RU2016106270A - Новые селективные векторы и способы селекции эукариотических клеток-хозяев - Google Patents
Новые селективные векторы и способы селекции эукариотических клеток-хозяев Download PDFInfo
- Publication number
- RU2016106270A RU2016106270A RU2016106270A RU2016106270A RU2016106270A RU 2016106270 A RU2016106270 A RU 2016106270A RU 2016106270 A RU2016106270 A RU 2016106270A RU 2016106270 A RU2016106270 A RU 2016106270A RU 2016106270 A RU2016106270 A RU 2016106270A
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- folate receptor
- amino acid
- sequence
- leucine
- seq
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/65—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression using markers
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
- C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/67—General methods for enhancing the expression
- C12N15/69—Increasing the copy number of the vector
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2800/00—Nucleic acids vectors
- C12N2800/40—Systems of functionally co-operating vectors
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Immunology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Claims (100)
1. Экспрессионный вектор или сочетание по меньшей мере двух экспрессионных векторов, содержащие:
a) полинуклеотид, кодирующий мутантный фолатный рецептор в качестве селективного маркера, при этом мутантный фолатный рецептор имеет сниженную аффинность связывания фолата по сравнению с фолатным рецептором дикого типа, и
b) по меньшей мере один полинуклеотид, кодирующий интересующий полипептид,
при этом когда указанный экспрессионный вектор или сочетание по меньшей мере двух экспрессионных векторов вводят в клетку-хозяина, интересующий полипептид секретируется из указанной клетки-хозяина.
2. Экспрессионный вектор или сочетание по меньшей мере двух экспрессионных векторов по п. 1, отличающиеся тем, что закодированный мутантный фолатный рецептор имеет по меньшей мере одну мутацию в кармане связывания фолата, которая приводит к снижению аффинности связывания фолата по сравнению с фолатным рецептором дикого типа.
3. Экспрессионный вектор или сочетание по меньшей мере двух экспрессионных векторов по п. 1, отличающиеся тем, что закодированный мутантный фолатный рецептор представляет собой мутантный фолатный рецептор альфа.
4. Экспрессионный вектор или сочетание по меньшей мере двух экспрессионных векторов по п. 3, имеющие одну или более из следующих характеристик:
a) закодированный мутантный фолатный рецептор содержит аминокислотную последовательность, полученную из аминокислотной последовательности зрелого человеческого фолатного рецептора альфа дикого типа (SEQ ID NO 1), при этом аминокислотная последовательность мутантного фолатного рецептора имеет по меньшей мере одну мутацию, которая приводит к снижению аффинности связывания фолата по сравнению со зрелым человеческим фолатным рецептором альфа дикого типа (SEQ ID NO 1);
b) мутантный фолатный рецептор имеет по меньшей мере одну замену в аминокислотном положении, соответствующем структурно или по гомологии аминокислотных последовательностей аминокислотному положению, выбранному из положений 49, 104 и 166 последовательности зрелого человеческого фолатного рецептора дикого типа; и/или
c) мутантный фолатный рецептор имеет замену в аминокислотном положении, соответствующем структурно или по гомологии аминокислотных последовательностей аминокислоте 49 последовательности зрелого человеческого фолатного рецептора альфа дикого типа (SEQ ID NO 1).
5. Экспрессионный вектор или сочетание по меньшей мере двух экспрессионных векторов по п. 1, отличающиеся тем, что мутантный фолатный рецептор имеет сниженную аффинность связывания для 6S диастереоизомера 5-метилтетрагидрофолата по сравнению с фолатным рецептором дикого типа и/или мутантный фолатный рецептор имеет сниженную аффинность связывания для фолиевой кислоты по сравнению с фолатным рецептором дикого типа.
