ES2920510T3

ES2920510T3 - Vectores de selección novedosos y métodos para seleccionar células hospedadoras eucariotas

Info

Publication number: ES2920510T3
Application number: ES18179678T
Authority: ES
Inventors: Yehuda G Assaraf; Thomas Jostock; Hans-Peter Knopf
Original assignee: Novartis AG
Current assignee: Novartis AG
Priority date: 2013-07-31
Filing date: 2014-07-29
Publication date: 2022-08-04
Anticipated expiration: 2034-07-29
Also published as: SG11201510625TA; US20160177318A1; LT3027646T; IL243352A0; ES2689136T3; JP2016525366A; DK3027646T3; EP3027646B1; MX2016001396A; MX369109B; KR102288233B1; RU2016106270A; CN105593239A; KR20160030524A; EP3027646A1; RU2716977C2; PL3412684T3; JP6576924B2; RU2016106270A3; PT3027646T

Abstract

La divulgación se refiere a un vector de expresión o una combinación de al menos dos vectores de expresión que comprenden: A) Un polinucleótido que codifica un receptor de folato mutado como marcador seleccionable, en el que el receptor de folato mutado tiene una disminución de la afinidad de unión al folato en comparación con el receptor de folato de tipo salvaje; b) Al menos un polinucleótido que codifica un polipéptido de interés, en el que cuando dicho vector de expresión o combinación de al menos dos vectores de expresión se introduce en una célula huésped, el polipéptido de interés se secreta de dicha célula huésped. También se proporcionan células huésped adecuadas, métodos de selección y métodos para producir polipéptidos con alto rendimiento. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Vectores de selección novedosos y métodos para seleccionar células hospedadoras eucariotas

Campo de la divulgación

La presente divulgación se refiere a un sistema de selección novedoso que se basa en el uso de un receptor de folato mutado como marcador seleccionable para la selección de células hospedadoras, en particular, células hospedadoras de mamífero, que expresan un polipéptido de interés. La invención proporciona vectores de expresión adecuados, células hospedadoras y métodos para seleccionar células hospedadoras que expresan un polipéptido recombinante de interés con un rendimiento elevado. Además, la presente invención se refiere a un método para producir de manera eficaz polipéptidos recombinantes con un rendimiento elevado.

ANTECEDENTES DE LA DIVULGACIÓN

La capacidad de clonar y expresar productos de interés tales como péptidos y proteínas recombinantes en grandes cantidades se ha vuelto cada vez más importante. La capacidad para purificar niveles elevados de proteínas es importante en el campo biotecnológico y farmacéutico humano, por ejemplo, para producir fármacos proteínicos así como en el ámbito de la investigación básica, por ejemplo, para cristalizar proteínas con el fin de poder determinar su estructura tridimensional. Las proteínas que de otro modo son difíciles de obtener en cantidad se pueden sobreexpresar en una célula hospedadora, y posteriormente aislar y purificar.

La elección de un sistema de expresión para la producción de proteínas recombinantes depende de muchos factores, que incluyen las características de crecimiento celular, los niveles de expresión, la expresión intracelular y extracelular, las modificaciones postraduccionales y la actividad biológica de la proteína de interés, así como cuestiones normativas y consideraciones económicas en la producción de proteínas terapéuticas. Las principales ventajas de las células de mamífero frente a otros sistemas de expresión tales como bacterias o levaduras son la capacidad para llevar a cabo un plegamiento proteínico correcto, N-glucosilación compleja y O-glucosilación auténtica, así como un amplio espectro de otras modificaciones postraduccionales. Debido a las ventajas descritas, las células eucariotas y, en particular de mamífero son en la actualidad el sistema de expresión preferido para producir proteínas terapéuticas complejas tales como anticuerpos monoclonales.

La estrategia más habitual para obtener células hospedadoras con una expresión elevada (también denominadas grandes productoras) genera un vector de expresión apropiado para expresar el polipéptido de interés como un primer paso. El vector de expresión impulsa la expresión del polinucleótido que codifica el polipéptido de interés en la célula hospedadora y proporciona al menos un marcador seleccionable para generar la línea celular recombinante.

Un procedimiento consolidado para obtener líneas celulares con producción elevada que expresan el polipéptido de interés con un rendimiento elevado es la transfección estable de las células hospedadoras. El polipéptido de interés se secreta a continuación en el medio de cultivo y se puede obtener en grandes cantidades a partir de este. Sin embargo, la integración estable en el genoma es un evento infrecuente y solo un pequeño subconjunto de células transfectadas de manera estable son grandes productoras.

Los marcadores de selección y los sistemas de selección se utilizan ampliamente con el fin de obtener células hospedadoras que expresan un polipéptido de interés con un rendimiento elevado. Los sistemas respectivos también son útiles para generar e identificar clones transfectados de manera estable. El objetivo principal de utilizar los respectivos marcadores de selección y sistemas de selección es introducir un gen seleccionable el cual tras la exposición a condiciones de cultivo selectivas permita la identificación de células capaces de producir en niveles elevados el producto recombinante de interés. Los marcadores seleccionables consolidados incluyen, por ejemplo, la dihidrofolato-reductasa (DHFR) o glutamina-sintetasa (GS).

Otro sistema de selección se basa en el sistema de selección del portador de folato reducido. El portador de folato reducido (RFC, por sus siglas en inglés) es una glucoproteína de membrana expresada de forma ubicua que actúa como el transportador principal para la captación de folatos reducidos tales como 5-metil-THF y 5-formil-THF. Sin embargo, el RFC presenta una afinidad muy baja por el folato oxidado, ácido fólico. Así pues, las células que carecen de la expresión de RFC o en las que se ha eliminado el locus genómico de RFC pueden actuar como receptores para la transfección del gen marcador seleccionable RFC en condiciones en las que los folatos reducidos tales como 5-formil-THF se eliminan gradualmente del medio de cultivo para forzar de esta manera a que las células expresen niveles elevados de este transportador de folato. Existen varias desventajas para el sistema de selección de RFC: a) es necesario utilizar células receptoras con supresión de RFC en las que el locus endógeno de RFC se ha eliminado o inactivado mediante eliminación dirigida o mutaciones amórficas. b) RFC tiene una afinidad de transporte extremadamente baja por el ácido fólico y, por lo tanto, no se puede utilizar este folato oxidado para la selección. c) A diferencia del sistema basado en el receptor de folato (véase más adelante) que es un sistema de captación de folato unidireccional, RFC es un transportador de folato bidireccional que muestra una importación y exportación de folatos igual de potentes. Esto implica que en las condiciones de privación de folato, la sobreexpresión de RFC puede ser perjudicial para las células receptoras que exportan además folato mediante el RFC sobreexpresado.

Un sistema de selección adicional que se ha propuesto recientemente se basa en el uso de un receptor de folato tal como el receptor de folato alfa como marcador seleccionable. Este sistema se describe en el documento WO2009/080759. Este sistema tiene varias ventajas en el sentido de que para la selección no se necesitan sustancias tóxicas y además no es necesario eliminar el receptor de folato endógeno de la célula hospedadora. En el documento WO 2010/097240 se describen un sistema de selección adicional que se basa en el uso del receptor de folato como marcador seleccionable.

Los receptores de folato y mutantes de estos se describen, por ejemplo, en Shen et al. "Identification of amino acid residues that determine the differential ligand specificities of folate receptors alpha and beta" (Biochemistry 1997, 36, 6157 6163). También se describen mutaciones en el receptor de folato alfa asociado con trastornos médicos. Las posiciones aminoacídicas en los receptores de folato también se analizaron en Ramamoorthy et al. "In silico analysis of functionally important residues in folate receptors" (Bioinformation 2 (4): 157-162 (2007)).

En Maziarz et al. "Complete mapping of divergent amino acids responsible for differential ligand binding of folate receptors a and p" (Journal of Biological Chemistry 274 (16):11086-11091 (1999)) se proporciona un cartografiado de los aminoácidos divergentes responsables de la unión diferencial al ligando de los receptores de folato a y p.

Un sistema de selección de rigurosidad elevada es crucial para seleccionar y, por lo tanto, generar un enriquecimiento en células con producción elevada a partir de la población transfectada. Cuanto mayor sea la rigurosidad del sistema de selección, menor será el número de bajos productores después del proceso de selección y mayor la probabilidad de detectar los clones sobreproductores muy infrecuentes. Además, resulta muy necesario proporcionar un sistema de selección que permita obtener los clones con producción elevada con rapidez mayor que la de los métodos de la técnica anterior.

Es el objeto de la presente invención proporcionar un sistema de selección riguroso para la selección de células hospedadoras que producen un polipéptido de interés con un rendimiento elevado, así como vectores de expresión y células hospedadoras adecuados. En particular, es el objetivo de la presente invención proporcionar un sistema de selección novedoso que tenga ciertas ventajas respecto a los sistemas de selección de la técnica anterior mencionados anteriormente.

COMPENDIO DE LA DIVULGACIÓN

La presente invención se define mediante las reivindicaciones adjuntas.

En consecuencia, la presente invención proporciona un vector de expresión o una combinación de al menos dos vectores de expresión que comprende:

a) un polinucleótido que codifica un receptor de folato mutado como marcador seleccionable, donde el receptor de folato mutado es un receptor de folato unido a la membrana funcional que tiene una afinidad de unión al folato menor en comparación con el receptor de folato no modificado y donde el receptor de folato mutado codificado comprende una sustitución de aminoácidos en la posición correspondiente desde un punto de vista estructural o según homología con la secuencia de aminoácidos al aminoácido 49 de la secuencia del receptor de folato alfa humano no modificado maduro como se muestra en la SEQ ID NO 1 donde la alanina presente en la secuencia no modificada es sustituida por un aminoácido que da como resultado una afinidad de unión al folato menor; y

b) al menos un polinucleótido que codifica un polipéptido de interés,

donde cuando dicho vector de expresión o combinación de al menos dos vectores de expresión se introduce en una célula hospedadora, el polipéptido de interés es secretado a partir de dicha célula hospedadora.

En consecuencia, la presente invención proporciona además una célula hospedadora cuya viabilidad depende de la captación de folato de acuerdo con la reivindicación 10, un método para producir una célula hospedadora de acuerdo con la reivindicación 13, un método para seleccionar al menos una célula hospedadora capaz de expresar un polipéptido de interés con un rendimiento deseado de acuerdo con la reivindicación 14, un proceso para producir un polipéptido de interés de acuerdo con la reivindicación 16, un uso de un polipéptido de acuerdo con la reivindicación 17 y un uso de un polipéptido de acuerdo con la reivindicación 18.

La presente divulgación se refiere a un sistema de selección que es adecuado para seleccionar células hospedadoras que expresan un polipéptido de interés con un rendimiento elevado. Dicho sistema de selección se basa en el uso de un receptor de folato unido a la membrana funcional mutado como marcador seleccionable. Entre otros, dicho sistema de selección permite una selección más rigurosa y más rápida de los grandes productores que un sistema de selección que utiliza un receptor de folato unido a la membrana funcional no modificado correspondiente como marcador seleccionable.

Se divulgan los siguientes aspectos:

De acuerdo con un primer aspecto, la presente divulgación proporciona un vector de expresión o una combinación de al menos dos vectores de expresión que comprende:

a) un polinucleótido que codifica un receptor de folato mutado como marcador seleccionable, donde el receptor de folato mutado tiene una afinidad de unión al folato menor en comparación con el receptor de folato no modificado y b) al menos un polinucleótido que codifica un polipéptido de interés,

De acuerdo con un segundo aspecto, la presente divulgación se refiere a una célula hospedadora cuya viabilidad depende de la captación de folato que comprende

a) un polinucleótido introducido que codifica un receptor de folato mutado que tiene una afinidad de unión al folato menor en comparación con el receptor de folato no modificado como marcador seleccionable

y

b) al menos un polinucleótido introducido que codifica un polipéptido de interés

donde dicho polipéptido de interés se secreta a partir de dicha célula hospedadora.

De acuerdo con un tercer aspecto, la presente divulgación se refiere a un método para producir una célula hospedadora de acuerdo con el segundo aspecto de la presente divulgación, que comprende el paso de introducir en una célula hospedadora cuya viabilidad depende de la captación de folato al menos

a) un polinucleótido que codifica un receptor de folato mutado que tiene una afinidad de unión al folato menor en comparación con el receptor de folato no modificado como marcador seleccionable

y

b) al menos un polinucleótido que codifica un polipéptido de interés, donde el polipéptido de interés se secreta a partir de dicha célula hospedadora.

De acuerdo con un cuarto aspecto, la presente divulgación proporciona un método para seleccionar al menos una célula hospedadora capaz de expresar un polipéptido de interés, que comprende

a) proporcionar una pluralidad de células hospedadoras de acuerdo con el segundo aspecto;

b) cultivar dicha pluralidad de células hospedadoras en un medio de cultivo selectivo que comprenda folato en una concentración limitante;

y

c) obtener al menos una célula hospedadora que expresa el polipéptido de interés.

De acuerdo con un quinto aspecto, la presente divulgación se refiere a un proceso para producir un polipéptido de interés, que comprende

a) cultivar una célula hospedadora de acuerdo con el segundo aspecto y/o una célula hospedadora seleccionada de acuerdo con el cuarto aspecto en condiciones que permitan la expresión y secreción del polipéptido de interés; b) aislar el polipéptido de interés a partir del medio de cultivo celular y

c) opcionalmente procesar adicionalmente el polipéptido de interés aislado.

De acuerdo con un sexto aspecto, la presente divulgación se refiere al uso de un polinucleótido que codifica a) un receptor de folato mutado que comprende la siguiente secuencia

lAWARTELLNVCMNAKHHKEKPGPEDKLHEQCRPWRKNACCSTNTSQEXaaHKDVSYLYR FNWNHCGEMAPACKRHFIQDTCLYECSPNLGPWIQQVDQSWRKERVLNVPLCKEDCEQW WEDCRTSYTCKSNWHKGWNWTSGFNKCAVGAACQPFHFYFPTPTVLCNEIWTHSYKVSN YSRGSGRCIQMWFDPAQGNPNEEVARFYA (SEQ ID NO 9)

donde Xaa no es alanina y donde la afinidad de unión al folato del receptor de folato mutado es menor en comparación con el correspondiente receptor de folato no modificado donde Xaa es alanina (SEQ ID NO 1),

o

b) un receptor de folato mutado que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad secuencial de al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 96 %, al menos un 97 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % respecto a la secuencia mostrada como SEQ ID NO 9, y donde Xaa no es alanina en dicho receptor de folato mutado y donde la afinidad de unión al folato de dicho receptor de folato mutado es menor en comparación con la secuencia del receptor de folato alfa humano no modificado maduro donde Xaa es alanina (véase la SEQ ID NO 1),

como marcador seleccionable para seleccionar células, cuya viabilidad depende de la captación de folato.

De acuerdo con un séptimo aspecto la presente divulgación se refiere al uso de un polinucleótido que codifica a) un receptor de folato mutado que comprende la siguiente secuencia lAWARTELLNVCMNAKHHKEKPGPEDKLHEQCRPWRKNACCSTNTSQEXaaHKDVSYLYR FNWNHCGEMAPACKRHFIQDTCLYECSPNLGPWIQQVDQSWRKERVLNVPLCKEDCEQW WEDCRTSYTCKSNWHKGWNWTSGFNKCAVGAACQPFHFYFPTPTVLCNEIWTHSYKVSN YSRGSGRCIQMWFDPAQGNPNEEVARFYA (SEQ ID NO 9)

donde Xaa es leucina;

o

b) un receptor de folato mutado que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad secuencial de al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 96 %, al menos un 97 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % respecto a la secuencia mostrada como SEQ ID NO 9, y donde Xaa es leucina en dicho receptor de folato mutado de acuerdo con b),

como marcador seleccionable para seleccionar células cuya viabilidad depende de la captación de folato. Como se muestra en los ejemplos, un receptor de folato mutado respectivo es un marcador seleccionable riguroso y muy eficaz, que también permite seleccionar células hospedadoras que expresan el marcador seleccionable respectivo más rápidamente que el receptor de folato no modificado.

Otros objetos, características, ventajas y aspectos de la presente solicitud se volverán evidentes para los expertos en la técnica a partir de la siguiente descripción y las reivindicaciones adjuntas.

DESCRIPCIÓN BREVE DE LAS FIGURAS

Las Figuras de 1 a 5 muestran la productividad de anticuerpos de clones celulares individuales que se obtuvieron mediante dilución limitante a partir de combinados celulares policlonales que fueron transformados con anterioridad con diferentes vectores de expresión y obtenidos utilizando diferentes condiciones de selección. Por lo tanto, se muestra la productividad de los clones obtenidos después de la selección. Para la obtención de clones a partir de células únicas, las células se cultivaron en medio completo (y de esta manera sin mantener la presión de selección después de la selección) o en medio de selección (para mantener de esta manera la presión de selección después de la selección).

Fig. 1 : Obtención de clones a partir de células únicas de transfectantes con V-DHFRref después de la selección (MTX 125 nM)

Fig. 2 : Obtención de clones a partir de células únicas de transfectantes con V-DHFRref después de la selección (MTX 250 nM)

Fig. 3 : Obtención de clones a partir de células únicas de transfectantes con V-wtFRalfa después de la selección (FA 15 nM)

Fig. 4 : Obtención de clones a partir de células únicas de transfectantes con V-mutFRalfa (5 nM). Como se puede observar, se obtuvieron más clones celulares con expresión elevada cuando se utilizó el receptor de folato mutado como marcador seleccionable en comparación con cuando se utilizó el receptor de folato no modificado como marcador seleccionable. Además, la tasa de expresión fue más elevada que la observada con la selección utilizando DHFR como marcador seleccionable.

Fig. 5 : Obtención de clones a partir de células únicas de una población cotransfectada con V-mutFRalfa/V-DHFRref (ácido fólico 50 nM (FA)/MTX 50 nM). Como se puede observar, se obtuvieron significativamente más clones celulares y clones con mayor expresión cuando se utilizó una estrategia de coselección de este tipo.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA DIVULGACIÓN

La invención está definida por las reivindicaciones adjuntas.

Se observó sorpendentemente que un sistema de selección que se basa en el uso de un receptor de folato como un marcador seleccionable se puede mejorar considerablemente utilizando una forma mutada de un receptor de folato. El marcador seleccionable mutado se puede utilizar como marcador seleccionable dominante para seleccionar células eucariotas, tales como células de mamíferos. Dicho mutante tiene una afinidad de unión al folato modulada en comparación con el correspondiente receptor de folato no modificado. Se observó que un receptor de folato mutado que tiene una afinidad de unión al folato menor en comparación con el correspondiente receptor de folato no modificado, tiene ventajas importantes como marcador seleccionable.

El sistema novedoso se puede utilizar para la sección acelerada, cribado y establecimiento de clones celulares eucariotas, en particular de mamíferos, que expresan de manera estable y secretan polipéptidos recombinantes con rendimientos elevados. La selección se puede realizar utilizando un medio de cultivo que comprende una concentración limitante de folato, en particular, una concentración limitante de ácido fólico. El sistema de selección novedoso muestra, aparte de las ventajas generales que se asocian con el uso de un receptor de folato como marcador seleccionable, varias ventajas importantes respecto a los sistemas de selección disponibles en la técnica anterior y también respecto al uso del receptor de folato no modificado como marcador seleccionable como se explicará a continuación.

1. Mayor rapidez y mejores características de crecimiento. Como se muestra en los ejemplos, la utilización de un receptor de folato mutante como marcador seleccionable permite una selección considerablemente más rápida que los sistemas de selección estándar que se basan, por ejemplo, en el uso de DHFR como marcador seleccionable. Además, el sistema de selección de acuerdo con la presente divulgación es también más rápido que un sistema de selección que se basa en el uso del receptor de folato no modificado como marcador seleccionable. En particular, en comparación con el uso del receptor de folato no modificado como marcador seleccionable, las células que han incorporado el receptor de folato mutado de acuerdo con la presente divulgación como marcador seleccionable se dividen y recuperan más rápido cuando se cultivan en un medio de cultivo selectivo que comprende concentraciones de ácido fólico muy bajas. Esta rapidez lograda es una ventaja considerable que reduce la duración de un ciclo de selección. Se observa una ventaja de crecimiento respectiva incluso si se utilizan condiciones de selección muy rigurosas y en consecuencia concentraciones de ácido fólico sumamente limitantes en el medio de cultivo selectivo que incluso afectan al crecimiento de células que se habían transfectado con el receptor de folato no modificado como marcador seleccionable. Por lo tanto, se pueden utilizar condiciones de selección más rigurosas cuando se utiliza el receptor de folato mutado de acuerdo con la divulgación como marcador seleccionable. Esta ventaja del receptor de folato mutado de acuerdo con la presente divulgación respecto al receptor de folato no modificado fue totalmente inesperada. El folato tal como, preferentemente, el ácido fólico debe estar presente en el medio de cultivo y se debe incorporar eficazmente a las células hospedadoras con el fin de mantener el crecimiento celular, la biosíntesis de nucleótidos de purina y pirimidina, replicación del ADN y, por lo tanto, proliferación celular. Teniendo en cuenta este contexto, se esperaba que las células transfectadas con un receptor de folato mutado que tenía una afinidad de unión al folato menor, no tuvieran una ventaja de crecimiento en comparación con células que se transfectan como receptor de folato no modificado. Incluso se asumió que las células transfectadas con un receptor de folato mutante de este tipo como marcador seleccionable puede que ni tan siquiera tuvieran una ventaja de crecimiento en comparación con las células no transfectadas que expresan de manera endógena el receptor de folato no modificado que tiene la afinidad de unión al folato completa. Esto particularmente, ya que se sabe que la expresión del receptor de folato endógeno aumenta si las células no transfectadas se cultivan en un medio de cultivo que comprende una concentración limitante de folato (véase Zhu et al., Journal of Cellular Biochemistry 81:205-219 (2001)). Por lo tanto, fue sumamente sorprendente cuando los inventores observaron que un receptor de folato mutado que tiene una afinidad de unión al folato menor proporciona un marcador seleccionable eficaz que es incluso superior al receptor de folato no modificado.

