повышении температуры роста до 42^oС репрессор инактивируется, что позволяет РНК-полимеразе связаться с промотором и начать транскрипцию гена. В результате интенсивной транскрипции и последующей трансляции могут синтезироваться значительные количества белка.Large amounts of recombinant proteins can be synthesized in Escherichia coli cells carrying recombinant gene expression systems based on phage lambda promoters (see, for example, H. Bernard and DR Helinski. Methods Enzymol. Vol. 68, pp. 482-492, 1979). Transcription in such systems is regulated by the binding of the temperature-sensitive repressor of the lambda phage encoded by the mutant gene to Its857 with the operator site. When cells grow at a temperature of 30-32 ^o C, the repressor binds to the operator and blocks expression. When the growth temperature is increased to 42 ^° C, the repressor is inactivated, which allows the RNA polymerase to contact the promoter and begin transcription of the gene. Significant amounts of protein can be synthesized as a result of intense transcription and subsequent translation.

Известны рекомбинантные плазмидные ДНК рЕХ2 и рЕХ3, позволяющие экспрессировать рекомбинантные белки во всех трех рамках считывания (K. K. Stanley and J.P. Luzio. The EMBO Journal, vol.3, pp. 1429-1434, 1984). Последовательности ДНК для экспрессии можно вставить в полилинкер, расположенный в 3'-конце гена lacZ. В указанных плазмидах P_R промотор бактериофага лямбда обеспечивает экспрессию последовательностей ДНК, и продукт составляет значительную часть суммарного бактериального белка. Экспрессируемый белок в клетке накапливается в виде водонерастворимых агломератов.Recombinant plasmid DNA pEX2 and pEX3 are known for expressing recombinant proteins in all three reading frames (KK Stanley and JP Luzio. The EMBO Journal, vol. 3, pp. 1429-1434, 1984). DNA sequences for expression can be inserted into the polylinker located at the 3'-end of the lacZ gene. In these plasmids P _{R, the} lambda bacteriophage promoter provides expression of DNA sequences, and the product makes up a significant portion of the total bacterial protein. The expressed protein in the cell accumulates in the form of water-insoluble agglomerates.

Однако у этих векторов есть недостаток: для выделения водонерастворимых агломератов рекомбинантного белка необходимо разрушать клеточную стенку бактерии. However, these vectors have a drawback: in order to isolate water-insoluble agglomerates of a recombinant protein, it is necessary to destroy the bacterial cell wall.

Вектор рЕХ1 выбран в качестве прототипа для получения вектора рЕL5a. Преимущество заявленного вектора рЕL5a заключается в том, что в результате использования оперона, состоящего из гена, кодирующего рекомбинантный белок, и гена лизоцима (фиг. 1), одновременно с синтезом рекомбинантного белка идет синтез лизоцима, разрушающего полисахаридную оболочку E.coli, что существенно упрощает очистку водонерастворимых агломератов рекомбинантного белка. The pEX1 vector is selected as a prototype for the preparation of the pEL5a vector. The advantage of the claimed vector pEL5a is that as a result of using an operon consisting of a gene encoding a recombinant protein and a lysozyme gene (Fig. 1), simultaneously with the synthesis of a recombinant protein, lysozyme is synthesized that destroys the polysaccharide membrane of E. coli, which greatly simplifies purification of water-insoluble agglomerates of a recombinant protein.