6. Экспрессионный вектор или сочетание по меньшей мере двух экспрессионных векторов по п. 4 c), отличающиеся тем, что закодированный мутантный фолатный рецептор имеет аминокислотную замену в положении, соответствующем структурно или по гомологии аминокислотных последовательностей аминокислоте 49 последовательности зрелого человеческого фолатного рецептора альфа дикого типа (SEQ ID NO 1), при этом аланин, присутствующий в последовательности дикого типа, заменен аминокислотой, выбранной из группы, состоящей из лейцина, глицина, валина, изолейцина, гистидина и аспарагиновой кислоты, или при этом аланин, присутствующий в последовательности дикого типа в положении 49, заменен лейцином.
7. Экспрессионный вектор или сочетание по меньшей мере двух экспрессионных векторов по п. 1, отличающиеся тем, что закодированный мутантный фолатный рецептор имеет следующие характеристики:
a) зрелый мутантный фолатный рецептор содержит следующую последовательность
IAWARTELLNVCMNAKHHKEKPGPEDKLHEQCRPWRKNACCSTNTSQEXaaHKDVSYLYRFNWNHCGEMAPACKRHFIQDTCLYECSPNLGPWIQQVDQSWRKERVLNVPLCKEDCEQWWEDCRTSYTCKSNWHKGWNWTSGFNKCAVGAACQPFHFYFPTPTVLCNEIWTHSYKVSNYSRGSGRCIQMWFDPAQGNPNEEVARFYA (SEQ ID NO 9)
где Xaa не является аланином и где, необязательно, Xaa является аминокислотой, выбранной из лейцина, глицина, валина, изолейцина, гистидина и аспарагиновой кислоты, или является лейцином;
или
b) зрелый мутантный фолатный рецептор содержит аминокислотную последовательность, имеющую идентичность последовательности по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% с последовательностью, приведенной в SEQ ID NO 9, и при этом Xaa не является аланином в указанном мутантном фолатном рецепторе, при этом аффинность связывания фолата у указанного мутантного фолатного рецептора снижена по сравнению с последовательностью зрелого человеческого фолатного рецептора альфа дикого типа, где Xaa является аланином (смотри SEQ ID NO 1), и при этом, необязательно, Xaa является аминокислотой, выбранной из лейцина, глицина, валина, изолейцина, гистидина и аспарагиновой кислоты, или является лейцином.
8. Экспрессионный вектор или сочетание по меньшей мере двух экспрессионных векторов по п. 1, отличающиеся тем, что закодированный мутантный фолатный рецептор имеет следующие характеристики:
a) он содержит последовательность
IAWARTELLNVCMNAKHHKEKPGPEDKLHEQCRPWRKNACCSTNTSQEXaaHKDVSYLYRFNWNHCGEMAPACKRHFIQDTCLYECSPNLGPWIQQVDQSWRKERVLNVPLCKEDCEQWWEDCRTSYTCKSNWHKGWNWTSGFNKCAVGAACQPFHFYFPTPTVLCNEIWTHSYKVSNYSRGSGRCIQMWFDPAQGNPNEEVARFYAAAMSGAGPWAAWPFLLSLALMLLWLLS (SEQ ID NO 13)
где Xaa является лейцином;
или
b) он содержит аминокислотную последовательность, которая имеет идентичность последовательности по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% с последовательностью, приведенной в SEQ ID NO 13, где Xaa является лейцином, и при этом аффинность связывания указанного мутантного фолатного рецептора для 6S диастереоизомера 5-метилтетрагидрофолата снижена по сравнению с последовательностью зрелого человеческого фолатного рецептора альфа дикого типа, где Xaa является аланином (смотри SEQ ID NO 1).
9. Экспрессионный вектор или сочетание по меньшей мере двух экспрессионных векторов по п. 1, которые дополнительно содержат полинуклеотид, кодирующий селективный маркер, участвующий в метаболизме фолата, при этом, необязательно, полинуклеотид, кодирующий селективный маркер, кодирует дигидрофолатредуктазу.
