RU2043415C1 - Vector pel 5b designed for foreign dna expression - Google Patents

Abstract

FIELD: biotechnology. SUBSTANCE: advantage of proposed vector pEL 5b: as a result of operon utilization consisting of gene encoding recombinant protein and lysozyme gene synthesis of lysozyme destructing polysaccharide envelope of E. coli cells is carried out simultaneously with synthesis of recombinant protein. This simplifies the purification of water insoluble agglomerates of recombinant protein. EFFECT: simplified method of purification.

Description

Изобретение относится к биотехнологии, генетической инженерии и может быть использовано для получения плазмид, синтезирующих рекомбинантные белки. The invention relates to biotechnology, genetic engineering and can be used to obtain plasmids synthesizing recombinant proteins.

Большие количества рекомбинантных белков можно синтезировать в клетках Escherichia coli, несущих системы экспрессии рекомбинантных белков на основе промотора фага лямбда. Транскрипция в таких системах регулируется связыванием температурочувствительного репрессора фага лямбда, кодируемого мутантным геном clts857, с операторным участком. Когда клетки растут при температуре 30-32^оС, репрессор связывается с оператором и блокирует экспрессию. При повышении температуры роста до 42^оС репрессор инактивируется, что позволяет РНК-полимеразе связываться с промотором и начать транскрипцию гена. В результате интенсивной транскрипции и последующей трансляции могут синтезироваться значительные количества белка.Large amounts of recombinant proteins can be synthesized in Escherichia coli cells carrying recombinant protein expression systems based on the lambda phage promoter. Transcription in such systems is regulated by the binding of the temperature-sensitive lambda phage repressor encoded by the clts857 mutant gene to the operator site. When cells are grown at a temperature of 30-32 ^{° C,} the repressor binds to the operator and expression of the blocks. By increasing the growth temperature to 42 ^{° C} the repressor is inactivated, allowing RNA polymerase to bind to the promoter and start transcription of the gene. Significant amounts of protein can be synthesized as a result of intense transcription and subsequent translation.

Известны рекомбинантные плазмидные ДНК pEX1,pEX2 и pEX3, позволяющие экспрессировать рекомбинантные белки во всех трех рамках считывания. Последовательности ДНК для экспрессии можно вставить в полилинкер, расположенный в 3'-конце гена lacZ. В указанных плазмидах P_R промотор бактериофага лямбда обеспечивает экспрессию последовательностей ДНК, и продукт составляет значительную часть суммарного бактериального белка. Экспрессируемый белок в клетке накапливается в виде водонерастворимых аггломератов. Однако у этих векторов есть недостаток: для выделения водонерастворимых аггломератов рекомбинантного белка необходимо разрушать клеточную стенку бактерии.Recombinant plasmid DNAs pEX1, pEX2, and pEX3 are known for expressing recombinant proteins in all three reading frames. DNA sequences for expression can be inserted into the polylinker located at the 3'-end of the lacZ gene. In these plasmids P _{R, the} lambda bacteriophage promoter provides expression of DNA sequences, and the product makes up a significant portion of the total bacterial protein. The expressed protein in the cell accumulates in the form of water-insoluble agglomerates. However, these vectors have a drawback: in order to isolate water-insoluble agglomerates of a recombinant protein, it is necessary to destroy the bacterial cell wall.

Вектор pEX2 выбран в качестве прототипа для получения вектора pEL5b. Преимущество заявленного вектора pEL5b заключается в том, что в результате использования оперона, состоящего из гена, кодирующего рекомбинантный белок, и гена лизоцима одновременно с синтезом рекомбинантного белка идет синтез лизоцима, разрушающего полисахаридную оболочку E.coli, что существенно упрощает очистку водонерастворимых аггломератов рекомбинантного белка. The pEX2 vector is selected as a prototype to obtain the pEL5b vector. The advantage of the claimed vector pEL5b is that as a result of the use of an operon consisting of a gene encoding a recombinant protein and a lysozyme gene, synthesis of lysozyme destroys the polysaccharide membrane of E. coli simultaneously with the synthesis of recombinant protein, which greatly simplifies the purification of water-insoluble agglomerates of the recombinant protein.