Сущность изобретения состоит в том, что сконструирован вектор рЕL5a размером 6,4 тысячи пар оснований (т.п.о.), состоящий из следующих элементов (фиг. 1):
-Xbal-Xbal-фрагмента плазмидной ДНК бактериального вектора рЕХ1 размером 5,8 т. п.о. который содержит слитный cro-lacZ, ген кодирующий слитный белок под контролем промотора Р_R бактериофага лямбда, полилинкер в 3'-конце lacZ-гена;
-BamH1-BamH1-фрагмента ДНК плазмиды pLysS (A.C.Y. Chang and S. N. Cohen. J. Bacteriol. vol.134, pp. 1114, 1978), содержащего ген лизоцима бактериофага Т4 и имеющего размер 0,6 т.п.о.The essence of the invention lies in the fact that a vector pEL5a of 6.4 thousand base pairs (kbp) is constructed, consisting of the following elements (Fig. 1):
-Xbal-Xbal-fragment of plasmid DNA of the bacterial vector pEX1 size of 5.8 bp which contains a fusion cro-lacZ, a gene encoding a fusion protein under the control of the promoter P _{R of the} bacteriophage lambda, a polylinker at the 3'-end of the lacZ gene;
-BamH1-BamH1 DNA fragment of the plasmid pLysS (ACY Chang and SN Cohen. J. Bacteriol. Vol. 134, pp. 1114, 1978), containing the bacteriophage T4 lysozyme gene and having a size of 0.6 kb.

Для конструирования плазмиды рЕL5a ДНК плазмиды рЕХ1 гидролизуют рестриктазой Хbal и достраивают по два нуклеотида в липких концах с помощью ДНК-полимеразы PollK. Параллельно получают BamH1 рестрикт размером 0,6 т.п. о. из плазмиды рLysS (A.C.Y. Chang and S.N. Cohen. J. Bacteriol. vol. 134, pp. 1141, 1978), содержащий ген лизоцима бактериофага Т4 и имеющий два достроенных с помощью PollK нуклеотида в липких концах. Фрагмет рЕХ1 лигируют с фрагментом ДНК, содержащим ген лизоцима бактериофага Т4. Лигазной смесью трансформируют клетки Е.coli, содержащие в хромосоме температурочувствительный ген бактериофага лямбда с Its857, например клетки штамма PLT90. Трансформанты высевают на среду с ампициллином при 30^oС. Клоны, содержащие рекомбинантные плазмиды с геном лизоцима в нужной ориентации, отбирают с помощью анализа на способность к лизису после индукции синтеза белка. Экспрессию рекомбинантных белков индуцируют повышением температуры до 42^oС. В клонах, продуцирующих лизоцим, после индукции белкового синтеза и последующего добавления хлороформа происходит лизис клеток. Из отобранных клонов стандартными способами выделяют плазмиду рEL5a. Векторная ДНК стабильна при хранении в 10мМ трис, рН 8,0, 1 мМ ЭДТА при -20^o С.To construct plasmid pEL5a, the DNA of plasmid pEX1 was hydrolyzed with restriction enzyme Xbal and two nucleotides were added at the sticky ends using PollK DNA polymerase. At the same time, a BamH1 restriction of 0.6 size is obtained. about. from plasmid pLysS (ACY Chang and SN Cohen. J. Bacteriol. vol. 134, pp. 1141, 1978), containing the bacteriophage T4 lysozyme gene and having two PollK-linked nucleotides in sticky ends. The pEX1 fragment is ligated with a DNA fragment containing the bacteriophage T4 lysozyme gene. The E. coli cells containing the temperature-sensitive lambda bacteriophage gene with Its857 in the chromosome are transformed using a ligase mixture, for example, cells of strain PLT90. Transformants are plated on medium with ampicillin at 30 ^° C. Clones containing recombinant plasmids with the lysozyme gene in the desired orientation are selected by lysis assay after induction of protein synthesis. The expression of recombinant proteins is induced by increasing the temperature to 42 ^o C. In the clones producing lysozyme, after the induction of protein synthesis and the subsequent addition of chloroform, cell lysis occurs. From the selected clones, plasmid pEL5a is isolated by standard methods. Vector DNA is stable when stored in 10 mM Tris, pH 8.0, 1 mM EDTA at -20 ^o C.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами. The invention is illustrated by the following examples.

Пример 1. Получение векторной плазмиды рEL5a с оперонной системой экспрессии и лизиса. Example 1. Obtaining a vector plasmid pEL5a with an operon expression and lysis system.