10. Экспрессионный вектор или сочетание по меньшей мере двух экспрессионных векторов по п. 1, содержащие:
a) экспрессионную кассету, содержащую полинуклеотид, кодирующий мутантный фолатный рецептор, при этом закодированный мутантный фолатный рецептор имеет аминокислотную замену в положении, соответствующем структурно или по гомологии аминокислотных последовательностей аминокислоте 49 последовательности зрелого человеческого фолатного рецептора альфа дикого типа (SEQ ID NO 1), при этом аланин, присутствующий в последовательности дикого типа в указанном положении, заменен лейцином;
b) по меньшей мере одну экспрессионную кассету, содержащую полинуклеотид, кодирующий интересующий полипептид; и
c) экспрессионную кассету, содержащую полинуклеотид, кодирующий дигидрофолатредуктазу в качестве селективного маркера.
11. Клетка-хозяин, жизнеспособность которой зависит от поглощения фолатов, содержащая
a) введенный полинуклеотид, кодирующий мутантный фолатный рецептор, имеющий сниженную аффинность связывания фолата по сравнению с фолатным рецептором дикого типа, в качестве селективного маркера,
и
b) по меньшей мере один введенный полинуклеотид, кодирующий интересующий полипептид,
при этом указанный интересующий полипептид секретируется из указанной клетки-хозяина.
12. Клетка-хозяин по п. 11, отличающаяся тем, что мутантный фолатный рецептор имеет одну или более из следующих характеристик:
a) он имеет аминокислотную замену в положении, соответствующем структурно или по гомологии аминокислотных последовательностей аминокислоте 49 последовательности зрелого человеческого фолатного рецептора альфа дикого типа (SEQ ID NO 1), при этом аланин, присутствующий в последовательности дикого типа, заменен аминокислотой, выбранной из группы, состоящей из лейцина, глицина, валина, изолейцина, гистидина и аспарагиновой кислоты, или при этом аланин, присутствующий в последовательности дикого типа в положении 49, заменен лейцином;
b) зрелый мутантный фолатный рецептор содержит:
(i) следующую последовательность
IAWARTELLNVCMNAKHHKEKPGPEDKLHEQCRPWRKNACCSTNTSQEXaaHKDVSYLYRFNWNHCGEMAPACKRHFIQDTCLYECSPNLGPWIQQVDQSWRKERVLNVPLCKEDCEQWWEDCRTSYTCKSNWHKGWNWTSGFNKCAVGAACQPFHFYFPTPTVLCNEIWTHSYKVSNYSRGSGRCIQMWFDPAQGNPNEEVARFYA (SEQ ID NO 9)
где Xaa не является аланином и где, необязательно, Xaa является аминокислотой, выбранной из лейцина, глицина, валина, изолейцина, гистидина и аспарагиновой кислоты, или является лейцином;
или
(ii) зрелый мутантный фолатный рецептор содержит аминокислотную последовательность, имеющую идентичность последовательности по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% с последовательностью, приведенной в SEQ ID NO 9, и при этом Xaa не является аланином в указанном мутантном фолатном рецепторе, при этом аффинность связывания фолата у указанного мутантного фолатного рецептора снижена по сравнению с последовательностью зрелого человеческого фолатного рецептора альфа дикого типа, где Xaa является аланином (смотри SEQ ID NO 1), и при этом, необязательно, Xaa является аминокислотой, выбранной из лейцина, глицина, валина, изолейцина, гистидина и аспарагиновой кислоты, или является лейцином.
c) он содержит:
(i) последовательность
IAWARTELLNVCMNAKHHKEKPGPEDKLHEQCRPWRKNACCSTNTSQEXaaHKDVSYLYRFNWNHCGEMAPACKRHFIQDTCLYECSPNLGPWIQQVDQSWRKERVLNVPLCKEDCEQWWEDCRTSYTCKSNWHKGWNWTSGFNKCAVGAACQPFHFYFPTPTVLCNEIWTHSYKVSNYSRGSGRCIQMWFDPAQGNPNEEVARFYAAAMSGAGPWAAWPFLLSLALMLLWLLS (SEQ ID NO 13)
где Xaa является лейцином;
или
(ii) аминокислотную последовательность, которая имеет идентичность последовательности по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% с последовательностью, приведенной в SEQ ID NO 13, где Xaa является лейцином, и при этом аффинность связывания указанного мутантного фолатного рецептора для 6S диастереоизомера 5-метилтетрагидрофолата снижена по сравнению с последовательностью зрелого человеческого фолатного рецептора альфа дикого типа, где Xaa является аланином (смотри SEQ ID NO 1).