2. Rigurosidad y productividad mejoradas. Las células que han incorporado el receptor de folato mutado de acuerdo con la presente divulgación como marcador seleccionable, sorprendentemente, toleran concentraciones de folato menores en el medio de cultivo selectivo que las células que comprenden el receptor de folato no modificado como marcador seleccionable. Esto permite el uso de condiciones de selección más rigurosas. Por lo tanto, las células que tienen una tasa de productividad elevada se pueden obtener más rápido cuando se utiliza el marcador seleccionable novedoso descrito en la presente. Esto fue completamente inesperado considerando el hecho de que la afinidad de unión al folato del receptor de folato mutado de acuerdo con la presente divulgación es menor en comparación con el no modificado.

3. Fiabilidad mejorada. Se observa una dependencia de la dosis lineal con la concentración de folato en el medio de cultivo cuando se utiliza en el receptor de folato mutado de acuerdo con la presente divulgación como marcador seleccionable. Cuanto menor sea la concentración de folato en el medio de selección, mayor es la productividad resultante de las células seleccionadas. No se observa una dependencia respectiva de la misma manera cuando se utiliza el receptor de folato no modificado como marcador seleccionable. Esta dependencia de la dosis lineal facilita un control más fiable y la optimización de las condiciones de selección. Este descubrimiento también fue algo completamente inesperado.

Por lo tanto, la selección con folato novedosa descrita en la presente que se basa en el uso de un receptor de folato mutado como marcador seleccionable que tiene, en comparación con el receptor de folato no modificado correspondiente, una afinidad de unión al folato menor es una estrategia excelente muy adecuada para la selección acelerada de células estables que expresan un polipéptido recombinante de interés con un rendimiento elevado. Los resultados beneficiosos descritos en la presente se pueden conseguir con concentraciones de folato bajas en el medio de cultivo de células e incluso en ausencia de una selección con fármacos citotóxicos como se utiliza habitualmente en varios de otros sistemas de selección.

Vector de expresión y combinación de vectores de expresión

a) un polinucleótido que codifica un receptor de folato mutado como marcador seleccionable, donde el receptor de folato mutado tiene una afinidad de unión al folato menor en comparación con el receptor de folato no modificado; y

b) al menos un polinucleótido que codifica un polipéptido de interés,

Un «vector» de acuerdo con la presente divulgación se refiere en particular a un polinucleótido capaz de portar al menos un fragmento polinucleotídico. Un vector funciona como una molécula portadora que suministra polinucleótidos a una célula hospedadora. Un vector de expresión puede comprender al menos un casete de expresión que comprende secuencias reguladoras para la expresión adecuada de un polinucleótido incorporado a él. Los polinucleótidos (por ejemplo, que codifican el polipéptido de interés o un marcador seleccionable) que se van a introducir en la célula se pueden insertar en el casete o casetes de expresión del vector con el fin de ser expresados a partir de este. Cuando se introduce en una célula hospedadora, un casete de expresión, entre otros, es capaz de dirigir la maquinaria celular para transcribir un polinucleótido incorporado que codifica un polipéptido de interés para generar ARN, el cual normalmente se procesa a continuación adicionalmente y finalmente se traduce para generar el polipéptido de interés. El vector puede estar presente en forma lineal(izada) o circular. El término «vector» también comprende cromosomas artificiales, vectores víricos o polinucleótidos respectivos similares que permiten la transferencia de fragmentos de ácido nucleico exógeno.

Un «polinucleótido» es un polímero de nucleótidos que normalmente se unen de una desoxirribosa o ribosa a otra y se refiere a ADN así como también ARN, dependiendo del contexto. El término «polinucleótido» no comprende ninguna restricción de tamaño.

Posteriormente, los autores describen realizaciones del vector de expresión y la combinación de al menos dos vectores de expresión de acuerdo con la presente divulgación. El polinucleótido que codifica el receptor de folato mutado y el polinucleótido que codifica un polipéptido de interés se pueden ubicar en el mismo vector de expresión o en vectores de expresión separados si se utiliza una combinación de al menos dos vectores de expresión. Si se utiliza una combinación de al menos dos vectores de expresión, donde un vector de expresión comprende el polinucleótido que codifica el polipéptido de interés y el otro vector de expresión comprende el polinucleótido que codifica el receptor de folato mutado, con dicha combinación se cotransfectan las mismas células hospedadoras para permitir la selección. Las estrategias de cotransfección respectivas son muy conocidas por el experto y también se describen en los ejemplos. Posteriormente, los autores describen realizaciones específicas y ventajas predominantemente junto con la realización donde ambos polinucleótidos se ubican en el mismo vector de expresión. Sin embargo, dicha divulgación mutatis mutandis se aplica a la realización, donde se utiliza una combinación de al menos dos vectores de expresión con los que se cotransfectan las células. Cuando sea apropiado, los autores describen las ventajas asociadas con el vector de expresión o la combinación de al menos dos vectores de expresión junto con el uso de dicho vector o vectores de expresión para seleccionar células hospedadoras que expresan el polipéptido de interés con un rendimiento elevado.

Receptor de folato mutado

Un «receptor de folato», como se utiliza en la presente, se refiere a un receptor que es funcional y, por lo tanto, capaz de importar o captar folato o un derivado de este e introducirlo en una célula eucariota, en particular, una célula de mamífero. Preferentemente, el receptor de folato puede importar o captar de manera unidireccional folato o un derivado de este e introducirlo en una célula hospedadora eucariota, en particular, una célula de mamífero. Además, un receptor de folato, como se utiliza en la presente, está unido a la membrana. Por tanto, los receptores de folato descritos en la presente son receptores de folato unidos a la membrana funcionales. Esto se aplica al receptor de folato mutado así como al no modificado. El anclaje a la membrana se puede conseguir, por ejemplo, mediante un anclaje transmembrana o un anclaje de glucosilfosfatidilinositol (GPI). Se prefiere un anclaje de GPI ya que corresponde al contexto natural de un receptor de folato. Los receptores de folato (FR, por sus siglas en inglés) son glucoproteínas que se unen a folato con una afinidad elevada. Están codificadas por tres genes distintos FR alfa, FR beta y FR gamma. FR alfa también se conoce como proteína de unión al folato del adulto o FDP, como receptor de folato 1 o FOLR (en ratones folbp1) y como antígeno asociado al cáncer de ovario. FR beta también se conoce como FOLR2 (fetal) y como FBP/PL-1(placenta). FR gamma también se conoce como FOLR3 y como FR-G (revisado por M.D. Salazar y M. Ratnam, Cáncer Metástasis Rev. 2007 26(1), págs.141-152). Los FR maduros, que están bien caracterizados, son proteínas homólogas con ~70-80 % de identidad de aminoácidos y contienen de 229 a 236 aminoácidos así como de dos a tres sitios de N-glucosilación. FR alfa y FR beta son proteínas unidas a la membrana. FR alfa y FR beta están ancladas mediante GPI, glucoproteínas de la superficie celular, mientras que FR gamma está desprovista de un anclaje de GPI y es una proteína secretada. Sin embargo, se puede alterar genéticamente para incluir un dominio transmembrana o un anclaje de GPI. Una forma alterada de este tipo de un FR gamma que incluye un anclaje a la membrana también se considera un receptor de folato no modificado si es capaz de importar o captar folato o un derivado de este e introducirlo en una célula eucariota como se ha descrito anteriormente. ^fR alfa y FR beta muestran una afinidad elevada por el ácido fólico (Kd = 0,1-1 nM), ácido 5,10-dideazatetrahidrofólico (DDATHF; lometrexol; Ki=0,4-1,3 nM utilizando ácido [3H]fólico como sustrato) y BGC945 (que es un inhibidor de la timidilato-sintasa, basado en ciclopenta[g]quinazolina transportado específicamente únicamente mediante FR alfa y no mediante el portador de folato reducido) (Kd = 1 nM), pero una afinidad mucho menor por MTX (Kd >100 nM). La captación dependiente de FR de folato y antifolatos se produce a través de un mecanismo clásico de endocitosis mediada por el receptor.

Un «receptor de folato mutado que tiene una afinidad de unión al folato menor en comparación con el receptor de folato no modificado» o expresiones similares utilizadas en la presente se refieren en particular a un receptor de folato mutado que tiene, en comparación con el receptor de folato no modificado correspondiente, una afinidad de unión reducida a al menos un folato seleccionado del grupo de folato reducidos y folatos oxidados. Dicha expresión se refiere en particular a los receptores de folato mutados que tienen, en comparación con el receptor de folato no modificado correspondiente, una afinidad de unión al folato menor a un folato específico. La afinidad de unión al folato a otros folatos, es decir, folatos diferentes de dicho folato específico, puede estar inalterada. De acuerdo con una realización, el receptor de folato mutado que tiene una afinidad de unión al folato menor comprende al menos una mutación que, en comparación con el receptor de folato no modificado correspondiente, disminuye la afinidad de unión a al menos un folato seleccionado del grupo de folatos reducidos y folatos oxidados. De acuerdo con una realización, el receptor de folato mutado muestra, en comparación con el receptor de folato no modificado correspondiente, una menor afinidad de unión a un folato reducido. De acuerdo con una realización, el receptor de folato mutado muestra, en comparación con el receptor de folato no modificado correspondiente, una afinidad de unión reducida al diastereoisómero 6S de 5-metiltetrahidrofolato. De acuerdo con una realización, el receptor de folato mutado tiene un valor de CI⁵⁰por un folato reducido, preferentemente el diastereoisómero 6S de 5-metiltetrahidrofolato, que es al menos 20 veces, al menos 30 veces, al menos 40 veces, al menos 50 veces o al menos 55 veces más elevado que el valor de CI⁵⁰del receptor de folato no modificado correspondiente. Debido al valor de CI⁵⁰significativamente mayor tiene una afinidad de unión a dicho folato reducido significativamente reducida en comparación con el receptor de folato no modificado. De acuerdo con una realización, el receptor de folato mutado muestra una unión reducida al ácido fólico.

La al menos una mutación que da como resultado una afinidad de unión al folato menor puede ser, por ejemplo, una sustitución, deleción o inserción de aminoácidos. De acuerdo con una realización, la al menos una mutación está presente en la cavidad putativa de unión al folato. De acuerdo con una realización, dicha mutación es una sustitución en la cavidad putativa de unión al folato.

El receptor de folato mutado que se usa de acuerdo con la presente divulgación como marcador seleccionable tiene una afinidad de unión al folato menor en comparación con el receptor de folato no modificado correspondiente. Como se ha descrito anteriormente y como se muestra en los ejemplos, resulta conveniente utilizar un receptor de folato mutado que tiene, en comparación con el receptor de folato no modificado correspondiente, al menos una afinidad de unión reducida al diastereoisómero 6S de 5-metiltetrahidrofolato. Se puede conseguir una disminución en la afinidad de unión al folato introduciendo una o más mutaciones en la secuencia no modificada. Se describen ejemplos adecuados más adelante. Sin desear ceñirse a ninguna teoría, se cree que debido a la reducción de la afinidad de unión al folato, las células transfectadas con el vector o vectores de expresión de acuerdo con la presente divulgación necesitan expresar mayor cantidad de receptores de folato mutados para conseguir una tasa de captación de folato suficiente con el fin de sobrevivir en condiciones de privación selectiva de folato. Por lo tanto, la población superviviente también expresa un nivel mayor del polipéptido de interés. Como se muestra en los ejemplos, cuando se utiliza el receptor de folato mutado como se describe en la presente como marcador seleccionable, la productividad aumenta si la concentración de folato en el medio de cultivo selectivo se reduce. No se observa una correlación respectiva en la misma manera cuando se utiliza el receptor de folato no modificado como marcador seleccionable. Además, cuando se utiliza el receptor de folato mutado como marcador seleccionable, es posible reducir aún más la concentración de folato en el medio de cultivo selectivo y, por lo tanto, aumentar adicionalmente la presión de selección sobre las células transfectadas. De este modo, se proporciona un sistema de selección muy riguroso y rápido que es superior al sistema de selección que utiliza el receptor de folato no modificado como marcador seleccionable. Esto fue algo inesperado y sumamente sorprendente considerando el hecho de que la afinidad de unión al folato del receptor de folato mutado de acuerdo con la presente divulgación es menor en comparación con el receptor de folato no modificado. Además, se observó sorprendentemente que las células que fueron transfectadas con el transportador de folato mutado mostraron características superiores y en particular se recuperaron antes de las condiciones de selección, incluso cuando se utilizaron condiciones de selección sumamente rigurosas.

Preferentemente, el receptor de folato mutado que se utiliza como marcador seleccionable comprende al menos una mutación en la cavidad de unión al folato donde dicha mutación tiene el efecto de disminuir la afinidad de unión al folato en comparación con el receptor de folato no modificado correspondiente. Más adelante se describen mutaciones adecuadas. La incorporación de una mutación a la cavidad de unión al folato es una estrategia muy eficaz para reducir la afinidad de unión al folato. Solo las células que sobreexpresan en gran medida el receptor de folato mutado introducido pueden incorporar cantidades suficientes de folato a partir del medio de cultivo para mantener el crecimiento celular, replicación del ADN y, por lo tanto, la proliferación celular. Sorprendentemente, aunque las células hayan incorporado un receptor de folato mutado que tiene una afinidad reducida por el folato como marcador seleccionable, las células transfectadas muestran un crecimiento sustancialmente acelerado en comparación con células que fueron transfectadas con el receptor de folato no modificado o en comparación con células que fueron transfectadas con un marcador seleccionable convencional tal como DHFR. Este crecimiento acelerado es una ventaja significativa ya que reduce el tiempo que es necesario para llevar a cabo la selección.

El receptor de folato mutado utilizado de acuerdo con la presente divulgación se puede obtener a partir de un receptor de folato de cualquier especie siempre que sea funcional en la presente divulgación, es decir, sea compatible con la célula hospedadora que se utiliza y cuando se exprese a partir de la célula hospedadora transfectada incorpore folato, en particular ácido fólico, a partir del medio de cultivo y lo introduzca en la célula hospedadora.

En general, el receptor de folato mutado que se introduce en la célula hospedadora eucariota y se utiliza como marcador seleccionable puede ser homólogo o heterólogo respecto a un receptor de folato endógeno de la célula hospedadora (si está presente un receptor de folato endógeno que se prefiera). Si es homólogo, se obtendrá a partir de la misma especie que la célula hospedadora. Si es heterólogo, se obtendrá a partir de otra especie distinta a la célula hospedadora. Por ejemplo, se puede utilizar un receptor de folato obtenido a partir de un ser humano como marcador seleccionable para una célula hospedadora de roedores, por ejemplo, una célula CHO. Preferentemente, se utiliza un receptor de folato obtenido a partir de una especie de mamífero, por ejemplo, obtenido a partir de un roedor, tal como ratón, rata o hámster 0, más preferido, obtenido a partir de un ser humano. De acuerdo con una realización, se utiliza un receptor de folato mutado obtenido a partir del receptor de folato alfa humano como marcador seleccionable.

El receptor de folato mutado se puede seleccionar del grupo que consiste en un receptor de folato alfa, un receptor de folato beta y un receptor de folato gamma. El receptor de folato mutado se puede obtener a partir de un receptor de folato no modificado que comprende una secuencia de aminoácidos como se muestra en las SEQ ID NO 1, 3, 4, 6, 7 y 8 a continuación, donde, sin embargo, dicho receptor de folato mutado comprende al menos una mutación que da como resultado una afinidad de unión al folato menor en comparación con el receptor de folato no modificado correspondiente. Preferentemente, el receptor de folato mutado se obtiene a partir de un receptor de folato alfa, en particular el receptor de folato alfa humano.

El receptor de folato alfa humano no modificado maduro comprende la siguiente secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO 1, código de 1 letra, mostrada en dirección del extremo N al extremo C):

IAWARTELLNVCMNAKHHKEKPGPEDKLHEQCRPWRKNACCSTNTSQEAHKDVSYLYRFN

WNHCGEMAPACKRHFIQDTCLYECSPNLGPWIQQVDQSWRKERVLNVPLCKEDCEQWW

EDCRTSYTCKSNWHKGWNWTSGFNKCAVGAACQPFHFYFPTPTVLCNEIWTHSYKVSNY

SRGSGRCIQMWFDPAQGNPNEEVARFYA

El receptor de folato alfa se ancla de forma natural a la membrana celular mediante un anclaje de GPI. La secuencia señal para un anclaje de GPI no se muestra en la SEQ ID NO 1. De acuerdo con una realización, el receptor de folato mutado alfa obtenido a partir de la SEQ ID NO 1 comprende una señal del anclaje de GPI en el extremo C. Se puede utilizar cualquier señal de anclaje de GPI adecuada. La secuencia señal del anclaje de GPI natural del receptor de folato alfa humano es de la siguiente manera (SEQ ID NO 2, código de 1 letra, mostrada en dirección del extremo N al extremo C):

AAMSGAGPWAAWPFLLSLALMLLWLLS

El anclaje a membrana se puede lograr, de forma alternativa, utilizando un anclaje a la membrana, por ejemplo, un anclaje transmembrana. En esta realización, el receptor de folato mutado comprende un anclaje a la membrana en su extremo C. Los anclajes adecuados son conocidos en la técnica anterior.

El receptor de folato alfa mutado que se obtiene a partir de la SEQ ID NO 1 puede comprender una secuencia líder en el extremo N. Se puede utilizar cualquier secuencia líder adecuada que garantice la expresión funcional del receptor de folato mutado.

La secuencia de aminoácidos completa, incluidas la secuencia líder natural (en el extremo N, subrayada) y la secuencia señal del anclaje de GPI natural (en el extremo C, subrayada), del receptor de folato alfa humano no modificado es de la siguiente manera (SEQ ID NO 3, código de 1 letra, mostrada en dirección del extremo N al extremo C):

MAQRMTTQLLLLLVWVAVVGEAQTRIAWARTELLNVCMNAKHHKEKPGPEDKLHEQCRPW RKNACCSTNTSQEAHKDVSYLYRFNWNHCGEMAPACKRHFIQDTCLYECSPNLGPWIQQV DQSWRKERVLNVPLCKEDCEQWWEDCRTSYTCKSNWHKGWNWTSGFNKCAVGAACQP FHFYFPTPTVLCNEIWTHSYKVSNYSRGSGRCIQMWFDPAQGNPNEEVARFYAAAMSGAG PWAAWPFLLSLALMLLWLLS

La secuencia no modificada del receptor de folato beta humano maduro tiene la siguiente secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO 4, código de 1 letra, mostrada en dirección del extremo N al extremo C):

QDRTDLLNVCMDAKHHKTKPGPEDKLHDQCSPWKKNACCTASTSQELHKDTSRLYNFNW DHCGKMEPACKRHFIQDTCLYECSPNLGPWIQQVNQTWRKERFLDVPLCKEDCQRWWED CHTSHTCKSNWHRGWDWTSGVNKCPAGALCRTFESYFPTPAALCEGLWSHSYKVSNYSR GSGRCIQMWFDSAQGNPNEEVARFYA

El receptor de folato beta está anclado de manera natural a la membrana mediante un anclaje de GPI. La secuencia señal para un anclaje de GPI no se muestra en la SEQ ID NO 4. De acuerdo con una realización, el receptor de folato beta mutado que se obtiene a partir de la SEQ ID NO 4 comprende una señal del anclaje de GPI en el extremo C. Se puede utilizar cualquier señal de anclaje de GPI adecuada. La secuencia señal del anclaje de GPI natural del receptor de folato beta humano es de la siguiente manera (SEQ ID NO 5, código de 1 letra, mostrada en dirección del extremo N al extremo C):

AAMHVNAGEMLHGTGGLLLSLALMLQLWLLG

El anclaje a la membrana también se puede lograr utilizando un anclaje a la membrana, por ejemplo, un anclaje transmembrana. En esta realización, el receptor de folato mutado comprende un anclaje a la membrana en su extremo C. En la técnica se conocen los anclajes adecuados.

El receptor de folato beta mutado que se obtiene a partir de la SEQ ID NO 4 puede comprender una secuencia líder en el extremo N. Se puede utilizar cualquier secuencia líder adecuada que garantice la expresión funcional del receptor de folato mutado.

La secuencia de aminoácidos completa, incluidas la secuencia líder (en el extremo N, subrayada) y la secuencia señal del anclaje de GPI no modificada (en el extremo C, subrayada), del receptor de folato beta humano natural es de la siguiente manera (SEQ ID NO 6, código de 1 letra, mostrada en dirección del extremo N al extremo C):

MVWKWMPLLLLLVCVATMCSAQDRTDLLNVCMDAKHHKTKPGPEDKLHDQCSPWKKNAC CTASTSQELHKDTSRLYNFNWDHCGKMEPACKRHFIQDTCLYECSPNLGPWIQQVNQTWR KERFLDVPLCKEDCQRWWEDCHTSHTCKSNWHRGWDWTSGVNKCPAGALCRTFESYFP TPAALCEGLWSHSYKVSNYSRGSGRCIQMWFDSAQGNPNEEVARFYAAAMHVNAGEMLH GTGGLLLSLALMLQLWLLG

Además, se puede utilizar un receptor de folato que, de manera natural, no esté unido a la membrana. Un receptor de folato no unido a la membrana de este tipo se puede alterar para que se convierta en uno unido a la membrana. Por ejemplo, se puede proporcionar un anclaje a la membrana y dicho receptor de folato se puede expresar como una proteína

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de fusión que comprende el receptor de folato y un anclaje a la membrana de otro polipéptido. Además, la secuencia se puede modificar para incorporar una secuencia señal del anclaje de GPI. Anteriormente en este documento se han descrito secuencias señal del anclaje de GPI adecuadas y también se conocen en la técnica anterior. De este modo, el receptor de folato se puede anclar a la membrana de la célula mediante un anclaje de GPI. Asimismo, se pueden utilizar otras variantes de las que un experto en la técnica podría disponer fácilmente. Los ejemplos preferidos en este sentido serían un receptor de folato mutado que se basa en el receptor de folato gamma, preferentemente el receptor de folato gamma humano, que se ha alterado genéticamente para que comprenda un anclaje a la membrana. Así pues, la secuencia del receptor de folato gamma debería estar mutada de acuerdo con el contenido de la presente divulgación para mostrar una afinidad de unión al folato menor.

