RU2065877C1 - Process for preparing affinic sorbent for purifying proteinases - Google Patents

Abstract

FIELD: biotechnology, food industry, biochemistry, medicine, production of detergents and enzymic synthesis of peptides. SUBSTANCE: in order to obtain affinic sorbent for purifying proteinases, insoluble amine-containing carrier is synthesized. The latter includes natural biopolymers, e.g. quitin or quitosan, with antibiotics such as polypeptides and condensating agent. The latter is 10-25% aqueous glutaric aldehyde. 1 kg of natural biopolymer, 0.15-0.5 g antibiotic and 0.15-0.5 g glutaric aldehyde are used, and the process is carried out at 15-37 C. EFFECT: more efficient preparation process. 2 cl

Description

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к способу получения афинного сорбента для очистки протеиназ, и может быть использовано в пищевой промышленности, биохимии, медицине, в производстве моющих средств, в фермантативном синтезе пептидов, а также для исследовательских целей. The invention relates to biotechnology, in particular to a method for producing an affinity sorbent for the purification of proteinases, and can be used in the food industry, biochemistry, medicine, in the production of detergents, in the enzymatic synthesis of peptides, as well as for research purposes.

Известен способ получения бацитрацин-сафарозы сорбента для афинной хроматографии протеиназ. По этому способу в качестве носителя используют производные агарозы, которые неустойчивы в кислой среде и могут разрушаться целлюлозами в процессе хроматографии. Кроме того, в качестве конденсирующего реагента при синтезе используют высокотоксичный бромциан [1]
Наиболее близким по технической сущности и достигаемому результату является способ получения афинного сорбента для очистки протеиназ, включающий взаимодействие аминопроизводного кремнеземсодержащего материала, используемого в качестве инертного носителя с антибиотиком-полипептидом и конденсирующим агентом при рН 1,8-9,5. Недостатками данного способа являются низкий выход сорбента, использование в качестве конденсирующего агента концерогенного вещества п-бензохинона. Также к недостатку способа следует отнести применение инертных силикатных материалов, которые для взаимодействия с антибиотиками-полипептидами должны быть аминированы аминопропилтриэтоксисисиланом, являющимся труднодоступным, дорогостоящим реагентом.A known method of producing bacitracin-safarose sorbent for affinity chromatography of proteinases. According to this method, derivatives of agarose are used as a carrier, which are unstable in an acidic environment and can be destroyed by celluloses during chromatography. In addition, highly toxic bromine cyan is used as a condensing reagent in the synthesis [1]
The closest in technical essence and the achieved result is a method of producing an affinity sorbent for the purification of proteinases, including the interaction of an amino derivative of a silica-containing material used as an inert carrier with an antibiotic-polypeptide and a condensing agent at a pH of 1.8-9.5. The disadvantages of this method are the low yield of the sorbent, the use of p-benzoquinone as a condensing agent of the concertogenic substance. Also a disadvantage of the method is the use of inert silicate materials, which must be aminated with aminopropyltriethoxysilysilane, which is an inaccessible, expensive reagent, to interact with antibiotic polypeptides.

Целью изобретения является упрощение процесса, увеличение выхода сорбента, неиспользование концерогенных веществ. Это достигается способом получения афинного сорбента для очистки протеиназ, включающим взаимодействие аминсодержащего нерастворимого носителя, в качестве которого используют природные биополимеры, например, хитин или хитозан, с антибиотиками-полипептидами и с конденсирующим агентом, в качестве которого используют водный раствор (10-25% ) глутарового альдегида, причем на 1 г природного биополимера берут 0,15-0,5 г антибиотика и 0,15-0,5 г глутарового альдегида и процесс проводят при 15-37^o С.The aim of the invention is to simplify the process, increase the yield of the sorbent, the non-use of concertogenic substances. This is achieved by the method of producing an affinity sorbent for the purification of proteinases, including the interaction of an amine-containing insoluble carrier, using natural biopolymers, for example, chitin or chitosan, with antibiotic polypeptides and with a condensing agent, which is used as an aqueous solution (10-25%) glutaraldehyde, with 1 g of a natural biopolymer taking 0.15-0.5 g of antibiotic and 0.15-0.5 g of glutaraldehyde and the process is carried out at 15-37 ^o C.