13. Клетка-хозяин по п. 12, содержащая экспрессионный вектор или сочетание по меньшей мере двух экспрессионных векторов, содержащие:
a) экспрессионную кассету, содержащую полинуклеотид, кодирующий мутантный фолатный рецептор, при этом закодированный мутантный фолатный рецептор имеет аминокислотную замену в положении, соответствующем структурно или по гомологии аминокислотных последовательностей аминокислоте 49 последовательности зрелого человеческого фолатного рецептора альфа дикого типа (SEQ ID NO 1), при этом аланин, присутствующий в последовательности дикого типа в указанном положении, заменен лейцином;
b) по меньшей мере одну экспрессионную кассету, содержащую полинуклеотид, кодирующий интересующий полипептид; и
c) экспрессионную кассету, содержащую полинуклеотид, кодирующий дигидрофолатредуктазу в качестве селективного маркера.
14. Клетка-хозяин по п. 11, имеющая одну или более из следующих характеристик:
a) она представляет собой клетку млекопитающего;
b) она представляет собой клетку грызуна;
c) она представляет собой клетку CHO;
d) она экспрессирует эндогенный фолатный рецептор;
e) она содержит введенный полинуклеотид, кодирующий селективный маркер, участвующий в метаболизме фолата, который, необязательно, представляет собой дигидрофолатредуктазу; и/или
f) введенные полинуклеотиды стабильно интегрированы в геном.
15. Способ селекции по меньшей мере одной клетки-хозяина, способной экспрессировать интересующий полипептид с желаемым выходом, включающий
a) получение множества клеток-хозяев по п. 11;
b) культивирование указанного множества клеток-хозяев в селективной культуральной среде, содержащей фолат в ограниченной концентрации;
и
c) получение по меньшей мере одной клетки-хозяина, экспрессирующей интересующий полипептид.
16. Способ по п. 15, имеющий одну или более из следующих характеристик:
i) выполняют один или более циклов селекции, включающих этапы b) и c);
ii) после этапа c) клетки культивируют в культуральной среде, содержащей не ограниченную концентрацию фолата, а затем вновь культивируют в соответствии с этапом b) и получают в соответствии с этапом c);
iii) выполняют один или более дополнительных этапов селекции до и/или после выполнения этапа b) и/или c), при этом указанные один или более дополнительных этапов селекции выбирают из селекции на основе метода проточной цитометрии и селекции на один или более дополнительных селективных маркеров, введенных в клетку-хозяина;
iv) клетки-хозяева стабильно трансфицированы; и/или
v) выбранные клетки-хозяева рекомбинантно экспрессируют и секретируют молекулу иммуноглобулина.
17. Способ получения интересующего полипептида, включающий
a) культивирование клетки-хозяина по п. 11 в условиях, допускающих экспрессию и секрецию интересующего полипептида;
b) выделение интересующего полипептида из среды для культивирования клеток, и
c) необязательно, обработку выделенного интересующего полипептида.