El receptor de folato gamma soluble humano no modificado tiene la siguiente secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO 7, código de 1 letra, mostrada en dirección del extremo N al extremo C):

QPRSARARTDLLNVCMNAKHHKTQPSPEDELYGQCSPWKKNACCTASTSQELHKDTSRLY

NFNWDHCGKMEPTCKRHFIQDSCLYECSPNLGPWIRQVNQSWRKERILNVPLCKEDCERW

WEDCRTSYTCKSNWHKGWNWTSGINECPAGALCSTFESYFPTPAALCEGLWSHSFKVSN

YSRGSGRCIQMWFDSAQGNPNEEVAKFYAAAMNAGAPSRGIIDS

Además, un receptor de folato gamma mutado que se obtiene a partir de la SEQ ID NO 7 puede comprender una secuencia líder en el extremo N. Se puede utilizar cualquier secuencia líder adecuada que garantice la expresión funcional del receptor de folato mutado.

La secuencia de aminoácidos completa, incluida la secuencia líder del receptor de folato gamma humano no modificado (subrayada), es de la siguiente manera (SEQ ID NO 8, código de 1 letra, mostrada en dirección del extremo N al extremo C):

MDMAWQMMQLLLLALVTAAGSAQPRSARARTDLLNVCMNAKHHKTQPSPEDELYGQCSP WKKNACCTASTSQELHKDTSRLYNFNWDHCGKMEPTCKRHFIQDSCLYECSPNLGPWIRQ

VNQSWRKERILNVPLCKEDCERWWEDCRTSYTCKSNWHKGWNWTSGINECPAGALCSTF

ESYFPTPAALCEGLWSHSFKVSNYSRGSGRCIQMWFDSAQGNPNEEVAKFYAAAMNAGA

PSRGIIDS

Un receptor de folato mutado de acuerdo con la presente divulgación que se basa en el receptor de folato gamma comprende al menos una mutación en la secuencia respectiva para proporcionar un receptor de folato mutado que tiene una afinidad de unión al folato reducida. Preferentemente, la mutación está en la cavidad de unión al folato.

De acuerdo con una realización, el receptor de folato mutado se obtiene a partir de un receptor de folato alfa o beta. De acuerdo con una realización, se obtiene un receptor de folato mutado al proporcionar una secuencia de aminoácidos quimérica que se obtiene a partir del receptor de folato alfa y beta. En el receptor de folato alfa y beta, las posiciones aminoacídicos importantes implicadas en la unión al ligando son, haciendo referencia a la secuencia de aminoácidos del receptor de folato maduro correspondiente (véase, por ejemplo, las SEQ ID NO 1 y 4), las posiciones 49, 104 y 166 (véase también Ramamoorthy et al., 2007). De acuerdo con una realización, el receptor de folato mutado comprende al menos una sustitución en una posición aminoacídica que corresponde desde un punto de vista estructural o según homología con la secuencia de aminoácidos a una posición aminoacídica seleccionada entre la posición 49, 104 y 166 de la secuencia no modificada correspondiente. Asimismo, más de un aminoácido puede ser sustituido en el receptor de folato mutado en las posiciones respectivas. Una sustitución en uno o más de estas posiciones aminoacídicas tiene un gran efecto sobre la afinidad de unión al folato. La sustitución preferentemente reduce la afinidad de unión al folato del receptor de folato mutado en comparación con el receptor de folato no modificado correspondiente. De acuerdo con una realización, el receptor de folato mutado resultante muestra, en comparación con el receptor de folato no modificado correspondiente, una afinidad de unión reducida al diastereoisómero 6S de 5-metiltetrahidrofolato. De acuerdo con una realización, el receptor de folato mutado resultante muestra una unión reducida a ácido fólico. De acuerdo con una realización, el aminoácido presente de manera natural en la secuencia no modificada correspondiente es sustituido por un aminoácido no conservador, donde dicha sustitución disminuye la afinidad de unión al folato del receptor de folato mutado. De acuerdo con una realización, el aminoácido de origen natural en la correspondiente secuencia no modificada es sustituido por un aminoácido conservador. En un intercambio conservador, se reemplaza un aminoácido por otro aminoácido por un grupo con propiedades similares. Son ejemplos de grupos correspondientes:

- Aminoácidos que tienen cadenas laterales no polares: A, G, V, L, I, P, F, W, M

- Aminoácidos no cargados que tienen cadenas laterales polares: S, T, G, C, Y, N, Q

- Aminoácidos que tienen cadenas laterales aromáticas: F, Y, W

- Aminoácidos con carga positiva: K, R, H

- Aminoácidos con carga negativa: D, E

- Aminoácidos de tamaño o peso molecular similar, donde el peso molecular de los aminoácidos de reemplazo se desvía como máximo en un /- 25 % (o /- 20 %, /- 15 %, /- 10 %) del peso molecular del aminoácido original.

Es evidente, que los grupos también incluyen aminoácidos modificados y aminoácidos no naturales con el respectivo perfil de la cadena lateral tales como, por ejemplo, homoarginina en el caso del grupo que presenta cadenas laterales con carga positiva. De acuerdo con una realización, un aminoácido de origen natural en la secuencia no modificada es sustituido por un L-aminoácido natural con el fin de proporcionar el receptor de folato mutado.

Preferentemente, el receptor de folato mutado es un receptor de folato alfa. Se puede obtener a partir de un roedor tal como un ratón, rata o hámster o se puede obtener a partir de un receptor de folato alfa humano. Preferentemente, el receptor de folato mutado se obtiene a partir de un receptor de folato humano alfa. De acuerdo con una realización, el receptor de folato mutado de acuerdo con la presente divulgación se obtiene a partir del receptor de folato alfa humano no modificado que tiene la SEQ ID NO 1 o SEQ ID NO 3 mostrada anteriormente, donde, sin embargo, dicho receptor de folato alfa mutado comprende al menos una mutación que da como resultado una afinidad de unión al folato menor en comparación con el receptor de folato no modificado. De acuerdo con una realización, el receptor de folato mutado resultante muestra, en comparación con el receptor de folato no modificado correspondiente, una afinidad de unión reducida al diastereoisómero 6S de 5-metiltetrahidrofolato. De acuerdo con una realización, el receptor de folato mutado resultante muestra como alternativa o además una afinidad de unión reducida a ácido fólico.

Preferentemente, el receptor de folato mutado de acuerdo con la presente divulgación comprende una sustitución en la posición aminoacídica que corresponde desde un punto de vista estructural o según homología con la secuencia de aminoácidos al aminoácido 49 de la secuencia del receptor de folato alfa humano no modificado maduro como se muestra en la SEQ ID NO 1. Una mutación en la posición 49 de la secuencia no modificada madura del receptor de folato alfa introduce una mutación en la cavidad de unión al folato y, por lo tanto, tiene un fuerte efecto sobre la afinidad de unión al folato. Esta alanina en la posición 49 de la secuencia no modificada se detecta en la secuencia del receptor de folato alfa no modificada humana así como también en la de ratón correspondiente. Por supuesto, el receptor de folato mutado de acuerdo con la presente divulgación puede comprender mutaciones adicionales en otras posiciones siempre que el receptor de folato mutado sea funcional. De acuerdo con una realización, la al menos una mutación que disminuye la afinidad de unión al folato en comparación con el receptor de folato no modificado es una sustitución de la alanina presente en la posición 49 de la secuencia del receptor de folato alfa no modificada madura por un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en leucina, glicina, valina, isoleucina, histidina y ácido aspártico. Preferentemente, la alanina es sustituida por leucina. Los inventores han descubierto sorprendentemente que la sustitución A49L en la secuencia del receptor de folato alfa proporciona un receptor de folato alfa mutado que tiene propiedades superiores como marcador seleccionable en comparación con el receptor de folato alfa no modificado correspondiente. Un receptor de folato alfa mutado que comprende una sustitución A49L respectiva muestra, en comparación con el receptor de folato alfa no modificado correspondiente, una afinidad de unión reducida a folato, concretamenete el diastereoisómero 6S de 5-metiltetrahidrofolato. Además, como se muestra en los ejemplos, el mutante A49L del receptor de folato alfa humano muestra ventajas significativas cuando se utiliza como marcador de selección para identificar y seleccionar células hospedadoras de mamífero transfectadas con éxito. Por lo tanto, se utiliza preferentemente como marcador de selección para identificar células hospedadoras que expresan un polipéptido recombinante de interés con rendimiento elevado.

De acuerdo con una realización, el receptor de folato mutado maduro comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad secuencial de al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 96 %, al menos un 97 % o al menos un 98 % o al menos un 99 % con la secuencia no modificada madura del receptor de folato alfa humano (SEQ ID NO 1), donde, sin embargo, la secuencia de aminoácidos del receptor de folato mutado maduro comprende al menos una mutación que disminuye la afinidad de unión al folato en comparación con el receptor de folato alfa humano no modificado. Como se ha analizado anteriormente, la al menos una mutación que disminuye la afinidad de unión al folato en comparación con el receptor de folato no modificado preferentemente es una sustitución de la alanina presente en la posición 49 de la secuencia del receptor de folato alfa no modificado maduro (véase la SEQ ID NO 1) por un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en leucina, glicina, valina, isoleucina, histidina y ácido aspártico. Preferentemente, la alanina en la posición 49 es sustituida por leucina. Un receptor de folato mutado de este tipo muestra, en comparación con el receptor de folato no modificado correspondiente, una afinidad de unión reducida al diastereoisómero 6S de 5-metiltetrahidrofolato y características mejoradas como marcador seleccionable.

De acuerdo con una realización, el primer polinucleótido codifica un receptor de folato mutado, donde dicho receptor de folato mutado tiene las siguientes características:

a) el receptor de folato mutado maduro comprende la siguiente secuencia

lAWARTELLNVCMNAKHHKEKPGPEDKLHEQCRPWRKNACCSTNTSQEXaaHKDVSYLYR

FNWNHCGEMAPACKRHFIQDTCLYECSPNLGPWIQQVDQSWRKERVLNVPLCKEDCEQW

WEDCRTSYTCKSNWHKGWNWTSGFNKCAVGAACQPFHFYFPTPTVLCNEIWTHSYKVSN YSRGSGRCIQMWFDPAQGNPNEEVARFYA (SEQ ID NO 9)

donde Xaa no es alanina y donde preferentemente, Xaa es un aminoácido seleccionado entre leucina, glicina, valina, isoleucina, histidina y ácido aspártico y donde, más preferentemente en, Xaa es leucina;

o

b) el receptor de folato mutado maduro comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad secuencial de al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 96 %, al menos un 97 % o un 98 % o al menos un 99 % respecto a la secuencia mostrada como SEQ ID NO 9, y donde Xaa no es alanina en dicho receptor de folato mutado y preferentemente Xaa es un aminoácido seleccionado entre leucina, glicina, valina, isoleucina, histidina y ácido aspártico y más preferentemente Xaa es leucina y donde la afinidad de unión al folato de dicho receptor de folato mutado es menor en comparación con la secuencia del receptor de folato alfa humano no modificado maduro donde Xaa es alanina (véase la SEQ ID NO 1). De acuerdo con una realización, dicho receptor de folato mutado muestra, en comparación con el receptor de folato no modificado correspondiente, una afinidad de unión reducida al diastereoisómero 6S de 5-metiltetrahidrofolato. De acuerdo con una realización, el receptor de folato mutado resultante como alternativa o además muestra una unión reducida a ácido fólico. El receptor de folato mutado de acuerdo con b) se puede considerar como una variante funcional de a) y puede comprender una mutación o mutaciones adicionales de uno o más aminoácidos en comparación con el receptor de folato mutado de acuerdo con a). Por ejemplo, puede comprender una o más sustituciones, deleciones y/o adiciones adicionales de uno o más aminoácidos siempre que no se elimine la función del receptor de folato. También se engloban proteínas de fusión, que comprenden una secuencia del receptor de folato mutada respectiva.

Como se ha analizado anteriormente, preferentemente, Xaa es leucina. Como se muestra en los ejemplos, mutar la alanina comprendida en la posición 49 de la secuencia no modificada del receptor de folato alfa a leucina proporciona un receptor de folato mutado que tiene, en comparación con la secuencia no modificada correspondiente, características superiores como marcador seleccionable. Como muestran los ejemplos, las células que comprenden como marcador seleccionable un receptor de folato mutado que portan una mutación en la posición correspondiente a la posición 49 de la secuencia no modificada madura del receptor de folato alfa muestran, después de la selección, una productividad elevada del polipéptido de interés que a menudo es considerablemente más elevada que la productividad que se logra cuando se utiliza el correspondiente receptor de folato no modificado como marcador seleccionable y que también es más elevada que la productividad que se consigue con otras formas multadas del receptor. Además, las células se recuperan más rápido de la selección. Estas importantes ventajas convierten al receptor de folato con la mutación A49L especialmente adecuado como marcador seleccionable. Dicho receptor de folato alfa mutado se ha descrito y caracterizado en Shen et al., 1997. En ese artículo, se mostró que dicha versión mutada muestra una afinidad de unión reducida al diastereoisómero 6S de 5-metiltetrahidrofolato como se puede observar según el valor de CI⁵⁰(nM) que aumenta con respecto al receptor de folato alfa no modificado (2,9) casi 60 veces (hasta 179,0).

El receptor de folato mutado está anclado a la membrana y puede comprender, por ejemplo, un anclaje de GPI o un anclaje transmembrana. Como se ha descrito anteriormente, los receptores de folato alfa y beta están anclados de manera natural por un anclaje de GPI a la membrana celular. Cuando se utiliza un anclaje de GPI para el anclaje a la membrana, el polinucleótido codificante debe proporcionar la secuencia señal apropiada para la unión a un anclaje de GPI. En la técnica anterior hay constancia de secuencias señal adecuadas para el anclaje de GPI y también se han descrito anteriormente. Como se ha explicado anteriormente, se proporcionan secuencias señal del anclaje de GPI respectivas en el extremo C y se puede utilizar junto con la presente divulgación.

De acuerdo con una realización, el receptor de folato mutado premaduro comprende la secuencia líder del receptor de folato alfa humano funcional no modificado como se muestra a continuación (SEQ ID NO 10, código de 1 letra, mostrada en dirección del extremo N al extremo C):

MAQRMTTQLLLLLVWVAVVGEAQTR

Las secuencias líder de los receptores de folato beta y gamma humanos no modificados se muestran posteriormente (SEQ ID NO 11 y 12, código de 1 letra, mostradas en dirección del extremo N al extremo C):

MVWKWMPLLLLLVCVATMCSA (SEQ ID NO 11)

MDMAWQMMQLLLLALVTAAGSA (SEQ ID NO 12)

1

a) el receptor de folato mutado comprende la siguiente secuencia

lAWARTELLNVCMNAKHHKEKPGPEDKLHEQCRPWRKNACCSTNTSQEXaaHKDVSYLYR FNWNHCGEMAPACKRHFIQDTCLYECSPNLGPWIQQVDQSWRKERVLNVPLCKEDCEQW

WEDCRTSYTCKSNWHKGWNWTSGFNKCAVGAACQPFHFYFPTPTVLCNEIWTHSYKVSN

YSRGSGRCIQMWFDPAQGNPNEEVARFYAAAMSGAGPWAAWPFLLSLALMLLWLLS

(SEQ ID NO 13)

donde Xaa es leucina;

o

b) el receptor de folato mutado comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad secuencial de al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 96 %, al menos un 97 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % respecto a la secuencia mostrada como SEQ ID NO 13, donde Xaa es leucina en dicho receptor de folato mutado de acuerdo con b) y donde la afinidad de unión de dicho receptor de folato mutado al diastereoisómero 6S de 5-metiltetrahidrofolato es menor en comparación con la secuencia del receptor de folato alfa humano no modificado maduro donde Xaa es alanina (véase la SEQ I^dNO 1).

El polipéptido de interés

El vector de expresión o combinación de vectores de expresión comprende al menos un polinucleótido que codifica un polipéptido de interés. Cuando dicho vector de expresión o vector combinado se introduce en una célula hospedadora dependiente de folato tal como, por ejemplo, una célula de mamífero como se ha descrito en la presente, dicha célula hospedadora secreta el polipéptido de interés. Por lo tanto, el polipéptido de interés es un polipéptido secretado. El polinucleótido puede codificar un polipéptido que se secreta de manera natural o este se puede alterar para propiciar su secreción al proporcionar una secuencia líder secretora apropiada. La mayoría de los polipéptidos secretados poseen un péptido líder amino-terminal (también denominado péptido señal o secuencia líder secretora) que se extiende del polipéptido precursor naciente durante la biosíntesis. Los péptidos líder secretores tienen una longitud normalmente de 5 a 60 aminoácidos. Esta secuencia es necesaria y suficiente para la secreción. En la técnica anterior se conocen exhaustivamente numerosos ejemplos de secuencias líder secretoras y, por lo tanto, no es necesaria una descripción detallada en la presente. El análisis de un gran número de estos péptidos líder secretores ha revelado un motivo estructural común que se produce en ausencia de una homología significativa entre las secuencias de aminoácidos [Von Heijne, 1981; Perlman et al., 1983, Bird et al., 1990]. En general, una secuencia líder secretora consiste en un extremo amino con carga positiva (n), un núcleo hidrófobo (h) y un extremo carboxi más polar (c) que define el sitio de escisión de la peptidasa señal. La alteración de la región h por deleción o por reemplazamiento de los residuos hidrófobos con aminoácidos hidrófilos o cargados da lugar a la pérdida de la función de señal, mientras que las alteraciones en la región «n» tienen poco efecto. El extremo carboxi, o región de escisión, tiene normalmente una longitud de aproximadamente 6 aminoácidos. Esta región participa en el reconocimiento y escisión de la peptidasa señal, que se necesita normalmente para conseguir el plegamiento final y secreción de la proteína.

El polipéptido de interés puede ser un compuesto con actividad terapéutica o farmacéutica, o una herramienta de investigación que se vaya a utilizar en ensayos y similares. El polipéptido de interés puede ser de cualquier tipo. El término «polipéptido» se refiere a una molécula que comprende un polímero de aminoácidos unidos entre sí por uno o más enlaces peptídicos. Los polipéptidos incluyen polipéptidos de cualquier longitud, que incluyen proteínas (por ejemplo, que tienen más de 50 aminoácidos) y péptidos (por ejemplo, de 2-49 aminoácidos). Los polipéptidos incluyen proteínas y/o péptidos de cualquier tamaño, función o actividad, y pueden incluir, por ejemplo, enzimas (por ejemplo, proteasas, cinasas, fosfatasas), receptores, transportadores, proteínas bactericidas y/o de unión a endotoxinas, polipéptidos estructurales, glucoproteínas, proteínas globulares, polipéptidos inmunitarios, toxinas, antibióticos, hormonas, factores de crecimiento, factores sanguíneos, vacunas o similares. El polipéptido se puede seleccionar del grupo que consiste en hormonas peptídicas, interleucinas, activadores de plasminógeno tisular, citocinas, inmunoglobulinas, en particular anticuerpos o fragmentos funcionales de anticuerpo o variantes de estos y proteínas de fusión con Fc. El polipéptido de interés que se expresa de acuerdo con el contenido descrito en la presente también puede ser una subunidad o dominio de un polipéptido, tal como, por ejemplo, una cadena pesada o una cadena ligera de un anticuerpo o fragmento funcional o derivado de este. La expresión «polipéptido de interés» se puede referir a una subunidad o dominio individual de este tipo o a la proteína final que está compuesta por las respectivas subunidades o dominios, dependiendo del contexto. En una realización preferida, el polipéptido de interés es una molécula de inmunoglobulina, más preferentemente un anticuerpo o una subunidad o dominio de este, tal como, por ejemplo, la cadena pesada o ligera de un anticuerpo. El término «anticuerpo», tal como se utiliza en la presente, se refiere en particular a una proteína que comprende al menos dos cadenas pesadas y dos cadenas ligeras conectadas mediante enlaces de disulfuro. El término «anticuerpo» incluye anticuerpos de origen natural, así como también todas las formas recombinantes de los anticuerpos, por ejemplo, anticuerpos humanizados, anticuerpos totalmente humanos y anticuerpos quiméricos. Cada cadena pesada está constituida normalmente por una región variable de la cadena pesada (VH) y una región constante de la cadena pesada (CH). Cada cadena ligera está constituida normalmente por una región variable de la cadena ligera (VL) y una región constante de la cadena ligera (CL). Sin embargo, el término «anticuerpo» también incluye otros tipos de anticuerpos tales como anticuerpos de un único dominio, anticuerpos de cadena pesada, es decir, anticuerpos constituidos únicamente por una o más, en particular dos cadenas pesadas, y nanocuerpos, es decir, anticuerpos constituidos únicamente por un único dominio monomérico variable. Según se ha expuesto anteriormente, el polinucleótido que codifica el polipéptido de interés también puede codificar una o más subunidades o dominios de un anticuerpo, por ejemplo, una cadena pesada o ligera o un fragmento funcional o derivado de este, como polipéptido de interés. Dichas subunidades o dominios se pueden expresar tanto a partir del mismo casete de expresión como de casetes de expresión diferentes. Un «fragmento o derivado funcional» de un anticuerpo en particular se refiere a un polipéptido que se obtiene a partir de un anticuerpo y se puede unir al mismo antígeno, en particular al mismo epítopo que el anticuerpo. Se ha demostrado que la función de unión al antígeno de un anticuerpo puede ser ejecutada por fragmentos de un anticuerpo de longitud completa o derivados de este. Los ejemplos de fragmentos o derivados de un anticuerpo incluyen (i) fragmentos Fab, fragmentos monovalentes constituidos por la región variable y el primer dominio constante de cada una de las cadenas pesada y ligera; (ii) fragmentos F(ab)², fragmentos bivalentes que comprenden dos fragmentos Fab unidos por un puente disulfuro en la región bisagra; (iii) fragmentos Fd constituidos por la región variable y el primer dominio constante CH1 de la cadena pesada; (iv) fragmentos Fv constituidos por la región variable de la cadena pesada y la cadena ligera de un único brazo de un anticuerpo; (v) fragmentos scFv, fragmentos Fv constituidos por una única cadena polipéptidica; (vi) fragmentos (Fv)²constituidos por dos fragmentos Fv unidos covalentemente entre sí; (vii) un dominio variable de la cadena pesada; y (viii) multicuerpos constituidos por una región variable de la cadena pesada y una región variable de la cadena ligera unidas covalentemente entre sí de tal manera que la asociación de las regiones variables de la cadena pesada y la cadena ligera solo se pueda producir de manera intermolecular pero no intramolecular.