Сущность изобретения состоит в том, что сконструирован вектор pEL5b размером 6,4 тысячи пар оснований (т.п.о.), состоящий из следующих элементов. The essence of the invention lies in the fact that a vector pEL5b of 6.4 thousand base pairs (kbp) is constructed, consisting of the following elements.

Xba1-Xba1- фрагмента плазмидной ДНК бактериального вектора pEX2 размером 5,8 т. п. о. который содержит слитный cro-lacZ ген, кодирущий слитный белок под контролем промотора P_R бактериофага лямбда, полилинкер в 3'-конце lacZ-гена:
BamH1-BamH1- фрагмента ДНК плазмиды pLysS, содержащего ген лизоцима бактериофага Т4 и имеющего размер 0,6 т.п.о.Xba1-Xba1-fragment of plasmid DNA of the bacterial vector pEX2 size of 5.8 T. p. which contains the fusion cro-lacZ gene encoding the fusion protein under the control of the promoter P _{R of the} bacteriophage lambda, polylinker at the 3'-end of the lacZ gene:
BamH1-BamH1- DNA fragment of plasmid pLysS containing the bacteriophage T4 lysozyme gene and having a size of 0.6 kb.

Для конструирования плазмиды pEL5b ДНК плазмиды pEX2 гидролизуют рестриктазой XbaI и достраивают по три нуклеотида в липких концах с помощью ДНК-полимеразы PollK. Параллельно получают BamH1 рестрикт размером 0,6 т.п. о. из плазмиды pLysS, содержащий ген лизоцима бактериофага Т4 и имеющий три достроенных с помощью PollK нуклеотида в липких концах. Фрагмент pEX2 лигируют с фрагментом ДНК, содержащим ген лизоцима бактериофага Т4. Лигазной смесью трансформируют клетки E.coli, содержащие в хромосоме температурочувствительный ген бактериофага лямбда clts857, например клетки штамма PLT90. Трансформанты высевают на среду с ампициллином при 30^оС. Клоны, содержащие рекомбинантные плазмиды с геном лизоцима в нужной ориентации, отбирают с помощью анализа на способность к лизису после индукции синтеза белка. Экспрессию рекомбинантных белков индуцируют повышением температуры до 42^оС. В клонах, продуцирующих лизоцим, после индукции белкового синтеза и последующего добавления хлороформа, происходит лизис клеток. Из отобранных клонов стандартными способами выделяют плазмиду pEL5b. Векторная ДНК стабильна при хранении в 10 мМ трис, рН 8,0, 1 мМ ЭДТА при -20^оС.To construct plasmid pEL5b, the DNA of plasmid pEX2 is hydrolyzed with XbaI restriction enzyme and three nucleotides are added at the sticky ends using PollK DNA polymerase. At the same time, a BamH1 restriction of 0.6 size is obtained. about. from the plasmid pLysS containing the T4 bacteriophage lysozyme gene and having three nucleotides completed with PollK in sticky ends. The pEX2 fragment is ligated with a DNA fragment containing the bacteriophage T4 lysozyme gene. The E. coli cells containing the temperature-sensitive gene of the bacteriophage lambda clts857 gene, for example, cells of the strain PLT90, are transformed with a ligase mixture. Transformants were plated on medium with ampicillin at 30 ^C. Clones containing recombinant plasmids with the lysozyme gene in the correct orientation are selected by analysis of the ability to lysis after induction of protein synthesis. The expression of recombinant proteins is induced by increasing the temperature to 42 ^about C. In the clones producing lysozyme, after the induction of protein synthesis and the subsequent addition of chloroform, cell lysis occurs. From selected clones, plasmid pEL5b is isolated by standard methods. Vector DNA is stable when stored in 10 mM Tris, pH 8.0, 1 mM EDTA at -20 ° ^C.

