RU2022019C1 - Method of preparing of biologically active lipids complex - Google Patents

Abstract

FIELD: biotechnology, microbiology. SUBSTANCE: method involves preparing of lipid complex containing γ-linolenic acid. Method is carried out by growing of fungus Mucor lusitanicus INMI at submerged cultivation under conditions of continuous aeration on the nutrient medium containing hydrocarbon source of carbon and inorganic source of nitrogen. Medium has additionally, g/l: sodium acetate 3-5; KMnO₄ 0.015-0.030; CuSO₄·7H₂O 0.01-0.001; vitamin β₁ 0.002. Growing is carried out at pH 4.5-5.5. After 72 h of growing synthesis of lipids is 12 g per 100 g utilized glucose, lipids contains 28% γ-linolenic acid of total content of fatty acids and 6500 mcg carotinoids per 1 g lipids. EFFECT: improved method of bioactive complex preparing. 1 tbl

Description

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к микробному синтезу фармакологически активных веществ. The invention relates to biotechnology, namely to the microbial synthesis of pharmacologically active substances.

Известно, что полиненасыщенные жирные кислоты, в частности γ-линоленовая кислота, являются биологически активными вещества и используются в медицине, например, для предупреждения атеросклероза, а также как противовоспалительные, антиаллергические средства . В последнее время липиды, содержащие γ-линоленовую кислоту, находят широкое применение также в косметологии . It is known that polyunsaturated fatty acids, in particular γ-linolenic acid, are biologically active substances and are used in medicine, for example, to prevent atherosclerosis, as well as anti-inflammatory, anti-allergic agents. Recently, lipids containing γ-linolenic acid are also widely used in cosmetology.

Каротиноиды - биологически активные соединения, они входят в состав препаратов, обладающих репаративной активностью . Carotenoids are biologically active compounds, they are part of drugs with reparative activity.

Наряду с лечебным действием каротиноиды обладают антиоксидантным действием по отношению к ненасыщенным липидам , поэтому присутствие их в липидах стабилизирует полиненасыщенные жирные кислоты, в данном случае предотвращает перекисное окисление γ-линоленовой кислоты. Along with the therapeutic effect, carotenoids have an antioxidant effect on unsaturated lipids, therefore, their presence in lipids stabilizes polyunsaturated fatty acids, in this case it prevents the peroxidation of γ-linolenic acid.

Представляет большой интерес разработка способа получения липидов, содержащих так γ-линоленовую кислоту, так и каротиноиды. Of great interest is the development of a method for producing lipids containing both γ-linolenic acid and carotenoids.

Известен способ получения липидов, содержащих полиненасыщенные жирные кислоты и каротиноиды, с помощью культуры Mortierella . A known method of producing lipids containing polyunsaturated fatty acids and carotenoids using a Mortierella culture.

Недостатком этого способа является недостаточно высокое содержание γ-линоленовой кислоты и каротиноидов в липидах (в 8% γ-линоленовой кислоты от суммы жирных кислот и 1800 мкг/г липидов каротиноидов). The disadvantage of this method is the insufficiently high content of γ-linolenic acid and carotenoids in lipids (in 8% of γ-linolenic acid of the sum of fatty acids and 1800 μg / g of lipids of carotenoids).

Известен способ получения каротиноидов с помощью культуры Вl.trispora, его липиды содержат 20000 мкг/г липидов каротиноидов, но всего лишь до 12% γ-линоленовой кислоты от суммы жирных кислот . A known method of producing carotenoids using a Bl.trispora culture, its lipids contain 20,000 μg / g of carotenoid lipids, but only up to 12% of γ-linolenic acid of the total fatty acids.

Известен способ получения комплекса биологически активных веществ липидной природы с помощью штамма дрожжей Rhodotorula glutinis . В комплексе липидов содержится до 40% незаменимых жирных кислот от суммы жирных кислот и 1200-1250 мкг каротиноидов на 1 г липидов. Однако в составе жирных кислот отсутствует γ -линоленовая кислота. Данный комплекс липидов предлагается использовать в сельском хозяйстве качестве добавки в корм животных. A known method of obtaining a complex of biologically active substances of lipid nature using a strain of yeast Rhodotorula glutinis. The lipid complex contains up to 40% of essential fatty acids of the total fatty acids and 1200-1250 μg of carotenoids per 1 g of lipids. However, γ-linolenic acid is absent in the composition of fatty acids. This lipid complex is proposed to be used in agriculture as an additive in animal feed.