Marcadores seleccionables adicionales

De acuerdo con una realización, el vector de expresión o combinación de al menos dos vectores de expresión de acuerdo con la presente divulgación comprende(n) adicionalmente uno o más polinucleótidos que codifican un marcador seleccionable adicional. Un marcador seleccionable permite, en condiciones de cultivo selectivo apropiadas, la selección de las células hospedadoras que expresan dicho marcador seleccionable. Un marcador seleccionable proporciona el portador de dicho marcador en condiciones selectivas con una ventaja de supervivencia y/o crecimiento. Habitualmente, un gen marcador seleccionable conferirá resistencia a un agente de selección tal como un fármaco, por ejemplo, un antibiótico u otro agente tóxico, o compensará un defecto metabólico o catabólico en la célula hospedadora. Puede ser un marcador de selección positivo o negativo. Para seleccionar las células hospedadoras transfectadas con éxito, se puede utilizar un medio de cultivo para cultivar las células hospedadoras que comprenda un agente de selección que permita la selección del marcador seleccionable utilizado. En otras realizaciones, el marcador de selección posibilita que la célula hospedadora sobreviva y prolifere en ausencia o reducción de un compuesto que es esencial para la supervivencia y/o proliferación de las células hospedadoras que carecen del marcador de selección. De acuerdo con una realización, el marcador seleccionable es un marcador de resistencia a un fármaco que codifica una proteína que confiere resistencia a unas condiciones de selección en las que participa dicho fármaco. El experto estará familiarizado con diversos genes marcadores seleccionables y estos se han descrito en la bibliografía (véanse, por ejemplo, los documentos WO 92/08796, WO 94/28143, WO2004/081167, WO2009/080759, WO2010/097240). El marcador seleccionable puede ser, de acuerdo con una realización, un marcador seleccionable amplificable. Los genes marcadores seleccionables empleados habitualmente con células de mamífero incluyen los genes para la aminoglucósido-fosfotransferasa (APH), higromicina-fosfotransferasa (hyg), dihidrofolato-reductasa (DHFR), timidina-cinasa (tk), glutamina-sintetasa, asparagina-sintetasa y genes que codifican resistencia a la neomicina (G418), puromicina, higromicina y zeocina. Se pueden utilizar tales marcadores seleccionables además del receptor de folato mutado.

De acuerdo con una realización, el vector de expresión o combinación de vectores de expresión comprende un polinucleótido adicional que codifica un marcador seleccionable que participa en el metabolismo del folato y donde la actividad de dicho marcador seleccionable está influenciada, al menos parcialmente, por la actividad del receptor de folato mutado. La característica, que la actividad del marcador seleccionable adicional esté influenciada, al menos parcialmente, por la actividad del receptor de folato mutado, significa en particular que la actividad de dicho marcador seleccionable adicional está influenciada por y/o depende al menos en cierto grado directa o indirectamente de la actividad o función del receptor de folato mutado. Esta dependencia/interacción del receptor de folato mutado y el marcador seleccionable adicional se puede utilizar para aumentar considerablemente la presión de selección sobre las células hospedadoras en condiciones de cultivo selectivo.

De acuerdo con una realización, el marcador seleccionable adicional es una enzima que procesa un sustrato el cual es un folato, un derivado de folato y/o un producto que se puede obtener procesando folato tal como DHF o THF o un derivado o variante funcional de los anteriores. Los sustratos respectivos son importantes para la producción de ácidos nucleicos. Preferentemente, el marcador seleccionable adicional es una dihidrofolato-reductasa (DHFR) o una enzima que actúa

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después o junto con DHFR tal como la timidilato-sintasa (TS) y serina-hidroximetiltransferasa (SHMT). Preferentemente, el marcador seleccionable adicional es una DHFR. La DHFR también se puede expresar como parte de una proteína de fusión.

Utilizar una combinación respectiva de marcadores de selección, es decir, el receptor de folato mutado de acuerdo con la presente divulgación y un marcador seleccionable adicional que participa en el metabolismo del folato como se ha descrito anteriormente, preferentemente DHFR, proporciona un sistema de selección muy riguroso para obtener células con una producción elevada y conseguir un enriquecimiento en estas a partir de la población de células hospedadoras transfectadas. Este concepto de utilizar un receptor de folato como marcador seleccionable combinado con un marcador seleccionable adicional que participa en el metabolismo del folato, tal como, preferentemente, DHFR, y las ventajas asociadas se divulgan en el documento WO 2010/097240. Como se muestra en los ejemplos, la rigurosidad elevada del sistema de selección de acuerdo con esta realización reduce considerablemente el número de bajos productores en la población obtenida después de la selección y, de esta manera, aumenta la probabilidad de detectar los clones sobreproductores muy infrecuentes. Además, se obtiene una población más homogénea de células con producción elevada después de la selección lo que reduce la laboriosidad del cribado. Esto simplifica la obtención de clones a partir de células únicas de células con producción elevada. Tal como se muestra en los ejemplos, utilizar el receptor de folato mutado como se describe en la presente combinado con un marcador seleccionable adicional que participa en el metabolismo del folato como se ha descrito anteriormente, preferentemente, DHFR, da lugar a resultados mejores en comparación con la utilización del receptor de folato no modificado combinado con tal marcador seleccionable. Por lo tanto, también cuando se utiliza una combinación de marcadores seleccionables respectivos, la presente divulgación proporciona ventajas significativas debido al uso de un receptor de folato mutado.

Como se ha analizado anteriormente, el marcador seleccionable adicional preferentemente es una enzima DHFR. En la técnica anterior se conocen varias enzimas de tipo DHFR adecuadas y en consecuencia genes que se pueden utilizar como marcador seleccionable junto con la presente divulgación. Los términos «dihidrofolato-reductasa» o «DHFR» se refieren a la DHFR no modificada así como también a enzimas de tipo DHFR que tienen uno o más intercambios en la secuencia de aminoácidos (por ejemplo, deleciones, sustituciones o adiciones) con respecto a la secuencia de aminoácidos de la enzima DHFR no modificada correspondiente, proteínas de fusión que comprenden una enzima DHFR y enzimas DHFR que han sido modificadas para proporcionar una estructura y/o función adicionales, así como también fragmentos funcionales de los anteriores, que siguen teniendo al menos una función de una enzima DHFR. Dichas realizaciones son bien conocidas en la técnica anterior y, por lo tanto, no es necesario describirlas detalladamente. Por ejemplo, se puede utilizar una enzima DHFR como marcador seleccionable que sea más o menos sensible a antifolatos tales como MTX que la enzima DHFR no modificada y/o la enzima DHFR expresada de forma endógena por la célula hospedadora, si se expresa. Las enzimas DHFR respectivas son muy conocidas en la técnica anterior y se describen, por ejemplo, en el documento EP 0246049 y en otros documentos. La enzima DHFR se puede obtener a partir de cualquier especie siempre que sea funcional en la presente invención, es decir, compatible con la célula hospedadora de mamífero utilizada. Por ejemplo, se ha utilizado ampliamente una DHFR de ratón mutante con una resistencia significativa a MTX como un marcador seleccionable dominante en células de mamífero. Se puede utilizar una enzima DHFR como marcador seleccionable que sea menos susceptible a un inhibidor de DHFR tal como MTX que la enzima DHFR expresada de forma endógena en una célula hospedadora DHFR+ (más) y, por tanto, una célula hospedadora que comprenda un gen de DHFR endógeno funcional. De acuerdo con una realización, se coloca un intrón o un fragmento de este en el extremo 3' del marco abierto de lectura del gen de DHFR. El intrón utilizado en el casete de expresión de DHFR conduce a una variante no funcional más pequeña del gen de DHFR (Grillari et al., 2001, J. Biotechnol. 87, 59-65). De ese modo, el nivel de expresión del gen de DHFR se reduce, lo que aumenta adicionalmente la rigurosidad de la selección. Se describen métodos alternativos que hacen uso de un intrón para reducir el nivel de expresión del gen de DHFR en el documento EP 0724639 y también se podrían utilizar.

El polinucleótido que codifica el marcador seleccionable adicional se puede ubicar en el mismo vector de expresión que el polinucleótido que codifica el receptor de folato mutado y/o el al menos un polinucleótido que codifica el polipéptido de interés o se puede ubicar en un vector de expresión separado si se utiliza una combinación de vectores de expresión. En este caso, se utilizaría la combinación de vectores de expresión que comprende todos los polinucleótidos (que codifican el receptor de folato mutado, el polipéptido de interés y el marcador seleccionable adicional) para la cotransfección de las células hospedadoras para permitir la selección.

De acuerdo con una realización preferida, el vector de expresión o combinación de vectores de expresión comprende

- un polinucleótido que codifica un receptor de folato mutado que comprende al menos una mutación que corresponde desde un punto de vista estructural o según la posición aminoacídica al aminoácido 49 de la secuencia no modificada madura del receptor de folato alfa humano (véase la SEQ ID NO 1), donde dicha mutación disminuye la afinidad de unión al folato en comparación con el receptor de folato alfa no modificado, donde, preferentemente, la alanina presente en la secuencia no modificada en dicha posición es sustituida por leucina, y

- un polinucleótido que codifica una DHFR que es menos sensible a MTX que la enzima DHFR no modificada y/o la enzima DHFR expresada de forma endógena por la célula hospedadora como marcador seleccionable adicional.

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Dicha DHFR también comprende, preferentemente, un intrón como se ha descrito anteriormente. Se prefiere especialmente una combinación de marcadores respectivos si se utilizan células DHFR (más) como células hospedadoras. Las células DHFR (más) expresan una DHFR endógena. Como se muestra en los ejemplos, se pueden seleccionar eficazmente clones de células con una producción muy elevada cuando se utiliza un vector o combinación de vectores de expresión respectivos.

El vector de expresión o combinación de al menos dos vectores de expresión de acuerdo con la presente divulgación puede comprender además uno o más polinucleótidos adicionales que codifican un marcador seleccionable. Tal marcador seleccionable adicional puede estar presente además del receptor de folato mutado y el marcador seleccionable adicional que participan en el metabolismo del folato, que preferentemente es DHFR.

Además de marcadores seleccionables eucarióticos adicionales que permitan la selección de células hospedadoras eucariotas, en el vector de expresión o combinación de vectores de expresión también pueden estar presentes marcadores seleccionables procarióticos. Esto, por ejemplo, permite la amplificación del vector o vectores en procariotas. Un «marcador seleccionable procariótico» es un marcador seleccionable que permite la selección en células hospedadoras procariotas en condiciones de selección apropiadas. Son ejemplos de marcadores seleccionables procarióticos respectivos los marcadores que proporcionan una resistencia a antibióticos tales como, por ejemplo, ampicilina, kanamicina, tetraciclina y/o cloranfenicol.

Elementos de vectores adicionales y realizaciones del vector o vectores de expresión

El vector de expresión o la combinación de al menos dos vectores de expresión puede comprender además elementos vectoriales adicionales. Por ejemplo, puede comprender al menos un polinucleótido adicional que codifica un polipéptido de interés adicional. Según se ha explicado anteriormente y según resulta evidente a partir de los ejemplos descritos de polipéptidos que se pueden expresar, el polipéptido final que ha de ser producido y secretado por la célula hospedadora también puede ser una proteína que esté compuesta por varias subunidades o dominios individuales. Un ejemplo preferido de una proteína respectiva es una molécula de inmunoglobulina, en particular un anticuerpo que comprende, por ejemplo, cadenas pesadas y ligeras. Existen varias opciones para producir una proteína respectiva que esté compuesta por diferentes subunidades o dominios individuales y en la técnica se conocen diseños de vectores adecuados. De acuerdo con una realización, se expresan dos o más subunidades o dominios de dicha proteína a partir de un casete de expresión. En esta realización, se obtiene un transcrito largo a partir del casete de expresión respectivo que comprende las regiones codificantes de las subunidades o dominios individuales de la proteína. De acuerdo con una realización, al menos un elemento IRES (siglas en inglés referentes al sitio de entrada interna de ribosomas) está ubicado funcionalmente entre las regiones codificantes de las subunidades o dominios individuales y cada región codificante va precedida por una secuencia líder secretora. De este modo, se garantiza que se obtengan productos de traducción por separado a partir de dicho transcrito y que la proteína final se pueda agrupar y secretar correctamente. En la técnica anterior existe constancia de las tecnologías respectivas y, por lo tanto, no es necesaria una descripción detallada en la presente.

Sin embargo, también está dentro del alcance de la presente divulgación y para algunas realizaciones tales como la expresión de anticuerpos, se prefiere incluso expresar las subunidades o dominios individuales a partir de diferentes casetes de expresión. De acuerdo con una realización, el casete de expresión utilizado para expresar el polipéptido de interés es un casete de expresión monocistrónico. Preferentemente, todos los casetes de expresión comprendidos en el vector de expresión o combinación de vectores de expresión son monocistrónicos. Por consiguiente, de acuerdo con una realización, cada casete de expresión comprende un polinucleótido que codifica una subunidad o dominio de la proteína que se va a expresar como polipéptido de interés. Por ejemplo, en el caso de anticuerpos, un casete de expresión codifica la cadena ligera del anticuerpo y otro casete de expresión codifica la cadena pesada del anticuerpo. Tras la expresión de las subunidades/dominios individuales a partir de los casetes de expresión individuales, la proteína final tal como un anticuerpo se agrupa a partir de dichas subunidades o dominios y es secretada a partir de la célula hospedadora. Esta realización es particularmente adecuada para expresar moléculas de inmunoglobulina tales como anticuerpos. En este caso, un primer polinucleótido que codifica un polipéptido de interés codifica, por ejemplo, la cadena pesada o ligera de una molécula de inmunoglobulina y un segundo polinucleótido que codifica un polipéptido de interés codifica la otra cadena de la molécula de inmunoglobulina. De acuerdo con una realización, el vector de expresión o combinación de al menos dos vectores de expresión comprende al menos un casete de expresión que comprende un polinucleótido que codifica la cadena pesada de una molécula de inmunoglobulina o un fragmento funcional de esta y al menos un casete de expresión que comprende un polinucleótido que codifica la cadena ligera de una molécula de inmunoglobulina o un fragmento funcional de esta. Dichos polinucleótidos pueden estar ubicados en el mismo vector de expresión o en diferentes en el caso de que se use una combinación de al menos dos vectores de expresión. Tras la expresión de dichos polinucleótidos en la célula hospedadora transfectada, se obtiene una molécula de inmunoglobulina funcional y esta se secreta a partir de la célula hospedadora.

Los vectores de expresión utilizados para expresar productos recombinantes de interés normalmente contienen elementos de elementos de control de la transcripción de un casete de expresión adecuados para dirigir la transcripción tales como, por ejemplo, promotores, potenciadores, señales de poliadenilación, señales de pausa o terminación de la transcripción como elementos de un casete de expresión. Preferentemente, se incluyen elementos adecuados de control de la traducción tales como, por ejemplo, regiones no traducidas 5' que dan lugar a estructuras de caperuza 5' adecuadas para captar ribosomas y codones de parada con el fin de terminar el proceso de traducción. Los transcritos resultantes del gen o los genes marcadores seleccionables y el del polipéptido de interés albergan elementos de traducción funcionales que facilitan niveles sustanciales de expresión proteínica (es decir, traducción) y una terminación de la traducción apropiada. Una unidad de expresión funcional, capaz de dirigir de forma apropiada la expresión de un polinucleótido incorporado también se denomina «casete de expresión» en la presente. El polinucleótido o los polinucleótidos que codifica el polipéptido de interés que se va a secretar y los polinucleótidos que codifican el marcador o los marcadores seleccionables como se describen en la presente están comprendidos preferentemente en un casete de expresión. Varias realizaciones son adecuadas, por ejemplo, cada uno de dicho polinucleótido o polinucleótidos puede estar comprendido en un casete de expresión por separado. Sin embargo, al menos dos de los polinucleótidos respectivos también pueden estar comprendidos en un casete de expresión. De acuerdo con una realización, al menos un elemento de sitio de entrada interno de ribosomas (IRES) está ubicado funcionalmente entre los polinucleótidos que se expresan a partir del mismo casete de expresión. De este modo, se asegura que se obtengan productos de traducción separados a partir de dicho transcrito. Las tecnologías de expresión respectivas basadas en IRES y otros sistemas bi- y policistrónicos son muy conocidos y, por lo tanto, no es necesaria una descripción adicional en la presente.

Como se ha descrito, el vector de expresión o combinación de vectores de expresión de acuerdo con la presente divulgación puede comprender al menos un promotor y/o promotor/elemento potenciador como elemento de un casete de expresión. Los promotores se pueden dividir en dos clases, los que funcionan de forma constitutiva y los que están regulados por inducción o desrepresión. Ambos son adecuados junto con el contenido de la presente. Los promotores utilizados para la producción en niveles altos de proteínas en células de mamífero deben ser potentes y preferentemente activos en una gran diversidad de tipos celulares. Los promotores constitutivos potentes que dirigen la expresión en muchos tipos celulares incluyen, entre otros, el promotor tardío principal de adenovirus, el promotor temprano inmediato de citomegalovirus humano, el promotor de SV40 y del virus del sarcoma de Rous, y el promotor de la 3-fosfoglicerato-cinasa murina, EF1a. De acuerdo con una realización, el promotor y/o potenciador se obtiene de CMV y/o SV40. Los promotores de la transcripción se pueden seleccionar a partir del grupo constituido por un promotor de SV40, un promotor de CMV, un promotor de Eflalfa, un promotor de RSV, un promotor BROAD3, un promotor de rosa 26 murino, un promotor de pCEFL y un promotor de p-actina.

De acuerdo con una realización, el al menos un polinucleótido que codifica un polipéptido de interés, el polinucleótido que codifica un receptor de folato mutado y/o el polinucleótido que codifica un segundo marcador seleccionable están controlados por promotores de la transcripción separados. Los promotores de la transcripción separados que dirigen la expresión a partir de los polinucleótidos pueden ser los mismos o diferentes.

De acuerdo con una realización, se utiliza un promotor y/o potenciador para dirigir la expresión del al menos un polinucleótido que codifica el polipéptido de interés más potente que para dirigir la expresión del polinucleótido que codifica el receptor de folato mutado y/o el uno o más marcadores seleccionables adicionales. Esta configuración tiene el efecto de generar más transcrito del polipéptido de interés que de los marcadores seleccionables. Resulta conveniente que la producción del polipéptido de interés sea dominante respecto a la producción de los marcadores seleccionables, ya que la capacidad celular individual para producir productos heterólogos no es ilimitada y, por lo tanto, se debería centrar en el polipéptido de interés. Además, el proceso de selección solo se produce en las etapas iniciales del establecimiento de una línea celular de expresión, que a continuación produce constantemente el polipéptido de interés. Por lo tanto, resulta conveniente centrar los recursos de las células en la expresión/producción del polipéptido de interés. Además, si se utiliza un promotor menos potente para la expresión del marcador seleccionable que el utilizado para la expresión del polipéptido de interés se aumenta adicionalmente la presión de selección sobre las células hospedadoras transfectadas

De acuerdo con una realización, el promotor que dirige la expresión del polinucleótido o los polinucleótidos que codifican el polipéptido de interés es un promotor de c Mv y el promotor que impulsa la expresión del polinucleótido que codifica el receptor de folato mutado es un promotor de SV40. Se sabe que el promotor de CMV es uno de los promotores más potentes disponibles para la expresión en mamíferos y conduce a una tasa de expresión muy buena. Se considera que proporciona significativamente más transcrito que el promotor de SV40. Sin embargo, también se pueden utilizar otros promotores.

De acuerdo con una realización adicional, el al menos un polinucleótido que codifica el polipéptido de interés y el polinucleótido que codifica el receptor de folato mutado y/o el polinucleótido que codifica un marcador seleccionable, si está presente, están controlados por el mismo promotor de la transcripción. Anteriormente, se han descrito promotores adecuados. En esta realización, se obtiene un transcrito largo a partir del casete de expresión respectivo que está controlado por dicho promotor de la transcripción. De acuerdo con una realización, al menos un elemento IRES está ubicado funcionalmente entre los polinucleótidos que se expresan a partir del mismo casete de expresión.

El vector de expresión o combinación de al menos dos vectores de expresión puede comprender un sitio de terminación de la transcripción adecuado como elemento de un casete de expresión. Esto, como la transcripción continuada desde un promotor en dirección 5' a través de una segunda unidad de transcripción puede inhibir la función del promotor en dirección 3', un fenómeno conocido como la oclusión del promotor o interferencia transcripcional. Los sitios de terminación de la transcripción están bien caracterizados y se ha mostrado que su incorporación a vectores de expresión tiene múltiples efectos beneficiosos sobre la expresión génica.