18. Способ по п. 17, отличающийся тем, что клетка-хозяин содержит введенный полинуклеотид, кодирующий мутантный фолатный рецептор, имеющий сниженную аффинность связывания фолата по сравнению с фолатным рецептором дикого типа, в качестве селективного маркера,
при этом указанный мутантный фолатный рецептор имеет одну или более из следующих характеристик:
a) он имеет аминокислотную замену в положении, соответствующем структурно или по гомологии аминокислотных последовательностей аминокислоте 49 последовательности зрелого человеческого фолатного рецептора альфа дикого типа (SEQ ID NO 1), при этом аланин, присутствующий в последовательности дикого типа, заменен аминокислотой, выбранной из группы, состоящей из лейцина, глицина, валина, изолейцина, гистидина и аспарагиновой кислоты, или при этом аланин, присутствующий в последовательности дикого типа в положении 49, заменен лейцином;
b) зрелый мутантный фолатный рецептор содержит:
(i) следующую последовательность
IAWARTELLNVCMNAKHHKEKPGPEDKLHEQCRPWRKNACCSTNTSQEXaaHKDVSYLYRFNWNHCGEMAPACKRHFIQDTCLYECSPNLGPWIQQVDQSWRKERVLNVPLCKEDCEQWWEDCRTSYTCKSNWHKGWNWTSGFNKCAVGAACQPFHFYFPTPTVLCNEIWTHSYKVSNYSRGSGRCIQMWFDPAQGNPNEEVARFYA (SEQ ID NO 9)
где Xaa не является аланином и где, необязательно, Xaa является аминокислотой, выбранной из лейцина, глицина, валина, изолейцина, гистидина и аспарагиновой кислоты, или является лейцином;
или
(ii) зрелый мутантный фолатный рецептор содержит аминокислотную последовательность, имеющую идентичность последовательности по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% с последовательностью, приведенной в SEQ ID NO 9, и при этом Xaa не является аланином в указанном мутантном фолатном рецепторе, при этом аффинность связывания фолата у указанного мутантного фолатного рецептора снижена по сравнению с последовательностью зрелого человеческого фолатного рецептора альфа дикого типа, где Xaa является аланином (смотри SEQ ID NO 1), и при этом, необязательно, Xaa является аминокислотой, выбранной из лейцина, глицина, валина, изолейцина, гистидина и аспарагиновой кислоты, или является лейцином.
c) он содержит:
(i) последовательность
IAWARTELLNVCMNAKHHKEKPGPEDKLHEQCRPWRKNACCSTNTSQEXaaHKDVSYLYRFNWNHCGEMAPACKRHFIQDTCLYECSPNLGPWIQQVDQSWRKERVLNVPLCKEDCEQWWEDCRTSYTCKSNWHKGWNWTSGFNKCAVGAACQPFHFYFPTPTVLCNEIWTHSYKVSNYSRGSGRCIQMWFDPAQGNPNEEVARFYAAAMSGAGPWAAWPFLLSLALMLLWLLS (SEQ ID NO 13)
где Xaa является лейцином;
или
(ii) аминокислотную последовательность, которая имеет идентичность последовательности по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% с последовательностью, приведенной в SEQ ID NO 13, где Xaa является лейцином, и при этом аффинность связывания указанного мутантного фолатного рецептора для 6S диастереоизомера 5-метилтетрагидрофолата снижена по сравнению с последовательностью зрелого человеческого фолатного рецептора альфа дикого типа, где Xaa является аланином (смотри SEQ ID NO 1).
19. Способ по п. 18, отличающийся тем, что клетка-хозяин содержит экспрессионный вектор или сочетание по меньшей мере двух экспрессионных векторов, содержащие:
a) экспрессионную кассету, содержащую полинуклеотид, кодирующий мутантный фолатный рецептор, при этом закодированный мутантный фолатный рецептор имеет аминокислотную замену в положении, соответствующем структурно или по гомологии аминокислотных последовательностей аминокислоте 49 последовательности зрелого человеческого фолатного рецептора альфа дикого типа (SEQ ID NO 1), при этом аланин, присутствующий в последовательности дикого типа в указанном положении, заменен лейцином;
b) по меньшей мере одну экспрессионную кассету, содержащую полинуклеотид, кодирующий интересующий полипептид; и
c) экспрессионную кассету, содержащую полинуклеотид, кодирующий дигидрофолатредуктазу в качестве селективного маркера.
20. Способ по п. 17, отличающийся тем, что клетка-хозяин имеет одну или более из следующих характеристик:
a) она представляет собой клетку млекопитающего;
b) она представляет собой клетку грызуна;
c) она представляет собой клетку CHO;
d) она экспрессирует эндогенный фолатный рецептор;
e) она содержит введенный полинуклеотид, кодирующий селективный маркер, участвующий в метаболизме фолата, который, необязательно, представляет собой дигидрофолатредуктазу; и/или
f) введенные полинуклеотиды стабильно интегрированы в геном.