Наиболее близким к предлагаемому техническому решению является способ получения биологически активных липидов, содержащих γ-линоленовую кислоту, с помощью гриба Мuсor ИНМИ . Культуру гриба выращивают в течение 72 ч при температуре 28±1 ^оС в двухлитровых колбах с рабочим объемом 300 мл. Состав среды, г/л Н₂О: глюкоза 30; мочевина 1 г; К₂НРО₄1 г; NaCl 0,5 г; MgSO₄ ˙7H₂O 0,5 г; FeSO₄ ˙7Н₂О 0,01 г; СаСl₂ 0,02 г; ZnSO₄ ˙7H₂O 0,01 г; дрожжевой экстракт 0,5; витамин В₆ 2 мг; биотин 0,02 мг; Н₂О 1 л, рН 6,5, при аэрации 1,6-1,8 О₂/л/ч. При этом получают 29% γ-линоленовой кислоты от суммы жирных кислот при выходе липидов 12,0 г на 100 г использованной глюкозы, каротиноидов 1500-2000 мкг/г липидов.Closest to the proposed technical solution is a method for producing biologically active lipids containing γ-linolenic acid using the fungus Mucor INMI. The culture of the fungus is grown for 72 hours at a temperature of 28 ± 1 ^{° C} in a two-liter flasks with a working volume of 300 ml. The composition of the medium, g / l H ₂ O: glucose 30; urea 1 g; To ₂ NRA ₄ 1 g; NaCl 0.5 g; MgSO ₄ ˙ 7H ₂ O 0.5 g; FeSO ₄ ˙ 7H ₂ O 0.01 g; CaCl ₂ 0.02 g; ZnSO ₄ ˙ 7H ₂ O 0.01 g; yeast extract 0.5; Vitamin B ₆ 2 mg; Biotin 0.02 mg; H ₂ O 1 l, pH 6.5, with aeration of 1.6-1.8 O ₂ / l / h. In this case, 29% of γ-linolenic acid of the total fatty acids is obtained with a lipid yield of 12.0 g per 100 g of glucose used, carotenoids of 1500-2000 μg / g of lipids.

Недостатком данного способа является низкое содержание каротиноидов в липидах, в результате чего они недостаточно эффективны при изготовлении ранозаживляющих и других лекарственных средств. The disadvantage of this method is the low content of carotenoids in lipids, as a result of which they are not effective enough in the manufacture of wound healing and other drugs.

Цель изобретения - увеличение содержания каротиноидов в комплексе липидов, содержащих γ-линоленовую кислоту. The purpose of the invention is to increase the content of carotenoids in the complex of lipids containing γ-linolenic acid.

Это достигается тем, что гриб Mucor lusitanicus ИНМИ (депонирован в ВКМ под номером F - 306 Д) выращивают на среде следующего состава, г/л Н₂О): глюкоза 60±0,01; ацетат натрия 3-5; мочевина 2±0,01; К₂ НРО₄ 1 ± 0,01; NаСl 0,5±0,01; MgSO₄ ˙ 7H₂O 0,5 ± 0,01; ZnSO₄ ˙ 7H₂O 0,01± 0,001; FeSO₄ ˙ 7H₂O 0,01 ± 0,001; СuSO₄ ˙7Н₂О 0,01±0,001; СаСl₂ 0,02±0,001; KMnO₄ 0,015-0,030; витамин В₁ 0,002; витамин В₆ 0,002; биотин 0,02 мг; дрожжевой экстракт 0,5±0,01. Культивирование проводят в течение 72 ч при температуре 26-28^оС, аэрации 1,6-1,8 О₂/л/ч, рН 4,5-5,5.This is achieved by the fact that the fungus Mucor lusitanicus INMI (deposited in VKM under number F - 306 D) is grown on a medium of the following composition, g / l H ₂ O): glucose 60 ± 0.01; sodium acetate 3-5; urea 2 ± 0.01; K ₂ NRA ₄ 1 ± 0.01; NaCl 0.5 ± 0.01; MgSO ₄ ˙ 7H ₂ O 0.5 ± 0.01; ZnSO ₄ ˙ 7H ₂ O 0.01 ± 0.001; FeSO ₄ ˙ 7H ₂ O 0.01 ± 0.001; CuSO ₄ ˙ 7H ₂ O 0.01 ± 0.001; CaCl ₂ 0.02 ± 0.001; KMnO ₄ 0.015-0.030; Vitamin B ₁ 0.002; Vitamin B ₆ 0.002; Biotin 0.02 mg; yeast extract 0.5 ± 0.01. Cultivation was carried out for 72 hours at a temperature of 26-28 ^{° C,} aeration 1,6-1,8 O ₂ / l / h, pH 4.5-5.5.