Клетки бактерий E.coli PLT90, содержащие плазмиду pEX1 (K.K. Stanley and J. P. Luzio. The ЕМВО Journal, vol. 3, pp. 1429-1434, 1984), выращивают в 50 мл бульона 2YT (16 г триптона, 10 г дрожжевого экстракта, 5 г NaCl на 1 л воды), содержащего 100 мкг/мл ампициллина до титра 10₉ кл/мл.Bacterial cells of E. coli PLT90 containing plasmid pEX1 (KK Stanley and JP Luzio. The EMBO Journal, vol. 3, pp. 1429-1434, 1984) were grown in 50 ml of 2YT broth (16 g of tryptone, 10 g of yeast extract, 5 g of NaCl per 1 liter of water) containing 100 μg / ml ampicillin to a titer of 10 ₉ cells / ml.

Клетки осаждают центрифугированием, ресуспендируют в 2 мл раствора (50 мМ глюкозы, 25 мМ трис-HCl, рН 8,0, 10 мМ ЭДТА, 5 мг/мл лизоцима) и инкубируют 5 мин при комнатной температуре. Далее добавляют 4 мл раствора 0,2 М NaOH, 1% додецилсульфата натрия, перемешивают, инкубируют 10 мин во льду, добавляют 3 мл охлажденного 5 М раствора ацетата калия, рН 4,8, перемешивают, оставляют на 10 мин во льду, образовавшийся осадок отделяют центрифугированием. К надосадочной жидкости добавляют 0,6 объема изопропилового спирта и выдерживают 15 мин при комнатной температуре. Осадок собирают центрифугированием, ресуспендируют в 0,5 мл ТЕ-буфера (10 мМ трис-HCl, pH 8,0, 1 мМ ЭДТА) и добавляют равный объем насыщенного раствора ацетата натрия. После инкубации в течение 30 мин при минус 20^oС осадок удаляют центрифугированием, а к надосадочной жидкости добавляют 0,6 объема изопропанола и оставляют на 1 час при комнатной температуре. Осадок собирают центрифугированием, промывают 70%-ным этанолом и ресуспендируют в 100 мкл ТЕ8-буфера.Cells are pelleted by centrifugation, resuspended in 2 ml of solution (50 mM glucose, 25 mM Tris-HCl, pH 8.0, 10 mM EDTA, 5 mg / ml lysozyme) and incubated for 5 min at room temperature. Then add 4 ml of a solution of 0.2 M NaOH, 1% sodium dodecyl sulfate, mix, incubate for 10 min in ice, add 3 ml of chilled 5 M potassium acetate solution, pH 4.8, mix, leave for 10 min in ice, the precipitate formed separated by centrifugation. 0.6 volumes of isopropyl alcohol are added to the supernatant and incubated for 15 minutes at room temperature. The precipitate was collected by centrifugation, resuspended in 0.5 ml of TE buffer (10 mM Tris-HCl, pH 8.0, 1 mM EDTA) and an equal volume of saturated sodium acetate solution was added. After incubation for 30 minutes at minus 20 ^{° C., the} precipitate is removed by centrifugation, and 0.6 volumes of isopropanol are added to the supernatant and left for 1 hour at room temperature. The precipitate was collected by centrifugation, washed with 70% ethanol and resuspended in 100 μl of TE8 buffer.

Плазмидную ДНК (1 мкг рЕХ1) обрабатывают эндонуклеазой рестрикции Xba1 (10 ед.) в буфере А (50 мМ трис-HCl, рН 7,6, 10 мМ MgCl₂, 1 мМ дитиотрейтол, 100 мМ NaCl, 4 мМ спермидина) в течение 2 часов. Анализ полноты гидролиза проводят с помощью электрофореза. Используя фрагмент Кленова ДНК-полимеразы E. coli, достраивают два из четырех нуклеотидов в липких Xba1-концах. Белки удаляют фенольной экстракцией, ДНК осаждают этанолом и ресуспендируют в 5 мкл ТЕ8.Plasmid DNA (1 μg pEX1) is treated with Xba1 restriction endonuclease (10 units) in buffer A (50 mM Tris-HCl, pH 7.6, 10 mM MgCl ₂ , 1 mM dithiothreitol, 100 mM NaCl, 4 mM spermidine) for 2 hours. Analysis of the completeness of hydrolysis is carried out using electrophoresis. Using the Klenov fragment of E. coli DNA polymerase, two of the four nucleotides in the sticky Xba1 ends are completed. Proteins are removed by phenolic extraction, DNA is precipitated with ethanol and resuspended in 5 μl TE8.