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US201361860439P | 2013-07-31 | 2013-07-31 | |
US61/860,439 | 2013-07-31 | ||
PCT/IB2014/063517 WO2015015419A1 (en) | 2013-07-31 | 2014-07-29 | Novel selection vectors and methods of selecting eukaryotic host cells |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2016106270A true RU2016106270A (ru) | 2017-08-31 |
RU2016106270A3 RU2016106270A3 (ru) | 2018-04-27 |
RU2716977C2 RU2716977C2 (ru) | 2020-03-17 |
Family
ID=51383909
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2016106270A RU2716977C2 (ru) | 2013-07-31 | 2014-07-29 | Новые селективные векторы и способы селекции эукариотических клеток-хозяев |
Country Status (19)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US11807855B2 (ru) |
EP (3) | EP4095153A1 (ru) |
JP (1) | JP6576924B2 (ru) |
KR (1) | KR102288233B1 (ru) |
CN (2) | CN112029791A (ru) |
AU (1) | AU2014297966B2 (ru) |
BR (1) | BR112016001182A2 (ru) |
CA (1) | CA2918117C (ru) |
DK (2) | DK3027646T3 (ru) |
ES (2) | ES2920510T3 (ru) |
HU (1) | HUE058885T2 (ru) |
IL (1) | IL243352B (ru) |
LT (2) | LT3412684T (ru) |
MX (1) | MX369109B (ru) |
PL (2) | PL3412684T3 (ru) |
PT (2) | PT3027646T (ru) |
RU (1) | RU2716977C2 (ru) |
SG (1) | SG11201510625TA (ru) |
WO (1) | WO2015015419A1 (ru) |
Families Citing this family (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP2401377B1 (en) | 2009-02-27 | 2016-05-18 | Novartis AG | Expression vector system comprising two selection markers |
AU2014297966B2 (en) | 2013-07-31 | 2017-10-26 | Novartis Ag | Novel selection vectors and methods of selecting eukaryotic host cells |
EP3521435A1 (en) | 2018-02-06 | 2019-08-07 | Bayer AG | A high stringency selection system for protein expression in proline-auxotrophic cells |
EP3847271A4 (en) * | 2018-09-07 | 2022-10-12 | MedImmune, LLC | CELL SELECTION METHODS |
US20220348632A1 (en) | 2019-09-18 | 2022-11-03 | Novartis Ag | Nkg2d fusion proteins and uses thereof |
JP2023550459A (ja) | 2020-11-23 | 2023-12-01 | ノバルティス アーゲー | 抗体構築物の発現技術 |
JP2024517711A (ja) | 2021-04-29 | 2024-04-23 | ノバルティス アーゲー | 高シアル酸付加細胞 |
WO2023122567A1 (en) * | 2021-12-21 | 2023-06-29 | Absci Corporation | Fola selection assay to identify strains with increased soluble target protein expression |
Family Cites Families (25)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4771036A (en) | 1986-02-10 | 1988-09-13 | Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Method and ophthalmic composition for the prevention and reversal of cataracts |
JP2585532B2 (ja) | 1986-05-10 | 1997-02-26 | 三井東圧化学株式会社 | 動物細胞の形質転換体及びそれを得る方法並びにその形質転換体を用いてt−PAを生産する方法 |
JP3150340B2 (ja) | 1990-11-13 | 2001-03-26 | イムネクス コーポレイション | 二機能選択可能融合遺伝子 |
AU660671B2 (en) | 1991-03-29 | 1995-07-06 | Genentech Inc. | Methods for selection of recombinant host cells expressing high levels of a desired protein |
AU6953394A (en) | 1993-05-21 | 1994-12-20 | Targeted Genetics Corporation | Bifunctional selectable fusion genes based on the cytosine deaminase (cd) gene |
US5439808A (en) | 1993-07-23 | 1995-08-08 | North American Vaccine, Inc. | Method for the high level expression, purification and refolding of the outer membrane group B porin proteins from Neisseria meningitidis |