П р и м е р 1. Получение векторной плазмиды pEL5b с оперонной системой экспрессии и лизиса. PRI me R 1. Obtaining a vector plasmid pEL5b with an operon system of expression and lysis.

Клетки бактерий E.coli PLT90, содержащие плазмиду pEX2, выращивают в 50 мл бульона 2YT (16 г триптона, 10 г дрожжевого экстракта, 5 г NaCl на 1 л воды), содержащего 100 мкг/мл ампицллина до титра 10⁹ кл/мл.E. coli PLT90 bacteria cells containing the pEX2 plasmid are grown in 50 ml of 2YT broth (16 g of tryptone, 10 g of yeast extract, 5 g of NaCl per 1 liter of water) containing 100 μg / ml ampicillin to a titer of 10 ⁹ cells / ml.

Клетки осаждают центрифугированием, ресуспендируют в 2 мл раствора (50 мМ глюкозы, 25 мМ трис-HCl, рН 8,0, 10 мМ ЭДТА, 5 мг/мл лизоцима) и инкубируют 5 мин при комнатной температуре. Далее добавляют 4 мл раствора 0,2 М NaOH, 1% -ного додецилсульфата натрия, перемешивают, инкубируют 10 мин во льду, добавляют 3 мл охлажденного 5 М раствора ацетата калия, рН 4,8, перемешивают, оставляют на 10 мин во льду, образовавшийся осадок отделяют центрифугированием. К надосадочной жидкости добавляют 0,6 объема изопропилового спирта и выдерживают 15 мин при комнатной температуре. Осадок собирают центрифугированием, ресуспендируют в 0,5 мл ТЕ8-буфера (10 мМ трис-HCl, рН 8,0, 1 мМ ЭДТА) и добавляют равный объем насыщенного раствора ацетата натрия. После инкубации в течение 30 мин при минус 20^оС осадок удаляют центрифугированием, а к надосадочной жидкости добавляют 0,6 объема изопропанола и оставляют на 1 ч при комнатной температуре. Осадок собирают центрифугированием, промывают 70%-ным этанолом и ресуспендируют в 100 мкл ТЕ8-буфера.Cells are pelleted by centrifugation, resuspended in 2 ml of solution (50 mM glucose, 25 mM Tris-HCl, pH 8.0, 10 mM EDTA, 5 mg / ml lysozyme) and incubated for 5 min at room temperature. Then add 4 ml of a solution of 0.2 M NaOH, 1% sodium dodecyl sulfate, mix, incubate for 10 min in ice, add 3 ml of chilled 5 M potassium acetate solution, pH 4.8, mix, leave for 10 min in ice, the precipitate formed is separated by centrifugation. 0.6 volumes of isopropyl alcohol are added to the supernatant and incubated for 15 minutes at room temperature. The precipitate was collected by centrifugation, resuspended in 0.5 ml of TE8 buffer (10 mM Tris-HCl, pH 8.0, 1 mM EDTA) and an equal volume of saturated sodium acetate solution was added. After incubation for 30 min at -20 ^{° C} the precipitate was removed by centrifugation and to the supernatant was added 0.6 volume of isopropanol and left for 1 hour at room temperature. The precipitate was collected by centrifugation, washed with 70% ethanol and resuspended in 100 μl of TE8 buffer.

Плазмидную ДНК (1 мкг pEX2) обрабатывают эндонуклеазой рестрикции Xba1 (10 ед.) в буфере A (50 мМ трис-HCl, рН 7,6, 10 мМ MgCl₂, 1 мМ дитиотрейтол, 100 мМ NaCl, 4 мМ спермидина) в течение 2 ч.Plasmid DNA (1 μg pEX2) was treated with Xba1 restriction endonuclease (10 units) in buffer A (50 mM Tris-HCl, pH 7.6, 10 mM MgCl ₂ , 1 mM dithiothreitol, 100 mM NaCl, 4 mM spermidine) for 2 hours