Мицелий отделяют от культуральной жидкости фильтрованием и лиофилизируют. Липиды извлекают из лиофилизированной биомассы последовательной экстракцией этанолом и гексанолом (соотношение биомассы и растворителя 1:15). Жирнокислотный состав липидов определяют методом газожидкостной хроматографии метиловых эфиров жирных кислот, которые получают кислотным метанолизом. Каротиноиды определяют спектрофотометрически при длине волны 451±2 нм. The mycelium is separated from the culture fluid by filtration and lyophilized. Lipids are recovered from lyophilized biomass by sequential extraction with ethanol and hexanol (ratio of biomass to solvent 1:15). The fatty acid composition of lipids is determined by gas-liquid chromatography of methyl esters of fatty acids, which are obtained by acid methanolysis. Carotenoids are determined spectrophotometrically at a wavelength of 451 ± 2 nm.

В результате получают смесь липидов, содержащую 28-30% γ-линоленовой кислоты от суммы жирных кислот и 5600-6500 мкг/г липидов каротиноидов, при выходе липидов 11-12 г на 100 г использованной глюкозы. The result is a lipid mixture containing 28-30% of γ-linolenic acid of the total fatty acids and 5600-6500 μg / g of carotenoid lipids, with a yield of 11-12 g per 100 g of glucose used.

Отличительным признаком данного способа является то, что среда дополнительно содержит, г/л: ацетат натрия 3-5; КМnО₄ 0,015-0,03; СuSO₄˙7H₂O 0,01± 0,001; витамин В₁ 0,002, а выращивание ведут при рН 4,5-5,5.A distinctive feature of this method is that the medium additionally contains, g / l: sodium acetate 3-5; KMnO ₄ 0.015-0.03; CuSO ₄ ˙ 7H ₂ O 0.01 ± 0.001; vitamin B ₁ 0.002, and cultivation is carried out at pH 4.5-5.5.

Добавление КМnО₄, являющегося сильным окислителем, стимулирует синтез каротиноидов, не оказывая влияния на рост гриба и не подавляя синтез γ-линоленовой кислоты. Добавление ацетата натрия в концентрации от 3 до 5 г/л и витамина В₁ способствует синтезу липидов и каротиноидов. При повышении концентрации ацетата натрия больше 5 г/л снижается содержание γ-линоленовой кислоты в липидах. СuSO₄ x x 7Н₂О стимулирует синтез γ-линоленовой кислоты.The addition of KMnO ₄ , which is a strong oxidizing agent, stimulates the synthesis of carotenoids without affecting the growth of the fungus and without inhibiting the synthesis of γ-linolenic acid. The addition of sodium acetate in a concentration of 3 to 5 g / l and vitamin B ₁ promotes the synthesis of lipids and carotenoids. With increasing concentration of sodium acetate more than 5 g / l, the content of γ-linolenic acid in lipids decreases. CuSO ₄ xx 7H ₂ O stimulates the synthesis of γ-linolenic acid.