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Los casetes de expresión pueden comprender un sitio de poliadenilación. Existen varias señales de poliA eficaces que se pueden utilizar en vectores de expresión de mamífero, que incluyen las obtenidas a partir de la hormona del crecimiento bovina (bgh, por sus siglas en inglés), beta-globina de ratón, la unidad de transcripción temprana de SV40 y el gen de la timidina-cinasa del virus del herpes simple. Sin embargo, también se conocen sitios de poliadenilación sintéticos (véase, por ejemplo, el vector de expresión pCI-neo de Promega que se basa en Levitt el al., 1989, Genes Dev. 3, (7): 1019-1025). El sitio de poliadenilación se puede seleccionar del grupo que consiste en el sitio de poliA de SV40, tal como el sitio de poli-A tardío y temprano de SV40 (véase, por ejemplo, el plásmido pSV2-DHFR como se describe en Subramani et al., 1981, Mol.Cell. Biol. 854-864), un sitio de poliA sintético (véase, por ejemplo, el vector de expresión pCI-neo de Promega que se basa en Levitt el al., 1989, Genes Dev. 3, (7): 1019-1025) y un sitio de poliA de bgh (hormona del crecimiento bovina).

Además, un casete de expresión puede comprender al menos un intrón. Habitualmente, los intrones se colocan en el extremo 5' del marco abierto de lectura, pero también se pueden colocar en el extremo 3'. Por consiguiente, un intrón puede estar comprendido en el casete o los casetes de expresión para aumentar la tasa de expresión. Dicho intrón puede estar ubicado entre el promotor y o un elemento o elementos promotores/potenciadores y el extremo 5' del marco abierto de lectura del polinucleótido que se va a expresar. Se conocen varios intrones adecuados en el estado de la técnica que se pueden utilizar junto con la presente divulgación. De acuerdo con una realización, el intrón utilizado en los casetes de expresión para expresar el polipéptido de interés, es un intrón sintético tal como el intrón SIS o el RK. El intrón RK consiste en el sitio de corte y empalme donante intrónico del promotor de CMV y el sitio de corte y empalme aceptor de la región variable de cadena pesada de IgG de ratón (véanse, por ejemplo, Eaton et al., 1986, Biochemistry 25, 8343-8347, Neuberger et al., 1983, EMBO J. 2(8), 1373-1378; se puede obtener a partir del vector pRK-5 (BD PharMingen)) y se sitúa preferentemente antes del cordón de inicio ATG del gen de interés.

El vector de expresión o combinación de vectores de acuerdo con la presente divulgación se puede utilizar en su forma circular o en una forma linealizada para transformar la célula hospedadora. La linealización del vector de expresión antes de la transfección a menudo mejora la eficacia de una transfección estable. Esto también ya que el punto de linealización se puede controlar si el vector de expresión se linealiza antes de la transfección. Se describen en diseños adecuados para dicho sitio de linealización, por ejemplo, en el documento WO 2009/080720. El vector o vectores de expresión también pueden comprender un origen de replicación procariótico.

El vector de expresión o combinación de vectores de expresión de acuerdo con la presente divulgación puede comprender elementos adicionales para permitir la combinación del método de selección de acuerdo con la presente divulgación que se basa en el uso del receptor de folato mutado con otros sistemas de selección conocidos en la técnica anterior.

Un método de selección consolidado conocido en la técnica anterior se basa en el uso de la citometría de flujo, en particular clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS, por sus siglas en inglés) para seleccionar células hospedadoras con una expresión elevada. Los métodos de selección que emplean la citometría de flujo tienen la ventaja de que se pueden cribar rápidamente grandes cantidades de células para detectar el rendimiento de expresión característico deseado. En un método de selección que es particularmente útil para identificar clones de células con producción elevada, una porción del polipéptido de interés, por ejemplo, un anticuerpo, se expresa como un polipéptido de fusión unido a la membrana. Por lo tanto, una porción del producto se muestra como polipéptido de fusión en la superficie celular. Ya que la cantidad de polipéptido de fusión producido se correlaciona con la tasa de expresión global, las células hospedadoras se pueden seleccionar mediante citometría de flujo basándose en la cantidad de polipéptido de fusión mostrado en la superficie celular. Esto permite la rápida selección de las células hospedadoras con una producción elevada. El sistema de selección de acuerdo con la presente divulgación se puede combinar convenientemente con métodos de selección respectivos que se basan en el uso de la citometría de flujo. Para permitir una selección eficaz utilizando FACS, se utiliza preferentemente un casete de expresión especial para expresar el polipéptido de interés. Por lo tanto, de acuerdo con una realización, el polinucleótido que codifica el polipéptido de interés está comprendido en un casete de expresión que se diseña de manera que una porción del polipéptido de interés expresado comprenda un anclaje transmembrana. Existen varias opciones para conseguir ese resultado.

De acuerdo con una realización, dicho casete de expresión para expresar el polipéptido de interés comprende al menos

(i) el polinucleótido que codifica el polipéptido de interés,

(ii) al menos un codón de parada en dirección 3' respecto al polinucleótido que codifica el polipéptido de interés, y

(iii) un polinucleótido adicional en dirección 3' respecto al codón de parada que codifica un anclaje a la membrana y/o una señal para un anclaje a la membrana.

La transcripción del polinucleótido que codifica el polipéptido de interés comprendido en el casete de expresión descrito anteriormente da lugar a un transcrito que comprende, en orden consecutivo, al menos

(i) un polinucleótido, donde la traducción de dicho polinucleótido da como resultado el polipéptido de interés;

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(ii) al menos un codón de parada en dirección 3' respecto a dicho polinucleótido;

(iii) un polinucleótido en dirección 3' respecto a dicho codón de parada, que codifica un anclaje a la membrana y/o una señal para un anclaje a la membrana.

Una porción del transcrito se traduce para generar un polipéptido de fusión que comprende el polipéptido de interés y el anclaje a la membrana mediante ultratraducción (translationalread-through) del al menos un codón de parada. Este diseño del casete de expresión tiene el efecto de que mediante los procesos de ultratraducción (el codón de parada no detiene la traducción) se produce una porción del polipéptido de interés como un polipéptido de fusión que comprende un anclaje a la membrana. El resto se expresa como el polipéptido de interés secretado. El polipéptido de fusión se presenta en la superficie celular y las células que muestran niveles elevados del polipéptido de fusión anclado a la membrana se pueden seleccionar mediante citometría de flujo, preferentemente, mediante FACS, por ejemplo, utilizando técnicas de tinción de la superficie celular apropiadas. De este modo, se seleccionan las células hospedadoras que tienen una tasa de expresión elevada. En los documentos WO2005/073375 y WO2010/022961 se describen detalles y realizaciones preferidas de esta tecnología que utiliza codones de parada. Se hace referencia a esta divulgación.

De acuerdo con una realización, el casete de expresión comprende además (iv) un polinucleótido que codifica un indicador, tal como, por ejemplo, GFP. Dicho polinucleótido que codifica el indicador se ubica en dirección 3' respecto al codón de parada. Tras la ultralectura más allá del codón de parada se obtiene un polipéptido de fusión que comprende el indicador, y de esta manera es posible la selección mediante citometría de flujo basándose en las características del indicador expresado tal como, por ejemplo, su fluorescencia. Preferentemente, el polinucleótido que codifica el indicador se ubica en dirección 3' respecto al polinucleótido que codifica un anclaje a la membrana.

De acuerdo con una realización alternativa dicho casete de expresión comprende al menos

(i) el polinucleótido que codifica el polipéptido de interés,

(ii) el intrón que comprende un sitio de corte y empalme donante 5' y un sitio de corte y empalme aceptor 3' y que comprende un codón de parada de la traducción dentro del marco de lectura y una señal de poliadenilación y

(iii) un polinucleótido en dirección 3' respecto a dicho intrón que codifica un anclaje a la membrana y/o una señal para un anclaje a la membrana.

El diseño del casete de expresión tiene el efecto de que mediante la transcripción y el procesamiento del transcrito se obtienen al menos dos ARNm maduros diferentes (ARNm-POI) y (ARNm-POI-ANCLAjE) a partir del casete de expresión. La traducción del ARNm-POI da como resultado el polipéptido de interés. La traducción del ARNm-POI-ANCLAJE da como resultado un polipéptido de fusión que comprende el polipéptido de interés (POI, por sus siglas en inglés) y un anclaje a la membrana. Como resultado, este polipéptido de fusión se presenta de nuevo en la superficie celular y las células que presentan niveles elevados de polipéptido de fusión anclado a membrana se pueden seleccionar por citometría de flujo, preferentemente FACS. De este modo, se seleccionan las células hospedadoras que tienen una tasa de expresión elevada. En el documento WO2007/131774 se describen detalles y realizaciones preferidas de esta tecnología que utiliza intrones. Se hace referencia a esta divulgación. De acuerdo con una realización, el casete de expresión comprende además (iv) un polinucleótido que codifica un indicador, tal como, por ejemplo, GFP. Dicho polinucleótido que codifica el indicador está ubicado en dirección 3' respecto al intrón. De esta manera, se obtiene un polipéptido de fusión que comprende el indicador, para permitir de este modo la selección por citometría de flujo basándose en las características del indicador, tal como, por ejemplo, su fluorescencia. Preferentemente, el polinucleótido que codifica el indicador se ubica en dirección 3' respecto al polinucleótido que codifica un anclaje a la membrana. De este modo, el indicador está ubicado dentro de la célula hospedadora.

De acuerdo con una realización, el casete de expresión se construye de modo que se obtenga aproximadamente < 50 %, < 25 %, < 15 %, < 10 %, < 5 %, < 2,5 %, < 1,5 %, < 1 % o menos de < 0,5 % de polipéptido de fusión. La porción restante se produce como la forma polipeptídica secretada que no comprende el anclaje a la membrana. El anclaje a la membrana puede ser de cualquier tipo siempre que posibilite el anclaje del polipéptido de interés a la membrana celular y, por tanto, permite la presentación del polipéptido de fusión sobre la superficie celular. Las realizaciones adecuadas incluyen, entre otros, un anclaje de GPI o un anclaje transmembrana. Se prefiere un anclaje transmembrana para asegurar una unión fuerte del polipéptido de fusión a la superficie celular y para evitar el desprendimiento de la proteína de fusión. Es particularmente preferido, en particular cuando se expresan anticuerpos como polipéptido de interés, el uso de un anclaje transmembrana de inmunoglobulina. Se describen otros anclajes de membrana y realizaciones preferidas de un anclaje transmembrana de inmunoglobulina en los documentos WO 2007/131774, WO 2005/073375 y WO 2010/022961.

De acuerdo con una realización, el polipéptido de interés es una molécula de inmunoglobulina tal como un anticuerpo. El polinucleótido que codifica la cadena pesada de una molécula de inmunoglobulina y el polinucleótido que codifica la cadena ligera de una molécula de inmunoglobulina pueden estar comprendidos en el mismo casete de expresión o,

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preferentemente, están comprendidos en casetes de expresión separados como se ha descrito anteriormente. Cuando se utiliza un casete de expresión diseñado como se ha descrito anteriormente, donde una porción del polipéptido de interés se produce como un polipéptido de fusión anclado a la membrana mediante ultratraducción o corte y empalme alternativo, tal diseño del casete de expresión se utiliza para expresar la cadena pesada del anticuerpo.

Las células hospedadoras

De acuerdo con un segundo aspecto, la presente divulgación proporciona una célula hospedadora cuya viabilidad depende de la captación de folato que comprende al menos

y

b) un polinucleótido introducido que codifica un polipéptido de interés,

Un «polinucleótido introducido» se refiere a una secuencia polinucleotídica que se ha introducido en una célula hospedadora, por ejemplo, mediante el uso de técnicas recombinantes tales como transfección. La célula hospedadora puede comprender o no un polinucleótido endógeno que corresponde funcionalmente al polinucleótido introducido o que es idéntico a este. Preferentemente, la introducción se consigue utilizando un vector de expresión que comprende un casete de expresión que comprende el polinucleótido que se va a introducir, por ejemplo, que codifica el polipéptido de interés o que codifica un receptor de folato mutado. Los ejemplos preferidos de vectores de expresión y combinación de vectores de expresión de acuerdo con la presente divulgación se han descrito anteriormente junto con el primer aspecto de la presente divulgación. La introducción se puede lograr, por ejemplo, transfectando con un vector de expresión adecuado que se pueda integrar en el genoma de la célula hospedadora (transfección estable). Si el polinucleótido no se inserta en el genoma, se puede perder en una etapa posterior, por ejemplo, cuando las células experimentan mitosis (transfección transitoria). También se pueden mantener vectores adecuados en la célula hospedadora sin integración en el genoma, por ejemplo, mediante replicación episómica. Se prefiere la transfección estable para generar clones celulares con expresión elevada que sean adecuados para producir un polipéptido de interés a escala industrial. Existen varios métodos apropiados conocidos en la técnica anterior para introducir un polinucleótido tal como un vector de expresión en células hospedadoras eucariotas. Los métodos respectivos incluyen, entre otros, transfección con fosfato de calcio, electroporación, nucleofección, lipofección, transferencia de genes mediada por polímeros y biolística y similares. Además de los métodos tradicionales basados en una integración aleatoria, también se pueden utilizar estrategias mediadas por recombinación para transferir el polinucleótido que se va a introducir en el genoma de la célula hospedadora. Ya que los métodos respectivos son muy conocidos en la técnica anterior, no es necesaria una descripción detallada en la presente. Sin embargo, en la técnica anterior también se conocen otras técnicas para introducir un polinucleótido en una célula hospedadora las cuales se describen más detalladamente a continuación.

De acuerdo con una realización, la célula hospedadora comprende un vector de expresión o combinación de al menos dos vectores de expresión de acuerdo con el primer aspecto que se describe detalladamente en secciones previas y en las reivindicaciones. Los autores refieren a dicha divulgación que también se aplica aquí. Preferentemente, dicho vector o combinación de vectores de expresión se integra de manera estable en el genoma.

Para permitir la selección con el sistema de acuerdo con la presente divulgación, la viabilidad celular de la célula hospedadora debe depender de la captación de folato, preferentemente de la captación de ácido fólico. Se pueden seleccionar células eucariotas adecuadas del grupo que consiste en células de mamífero, células de insecto, células de levadura, células vegetales y células de hongos. Las células de hongos y células vegetales pueden ser prototróficas para folatos (es decir, tales células que pueden sintetizar de manera autónoma sus propios folatos necesarios para su viabilidad celular, es decir, el crecimiento y la proliferación celulares). La presente divulgación engloba tales células de hongos y vegetales que son o se vuelven auxotróficas para folatos. Esto se puede ver, por ejemplo, debido a la manipulación genética, es decir, células que entonces son incapaces de sintetizar suficientes cantidades de los folatos necesarios para su viabilidad celular. Preferentemente, la célula hospedadora es una célula de mamífero. Todas las células de mamífero dependen de la captación de folato y, en consecuencia, se pueden utilizar junto con el sistema de selección descrito en la presente. De acuerdo con una realización, la célula de mamífero se selecciona del grupo que consiste en una célula de roedor, una célula humana y una célula de mono. Se prefiere especialmente una célula de roedor, que se puede seleccionar del grupo que consiste en una célula CHO, una célula BHK, una célula NS0, una célula de fibroblasto 3T3 de ratón y una célula SP2/0. Una célula de roedor especialmente preferida es una célula CHO. Las células humanas también se pueden utilizar y se pueden seleccionar del grupo que consiste en una célula HEK293, una célula MCF-7, una célula PerC6, una célula CAP y una célula HeLa. Las células de mono se pueden seleccionar del grupo que consiste en una célula COS-1, una COS-7 y una célula Vero.

De acuerdo con una realización, la célula hospedadora carece de la actividad completa de al menos un receptor de folato endógeno. Se pueden obtener las líneas celulares respectivas mediante procesos de selección/cribado o mediante técnicas de ingeniería genética, por ejemplo, con el fin de generar líneas celulares con genes inactivados. Por lo tanto, también se proporciona una célula hospedadora, donde el sistema de transporte de folato funcional unidireccional endógeno, por ejemplo, que comprende al menos un receptor de folato endógeno, carece de una actividad completa, por ejemplo, está atenuado. Se puede proporcionar una atenuación de este tipo, por ejemplo, mediante cualquier tipo de mutagénesis del sistema de transporte de folato endógeno en cuestión, por ejemplo, el receptor de folato endógeno, por ejemplo, mediante mutación puntual, alteración de genes y similares. La atenuación puede ser parcial o completa. En este caso, la célula hospedadora de acuerdo con la presente divulgación no comprende un sistema de transporte de folato funcional unidireccional funcional endógeno, por ejemplo, un receptor de folato endógeno.

De acuerdo con una realización preferida, sin embargo, la célula hospedadora de acuerdo con la presente divulgación comprende al menos un sistema de transporte de folato funcional unidireccional funcional endógeno además del receptor de folato mutado que se introduce en dicha célula hospedadora, por ejemplo, mediante el vector de expresión o combinación de vectores de expresión descritos anteriormente, en particular uno o más receptores de folato endógenos. Por lo tanto, se pueden utilizar células no alteradas genéticamente para la transfección con el vector de expresión o combinación de vectores de expresión de acuerdo con la presente divulgación. Es una ventaja de la presente divulgación que el sistema de selección descrito en la presente se puede utilizar incluso en presencia de tal sistema de transporte de folato funcional unidireccional endógeno, es decir, cuando se conserve un sistema endógeno de este tipo. Esto supone una ventaja, ya que el uso de las células hospedadoras respectivas para la producción posterior del polipéptido de interés que se produce en condiciones no selectivas para folato es más fácil de manejar si el sistema endógeno se conserva y, por lo tanto, es funcional. Como se ha descrito anteriormente, se prefieren las células hospedadoras de mamífero.

En consecuencia, también se proporciona una célula hospedadora, que comprende al menos un sistema de transporte de folato funcional unidireccional endógeno, donde tal sistema de transporte de folato funcional unidireccional endógeno comprende preferentemente al menos un receptor de folato endógeno. En una realización preferida de esto, el receptor de folato endógeno se selecciona del grupo que consiste en el receptor de folato alfa y el receptor de folato beta.

De acuerdo con una realización, la célula hospedadora comprende además un polinucleótido introducido que codifica un marcador seleccionable adicional que participa en el metabolismo del folato. Se han descrito anteriormente realizaciones conjuntamente con el primer aspecto y se remite a la divulgación anterior. Preferentemente, dicho marcador seleccionable adicional es una DHFR. En conjunto con esta realización, se pueden utilizar por ejemplo, células hospedadoras (por ejemplo, células CHO) que carecen del gen de DHFR (por ejemplo, mediante deleción genómica dirigida, también denominadas células hospedadoras DHFR -(menos)), como receptores para la cotransfección con el gen DHFR como marcador seleccionable. Sin embargo, también es posible y se prefiere el uso de células hospedadoras que expresen DHFR endógenamente (células hospedadoras DHFR (más)) cuando se realiza una selección con DHFR. En este caso, se utiliza preferentemente una enzima DHFR como marcador seleccionable que es menos sensible a MTX que la enzima DHFR endógena expresada por la célula hospedadora DHFR (más).

De acuerdo con una realización, el metabolismo endógeno de folato o la maquinaria de la célula hospedadora no se altera genéticamente antes de la introducción de los polinucleótidos mediante transfección.

El al menos un polinucleótido que codifica el polipéptido de interés, el polinucleótido que codifica el receptor de folato mutado y opcionalmente el polinucleótido que codifica el marcador seleccionable adicional que participa en el metabolismo del folato (que preferentemente es DHFR) y opcionalmente polinucleótidos adicionales como se ha descrito anteriormente junto con el primer aspecto se pueden introducir de manera estable en dicha célula hospedadora. La introducción estable respectivamente transfección supone una ventaja para establecer líneas celulares de expresión y, en particular, para la producción a gran escala de un polipéptido de interés secretado, tal como un anticuerpo.

Métodos para producir células hospedadoras recombinantes

De acuerdo con un tercer aspecto, se divulga un método para producir una célula hospedadora de acuerdo con el segundo aspecto, que comprende introducir en una célula hospedadora, cuya viabilidad depende de la captación de folato, al menos

y

Existen varios métodos apropiados conocidos en la técnica anterior para introducir polinucleótidos y vectores de expresión en células hospedadoras, incluidas células hospedadoras eucariotas tales como células hospedadoras de mamífero. En la técnica anterior se conocen los métodos respectivos y estos también se han descrito anteriormente. Además de los métodos tradicionales basados en una integración aleatoria, también se pueden utilizar estrategias mediadas por recombinación para transferir el polinucleótido que codifica el polipéptido de interés, el polinucleótido que codifica el receptor de folato mutado y opcionalmente el polinucleótido que codifica un marcador seleccionable adicional (y/o polinucleótidos adicionales) al genoma de la célula hospedadora. Tales métodos de recombinación pueden incluir el uso de recombinansas específicas del sitio como Cre, Flp o OC31 (véase, por ejemplo, Oumard et al., Cytotechnology (2006) 50: 93 - 108) que pueden mediar en la inserción directa de transgenes. Como alternativa, se puede utilizar el mecanismo de recombinación homóloga para insertar dichos polinucleótidos (objeto de revisión en Sorrell et al., Biotechnology Advances 23 (2005) 431 - 469). La inserción de genes basada en recombinación permite minimizar el número de elementos que se van a incluir en el ácido nucleico heterólogo que se transfiere/introduce en la célula hospedadora. Por ejemplo, se puede utilizar un locus de inserción que ya proporcione un promotor y un sitio de poliA (exógeno o endógeno) de modo que solo sea necesario transferir los elementos restantes a la célula hospedadora/solo sean necesarios los elementos restantes para transfectar la célula hospedadora. Los detalles respecto al polipéptido de interés, el receptor de folato mutado y uno o más marcadores seleccionables (si se utilizan), así como combinaciones de estos, se han descrito en detalle anteriormente; los autores remiten a la divulgación anterior. De acuerdo con una realización, se introduce un vector de expresión o una combinación de vectores de expresión de acuerdo con el primer aspecto en la célula hospedadora. El vector de expresión y la combinación de vectores de expresión se describe en detalle en partes anteriores y en las reivindicaciones. Se remite a la divulgación respectiva. Además, también se han descrito anteriormente ejemplos adecuados de células hospedadoras cuya viabilidad depende de la captación de folato; se remite a la divulgación respectiva.