Анализ полноты гидролиза проводят с помощью электрофореза. Используя фрагмент Кленова ДНК-полимеразы E.coli достраивают три из четырех нуклеотидов в липких XbaI-концах. Белки удаляют фенольной экстракцией, ДНК осаждают этанолом и ресуспендируют в 5 мкл ТЕ8. Analysis of the completeness of hydrolysis is carried out using electrophoresis. Using the Klenov fragment of E. coli DNA polymerase, three of the four nucleotides are added at the sticky XbaI ends. Proteins are removed by phenolic extraction, DNA is precipitated with ethanol and resuspended in 5 μl TE8.

Для получения фрагмента ДНК с геном лизоцима проводят рестрикцию 10 мкг ДНК плазмиды pLysS рестриктазой BamH1. С помощью фрагмента Кленова ДНК-полимеразы E.coli достраивают три из четырех нуклеотидов в липких BamH1-концах. Фрагмент -BamH1-BamH1- с частично достроенными липкими концами размером 0,6 т. п. о. выделяют с помощью электрофореза сорбцией на бумагу ДЕ81. Бумагу промывают, инкубируют 30 мин при 80^оС в буфере 2 М ацетата натрия, 50 мМ трис-HCl, рН 7,5, 10 мМ ЭДТА. ДНК, перешедшую в раствор, удаляют с бумаги центрифугированием, к раствору добавляют 2 объема этанола. После инкубации при -20^оС в течение 1 ч осадок собирают центрифугированием и растворяют в 5 мкл буфера ТЕ8.To obtain a DNA fragment with the lysozyme gene, 10 μg of the plasmid pLysS DNA is restricted by BamH1 restriction enzyme. Using the Klenov fragment of E. coli DNA polymerase, three of the four nucleotides are added at the sticky BamH1 ends. Fragment -BamH1-BamH1- with partially completed sticky ends measuring 0.6 bp isolated by electrophoresis by sorption on DE81 paper. The paper was washed, incubated 30 min at ⁸⁰ ° C in a buffer of 2 M sodium acetate, 50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 10 mM EDTA. DNA transferred to the solution is removed from the paper by centrifugation, 2 volumes of ethanol are added to the solution. After incubation at ^-20 ° C for 1 h, the precipitate was collected by centrifugation and dissolved in 5 .mu.l of buffer TE8.

0,5 мкг фрагмента ДНК вектора pEX2 смешивают с 0,2 мкг ДНК, содержащей ген лизоцима бактериофага Т4. Соединение фрагментов проводят с помощью 10 ед. ДНК-лигазы фага Т4 в буфере: 30 мМ трис-HCl, рН 7,2, 10 мМ хлористого магния, 2 мг/мл желатины, 1 мМ спермидина, 0,1% меркаптоэтанола, 0,2 мМ АТФ при 20^оС в течение 2 ч.0.5 μg of the pEX2 vector DNA fragment is mixed with 0.2 μg of DNA containing the bacteriophage T4 lysozyme gene. The connection of the fragments is carried out using 10 units DNA T4 ligase buffer: 30 mM Tris-HCl, pH 7.2, 10 mM magnesium chloride, 2 mg / ml gelatin, 1 mM spermidine, 0.1% mercaptoethanol, 0.2 mM ATP at ²⁰ ° C for 2 hours