Для получения фрагмента ДНК с геном лизоцима проводят рестрикцию 10 мкг ДНК плазмиды pLysS (A. C. Y. Chang and S. N. Cohen. J. Bacteriol, vol.134, pp.1141, 1978) рестриктазой BamH1. С помощью фрагмента Кленова ДНК-полимеразы E. coli достраивают два из четырех нуклеотидов в липких BamH1-концах. Фрагмент -BamH1-BamH1- с частично достроенными липкими концами размером 0,6 т. п. о. выделяют с помощью электрофореза сорбцией на бумагу ДЕ81. Бумагу промывают, инкубируют 30 мин при 80^oС в буфере 2 М ацетата натрия, 50 мМ трис-НCL, рН 7,5, 10 мМ ЭДТА. ДНК, перешедшую в раствор, удаляют с бумаги центрифугированием, к раствору добавляют 2 объема этанола. После инкубации при -20^oС в течение 1 часа осадок собирают центрифугированием и растворяют в 5 мкл буфера ТЕ8.To obtain a DNA fragment with the lysozyme gene, 10 μg of pLysS plasmid DNA is restriction (ACY Chang and SN Cohen. J. Bacteriol, vol. 134, pp. 1141, 1978) with restriction enzyme BamH1. Using a Klenov fragment of E. coli DNA polymerase, two of the four nucleotides are added at the sticky BamH1 ends. Fragment -BamH1-BamH1- with partially completed sticky ends measuring 0.6 bp isolated by electrophoresis by sorption on DE81 paper. The paper is washed, incubated for 30 min at 80 ^o C in a buffer of 2 M sodium acetate, 50 mm Tris-HCL, pH 7.5, 10 mm EDTA. DNA transferred to the solution is removed from the paper by centrifugation, 2 volumes of ethanol are added to the solution. After incubation at -20 ^° C for 1 hour, the precipitate was collected by centrifugation and dissolved in 5 μl of TE8 buffer.

0,5 мкг фрагмента ДНК вектора рЕХ1 смешивают с 0,2 мкг ДНК, содержащей ген лизоцима бактериофага Т4. Соединение фрагментов проводят с помощью 10 ед. ДНК-лигазы фага Т4 в буфере: 30 мМ трис-НCl, рН 7,2, 10 мМ хлористого магния, 2 мг/мл желатины, 1 мМ спермидина, 0,1%-меркаптоэтанола, 0,2 мМ АТФ при 20^oС в течение 2 часов.0.5 μg of the pEX1 vector DNA fragment is mixed with 0.2 μg of DNA containing the bacteriophage T4 lysozyme gene. The connection of the fragments is carried out using 10 units Phage T4 DNA ligases in buffer: 30 mM Tris-HCl, pH 7.2, 10 mM magnesium chloride, 2 mg / ml gelatin, 1 mM spermidine, 0.1% mercaptoethanol, 0.2 mM ATP at 20 ^° C within 2 hours.