Método de selección

De acuerdo con un cuarto aspecto, la presente divulgación proporciona un método para seleccionar al menos una célula hospedadora capaz de expresar un polipéptido de interés recombinante con alto rendimiento, que comprende

a) proporcionar una pluralidad de células hospedadoras de acuerdo con el segundo aspecto de la presente divulgación;

b) cultivar dicha pluralidad de células hospedadoras en un medio de cultivo selectivo que comprende una concentración limitante de folato;

y

El término «seleccionar» o «selección», tal como se utiliza en la presente, en particular se refiere a un proceso que utiliza un marcador seleccionable y condiciones de cultivo selectivo para seleccionar y, en consecuencia, obtener células hospedadoras que han incorporado los polinucleótidos que se van a introducir tal como el vector de expresión o combinación de vectores de acuerdo con la presente divulgación. Se pueden obtener células hospedadoras transfectadas con éxito, por ejemplo, mediante aislamiento y/o enriquecimiento a partir de una población de células hospedadoras transfectadas. Las células hospedadoras transfectadas con éxito son capaces de sobrevivir en las condiciones de selección y expresar el polipéptido de interés. El método de selección es un método ex vivo.

Una «concentración limitante de folato», como se utiliza en la presente, se refiere en particular a una concentración de folato o folatos en el medio de cultivo selectivo que proporciona una presión selectiva sobre la célula hospedadora. Por consiguiente, los folatos no están comprendidos en el medio de cultivo selectivo en abundancia, y esta limitación de folato o folatos en el medio de cultivo proporciona una presión de selección sobre las células hospedadoras. En tales condiciones de selección, básicamente solo crecen y/o proliferan las células hospedadoras que han incorporado el receptor de folato como marcador seleccionable. Las células hospedadoras que no han incorporado con éxito los polinucleótidos que se van a introducir tal como el vector de expresión o la combinación de al menos dos vectores de expresión y, por lo tanto, no expresan el receptor de folato mutado como marcador seleccionable, o donde la expresión es baja, no pueden proliferar, crecer y/o mueren en las condiciones de cultivo selectivo que proporciona una concentración limitante de folato. Por el contrario, las células hospedadoras que han incorporado con éxito el vector de expresión o la combinación de vectores de acuerdo con la presente divulgación y que expresan el receptor de folato mutado como marcador seleccionable (y en consecuencia expresan el polipéptido de interés cointroducido) con rendimiento suficiente son resistentes o se ven menos afectadas por la presión de selección y, por lo tanto, durante la selección pueden superar a las células hospedadoras que no han sido transfectadas con éxito o donde el sitio de integración en el genoma de la célula no es favorable en el caso de transfección estable.

El folato comprendido en el medio de cultivo selectivo en una concentración limitante puede ser captado e introducido en la célula hospedadora y ser procesado por esta, en particular por células hospedadoras que han incorporado el receptor de folato mutado que se utiliza como marcador seleccionable. Los folatos y, en particular, derivados de folato que no serían procesados por la célula hospedadora o que esta no puede procesar no contribuyen a la presión de selección que se ejerce para seleccionar las células hospedadoras que han incorporado el receptor de folato como marcador seleccionable y, en consecuencia, no contribuyen a la concentración limitante de folato. Sin embargo, los folatos

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respectivos tal como, por ejemplo, antifolatos, pueden estar presentes e incluso preferentemente están presentes si, por ejemplo, se realiza una selección combinada con DHFR como marcador seleccionable adicional como se ha descrito en la presente. El folato presente en el medio de cultivo selectivo en una concentración limitante puede ser, por ejemplo, un folato oxidado o un folato reducido o un derivado de este. Los folatos oxidados, tal como el ácido fólico, así como también los derivados reducidos del ácido fólico, conocidos como folatos reducidos o tetrahidrofolatos (THF), son un grupo de vitaminas B9 que son coenzimas y/o cofactores esenciales para la biosíntesis de purinas, timidilato y ciertos aminoácidos en células de mamífero. Los ejemplos de folatos reducidos incluyen ácido 5-metiltetrahidrofólico, 5-formiltetrahidrofólico, ácido 10-formiltetrahidrofólico y ácido 5,10-metilentetrahidrofólico. En general, un folato es útil siempre que la célula hospedadora pueda captar e introducir en ella tal folato y procesarlo para mantener el crecimiento y la proliferación. Preferentemente, el folato que está comprendido en una concentración limitante en el medio de cultivo selectivo es ácido fólico. Los intervalos de concentración adecuados para proporcionar una concentración limitante de folato se describen a continuación.

Durante la selección, se puede realizar un enriquecimiento en un conjunto de células hospedadoras que han incorporado con éxito el vector o los vectores de expresión de acuerdo con la presente divulgación a partir de la población de células hospedadoras transfectadas. Tal conjunto se puede, por ejemplo, analizar a continuación para identificar células hospedadoras comprendidas que expresan el polipéptido de interés y, por ejemplo, que tienen buenas tasas de expresión, características de crecimiento y/o propiedades de estabilidad particulares. Asimismo, se pueden aislar células hospedadoras individuales como clones únicos a partir de la población de células hospedadoras transfectadas y seleccionadas (por ejemplo, mediante selección clonal o selección por FACS). Las realizaciones adecuadas de procedimientos de selección con el fin de obtener clones únicos transfectados con éxito a partir de la población de células hospedadoras que han sobrevivido a la selección (por ejemplo, mediante clasificación por FACS o dilución limitante) se conoce muy bien en la técnica anterior y, en consecuencia, no es necesaria una descripción detallada.

Las realizaciones adecuadas y preferidas de las células hospedadoras, el marcador seleccionable mutado, marcadores seleccionables adicionales y combinaciones de marcadores, vectores de expresión y combinaciones de vectores se han descrito en detalle anteriormente y se remite a la divulgación anterior.

Como se ha descrito, el método de selección de acuerdo con la presente divulgación se basa en la disponibilidad limitada de folato, preferentemente ácido fólico, en el medio de cultivo celular. El sistema es ampliamente aplicable y, en particular, se puede utilizar para seleccionar células eucariotas cuya viabilidad celular dependa de la captación de folato, en particular ácido fólico, tal como en particular células de mamífero. Se han descrito anteriormente ejemplos de células de mamífero. Esta selección con folato en combinación con el uso del receptor de folato mutado como marcador seleccionable es una estrategia excelente que es muy adecuada para la sobreexpresión acelerada, estable y en un nivel elevado de polipéptidos en células de mamífero cultivadas. Como muestran los ejemplos, el método de acuerdo con la presente divulgación, donde se utiliza un receptor de folato mutado como marcador seleccionable, permite una selección, cribado y establecimiento acelerados de células hospedadoras, en particular células hospedadoras de mamífero, que sobreexpresan niveles elevados de productos recombinantes tales como anticuerpos. Los resultados son mejores respecto al uso de un receptor de folato no modificado como marcador seleccionable.

El sistema de selección de acuerdo con la presente divulgación no requiere, como se ha descrito anteriormente, una deleción genómica o atenuación del gen o genes del receptor de folato endógeno antes de la transfección y, por lo tanto, se puede aplicar a cualquier célula receptora incluso si está presente la expresión del gen del receptor de folato endógeno. Esta ventaja clave se basa en el hecho de que tras la transfección con el receptor de folato mutado como marcador seleccionable, las células se pueden exponer a una privación brusca y grave de folatos (por ejemplo, ácido fólico) en el medio de cultivo. Aquí, cuando se utiliza el receptor de folato mutado que tiene una afinidad de unión al folato menor, se pueden utilizar incluso concentraciones menores de folato en el medio de cultivo selectivo en comparación con un sistema de selección que utiliza el receptor de folato no modificado. Únicamente las células transfectadas que expresan cantidades significativas del receptor de folato mutado como marcador seleccionable pueden transportar folato suficiente al interior de la célula hospedadora para mantener la replicación del ADN y la proliferación celular. Esto ocurre incluso en ausencia de cualquier elevación significativa en la expresión del gen del receptor de folato alfa endógeno durante el ciclo de selección. Además, el sistema de selección de acuerdo con la presente divulgación aparentemente no se ve afectado por la pérdida de rigurosidad de la selección debido al alivio de la presión selectiva mediante una mayor expresión de rutas alternativas de captación de folato incluida la mayor expresión de RFC endógeno. Esta importante ventaja se debe al hecho de que mientras el receptor de folato alfa tiene una afinidad excelente por el ácido fólico (Kd = 0,1 nM), el RFC muestra una afinidad muy deficiente por el ácido fólico (Km = 0,2-0,4 mM).

Las células obtenidas como resultado del procedimiento de cribado/selección riguroso de la presente divulgación se pueden aislar a partir de las células no seleccionadas de la población celular original y obtener una población enriquecida en ellas. Se pueden aislar y cultivar como células individuales o combinados de células. Las células hospedadoras obtenidas también se pueden utilizar en uno o más ciclos de selección adicionales, opcionalmente para un análisis cualitativo o cuantitativo adicional, o se pueden utilizar, por ejemplo, en el desarrollo de una línea celular clonal para la producción de proteínas. De acuerdo con una realización, una población enriquecida de células hospedadoras productoras seleccionadas como se ha descrito anteriormente se utiliza directamente como población para la producción del polipéptido de interés con un buen rendimiento.

Preferentemente, se selecciona una célula hospedadora que expresa de manera estable y, por lo tanto secreta, el polipéptido de interés. Las ventajas de una transfección/expresión estable se han descrito en detalle anteriormente. Los autores remiten a la divulgación anterior. Preferentemente, se establece una línea celular clonal a partir de una célula hospedadora seleccionada que expresa la proteína de interés con el rendimiento elevado deseado.

El medio de cultivo selectivo que se utiliza en al menos un paso de selección b) puede comprender uno o más tipos de folato. Las células hospedadoras transfectadas pueden captar, introducir en su interior y procesar el folato comprendido en el medio de cultivo selectivo en una concentración limitante para permitir la supervivencia y, preferentemente, permitir mantener el crecimiento y la proliferación celulares. El medio de cultivo selectivo que se utiliza en el paso b) puede tener una o más de las siguientes características:

(a) comprende una concentración limitante de folato, donde dicho folato es preferentemente ácido fólico, en una concentración seleccionada entre aproximadamente 2000 nM o menos, aproximadamente 1750 nM o menos, aproximadamente 1500 nM o menos, aproximadamente 1000 nM o menos, aproximadamente 500 nM o menos, aproximadamente 350 nM o menos, aproximadamente 300 nM o menos, aproximadamente 250 nM o menos, aproximadamente 150 nM o menos, aproximadamente 100 nM o menos, aproximadamente 75 nM o menos, aproximadamente 50 nM o menos, aproximadamente 40 nM o menos, aproximadamente 35 nM o menos, aproximadamente 30 nM o menos, aproximadamente 25 nM o menos, aproximadamente 20 nM o menos, aproximadamente 15 nM o menos, aproximadamente 10 nM o menos, aproximadamente 5 nM o menos y aproximadamente 2,5 nM o menos y; y/o

(b) comprende ácido fólico en una concentración seleccionada entre aproximadamente 2000 nM o menos, aproximadamente 1750 nM o menos, aproximadamente 1500 nM o menos, aproximadamente 1000 nM o menos, aproximadamente 500 nM o menos, aproximadamente 100 nM o menos, aproximadamente 75 nM o menos, aproximadamente 50 nM o menos, aproximadamente 40 nM o menos, aproximadamente 35 nM o menos, aproximadamente 30 nM o menos, aproximadamente 25 nM o menos, aproximadamente 20 nM o menos, aproximadamente 15 nM o menos, aproximadamente 10 nM o menos, aproximadamente 5 nM o menos y aproximadamente 2,5 nM o menos.

Las concentraciones preferidas de folato y, en particular, ácido fólico en el medio de cultivo selectivo se pueden seleccionar entre:

(a) aproximadamente 2000 nM - 0,1 nM;

(b) aproximadamente 1750 nM - 0,1 nM;

(c) aproximadamente 1500 nM - 0,1 nM;

(d) aproximadamente 1250 nM - 0,1 nM;

(e) aproximadamente 1000 nM - 0,1 nM;

(f) aproximadamente 750 nM - 0,1 nM;

(g) aproximadamente 500 nM - 0,1 nM;

(h) aproximadamente 250 nM - 0,1 nM; preferentemente aproximadamente 250 nM - 1 nM o aproximadamente 250 nM - 2,5 nM;

(i) aproximadamente 150 nM - 0,1 nM; preferentemente aproximadamente 150 nM - 1 nM o aproximadamente 150 nM - 2,5 nM;

(j) aproximadamente 100 nM - 0,5 nM; preferentemente aproximadamente 100 nM - 1 nM o aproximadamente 100 nM - 2,5 nM;

(k) aproximadamente 75 nM - 0,5 nM, preferentemente aproximadamente 75 nM - 1 nM o aproximadamente 75 nM - 2,5 nM;

(l) aproximadamente 50 nM - 1 nM; preferentemente aproximadamente 50 nM - 2,5 nM o aproximadamente 50 nM - 5 nM;

(m) aproximadamente 35 nM - 0,5 nM; y

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(n) aproximadamente 25 nM - 1 nM o aproximadamente 25 nM - 2,5 nM, aproximadamente 20 nM - 3 nM aproximadamente 15 nM - 4 nM o 10 nM - 5 nM.

De acuerdo con una realización, el ácido fólico es el único folato comprendido en el medio de cultivo selectivo que contribuye a la concentración limitante de folato.

Las concentraciones e intervalos de concentración anteriores descritos anteriormente son especialmente adecuados para células en suspensión de crecimiento rápido, tales como células CHO, que es un fenotipo preferido para las líneas de células de producción comerciales. El folato comprendido en el medio de cultivo selectivo es preferentemente ácido fólico. Sin embargo, diferentes líneas celulares pueden tener diferentes propiedades de consumo de ácido fólico. Sin embargo, el experto puede determinar de forma experimental con facilidad las concentraciones adecuadas. Como muestran los ejemplos, utilizar un receptor de folato mutado como marcador seleccionable permite el uso de concentraciones más bajas de folato en el medio de cultivo selectivo.

De acuerdo con una realización, las células hospedadoras se precultivan en un medio de cultivo sin folato o en un medio de cultivo que comprende una concentración limitante de folato antes del paso de transfección y/o selección b). De este modo, se fuerza a las células a utilizar sus reservas internas de folato. Anteriormente se han descrito las concentraciones limitantes adecuadas de folato. Preferentemente, dicho medio de cultivo para precultivar las células hospedadoras comprende folato, en particular ácido fólico en una concentración de 100 nM o menos, 75 nM o menos, 50 nM o menos, preferentemente 25 nM o menos, más preferentemente 15 nM o menos, de la manera más preferente 10 nM o menos o incluso puede no tener folato. De acuerdo con una realización, se crea un banco celular, por ejemplo, un banco celular maestro o un banco celular de trabajo, a partir de tales células hospedadoras precultivadas con concentraciones limitantes de folato, por ejemplo, ácido fólico. Esto tiene la ventaja de un tiempo de preparación más corto para la transfección y generación de la línea celular.

De acuerdo con una realización preferida, el receptor de folato mutado que se utiliza como marcador seleccionable de acuerdo con el contenido de la presente divulgación se utiliza combinado con un marcador seleccionable adicional como se ha descrito anteriormente. Como se ha analizado anteriormente, dicho marcador seleccionable adicional preferentemente participa en el metabolismo del folato y, preferentemente, es un DHFR. De acuerdo con una realización, cuando las células se transfectan adicionalmente con un marcador seleccionable adicional, el medio de cultivo selectivo que se utiliza en el paso b) comprende al menos un inhibidor adecuado para dicho marcador seleccionable adicional. La concentración utilizada de dicho inhibidor en el medio de cultivo selectivo (que también se puede aumentar gradualmente), contribuye a la rigurosidad de las condiciones de selección. Además, con el fin de mantener la presión de selección, el medio de cultivo no debe comprender cantidades suficientes de metabolitos que permitirían eludir la actividad del marcador seleccionable adicional. Por ejemplo, si se utiliza DHFR como marcador seleccionable adicional que participa en el metabolismo del folato resulta conveniente que el medio de cultivo selectivo no comprenda nucleótidos relevantes. En general, los metabolitos u otros aditivos que interfieran con la estrategia de selección elegida se deben controlar, por ejemplo, evitar en el medio de selección.

Las condiciones de selección para el receptor de folato mutado (concentración limitante de folato) y para el marcador seleccionable adicional (por ejemplo, un inhibidor de DHFR si se utiliza DHFR como marcador seleccionable) se pueden aplicar simultáneamente en el paso b) utilizando un medio de cultivo selectivo apropiado. Esto aumenta la presión selectiva y permite un procedimiento de selección más eficaz, para reducir de esta manera el tiempo para obtener líneas celulares adecuadas que expresan un polipéptido de interés con un rendimiento elevado. Para la combinación de marcadores seleccionables, el receptor de folato mutado/DHFR se utiliza preferentemente un medio de cultivo selectivo en el paso b) que comprenda una concentración limitante de folato (se han descrito anteriormente las concentraciones adecuadas y ejemplos de folato) y que adicionalmente comprenda un inhibidor de DHFR tal como un antifolato. Un inhibidor de DHFR se refiere en particular a un compuesto que inhibe la actividad de la dihidrofolato-reductasa (DHFR). Un inhibidor respectivo puede competir, por ejemplo, con el sustrato de DHFR por la unión a DHFR. Los inhibidores de DHFR adecuados son, por ejemplo, antifolatos, tales como metotrexato (MTX). Los ejemplos adicionales incluyen, entre otros, glucuronato de trimetrexato (neutrexina), trimetoprim, pirimetamina y pemetrexed. Por lo tanto, de acuerdo con una realización, el medio de cultivo selectivo utilizado en el paso b) comprende además al menos un inhibidor de DHFR, tal como preferentemente un antifolato tal como MTX.

Por lo tanto, de acuerdo con una realización, las células hospedadoras proporcionadas en el paso a) comprenden adicionalmente un polinucleótido introducido que codifica un marcador seleccionable que es una DHFR y en el paso b), se utiliza un medio de cultivo selectivo que comprende un antifolato en una concentración de 1500 nM o menos, 1250 nM o menos, 1000 nM o menos, 750 nM o menos, 500 nM o menos, 250 nM o menos, 200 nM o menos, 150 nM o menos, 125 nM o menos, 100 nM o menos o 75 nM o menos. De acuerdo con una realización, el medio de cultivo selectivo comprende MTX como antifolato. Preferentemente, el medio de cultivo selectivo comprende MTX en una concentración de aproximadamente 350 nM o menos, 200 nM o menos, preferentemente aproximadamente 150 nM o menos, 125 nM o menos, 100 nM o menos, 75 nM o menos o 50 nM o menos. Como muestran los ejemplos, es una ventaja particular que se puedan utilizar concentraciones de MTX muy bajas en conjunto con el método de la presente divulgación. Las concentraciones preferidas de antifolato y, en particular, MTX se pueden seleccionar entre:

2

(a) aproximadamente 500 nM - 1 nM;

(b) aproximadamente 350 nM - 2,5 nM;

(c) aproximadamente 200 nM - 5 nM;

(d) aproximadamente 150 nM - 7,5 nM;

(e) aproximadamente 100 nM - 10 nM; y

(f) aproximadamente 75 nM - 10 nM.

Las concentraciones e intervalos de concentración preferidos para el folato y antifolato descritos anteriormente se pueden combinar entre sí. En una realización, se utiliza una concentración de folato de aproximadamente 0,1 nM - 100 nM, preferentemente 1 nM - 75 nM, más preferentemente 5 nM - 50 nM combinada con una concentración de antifolato de 2,5 nM - 150 nM, preferentemente de 5 nM a 125 nM, más preferentemente de 7,5 nM a 100 nM, más preferentemente de 10 nM a 50 nM en el medio de cultivo selectivo. Como se ha descrito anteriormente, se utiliza preferentemente ácido fólico como folato y MTX como antifolato.

Además, también se observó que las concentraciones del folato y antifolato utilizadas pueden influenciarse entre sí. Por lo tanto, además de la concentración absoluta de folatos y antifolatos, la proporción también puede ser un factor para proporcionar condiciones de selección adecuadas. La concentración de antifolatos (preferentemente MTX), puede ser de hasta aproximadamente 20 veces la concentración de folato (preferentemente ácido fólico). La concentración de antifolato (preferentemente MTX) puede ser de aproximadamente 10 veces la concentración de folato (preferentemente ácido fólico). Preferentemente, el medio de cultivo selectivo comprende un folato y un antifolato en una proporción de concentración de 1: 10 a 10: 1, preferentemente en una proporción de concentración de 1: 5 a 5:1. Se obtienen resultados muy buenos si se utilizan concentraciones de folato y antifolato aproximadamente equimolares. Como muestran los ejemplos, estas proporciones proporcionan condiciones de cultivo selectivo muy adecuadas para obtener células hospedadoras con una producción elevada si se utiliza la combinación deseada de marcadores seleccionables.