П р и м е р 1. Культуру Мucor lusitanicus ИНМИ выращивают в течение 72 ч в колбах на 750 мл, содержащих 100 мл среды, при температуре 28^оС на качалке при аэрации 1,8 О₂/л/ч. Состав среды, г/л Н₂О: глюкоза 60,0; ацетат натрия 3,0; мочевина 2,0; NaCl 0,5; К₂НРО₄ 1,0; MgSO₄ ˙7Н₂О 0,5; ZnSO₄ x 7H₂O 0,01; FeSО₄ ˙7Н₂О 0,01; СаСl₂ 0,02; КМnО₄ 0,015; CuSO₄ ˙ 7H₂O 0,01; витамин В₁ 0,002; витамин В₆ 0,002; биотин 0,02 мг; дрожжевой экстракт 0,5; рН среды 5,5.EXAMPLE EXAMPLE 1 Mucor lusitanicus INMI culture grown for 72 hours in 750 ml flasks containing 100 ml of medium at 28 ^{° C} on a shaker aeration at 1.8 O ₂ / l / h. The composition of the medium, g / l H ₂ O: glucose 60,0; sodium acetate 3.0; urea 2.0; NaCl 0.5; K ₂ NRA ₄ 1.0; MgSO ₄ ˙ 7H ₂ O 0.5; ZnSO ₄ x 7H ₂ O 0.01; FeSO ₄ ˙ 7H ₂ O 0.01; CaCl ₂ 0.02; KMnO ₄ 0.015; CuSO ₄ ˙ 7H ₂ O 0.01; Vitamin B ₁ 0.002; Vitamin B ₆ 0.002; Biotin 0.02 mg; yeast extract 0.5; pH 5.5.

В качестве инокулята используют суспензию спор плотностью 10⁶кл/мл. Споровый материал выращивают на агаризо- ванной среде Чапека.As an inoculum, a spore suspension of density 10 ⁶ cells / ml is used. Spore material is grown on a Capeca agar medium.

Биомассу отделяют от культуральной жидкости, лиофилизируют. Лиофилизированную биомассу последовательно экстрагируют этанолом и гексаном. Выход липидов составляет 11 г на 100 г использованной глюкозы, при этом содержание γ-линоленовой кислоты - 30% от суммы жирных кислот, каротиноидов - 5600 мкг/г липидов. The biomass is separated from the culture fluid, lyophilized. Lyophilized biomass is sequentially extracted with ethanol and hexane. The lipid yield is 11 g per 100 g of glucose used, while the content of γ-linolenic acid is 30% of the total fatty acids, carotenoids - 5600 μg / g of lipids.

П р и м е р 2. Культуру Mucor lusitanicus ИНМИ выращивают в течение 72 ч при температуре 26^оС, аэрации 1,8 О₂/л/ч, на среде следующего состава, г/л Н₂О: глюкоза 60,0; ацетат натрия 5,0; мочевина 2,0; NaCl 0,5; К₂НРО₄ 1,0; МgSО₄ ˙7Н₂О 0,5; ZnSО₄ ˙7Н₂О 0,1; СuSO₄ ˙7Н₂О 0,01; FeSO₄ ˙7H₂O 0,01; CaCl₂ 0,02; КMnO₄ 0,03; витамин В1 0,002; витамин В₆0,002; биотин 0,02 мг; дрожжевой экстракт 0,5, рН среды 4,0.PRI me R 2. The culture of Mucor lusitanicus INMI is grown for 72 hours at a temperature of 26 ^about With aeration of 1.8 About ₂ / l / h, on a medium of the following composition, g / l H ₂ About: glucose 60,0 ; sodium acetate 5.0; urea 2.0; NaCl 0.5; K ₂ NRA ₄ 1.0; MgSO ₄ ˙ 7H ₂ O 0.5; ZnSO ₄ ˙ 7H ₂ O 0.1; CuSO ₄ ˙ 7H ₂ O 0.01; FeSO ₄ ˙ 7H ₂ O 0.01; CaCl ₂ 0.02; KMnO ₄ 0.03; Vitamin B1 0.002; Vitamin B ₆ 0.002; Biotin 0.02 mg; yeast extract 0.5, pH 4.0.