Полученной смесью трансформируют клетки E.coli PLT90, содержащие clts857 репрессор. Для этого ночную культуру клеток разводят средой LB с 10 мМ MgSO₄ в соотношении 1:100 и растят с аэрацией до плотности А550=0,3 ОЕ. После 15 мин охлаждения при 0^oС клетки собирают центрифугированием, суспендируют в 1/3 первоначального объема буфером 30 мМ ацетата калия, рН 5,8, 100 мМ RbCL, 50 мМ MnCl₂, 15% глицерина, и оставляют на 30-60 мин на льду. Клетки собирают центрифугированием, ресуспендируют в 1/12,5 первоначального объема в буфере 10 мМ MOPS, рН 6,8, содержащем 10 мМ RbCl, 75 мМ СаCl₂, 15% глицерина и инкубируют 15 мин на льду. К суспензии клеток добавляют лигированные фрагменты ДНК, инкубируют 40 мин при 0^oC, затем 2 мин при 34^oС, 2-3 мин при 0^oС, разбавляют в 5 раз средой 2YT, растят 30 мин при 30^oС и высевают на агаризованную среду 2YT с ампициллином (50 мг/мл).The resulting mixture was transformed with E. coli PLT90 cells containing clts857 repressor. For this, the overnight cell culture was diluted with LB medium with 10 mM MgSO ₄ in a ratio of 1: 100 and grown with aeration to a density of A550 = 0.3 OE. After 15 minutes of cooling at 0 ^{° C., the} cells were collected by centrifugation, suspended in 1/3 of the original volume with 30 mM potassium acetate buffer, pH 5.8, 100 mM RbCL, 50 mM MnCl ₂ , 15% glycerol, and left for 30-60 minutes on ice. Cells are harvested by centrifugation, resuspended in 1 / 12.5 of the original volume in 10 mM MOPS buffer, pH 6.8, containing 10 mM RbCl, 75 mM CaCl ₂ , 15% glycerol and incubated for 15 min on ice. Ligated DNA fragments are added to the cell suspension, incubated for 40 min at 0 ^° C, then 2 min at 34 ^° C, 2-3 min at 0 ^° C, diluted 5 times with 2YT medium, grown 30 min at 30 ^° C and seeded 2YT agar medium with ampicillin (50 mg / ml).

Клоны, содержащие рекомбинантные плазмиды с геном лизоцима в нужной ориентации, отбирают с помощью анализа на способность к лизису после индукции синтеза белка. Экспрессию рекомбинантных белков индуцируют повышением температуры до 42^oС. В клонах, продуцирующих лизоцим, после индукции белкового синтеза и последующего добавления хлороформа происходит лизис клеток. Из отобранных клонов стандартными способами выделяют плазмиду рЕL5а. Векторная ДНК стабильна при хранении в 10мМ трис, рН 8,0, 1 ЭДТА при -20^oС.Clones containing recombinant plasmids with the lysozyme gene in the desired orientation are selected by lysis assay after induction of protein synthesis. The expression of recombinant proteins is induced by increasing the temperature to 42 ^o C. In the clones producing lysozyme, after the induction of protein synthesis and the subsequent addition of chloroform, cell lysis occurs. The plasmid pEL5a is isolated from the selected clones by standard methods. Vector DNA is stable when stored in 10mM Tris, pH 8.0, 1 EDTA at -20 ^o C.

Пример 2. Использование вектора рЕL5а для получения рекомбинантных белков в виде водонерастворимых агломератов. Example 2. The use of the vector pEL5a to obtain recombinant proteins in the form of water-insoluble agglomerates.