Esta realización de acuerdo con la presente divulgación, donde se utiliza el receptor de folato mutado combinado con un marcador seleccionable que participan en el metabolismo del folato, preferentemente DHFR, para la selección tiene la ventaja de que se aumenta notablemente la productividad de la población celular que sobrevive la selección. En particular, se aumenta notablemente la productividad promedio como muestran los ejemplos si se utiliza este principio junto con el receptor de folato mutado de acuerdo con la presente divulgación. Los ejemplos han mostrado que las células hospedadoras obtenidas después del método de selección producen el polipéptido de interés con un rendimiento elevado particular. Por lo tanto, mejora la probabilidad de detectar clones que son grandes productores con un cribado menos laborioso. Por lo tanto, el sistema de selección de acuerdo con la presente divulgación es superior a los sistemas de selección utilizados en la técnica anterior.

Además, se observó que las tasas de productividad se pueden aumentar aún más si el paso de selección b) se lleva a cabo al menos dos veces y donde entre cada paso de selección b) las células transfectadas se cultivan en un medio de cultivo que comprende concentraciones no limitantes o al menos limitantes en menor grado de folato y preferentemente sin el inhibidor de DHFR y, por lo tanto, por ejemplo, sin antifolato. Por lo tanto, entre cada paso de selección b) se prefiere cultivar las células en condiciones no selectivas. Se observó que una selección repetida respectiva, donde se permite que las células se recuperen entre los pasos de selección o los ciclos de selección, proporciona células hospedadoras que expresan la proteína de interés con un rendimiento elevado particular y además, se aumentó significativamente la cantidad de grandes productores.

Como se ha descrito anteriormente, también es posible utilizar uno o más marcadores seleccionables adicionales además del receptor de folato mutado y además del marcador seleccionable que participa en el metabolismo del folato. Las condiciones selectivas para tal marcador seleccionable adicional se pueden aplicar antes (por ejemplo, en un paso de preselección que se realiza entre los pasos a) y b)) o a la vez que se aplican en el paso b) las condiciones selectivas para receptor de folato mutado y opcionalmente el marcador seleccionable que participa en el metabolismo del folato. Por ejemplo, en caso de que se utilice el gen de la neomicina- fosfotransferasa (neo) como marcador seleccionable adicional, las células se pueden cultivar primero en un medio, por ejemplo, que contenga G418 con el fin de preseleccionar las células que hayan incorporado el vector de expresión o la combinación de al menos dos vectores de expresión de acuerdo con la presente divulgación. A continuación, se seleccionan las células con una expresión elevada a partir de dicha población celular preseleccionada utilizando la selección que utiliza el receptor de folato mutado, de acuerdo con una realización ventajosa combinada con una selección que utiliza DHFR.

Además, como se ha descrito anteriormente, el método de selección de acuerdo con la presente divulgación se puede combinar con métodos de selección que utilizan citometría de flujo conocidos en la técnica anterior. Por lo tanto, de acuerdo con una realización, se realiza un paso de selección en el que se lleva a cabo citometría de flujo después de que se hayan seleccionado las células hospedadoras de acuerdo con el método de la presente divulgación y, por lo tanto, después del paso c). Esto se puede realizar con el fin de seleccionar células hospedadoras a partir de la población superviviente que expresan el polipéptido de interés con un rendimiento elevado. Una estrategia de este tipo convierte en obsoletos los pasos de obtención de clones manual (por ejemplo, dilución limitante). Con este objeto, se expresa preferentemente al menos una porción del polipéptido de interés como un polipéptido de fusión anclado a la membrana que se muestra en la superficie celular de la célula hospedadora. Basándose en la cantidad de polipéptido de fusión mostrado, se pueden seleccionar las células hospedadoras utilizando citometría de flujo, preferentemente utilizando FACS, que expresan el polipéptido de interés con un rendimiento elevado. Se han descrito anteriormente casetes de expresión adecuados para expresar el polinucleótido que codifica el polipéptido de interés que permite una selección respectiva. Se remite a la divulgación respectiva. Para la selección, se cultivan las células hospedadoras para permitir la expresión del polipéptido de interés de modo que al menos una porción del polipéptido de interés se exprese como un polipéptido de fusión que comprende el anclaje a la membrana, donde dicho polipéptido de fusión se muestra en la superficie de dicha célula hospedadora y donde al menos una célula hospedadora se selecciona basándose en la cantidad del polipéptido de fusión mostrado en la superficie celular. Aquí, se puede utilizar un compuesto de detección marcado que se una a la porción extracelular de la proteína de fusión. Por ejemplo, se pueden utilizar compuestos de detección marcados con fluorescencia. Como alternativa, la proteína de fusión puede comprender además un indicador tal como GFP, que marca a la célula, para permitir de esta manera la selección directa basándose en las características del indicador. Preferentemente, el indicador se encuentra después de un anclaje transmembrana y, por lo tanto, se ubica dentro de la célula. Como se ha analizado anteriormente, las células hospedadoras se pueden seleccionar basándose en el rendimiento de expresión utilizando citometría de flujo, en particular FACS.

Métodos para producir un polipéptido de interés

De acuerdo con un quinto aspecto, se proporciona un proceso para producir un polipéptido recombinante de interés, que comprende el paso de cultivar una célula hospedadora de acuerdo con la presente divulgación y/o una célula hospedadora seleccionada de acuerdo con el contenido de la presente divulgación en condiciones que permiten la expresión y secreción del polipéptido de interés. Utilizar las células hospedadoras de acuerdo con la presente divulgación para producir un polipéptido de interés tiene la ventaja de que el polipéptido de interés se puede producir con un rendimiento elevado. Esto particularmente, cuando se realiza el método de selección de acuerdo con la presente divulgación para seleccionar células hospedadoras apropiadas para la expresión. Por lo tanto, la presente divulgación proporciona un método mejorado para producir un polipéptido de interés. Se han descrito anteriormente células hospedadoras adecuadas; los autores remiten a la divulgación anterior.

El polipéptido se secreta en el medio de cultivo y se puede obtener a partir de este. Con este objetivo, en el polipéptido de interés y proporciona un péptido líder secretor apropiado. Se han descrito ejemplos anteriormente. De este modo, se pueden producir polipéptidos recombinantes y obtenerlos/aislarlos eficazmente con un rendimiento elevado. De acuerdo con una realización, dichas células hospedadoras se cultivan en condiciones sin suero.

El método para producir el polipéptido de interés puede comprender al menos uno de los siguientes pasos:

- aislar el polipéptido de interés a partir de dicho medio de cultivo celular; y/o

- procesar el polipéptido de interés aislado.

El polipéptido de interés producido de acuerdo con la divulgación también se puede someter a pasos de procesamiento adicionales tales como, por ejemplo, pasos de purificación y/o modificación con el fin de producir el polipéptido de interés con la calidad deseada. Por ejemplo, el producto se puede recuperar a partir del medio nutriente mediante procedimientos convencionales que incluyen, entre otros, centrifugación, filtración, ultrafiltración, extracción o precipitación. La purificación se puede llevar a cabo mediante diversos procedimientos conocidos en la técnica que incluyen, entre otros, cromatografía (por ejemplo, de intercambio iónico, afinidad, hidrófoba, cromatoenfoque y exclusión por tamaño), procedimientos electroforéticos (por ejemplo, enfoque isoeléctrico preparativo), solubilidad diferencial (por ejemplo, precipitación con sulfato de amonio) o extracción. El polipéptido de interés aislado se puede formular como una composición farmacéutica.

Se han descrito anteriormente ejemplos del polipéptido de interés conjuntamente con el primer aspecto y se remite a la divulgación respectiva. La célula de mamífero puede comprender o no un polinucleótido endógeno correspondiente a, respectivamente idéntico al polinucleótido que codifica el polipéptido de interés. De acuerdo con una realización, la célula de mamífero no comprende ningún gen endógeno correspondiente al polipéptido de interés. También se proporciona un polipéptido obtenido mediante un método de acuerdo con la presente divulgación como el definido anteriormente y en las reivindicaciones. Dicho polipéptido puede ser en particular una molécula de inmunoglobulina o un fragmento funcional de esta.

Usos

Un sexto aspecto de la presente divulgación se refiere al uso de un polinucleótido que codifica

a) un receptor de folato mutado que tiene o comprende la siguiente secuencia

2

donde Xaa no es alanina y donde la afinidad de unión al folato del receptor de folato mutado es menor en comparación con el correspondiente receptor de folato no modificado donde Xaa es alanina (SEQ ID NO 1)

o

b) un receptor de folato mutado que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad secuencial de al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 96 %, al menos un 97 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % respecto a la secuencia mostrada como SEQ ID NO 9, y donde Xaa no es alanina en dicho receptor de folato mutado y donde la afinidad de unión al folato de dicho receptor de folato mutado es menor en comparación con la secuencia del receptor de folato alfa no modificado donde Xaa es alanina (véase la SEQ ID NO 1) como marcador seleccionable. Dicho marcador seleccionable se puede utilizar para seleccionar células hospedadoras transfectadas con éxito cuya viabilidad depende de la captación de folato tal como, en particular, células de mamífero. En particular, se puede utilizar como marcador de selección para identificar células hospedadoras que expresan un polipéptido de interés recombinante con un rendimiento elevado. Preferentemente, dicho receptor de folato mutado está comprendido en un vector de expresión. Se han descrito anteriormente detalles, combinaciones y ventajas de utilizar un receptor de folato mutado respectivamente como marcador seleccionable y vectores de expresión adecuado y se remite a la divulgación anterior. En particular, se prefiere el uso en los métodos de la presente divulgación. Como se ha descrito anteriormente, Xaa es preferentemente un aminoácido seleccionado entre leucina, glicina, valina, isoleucina, histidina y ácido aspártico. De la manera más preferente Xaa es leucina. Preferentemente, el receptor de folato mutado está anclado con GPI. De acuerdo con una realización dicho marcador seleccionable se utiliza combinado con DHFR como marcador seleccionable adicional. Los detalles de esta realización y condiciones de selección apropiadas se han descrito anteriormente y se remite a la divulgación anterior.

Un séptimo aspecto de la presente divulgación se refiere al uso de un polinucleótido que codifica

a) un receptor de folato mutado que comprende la siguiente secuencia lAWARTELLNVCMNAKHHKEKPGPEDKLHEQCRPWRKNACCSTNTSQEXaaHKDVSYLYR FNWNHCGEMAPACKRHFIQDTCLYECSPNLGPWIQQVDQSWRKERVLNVPLCKEDCEQW WEDCRTSYTCKSNWHKGWNWTSGFNKCAVGAACQPFHFYFPTPTVLCNEIWTHSYKVSN YSRGSGRCIQMWFDPAQGNPNEEVARFYA (SEQ ID NO 9)

o

lAWARTELLNVCMNAKHHKEKPGPEDKLHEQCRPWRKNACCSTNTSQEXaaHKDVSYLYR FNWNHCGEMAPACKRHFIQDTCLYECSPNLGPWIQQVDQSWRKERVLNVPLCKEDCEQW WEDCRTSYTCKSNWHKGWNWTSGFNKCAVGAACQPFHFYFPTPTVLCNEIWÍHSYKVSN YSRGSGRCIQMWFDPAQGNPNEEVARFYAAAMSGAGPWAAWPFLLSLALMLLWLLS

(SEQ ID NO 13)

donde Xaa es leucina;

o

b) un receptor de folato mutado que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad secuencial de al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 96 %, al menos un 97 % al menos un 98 % o al menos un 99 % respecto a la secuencia mostrada como SEQ ID NO 9 o SEQ ID NO 13, y donde Xaa es leucina en dicho receptor de folato mutado de acuerdo con b),

como marcador seleccionable. Dicho marcador seleccionable se puede utilizar para seleccionar células cuya viabilidad depende de la captación de folato tal como, en particular, células de mamífero. La selección de células de mamíferos se

2

reivindica en la reivindicación 18. En particular, se puede utilizar como marcador de selección para identificar células hospedadoras que expresan un polipéptido de interés recombinante con un rendimiento elevado. Preferentemente, dicho receptor de folato mutado que se utiliza como marcador seleccionable está comprendido en un vector de expresión. Se han descrito anteriormente detalles, combinaciones y ventajas de utilizar un receptor de folato mutado respectivamente (mutante A49L) como marcador seleccionable y de vectores de expresión adecuados y preferidos y también se describen en los ejemplos. Se remite a la divulgación respectiva. En particular, se prefiere el uso en los métodos de la presente divulgación. Preferentemente, el receptor de folato mutado está anclado con GPI. De acuerdo con una realización dicho marcador seleccionable se utiliza combinado con DHFR como marcador seleccionable adicional. Los detalles de esta realización y condiciones de selección apropiadas se han descrito anteriormente y se remite a la divulgación anterior. Las realizaciones preferidas de este séptimo aspecto se describen nuevamente a continuación.

De acuerdo con una realización del séptimo aspecto, se utiliza un vector de expresión o una combinación de al menos dos vectores de expresión que comprende:

a) un polinucleótido que codifica un receptor de folato mutado como marcador seleccionable donde

i) dicho receptor de folato mutado comprende la siguiente secuencia lAWARTELLNVCMNAKHHKEKPGPEDKLHEQCRPWRKNACCSTNTSQEXaaHKDVSYL

YRFNWNHCGEMAPACKRHFIQDTCLYECSPNLGPWIQQVDQSWRKERVLNVPLCKED

CEQWWEDCRTSYTCKSNWHKGWNWTSGFNKCAVGAACQPFHFYFPTPTVLCNEIWT

HSYKVSNYSRGSGRCIQMWFDPAQGNPNEEVARFYA (SEQ ID NO 9)

o

lAWARTELLNVCMNAKHHKEKPGPEDKLHEQCRPWRKNACCSTNTSQEXaaHKDVSYL

YRFNWNHCGEMAPACKRHFIQDTCLYECSPNLGPWIQQVDQSWRKERVLNVPLCKED

CEQWWEDCRTSYTCKSNWHKGWNWTSGFNKCAVGAACQPFHFYFPTPTVLCNEIWT

HSYKVSNYSRGSGRCIQMWFDPAQGNPNEEVARFYAAAMSGAGPWAAWPFLLSLAL

MLLWLLS (SEQ ID NO 13)

donde Xaa es leucina;

o

ii) dicho receptor de folato mutado comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad secuencial de al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 96 %, al menos un 97 % al menos un 98 % o al menos un 99 % respecto a la secuencia mostrada como SEQ ID NO 9 o SEQ ID NO 13, y donde Xaa es leucina en dicho receptor de folato mutado de acuerdo con ii)

b) al menos un polinucleótido que codifica un polipéptido de interés.

Preferentemente, el polinucleótido que codifica el receptor de folato mutado y el polinucleótido que codifica el polipéptido de interés están comprendidos en casetes de expresión separados. Se han descrito anteriormente detalles de realizaciones adecuadas y preferidas de casetes de expresión y vectores de expresión y se remite a la divulgación anterior. Preferentemente, el polipéptido de interés es un polipéptido secretado. Se han descrito detalles anteriormente conjuntamente con el primer aspecto. De acuerdo con una realización, el vector de expresión o combinación de al menos dos vectores de expresión comprende adicionalmente un polinucleótido que codifica un marcador seleccionable que participa en el metabolismo del folato, preferentemente una dihidrofolato-reductasa. Se han descrito anteriormente realizaciones adecuadas y preferidas y se remite a la divulgación anterior. Dicho marcador seleccionable que preferentemente es DHFR está comprendido preferentemente en un casete de expresión separado.

De acuerdo con una realización de este aspecto, también se proporciona una célula hospedadora cuya viabilidad depende de la captación de folato que comprende

a) un polinucleótido introducido que codifica un receptor de folato mutado donde

i) dicho receptor de folato mutado comprende la siguiente secuencia

lAWARTELLNVCMNAKHHKEKPGPEDKLHEQCRPWRKNACCSTNTSQEXaaHKDVSYL

YRFNWNHCGEMAPACKRHFIQDTCLYECSPNLGPWIQQVDQSWRKERVLNVPLCKED

CEQWWEDCRTSYTCKSNWHKGWNWTSGFNKCAVGAACQPFHFYFPTPTVLCNEIWT

HSYKVSNYSRGSGRCIQMWFDPAQGNPNEEVARFYA (SEQ ID NO 9)

o

lAWARTELLNVCMNAKHHKEKPGPEDKLHEQCRPWRKNACCSTNTSQEXaaHKDVSYL

YRFNWNHCGEMAPACKRHFIQDTCLYECSPNLGPWIQQVDQSWRKERVLNVPLCKED

CEQWWEDCRTSYTCKSNWHKGWNWTSGFNKCAVGAACQPFHFYFPTPTVLCNEIWT

HSYKVSNYSRGSGRCIQMWFDPAQGNPNEEVARFYAAAMSGAGPWAAWPFLLSLAL

MLLWLLS (SEQ ID NO 13)

donde Xaa es leucina;

o

ii) dicho receptor de folato mutado comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad secuencial de al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 96 %, al menos un 97 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % respecto a la secuencia mostrada como SEQ ID NO 9 o SEQ ID NO 13, y donde Xaa es leucina en dicho receptor de folato mutado de acuerdo con ii), y

b) al menos un polinucleótido introducido que codifica un polipéptido de interés, donde el polipéptido de interés se secreta a partir de dicha célula hospedadora.

Preferentemente, dicha célula hospedadora comprende un vector de expresión o combinación de al menos dos vectores de expresión como se ha descrito anteriormente. De acuerdo con una realización, la célula hospedadora es una célula de mamífero. Preferentemente es una célula de roedor, más preferentemente una célula CHO. De acuerdo con una realización, la célula hospedadora de mamífero expresa un receptor de folato endógeno. De acuerdo con una realización, la célula hospedadora de mamífero comprende un polinucleótido introducido que codifica un marcador seleccionable que participa en el metabolismo del folato, que preferentemente es una dihidrofolato-■ reductasa. Se han descrito anteriormente en detalle realizaciones adecuadas y preferidas así como también métodos para producir una célula hospedadora respectiva. Se remite a la divulgación respectiva.

De acuerdo con una realización de este aspecto, también se proporciona un método para seleccionar al menos una célula hospedadora capaz de expresar un polipéptido de interés recombinante con un rendimiento deseado, que comprende a) proporcionar una pluralidad de células hospedadoras cuya viabilidad depende de la captación de folato que comprenden aa) un polinucleótido introducido que codifica un receptor de folato mutado donde

YRFNWNHCGEMAPACKRHFIQDTCLYECSPNLGPWIQQVDQSWRKERVLNVPLCKED

CEQWWEDCRTSYTCKSNWHKGWNWTSGFNKCAVGAACQPFHFYFPTPTVLCNEIWT

HSYKVSNYSRGSGRCIQMWFDPAQGNPNEEVARFYA (SEQ ID NO 9)

o

lAWARTELLNVCMNAKHHKEKPGPEDKLHEQCRPWRKNACCSTNTSQEXaaHKDVSYL

YRFNWNHCGEMAPACKRHFIQDTCLYECSPNLGPWIQQVDQSWRKERVLNVPLCKED

CEQWWEDCRTSYTCKSNWHKGWNWTSGFNKCAVGAACQPFHFYFPTPTVLCNEIWT

HSYKVSNYSRGSGRCIQMWFDPAQGNPNEEVARFYAAAMSGAGPWAAWPFLLSLAL

MLLWLLS (SEQ ID NO 13)

1

donde Xaa es leucina;

o

ii) dicho receptor de folato mutado comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad secuencial de al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 96 %, al menos un 97 % al menos un 98 % o al menos un 99 % respecto a la secuencia mostrada como SEQ ID NO 9 o SEQ ID NO 13, y donde Xaa es leucina en dicho receptor de folato mutado de acuerdo con ii), y

bb) al menos un polinucleótido introducido que codifica un polipéptido de interés;

y

El medio de cultivo selectivo utilizado en el paso b) comprende una concentración limitante de folato, donde dicho folato es preferentemente ácido fólico, en una concentración seleccionada entre aproximadamente 2000 nM o menos aproximadamente 1750 nM o menos , aproximadamente 150C nM o menos, aproximadamente 1000 nM o menos aproximadamente 500 nM o menos, aproximadamente 350 nM o menos, aproximadamente 300 nM o menos aproximadamente 250 nM o menos, aproximadamente 150 nM o menos, aproximadamente 100 nM o menos aproximadamente 75 nM o menos, aproximadamente 50 nM o menos, aproximadamente 40 nM o menos aproximadamente 35 nM o menos, aproximadamente 30 nM o menos, aproximadamente 25 nM o menos aproximadamente 20 nM o menos, aproximadamente 15 nM o menos, aproximadamente 10 nM o menos aproximadamente 7,5 o menos, aproximadamente 5 nM o menos y aproximadamente 2,5 nM o menos. Preferentemente, se utiliza ácido fólico como folato. Preferentemente la célula hospedadora es una célula de mamífero. De acuerdo con una realización, la célula hospedadora comprende además un polinucleótido introducido que codifica un marcador seleccionable que es un dihidrofolato-reductasa. En esta realización, el medio de cultivo selectivo utilizado en el paso b) comprende además de acuerdo con una realización un antifolato en una concentración seleccionada entre 1500 nM o menos, 1000 nM o menos, 750 nM o menos, 500 nM o menos, 200 nM o menos, 150 nM o menos, 125 nM o menos, 100 nM o menos, 75 nM o menos, 50 nM o menos, 25 nM o menos, 20 nM o menos, 15 nM o menos, 12 mM o menos y 10 nM o menos. De acuerdo con una realización, después del paso c) las células se cultivan en un medio de cultivo que comprende una concentración no limitante de folato y entonces se cultivan nuevamente de acuerdo con el paso b) y se obtienen de acuerdo con el paso c). Se han descrito anteriormente detalles adicionales de realizaciones del método de selección y medios de cultivo selectivos preferidos y adecuados conjuntamente con el cuarto aspecto y se remite a la divulgación respectiva.