US5830698A (en) | 1997-03-14 | 1998-11-03 | Idec Pharmaceuticals Corporation | Method for integrating genes at specific sites in mammalian cells via homologous recombination and vectors for accomplishing the same |
US6106825A (en) | 1997-05-07 | 2000-08-22 | University Of Florida | Entomopoxvirus-vertebrate gene delivery vector and method |
FR2784030B1 (fr) | 1998-10-02 | 2002-12-20 | Inst Nat Sante Rech Med | Utilisation de bloqueurs des canaux calciques et/ou cgmp-dependants pour le traitement de pathologies de la retine |
FR2823221B1 (fr) | 2001-04-06 | 2004-04-02 | Univ Pasteur | Sequences associees a la degenerescence retinienne et applications |
US7384744B2 (en) | 2002-11-29 | 2008-06-10 | Boehringer Ingelheim Pharma Gmbh & Co., Kg | Expression vector, methods for the production of heterologous gene products and for the selection of recombinant cells producing high levels of such products |
DE10256083A1 (de) | 2002-11-29 | 2004-08-12 | Boehringer Ingelheim Pharma Gmbh & Co. Kg | Expressionsvektor, Verfahren zur Herstellung von heterologen Genprodukten und Selektionsverfahren für hochproduzierende rekombinante Zellen |
EA010096B1 (ru) | 2003-03-11 | 2008-06-30 | Лаборатуар Сероно Са | Экспрессирующие векторы, содержащие ie2-промотор mcmv |
EP1716233B1 (en) | 2004-01-30 | 2009-08-26 | Maxygen Holdings Ltd. | Regulated stop codon readthrough |
US20060275794A1 (en) | 2005-03-07 | 2006-12-07 | Invitrogen Corporation | Collections of matched biological reagents and methods for identifying matched reagents |
CN101389763B (zh) | 2006-02-21 | 2013-01-23 | 科罗迈吉尼科斯公司 | 高水平表达蛋白质的宿主细胞的选择 |
AU2007251766B2 (en) | 2006-05-17 | 2013-06-20 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Polypeptide producing cells |
BRPI0821311B1 (pt) | 2007-12-21 | 2018-09-18 | Novartis Ag | Ácido nucleico de vetor linearizado, método para produção de uma célula hospedeira de mamífero compreendendo o referido ácido, e método para produção de um polipetídeode interesse |
CN103805633B (zh) | 2007-12-21 | 2016-09-07 | 诺华股份有限公司 | 有机化合物 |
CA2734340C (en) | 2008-08-28 | 2019-03-05 | Novartis Ag | Cell surface display of polypeptide isoforms by stop codon readthrough |
ES2548980T3 (es) | 2008-09-10 | 2015-10-22 | Inserm - Institut National De La Santé Et De La Recherche Médicale | Factor de viabilidad neuronal y uso del mismo |
EP2401377B1 (en) | 2009-02-27 | 2016-05-18 | Novartis AG | Expression vector system comprising two selection markers |
CN102333875B (zh) | 2009-02-27 | 2014-04-16 | 诺华股份有限公司 | 选择表达异源蛋白质的真核细胞的方法 |
CN102030754B (zh) * | 2009-09-28 | 2013-07-10 | 中国科学院微生物研究所 | 非病毒载体及其制备方法与应用 |
AU2014297966B2 (en) | 2013-07-31 | 2017-10-26 | Novartis Ag | Novel selection vectors and methods of selecting eukaryotic host cells |
-
2014
- 2014-07-29 AU AU2014297966A patent/AU2014297966B2/en active Active
- 2014-07-29 PT PT14753158T patent/PT3027646T/pt unknown
- 2014-07-29 HU HUE18179678A patent/HUE058885T2/hu unknown
- 2014-07-29 ES ES18179678T patent/ES2920510T3/es active Active
- 2014-07-29 WO PCT/IB2014/063517 patent/WO2015015419A1/en active Application Filing
- 2014-07-29 EP EP22166577.1A patent/EP4095153A1/en not_active Withdrawn
- 2014-07-29 EP EP14753158.6A patent/EP3027646B1/en active Active