Клетки PLТ90, содержащие плазмиду pEL5а, инокулируют в 1 мл среды LB со 100 мкг/мл ампициллина и растят ночь при 30^oС. Ночную культуру разводят в 2 мл этой же среды в соотношении 1:100 и растят с аэрацией до 0,2 ОЕ при 550 нм, затем повышают температуру до 42^oС для индукции синтеза слитного белка и растят еще 2 часа. Затем добавляют хлороформ до 1% и инкубируют при 37^oС еще час. Далее лизат центрифугируют, ресуспендируют осадок в 75 мкл буфера ТЕ8 и добавляют равный объем буфера для электрофореза (160 мМ трис-HCl, рН 6,8, 20% глицерина, 4% додецилсульфата натрия, 4 мМ ЭДТА, 6%-меркаптоэтанола, 0,05% бромфенолового синего). Клеточные белки анализируются с помощью электрофореза в полиакриламидном геле по Лэммли (U.K. Lammli. Nature, vol.227, рр. 680-685, 1970). После окончания электрофореза белки в геле фиксируют и окрашивают кумасси ярко-голубым R-250.PLT90 cells containing the plasmid pEL5a were inoculated in 1 ml of LB medium with 100 μg / ml ampicillin and grown overnight at 30 ^o C. The night culture was diluted in 2 ml of the same medium in a ratio of 1: 100 and grown with aeration to 0.2 OE at 550 nm, then raise the temperature to 42 ^o With for the induction of synthesis of fusion protein and grow for another 2 hours. Then add chloroform to 1% and incubate at 37 ^o With another hour. The lysate is then centrifuged, the precipitate is resuspended in 75 μl of TE8 buffer, and an equal volume of electrophoresis buffer (160 mM Tris-HCl, pH 6.8, 20% glycerol, 4% sodium dodecyl sulfate, 4 mM EDTA, 6% mercaptoethanol, 0, 05% bromophenol blue). Cellular proteins are analyzed by Lammley polyacrylamide gel electrophoresis (UK Lammli. Nature, vol. 227, pp. 680-685, 1970). After electrophoresis, the proteins in the gel are fixed and Coomassie stained with bright blue R-250.

Анализ полученных результатов показывает, что в результате действия лизоцима происходит разрушение оболочки бактерии и высвобождение водорастворимых клеточных белков в среду, что проявляется в ослаблении минорных белковых полос. В контроле, в случае использования плазмиды рЕХ1, такого эффекта нет. An analysis of the results shows that as a result of the action of lysozyme, the bacterial membrane is destroyed and water-soluble cellular proteins are released into the medium, which is manifested in the weakening of minor protein bands. In the control, in the case of using the plasmid pEX1, there is no such effect.

Таким образом, изобретение позволяет получать водонерастворимые агломераты рекомбинантных белков без использования дополнительных методов разрушения клеточных стенок. Thus, the invention allows to obtain water-insoluble agglomerates of recombinant proteins without the use of additional methods of destruction of cell walls.

Claims (1)

Вектор рЕL5а, предназначенный для экспрессии чужеродной ДНК, размером 6,4 т.п.о, содержащий: XbaI-XbaI фрагмент плазмидной ДНК бактериального вектора рЕХI размером 5,8 т.п.о. со слитным cro-LacZ геном, кодирующим белок под контролем промотора Р_R бактериофага лямбда и полилинкером в 3'-конце LacZ-гена; BamHI-BamHI фрагмент ДНК плазмиды pLys S с геном лизоцима бактериофага Т4 размером 0,6 т.п.о. уникальные сайты рестрикции для клонирования ДНК на 3'-конце гена LacZ, SmaI, BamHI, SalI, PstI; оператор O_R и промотор P_R бактериофага λ терминаторы транскрипции фага fd; генетический маркер устойчивость к ампициллину; спектр хозяев - бактерии Escherichia coli с геном clts 857 бактериофага лямбда.The vector pEL5a, designed for the expression of foreign DNA, size 6.4 kb, containing: XbaI-XbaI fragment of the plasmid DNA of the bacterial vector pEXI size 5.8 kb with a fused cro-LacZ gene encoding a protein under the control of the promoter P _{R of the} bacteriophage lambda and polylinker at the 3'-end of the LacZ gene; BamHI-BamHI DNA fragment of plasmid pLys S with the bacteriophage T4 lysozyme gene of 0.6 kbp unique restriction sites for DNA cloning at the 3'-end of the LacZ, SmaI, BamHI, SalI, PstI gene; operator O _R and promoter P _{R of} bacteriophage λ phage transcription terminators fd; ampicillin resistance genetic marker; host spectrum - Escherichia coli bacteria with clts 857 gene of bacteriophage lambda.