В качестве инокулята используют суспензию спор плотностью 10⁶кл/мл. Споровый материал выращивают на агаризо- ванной среде Чапека.As an inoculum, a spore suspension of density 10 ⁶ cells / ml is used. Spore material is grown on a Capeca agar medium.

Биомассу отделяют от культуральной жидкости, лиофилизируют. Лиофилизированную биомассу последовательно экстрагируют этанолом и гексаном. Выход липидов составляет 12,0 г на 100 г использованной глюкозы, γ-линоленовой кислоты - 28% от суммы жирных кислот, каротиноидов - 6500 мкг/г липидов. The biomass is separated from the culture fluid, lyophilized. Lyophilized biomass is sequentially extracted with ethanol and hexane. The lipid yield is 12.0 g per 100 g of glucose used, γ-linolenic acid - 28% of the total fatty acids, carotenoids - 6500 μg / g of lipids.

Были изучены ранозаживляющие и противоожоговые свойства комплекса липидов гриба Mucor lusitanicus ИНМИ, полученного данным способом, который содержит γ-линоленовую кислоту и каротиноиды. Исследования проводились на кафедре оперативной хирургии 1-го лечебного факультета Московской медицинской академии им. И.М.Сеченова. Обнаружено, что присутствие в липидах каротиноидов в значительной степени усиливает лечебное действие используемых липидов (таблица). Как видно из таблицы комплекс липидов, содержащий γ-линолевую кислоту и каротиноиды, обладает более эффективным ранозаживляющим действием, чем липиды с γ-линоленовой кислотой без каротиноидов, облепиховое масло, синтомициновая эмульсия и препарат "Биополиен", разработанный в ММА им. И.М.Сеченова. The wound healing and anti-burn properties of the lipid complex of the fungus Mucor lusitanicus INMI, obtained by this method, which contains γ-linolenic acid and carotenoids, were studied. The studies were conducted at the Department of Surgery of the 1st Medical Faculty of the Moscow Medical Academy. I.M.Sechenova. It was found that the presence of carotenoids in lipids significantly enhances the therapeutic effect of the used lipids (table). As can be seen from the table, the lipid complex containing γ-linoleic acid and carotenoids has a more effective wound healing effect than lipids with γ-linolenic acid without carotenoids, sea buckthorn oil, synthomycin emulsion and the drug "Biopolien", developed in MMA named after I.M.Sechenova.

Предполагается разработка лабораторного регламента на получение лекарственных форм для наружного применения на основе липидов, полученных предложенным способом, на кафедре заводской технологии ГЛС ММА им. И.И.Сеченова. It is planned to develop laboratory regulations for the production of dosage forms for external use on the basis of lipids obtained by the proposed method at the Department of Factory Technology of the SFS MMA named after I.I. Sechenov.

Claims (1)

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КОМПЛЕКСА БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ЛИПИДОВ, содержащих γ -линоленовую кислоту и каротиноиды, предусматривающий выращивание гриба Mucor lusitanicus BKMF-306 D на синтетической питательной среде, содержащей источники азота, углерода, фосфора, микроэлементы и витамины, при аэрации, отличающийся тем, что, с целью увеличения содержания каротиноидов в комплексе липидов, используют среду, дополнительно содержащую, г/л:
Ацетат натрия 3 - 5
КМпО₄ 0,015 - 0,03
CuSO₄ · 7 H₂O 0,01 ± 0,001
Витамин B₁ 0,002,
а выращивание ведут при pH 4,5 - 5,5.METHOD FOR PRODUCING A BIOLOGICALLY ACTIVE LIPID COMPLEX containing γ-linolenic acid and carotenoids, involving the cultivation of the fungus Mucor lusitanicus BKMF-306 D on a synthetic nutrient medium containing sources of nitrogen, carbon, phosphorus, trace elements and vitamins, with aeration that differs in order to increase the content of carotenoids in the lipid complex, use a medium additionally containing, g / l:
Sodium Acetate 3-5
KMpO ₄ 0.015 - 0.03
CuSO ₄ · 7 H ₂ O 0.01 ± 0.001
Vitamin B ₁ 0.002,
and cultivation is carried out at a pH of 4.5 to 5.5.

Images