Предложенный способ отличается от известного использованием в качестве нерастворимого аминсодержащего носителя природного биополимера (в качестве конденсирующего агента глутарового альдегида при соотношении на 1 г носителя берут 0,15-0,5 г антибиотика и 0,15-0,5 г глутарового альдегида) и проведении процесса при 15-37^o С.The proposed method differs from the known one by using a natural biopolymer as an insoluble amine-containing carrier (0.15-0.5 g of antibiotic and 0.15-0.5 g of glutaraldehyde are taken as a condensing agent of glutaraldehyde at a ratio of 1 g of carrier) and process at 15-37 ^o C.

П р и м е р 1. Синтез бацитрацин-хитозана. К 1 г хитозана прибавляют 25 мл 25% -ного глутарового альдегида (10 мкМ) в 0,1 М фосфатном буфере при рН 6,9. После перемешивания в течение 4 ч при комнатной температуре помещают в термостат на 37^o С и оставляют на ночь. Затем сорбент отфильтровывают, промывают тем же буфером и помещают в раствор 0,5 г (9 мкМ) бацитрацина в том же буфере, перемешивают 30 мин и оставляют на ночь в термостате при 37 ^oС. Готовый сорбент отфильтровывают, промывают буфером и водой. Содержание бацитрацина в образце 8,5 мкМ/г, выход 94% Для определения включения антибиотика в сорбент навеску в 20 мг гидролизуют 5,7 н НС 48 ч при 105 ^oС и измеряют количественно содержание аминокислот (Asp, Glu, Val, Lys) на аминокислотном анализаторе. Выход реакции рассчитывают по отношению количества присоединяющегося антибиотика к количеству антибиотика, вводимого в реакцию (мкМ), принимая за 100% исходное содержание антибиотика в реакционной смеси на 1 г хитина или хитозана.PRI me R 1. Synthesis of bacitracin-chitosan. 25 ml of 25% glutaraldehyde (10 μM) in 0.1 M phosphate buffer at pH 6.9 are added to 1 g of chitosan. After stirring for 4 hours at room temperature, they are placed in a thermostat at 37 ^° C and left overnight. Then the sorbent is filtered off, washed with the same buffer and placed in a solution of 0.5 g (9 μM) of bacitracin in the same buffer, stirred for 30 minutes and left overnight in an thermostat at 37 ^o С. The finished sorbent is filtered off, washed with buffer and water. The bacitracin content in the sample is 8.5 μM / g, yield 94%. To determine the inclusion of the antibiotic in the sorbent, a 20 mg sample is hydrolyzed with 5.7 N HC for 48 hours at 105 ^° C and the amino acid content is measured quantitatively (Asp, Glu, Val, Lys) on an amino acid analyzer. The reaction yield is calculated as the ratio of the amount of antibiotic to be added to the amount of antibiotic introduced into the reaction (μM), taking as 100% the initial antibiotic content in the reaction mixture per 1 g of chitin or chitosan.