Полученной смесью трансформируют клетки E.coli PLT90 содержащие clts857 репрессор. Для этого ночную культуру клеток разводят средой LB с 10 мМ MgSO₄ в соотношении 1:100 и растят с аэрацией до плотности А550 0,3 ОЕ. После 15 мин охлаждения при 0^оС клетки собирают центрифугированием, суспендируют в 1/3 первоначального объема буфером 30 мМ ацетата калия, рН 5,8, 100 мМ RbCl, 50 мМ MnCl₂, 10 мМ CaCl₂, 15% глицерина, и оставляют на 30-60 мин на льду. Клетки собирают центрифугированием, ресуспендируют в 1/12,5 первоначального объема в буфере 10 мМ MOPS, рН 6,8, содержащем 10 мМ RbCl, 75 мМ CaCl₂, 15% глицерина и инкубируют 15 мин на льду. К суспензии клеток добавляют лигированные фрагменты ДНК, инкубируют 40 мин при 0^оС, затем 2 мин при 34^оС, 2-3 мин при 0^оС, разбавляют в 5 раз средой 2YT, растят 30 мин, при 30^оС и высевают на агаризованную среду 2YT с ампициллином (50 мг/мл).The resulting mixture transform cells of E. coli PLT90 containing clts857 repressor. For this, the overnight cell culture was diluted with LB medium with 10 mM MgSO ₄ in a ratio of 1: 100 and grown with aeration to a density of A550 0.3 OE. After 15 minutes cooling at ⁰ ° C, the cells were collected by centrifugation, resuspended in 1/3 the original volume of buffer, 30 mM potassium acetate, pH 5.8, 100 mM RbCl, 50 mM MnCl _2, 10 mM CaCl _2, 15% glycerol, and allowed to for 30-60 minutes on ice. Cells are harvested by centrifugation, resuspended in 1 / 12.5 of the original volume in 10 mM MOPS buffer, pH 6.8, containing 10 mM RbCl, 75 mM CaCl ₂ , 15% glycerol and incubated for 15 min on ice. To the cell suspension was added ligated DNA fragments were incubated 40 min at ⁰ ° C, followed by 2 minutes at 34 ^{° C,} 2-3 min at ⁰ ° C, diluted 5 times 2YT medium, grown for 30 minutes at 30 ^{° C} and seeded on agar medium 2YT with ampicillin (50 mg / ml).

Клоны, содержащие рекомбинантные плазмиды с геном лизоцима в нужной ориентации, отбирают с помощью анализа на способность к лизису после индукции синтеза белка. Экспрессию рекомбинантных белков индуцируют повышением температуры до 42^оС. В клонах, продуцирующих лизоцим, после индукции белкового синтеза и последующего добавления хлороформа происходит лизис клеток. Из отобранных клонов стандартными способами выделяют плазмиду pEL5b. Векторная ДНК стабильна при хранении в 10 мМ трис, рН 8,0, 1 мМ ЭДТА при -20^оС.Clones containing recombinant plasmids with the lysozyme gene in the desired orientation are selected by lysis assay after induction of protein synthesis. Expression of recombinant proteins was induced increasing temperature to 42 ° ^C. The clones producing lysozyme, after induction of protein synthesis and subsequent addition of chloroform, the lysis of cells occurs. From selected clones, plasmid pEL5b is isolated by standard methods. Vector DNA is stable when stored in 10 mM Tris, pH 8.0, 1 mM EDTA at -20 ° ^C.

П р и м е р 2. Использование вектора pEL5b для получения рекомбинантных белков в виде водонерастворимых аггломератов. PRI me R 2. The use of the vector pEL5b to obtain recombinant proteins in the form of water-insoluble agglomerates.