- 2014-07-29 ES ES14753158.6T patent/ES2689136T3/es active Active
- 2014-07-29 BR BR112016001182A patent/BR112016001182A2/pt not_active Application Discontinuation
- 2014-07-29 PT PT181796780T patent/PT3412684T/pt unknown
- 2014-07-29 EP EP18179678.0A patent/EP3412684B1/en active Active
- 2014-07-29 PL PL18179678.0T patent/PL3412684T3/pl unknown
- 2014-07-29 CN CN202010947233.8A patent/CN112029791A/zh active Pending
- 2014-07-29 KR KR1020167002307A patent/KR102288233B1/ko active IP Right Grant
- 2014-07-29 US US14/907,866 patent/US11807855B2/en active Active
- 2014-07-29 MX MX2016001396A patent/MX369109B/es active IP Right Grant
- 2014-07-29 SG SG11201510625TA patent/SG11201510625TA/en unknown
- 2014-07-29 DK DK14753158.6T patent/DK3027646T3/en active
- 2014-07-29 DK DK18179678.0T patent/DK3412684T3/da active
- 2014-07-29 LT LTEP18179678.0T patent/LT3412684T/lt unknown
- 2014-07-29 CA CA2918117A patent/CA2918117C/en active Active
- 2014-07-29 LT LTEP14753158.6T patent/LT3027646T/lt unknown
- 2014-07-29 RU RU2016106270A patent/RU2716977C2/ru active
- 2014-07-29 CN CN201480054263.9A patent/CN105593239B/zh active Active
- 2014-07-29 PL PL14753158T patent/PL3027646T3/pl unknown
- 2014-07-29 JP JP2016530647A patent/JP6576924B2/ja active Active
-
2015
- 2015-12-24 IL IL243352A patent/IL243352B/en active IP Right Grant
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
RU2016106270A (ru) | Новые селективные векторы и способы селекции эукариотических клеток-хозяев | |
JP2016525366A5 (ru) | ||
HRP20190970T1 (hr) | Polipeptidi koji sadrže neglikozilirani fc | |
RU2016144409A (ru) | Снижение превращения никотина в норникотин в растениях | |
RU2007141683A (ru) | Вариантная форма урат-оксидазы и ее использование | |
GB201201178D0 (en) | Novel enzymes | |
MX2013013644A (es) | Peptidos de transito al cloroplasto y metodos de uso. | |
WO2006007373A3 (en) | Polynucleotides encoding mature ahasl proteins for creating imidazolinone-tolerant plants | |
RU2016123135A (ru) | Отличные от человека животные, содержащие гуманизированный ген индуцирующего пролиферацию лиганда | |
RU2014145441A (ru) | Векторы | |
RU2011142793A (ru) | Полученная из микроорганизма протеаза усовершенствованного типа, обеспечивающая свертывание молока | |
SA521422495B1 (ar) | مستضدات البروستاتا المستحدثة واستخداماتها | |
RU2016108976A (ru) | С5-связующие полипептиды | |
EP2589658A4 (en) | PARTICLE POLYPEPTIDE OF THE REIC / DKK-3 PROTEIN | |
PH12017502080A1 (en) | Epidermal growth factor receptor variant iii-mesothelin fusions and methods of using the same | |
JP2020509755A5 (ru) | ||
RU2014144881A (ru) | Способ экспрессии полипептидов с применением модифицированных нуклеиновых кислот | |
JP2011509093A5 (ru) | ||
RU2015105052A (ru) | Выделение мутантов белка доставки лекарственного средства, усиливающих направленную миграцию | |
RU2014129220A (ru) | Новый аттенуированный полиовирус: pv-1 mono-cre-x | |
JP2017525368A5 (ru) | ||
WO2015077538A3 (en) | Nucleotide sequence encoding homeobox-leucine zipper protein hat22 (hd-zip protein 22) from corchorus olitorius and corchorus capsularis and methods of use | |
JPWO2020045472A5 (ru) | ||
JP2016158578A5 (ru) | ||
JP2009513150A5 (ru) |