Из данных таблицы видно, что по известному способу наибольший выход достигается при избытке бацитрацина 340 мкМ. В предложенном способе в целях экономии предлагается уменьшить количество дефицитных антибиотиков до 9 мкМ, т.е. в 38 раз. При этом выход повышается до 94%
Таким образом, способ обладает существенными преимуществами по сравнению с известным. Вместо инертных силикатных материалов в известном способе, требующем для активации применения дорогостоящего аминопропилтриэтоксисилана, предлагаются природные биополимеры отходы крабьего промысла хитин или хитозан, уже имеющие на поверхности аминогруппы и не требующие активации.From the data of the table it is seen that according to the known method, the greatest yield is achieved with an excess of bacitracin 340 μm. In the proposed method, in order to save, it is proposed to reduce the number of deficient antibiotics to 9 μM, i.e. 38 times. At the same time, the yield rises to 94%
Thus, the method has significant advantages compared with the known. Instead of inert silicate materials in the known method, requiring the activation of the use of expensive aminopropyltriethoxysilane, natural biopolymers are proposed for the crab waste chitin or chitosan, which already have an amino group on the surface and do not require activation.

Россия располагает большими сырьевыми ресурсами ракообразных для производства хитина и хитозана. Учитывая экологические аспекты утилизации отходов, эти биополимеры являются достаточно дешевыми носителями для афинных сорбентов, не уступающие в этом отношении макропористым силикатным материалом. Хитин и хитозан обладают высокой химической и биологической стойкостью, достаточной проницаемостью. Эти материалы характеризуются значительной степенью гидрофильности и могут использоваться в гранульной форме. Russia has large raw material resources of crustaceans for the production of chitin and chitosan. Given the environmental aspects of waste disposal, these biopolymers are fairly cheap carriers for affinity sorbents, not inferior in this respect to macroporous silicate material. Chitin and chitosan have high chemical and biological resistance, sufficient permeability. These materials are characterized by a significant degree of hydrophilicity and can be used in granular form.

Вместо канцерогенного п-бензохинона предлагается в качестве конденсирующего агента использовать безвредный глутаровый альдегид. Instead of the carcinogenic p-benzoquinone, it is proposed to use harmless glutaraldehyde as a condensing agent.

Синтез проводят при более низких температурах (15 37^oС), что снижает затраты энергии и уменьшает возможность побочных реакций.The synthesis is carried out at lower temperatures (15 37 ^o C), which reduces energy costs and reduces the possibility of side reactions.

Предлагаемый способ дает возможность лучше контролировать процесс, т.к. исходное количество аминогрупп на хитине или хитозане можно заранее определить и подобрать соответствующее количество антибиотика. Расход антибиотика сокращается в предлагаемом способе в 3,7-23 раза, а выход афинного сорбента увеличивается в 4-23 раза по сравнению с известным способом. Синтезированные по предлагаемому способу сорбенты по качеству сравнимы с применяемыми ранее. ТТТ1 The proposed method makes it possible to better control the process, because the initial amount of amino groups on chitin or chitosan can be determined in advance and the appropriate amount of antibiotic selected. The consumption of the antibiotic is reduced in the proposed method by 3.7-23 times, and the yield of the affinity sorbent is increased by 4-23 times compared with the known method. The sorbents synthesized by the proposed method are comparable in quality to those used previously. TTT1

Claims (2)

1. Способ получения афинного сорбента для очистки протеиназ, включающий взаимодействие аминосодержащего нерастворимого носителя с антибиотиками-полипептидами и конденсирующим агентом, отличающийся тем, что в качестве аминосодержащего нерастворимого носителя используют природные биополимеры, например, хитин или хитозан, а в качестве конденсирующего агента глутаровый альдегид, причем на 1 г природного биополимера берут 0,15 0,5 антибиотика и 0,15 0,5 г глутарового альдегида. 1. A method of producing an affinity sorbent for the purification of proteinases, comprising reacting an amine-containing insoluble carrier with antibiotic polypeptides and a condensing agent, characterized in that natural biopolymers, for example chitin or chitosan, and glutaraldehyde as a condensing agent, are used as an amine-containing insoluble carrier, moreover, 0.15 0.5 antibiotic and 0.15 0.5 g glutaraldehyde are taken per 1 g of natural biopolymer. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что процесс проводят при 15 - 37^oС.2. The method according to claim 1, characterized in that the process is carried out at 15 - 37 ^o C.

Images