Клетки PLT90, содержащие плазмиду pEL5b, инокулируют в 1 мл среды LB с 100 мкг/мл ампицилина и растят ночь при 30^оС. Ночную культуру разводят в 2 мл этой же среды в соотношении 1:100 и растят с аэрацией до 0,2 ОЕ при 550 нм, затем повышают температуру до 42^оС для индукции синтеза слитного белка и растят еще 2 ч. Затем добавляют хлороформ до 1% и инкубируют при 37^оС еще час. Далее лизат центрифугируют, ресуспендируют осадок в 75 мкл буфера ТЕ8 и добавляют равный объем буфера для электрофореза (160 мМ трис-HCl, рН 6,8, 20% глицерина, 4% додецилсульфата натрия, 4 мМ ЭДТА, 6% меркаптоэтанола, 0,05% бромфенолового синего). Клеточные белки анализируются с помощью электрофореза в полиакриламидном геле по Лэммли. После окончания электрофореза белки в геле фиксируют и окрашивают кумасси ярко-голубым R-250.PLT90 cells containing plasmid pEL5b, inoculated into 1 ml of LB medium with 100 .mu.g / ml ampicillin and grown overnight at 30 ^C. The overnight culture was diluted in 2 ml of the same medium in a ratio of 1: 100 and grown with aeration to 0.2 OU at 550 nm, then the temperature was raised to 42 ^{° C} to induce synthesis of the fused protein and grown another 2 hours. then, chloroform was added to 1% and incubated at ³⁷ ° C for another hour. The lysate is then centrifuged, the pellet is resuspended in 75 μl of TE8 buffer and an equal volume of electrophoresis buffer (160 mM Tris-HCl, pH 6.8, 20% glycerol, 4% sodium dodecyl sulfate, 4 mm EDTA, 6% mercaptoethanol, 0.05 % bromphenol blue). Cellular proteins are analyzed by Lammley polyacrylamide gel electrophoresis. After electrophoresis, the proteins in the gel are fixed and Coomassie stained with bright blue R-250.

Анализ полученных результатов показывает, что в результате действия лизоцима происходит разрушение оболочки бактерии и высвобождение водорастворимых клеточных бактерий в среду, что проявляется в ослаблении минорных белковых полос. В контроле, в случае использования плазмиды pEX2, такого эффекта нет. An analysis of the results shows that as a result of the action of lysozyme, the bacterial membrane is destroyed and water-soluble cell bacteria are released into the medium, which is manifested in the weakening of minor protein bands. In the control, in the case of using the plasmid pEX2, there is no such effect.

Таким образом, предлагаемое изобретение позволяет получать водонерастворимые аггломераты рекомбинантных белков без использования дополнительных методов разрушения клеточных стенок. Thus, the present invention allows to obtain water-insoluble agglomerates of recombinant proteins without the use of additional methods of destruction of cell walls.

Claims (1)

ВЕКТОР PEL 5b, ПРЕДНАЗНАЧЕННЫЙ ДЛЯ ЭКСПРЕССИИ ЧУЖЕРОДНОЙ ДНК, размером 6,4 т.п.о. содержащий Xba1 Xba1-фрагмент плазмидной ДНК бактериального вектора pEX2 размером 5,8 т.п.о. со слитным cro lacZ-геном, кодирующим белок под контролем промотора P_R бактериофага лямбда, полилинкер в 3' - конце lacZ-гена; BamH1 BamH1-фрагмент ДНК плазмиды PLysS, с ген лизоцима бактериофага Т4 размером 0,6 т.п.о. уникальные сайты рестрикции для клонирования ДНК на 3'-конце гена lacZ: EcoR1, Sma1, BamH1, Sal1, Pst1; - оператор O_R и промотор P_R бактериофага лямбда; терминаторы транскрипции фага fd; генетический маркер устойчивость к ампициллину; - спектр хозяев бактерии Escheri chia coli, с геном clts 857 бактериофага лямбда.VECTOR PEL 5b, INTENDED FOR EXPRESSION OF ALIEN DNA, 6.4 kb in size containing Xba1 Xba1 fragment of plasmid DNA of the bacterial vector pEX2 of 5.8 kbp with a fused cro lacZ gene encoding a protein under the control of the promoter P _{R of the} bacteriophage lambda, polylinker at the 3 'end of the lacZ gene; BamH1 BamH1 DNA fragment of the plasmid PLysS, with the bacteriophage T4 lysozyme gene of 0.6 kb in size. unique restriction sites for DNA cloning at the 3'-end of the lacZ gene: EcoR1, Sma1, BamH1, Sal1, Pst1; - operator O _R and promoter P _{R of the} bacteriophage lambda; phage fd transcription terminators; ampicillin resistance genetic marker; - host spectrum of the bacterium Escheri chia coli, with the clts 857 gene of the bacteriophage lambda.