De acuerdo con una realización adicional de este aspecto, también se proporciona un proceso para producir un polipéptido de interés, que comprende

a) cultivar una célula hospedadora como se ha descrito en los párrafos anteriores de este aspecto y/o una célula hospedadora seleccionada de acuerdo con el método descrito en los párrafos anteriores de este aspecto en condiciones que permitan la expresión y secreción del polipéptido de interés;

b) aislar el polipéptido de interés a partir del medio de cultivo celular y

c) opcionalmente procesar el polipéptido de interés aislado.

También se han descrito anteriormente detalles concernientes a un método de producción respectivo, así como también realizaciones adecuadas y preferidas del polipéptido de interés y se remite a la divulgación anterior. Preferentemente, el polipéptido de interés es un polipéptido con actividad terapéutica tal como un anticuerpo.

La invención no está limitada por los métodos y materiales a modo de ejemplo divulgados en la presente. Los intervalos numéricos descritos en la presente incluyen los números que definen el intervalo. Los encabezados proporcionados en la presente no son limitaciones de los diversos aspectos o realizaciones de esta invención, que se pueden leer haciendo referencia a la memoria descriptiva como un todo. De acuerdo con una realización, la materia en cuestión descrita en la presente que comprende ciertos elementos también se refiere a la materia en cuestión constituida por los elementos respectivos. En particular, los polinucleótidos descritos en la presente que comprenden ciertas secuencias también pueden estar constituidos por las secuencias respectivas. Se prefiere seleccionar y combinar las realizaciones preferidas descritas en la presente y la materia en cuestión específica que surge a partir de una combinación respectiva de realizaciones preferidas también pertenece a la presente divulgación.

2

Los siguientes ejemplos sirven para ilustrar la presente divulgación sin limitar de ningún modo el alcance de esta. En particular, los ejemplos se refieren a realizaciones preferidas de la presente divulgación.

EJEMPLOS

En los experimentos posteriores, se utilizaron los siguientes vectores:

El vector de referencia «V-DHFRref» comprendió los siguientes casetes de expresión principales: Un casete de expresión que comprende un polinucleótido que codifica DHFR como marcador de selección; un casete de expresión que comprende un polinucleótido que codifica la cadena ligera de un anticuerpo; un casete de expresión que comprende un polinucleótido que codifica la cadena pesada de un anticuerpo y un casete de expresión que comprende un polinucleótido que codifica una neomicina-fosfotransferasa. Todos los casetes de expresión se orientaron en la misma dirección. Se expresa un anticuerpo completo a partir de dicho vector de referencia. También se describe el diseño de un vector adecuado en el documento WO 2009/080720.

Los vectores que comprenden un receptor de folato como marcador de selección se diseñaron basándose en el vector de referencia intercambiando el polinucleótido que codifica DHFR como marcador seleccionable con un polinucleótido que codifica un receptor de folato como marcador seleccionable. Por lo demás, los casetes de expresión no se modificaron. El vector «V-wtFRalfa» comprendió el receptor de folato alfa humano no modificado como marcador de selección. El vector «V-mutFRalfa» comprendió el receptor de folato alfa humano mutante que comprende la mutación A49L.

Ejemplo 1: Transfecciones individuales

Para las transfecciones individuales, se introdujeron el receptor de ácido fólico alfa humano no modificado (vector: V-wtFRalfa) o un receptor de folato alfa humano mutante (vector: V-mutFRalfa) como marcador de selección en células CHO. Este experimento sirvió para analizar la función del sistema de selección con receptor de folato, el cual a diferencia del sistema DHFR/MTX no se basa en una inhibición tóxica del crecimiento celular, sino que se basa en una inhibición del crecimiento debido a la privación de ácido fólico en medio de cultivo. El ácido fólico es la forma oxidada de la vitamina B9. El ácido fólico tiene actividad biológica en su forma reducida, tetrahidrofolato (THF). El ácido fólico se reduce en las células para obtener su forma con actividad biológica tetrahidrofolato (THF) a través de dihidrofolato (DHF) en una reacción dependiente de NADPH por la enzima dihidrofolato-reductasa (DHFR). La captación de ácido fólico es esencial para las células de mamífero con el fin de mantener el crecimiento celular y la proliferación celular.

Solo las células que integran el vector transfectado en el genoma y expresan el receptor de folato alfa no modificado (V-wtFRalfa) o el receptor de folato alfa mutado (V-mutFRalfa) con una eficacia elevada pueden sobrevivir a las condiciones de selección que se basan en una concentración limitante de folato en el medio de cultivo. Estas células son capaces de incorporar una cantidad suficiente de ácido fólico a partir del medio de cultivo y al interior de las células para mantener la proliferación en el crecimiento celular aún cuando el medio de cultivo comprenda una concentración limitante de ácido fólico. Debido a que los vectores de expresión también introducen polinucleótidos que codifican una proteína de interés (en estos experimentos la cadena pesada y la ligera de un anticuerpo) en las células, es posible seleccionar líneas celulares de producción estables con una producción elevada utilizando la tecnología de selección que utiliza el receptor de folato.

Con el fin de determinar la influencia de la concentración de ácido fólico en el crecimiento de las células, se estudiaron diferentes medios de cultivo selectivos. El medio de cultivo estándar comprende ácido fólico 11,7 |^jM (medio completo). Se observó, que se alcanzaron las condiciones de selección más rigurosas cuando se utilizó ácido fólico <50 nM en el medio de cultivo. Además, se observaron diferencias en las tasas de crecimiento cuando se utilizaron diferentes concentraciones de ácido fólico. Cuanto menos ácido fólico en el medio de cultivo, más lento fue el crecimiento de las células.

En primer lugar, se redujeron las reservas internas de ácido fólico de las células CHO y se impidió una cotransferencia de ácido fólico del medio de cultivo estándar (medio completo) al medio de selección. Por lo tanto, antes de la transfección, las células destinadas a la selección con una concentración limitante de ácido fólico se lavaron tres veces con PBS y se inocularon en medio sin ácido fólico. El control de referencia (vector V-DHFRref) se pasó con la misma densidad celular a medio completo. Se analizó el crecimiento de las células antes de la transfección y se observó, que el cultivo que se cultivó en medio completo (5x106 LZ/mL) creció aprox. 2 veces mejor que el cultivo que se cultivó en medio de selección (2,5x106 LZ/mL).

Los vectores se transfectaron en las células utilizando nucleofección. Se transfectaron 5x106 células vivas (LZ/mL) con 3 jg de ADN vectorial. Las células CHO que comprendían los vectores V-wtFRalfa, V-mutFRalfa y los controles negativos (V-DHFRref sin ADN) se transfirieron a medio de selección; las transfecciones de referencia se transfirieron a medio completo. Las transfecciones individuales realizadas se resumen en la Tabla 1. La selección comenzó 48 horas después de la transfección, para permitir de esta manera que las células se recuperaran de la nucleofección y empezaran a expresar los vectores de expresión introducidos. Las células que comprendían los marcadores de selección que se iban a estudiar se expusieron a concentraciones limitantes de ácido fólico. En paralelo, el marcador de selección DHFR (V DHFRref) se expuso a diferentes medios de cultivo que comprendían MTX así como también a diferentes medios de selección que contenían ácido fólico (FA). Un cultivo sin ADN adicional actuó como control negativo.

Tabla 1: Resumen de las transfecciones individuales realizadas

La eficacia de la transfección se determinó después de 48 h mediante un control de GFP. La siguiente Tabla 2 proporciona un resumen de la densidad de células viables conseguida en el día 12 de la selección con ácido fólico.

T l 2: R m n l n i l l r LZmL n l í 12 l l i n n i f li FA

La Tabla 2 muestra la densidad celular [LZ/mL] de los combinados de células transfectadas con los controles (V-DHFRref; sin DNA), V-wtFRalfa y V-mutFRalfa y seleccionadas utilizando diferentes concentraciones de ácido fólico. Como se puede observar, se reduce el crecimiento cuando se reduce la concentración de ácido fólico en el medio de selección. Los combinados de células que se transfectaron con el receptor de folato alfa mutado como marcador de selección muestran en los medios de selección que comprenden concentraciones limitantes de ácido fólico un crecimiento celular que es aproximadamente el doble de alto o incluso más alto que el crecimiento celular que se observa en los otros combinados. En el día 12, las células transfectadas con el receptor de folato alfa no modificado aún no había mostrado una ventaja de crecimiento. Crecieron aproximadamente igual de bien que las poblaciones que comprendían V-DHFRref o los controles negativos. Sin embargo, se observa una ventaja de crecimiento con el receptor de folato alfa no modificado en una etapa posterior comenzando, dependiendo de la concentración de ácido fólico utilizada, aprox. en el día de 16 a 20. Por lo tanto, ambos tipos de receptores de folato (no modificado y mutante) son adecuados para seleccionar células en función de una concentración limitante de ácido fólico en el medio de cultivo. Sin embargo, el uso de un receptor de folato alfa mutado como marcador seleccionable como se describe en la presente divulgación es más conveniente debido a que se observa una ventaja de crecimiento de las células transfectadas con éxito antes que con el receptor de folato alfa no modificado. Además, el receptor de folato mutado permitió una selección con concentraciones de ácido fólico más bajas, tales como 15 nM e incluso 5 nM. Por lo tanto, se pueden utilizar condiciones de selección más rigurosas cuando se utiliza un receptor de folato mutado de acuerdo con la divulgación como marcador de selección.

Cuando se analiza la viabilidad de los combinados de células en el día 12 de la selección, la viabilidad observada fue aproximadamente la misma en las concentraciones de ácido fólico de 35 - 50 nM (viabilidad de los combinados de células >90 %). Debido a la viabilidad elevada fue posible realizar pases de las poblaciones este día. Sin embargo, con concentraciones de ácido fólico menores se redujo la viabilidad. En el medio selectivo con la concentración más baja de ácido fólico, únicamente la población transfectada con V-mutFRalfa mostró una viabilidad relativamente elevada de un 76 %.

Además, se analizó el tiempo necesario para la selección. El tiempo global que se necesita para la selección es importante cuando se establece un nuevo marcador de selección. Cuando se cultivan células CHO, se puede completar un paso de selección individual con DHFR-MTX dependiendo de las condiciones de selección utilizadas en un plazo de 15 a 16 días. Sin embargo, la amplificación génica en múltiples pasos normalmente lleva significativamente más tiempo. Durante este periodo, las células se deben recuperar de la crisis que se induce debido a la presión de selección. La Tabla 3 muestra el número de días en la selección hasta el siguiente pase, es decir, el periodo de tiempo necesario para que las células

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alcancen una viabilidad de más de un 90 % y en consecuencia lograr que las células se puedan utilizar para un cribado de título de anticuerpos.

La Tabla 3 muestra el número de días en la selección hasta el siguiente pase, es decir, el periodo de tiempo necesario para que las células superen la crisis de selección y consigan una viabilidad de más de un 90 %. Como se puede observar, al principio todos los combinados de células se recuperan cuando se cultivan en un medio selectivo que comprende ácido fólico 50, 45 o 35 nM. Sin embargo, las concentraciones de ácido fólico más bajas imponen una presión de selección más elevada en las células, de modo que solo el uso de V-mutFRalfa permite una buena recuperación y, por lo tanto, viabilidad después de 16 días en estas condiciones muy rigurosas. Aquí, la población transfectada con V-mutFRalfa se recuperó y mostró una viabilidad de más de un 90 % en un medio de selección que solo comprende una concentración de ácido fólico de 5 nM a 25 nM. Las células transfectadas con V-wtFRalfa necesitaron más tiempo y no se pueda recuperar en concentraciones de ácido fólico muy bajas.

Ejemplo 2: Determinación de la productividad de anticuerpos

Con el fin de analizar el éxito de la transfección y selección basándose en la expresión del gen de interés (aquí un anticuerpo de referencia) las células obtenidas, es decir, seleccionadas de acuerdo con el ejemplo 1, se cultivaron como cultivos discontinuos en matraces agitados durante 13 días con el fin de determinar la productividad de las células después de la selección. Las células tuvieron una viabilidad de más de un 90 %. En el día 13, se determinó la concentración de anticuerpo en el sobrenadante del cultivo utilizando cromatografía de afinidad con proteína A [mg/L]. Los resultados se muestran en la Tabla 4.

Ta l 4: n n r i n l ni r ^mA n l r n n l liv ^del cultivo discontinuo (mg/L)

El anticuerpo expresado a partir de los vectores de expresión introducidos se pudo detectar en todas las poblaciones celulares. También se determinaron cantidades bajas de anticuerpos en combinados que no se habían transfectado con ADN, solo se consideraron significativos valores de más de 9 mg/L. La población de referencia en MTX 125 nM (sistema de selección DHFR/MTX estándar) produjo 28 mg/L. Los resultados de las cuatro poblaciones celulares transfectadas con V-wtFRalfa estuvieron, en concentraciones de ácido fólico más elevadas, en el nivel del fondo. Sin embargo, cuando se redujo la concentración de ácido fólico en el medio de cultivo hasta ácido fólico 15 nM, la expresión del anticuerpo fue aproximadamente igual de elevada (24 mg/L) que con el control de referencia V-DHFRref en ^mT^x125 nM (28 mg/L). Esto confirma los hallazgos anteriores de que el receptor de folato no modificado puede actuar como marcador de selección y logra una eficacia comparable al sistema consolidado DHFR/MTX, aún cuando no se utilizan agentes tóxicos para la selección. Los combinados celulares que se transfectaron con V-mutFRalfa mostraron un aumento lineal en el título de anticuerpos que dependió de la concentración de ácido fólico en el medio de cultivo. Cuanto más baja fue la concentración de ácido fólico del medio de cultivo, más elevada fue la tasa de expresión de anticuerpos resultante. Por lo tanto, la utilización del receptor de folato mutado de acuerdo con la divulgación como marcador de selección tiene ventajas respecto al uso del receptor de folato no modificado como marcador de selección.

Ya que el número de transgenes integrados tiene una influencia importante sobre la tasa de expresión, se determinó el número de copias de los elementos más importantes, concretamente en las cadenas ligera y pesada (LC, HC) del anticuerpo expresado así como también el número de copias del receptor de folato (mutado o no modificado) utilizando PCR cuantitativa basándose en el ADN genómico de los combinados celulares.

En relación con el título de anticuerpos medido, el número de copias puede proporcionar indirectamente una idea sobre si el lugar de integración en el genoma fue responsable de una expresión fuerte o débil. El análisis por PCR cuantitativa, como se realizó en la presente, proporciona un valor promedio de los números de copias de transgenes, ya que no se analizaron los clones de células únicas, sino una población de diferentes células que sobrevivieron a la selección.

T l : D rmin i n l n m r i iliz n P R n i iv

La Tabla 5 muestra los resultados del análisis por PCR cuantitativa de los transfectantes V-wtFRalfa y V-mutFRalfa después de la selección. A partir de dos combinados de control, se analizó un combinado que había sobrevivido a la rigurosidad de selección más elevada (V-DHFRref: MTX 125 nM, ácido fólico 35 nM, sin ADN: ácido fólico 25 nM). Además, se analizaron células CHO no transfectadas cultivadas sin presión de selección como control negativo. La Tabla 5 muestra los números de copias de la cadena ligera y la cadena pesada así como también el número de copias del receptor de folato que se utilizó como marcador de selección. Los valores se refieren al tamaño del genoma teórico de las células CHO. La Tabla 5 muestra que en las células CHO no transfectadas, como cabía esperar, no se pudieron determinar secuencias de anticuerpos. Además, solo se determinaron copias del receptor de ácido fólico alfa no modificado endógeno. El control de referencia V-DHFRref seleccionado con MTX 125 nM muestra como promedio una integración de los transgenes de anticuerpos de dos veces. Cuando se analiza la población V-DHFRref seleccionada con ácido fólico 35 nM, se puede observar una integración mucho más elevada de las cadenas pesada y ligera del anticuerpo. Se detectaron 5,5 copias de la cadena pesada y 6,8 copias de la cadena ligera. El número de copias de los genes de Fr alfa es comparable a la de las células CHO originales y atribuible a los alelos endógenos.

Los combinados que se transfectaron con V-wtFRalfa mostraron, en comparación con los controles con V-DHFRref, solo unas pocas copias de HC y LC. No se observaron diferencias dependientes de la concentración. El número de copias del receptor de folato aumentó desde ácido fólico 50 nM hasta 35 nM hasta 2,8 copias, pero luego disminuyó a 25 nM. Asimismo, el combinado que se seleccionó con ácido fólico 15 nM incorporó como promedio 2,6 copias de las cadenas de anticuerpo. Por el contrario, los combinados celulares transfectados con V-mutFRalfa mostraron un aumento casi lineal en las copias de genes de las cadenas de anticuerpo que fue paralelo a la reducción de ácido fólico en el medio de selección. Por lo tanto, cuanto más baja sea la concentración de ácido fólico en el medio de selección, mayores números de copias de los genes LC y HC se detectaron en las células seleccionadas. Los números de copias del gen del receptor de folato alfa mutado mostraron una tendencia comparable. El combinado que se seleccionó utilizando ácido fólico 5 nM tuvo aproximadamente tres veces más copias del anticuerpo integrado que el control de referencia V-DHFRref seleccionado con MTX 125 nM.

Ejemplo 3: Obtención de clones a partir de células únicas

Con el fin de desarrollar una línea celular que produzca de manera estable un gen de interés con un rendimiento elevado, es necesario seleccionar de la población obtenida de diferentes células productoras que sobrevivieron a la selección de acuerdo con el ejemplo 1 los mejores clones celulares que muestren tanto una tasa de expresión de anticuerpo elevada como un buen crecimiento celular. Con este fin, se generaron líneas celulares a partir de células únicas mediante dilución limitante. La dilución limitante permite obtener una población celular monoclonal a partir de la masa policlonal de células que sobrevivieron la selección de acuerdo con el ejemplo 1. Esto se consigue estableciendo una serie de diluciones cada vez mayores del cultivo celular (policlonal) original. Se prepara una suspensión de las células originales. A continuación, se preparan diluciones apropiadas, dependiendo del número de células de la población de partida. Después de llevar a cabo las diluciones finales, se coloca una única célula en el pocillo de una placa de cultivo celular y se prepara un clon a partir de esta. El establecimiento de una población de células monoclonales garantiza una expresión de anticuerpos estable durante un periodo de tiempo prolongado. Se obtuvieron clones respectivamente de las poblaciones celulares seleccionadas V-wtFRalfa (ácido fólico 15 nM), V-mutFRalfa (ácido fólico 5 nM), V-DHFRref (MTX 125 nM) y V-DHFRref (MTX 250 nM - de una transfección diferente). La obtención de clones se realizó en un medio completo y además, en un medio de selección correspondiente como se había utilizado anteriormente para la selección. Por lo tanto, en el último caso, se mantuvo la presión de selección durante la obtención de clones a partir de células únicas. Después del cultivo con éxito, los clones que habían alcanzado una confluencia de más de un 70 % se transfirieron a placas de 24 pocillos y se estudiaron en un cultivo discontinuo (duración de 10 días) para determinar su producción de anticuerpos. Durante el cultivo discontinuo nuevamente se utilizó medio completo (sin presión de selección) o medio de selección (se mantuvo la presión de selección). Los clones se alinearon (dependiendo del medio) del nivel de expresión más alto al más bajo. Los resultados se muestran en las figuras de 1 a 4.

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Se muestran los resultados de la obtención de clones conseguidos en medio completo (sin mantener la presión de selección después de la selección) y medio de selección (se mantuvo la presión de selección después de la selección). Aquí, se observa el desarrollo típico de un procedimiento de obtención de clones manual. Se observan 1-5 clones celulares con una producción elevada y, posteriormente, la curva desciende rápidamente hasta una expresión de clones celulares baja o nula. Además, dentro de los clones celulares con una producción baja, se observó un amplio espectro de productividades celulares, donde, sin embargo, la mayoría estuvo por debajo del umbral de 9 mg/L.

La obtención de clones de células transfectadas con V-DHFRref (seleccionadas con MTX 125 nM) en medio completo y medio de selección dio como resultado 86 clones (53 en medio completo, 33 en medio de selección) de 6 x placas de 96 pocillos. El clon con la producción más elevada se cultivó en medio de selección y produjo en el lote de 24 pocillos 28,4 mg/L. En el matraz agitado de 250 mL (50 mL en total), el combinado policlonal original también consiguió un título de 28 mg/L. La obtención de clones de células transfectadas con V-DHFRref (seleccionadas con MTX 250 nM) en medio completo y medio de selección permitió aislar 76 clones (41 en medio completo y 35 en medio selectivo). Se aislaron los tres mejores clones a partir de células cultivadas en medio completo después de la selección, por lo demás las células cultivadas en medio selectivo mostraron una productividad global más elevada que los clones en medio completo. El combinado policlonal de partida tuvo un título de 27 mg/L, el clon celular de producción más elevada consiguió 42 mg/L en 24 pocillos. Ambos controles de referencia muestran que no es necesariamente la concentración más elevada de MTX utilizada durante la selección que da como resultado el título más elevado. Con el fin de poder aislar el mejor clon, es necesario analizar un número elevado de clones celulares.

También se obtuvieron clones de las células transfectadas con el vector V-wtFRalfa que comprende el receptor de folato alfa no modificado como marcador seleccionable (seleccionado con ácido fólico 15 nM) en medio completo (sin mantener la presión de selección después de la selección) o en medio de selección (para mantener de esta manera la presión de selección durante la obtención de clones). Los dos clones con la producción más elevada se aislaron en medio selectivo. El mejor clon consiguió 53 mg/L en un formato de 24 pocillos. Es remarcable que solo 7 clones sobrevivieran en este medio selectivo. En medio completo sobrevivieron 49 clones. El combinado original tuvo en un matraz agitado de 250 mL una concentración de anticuerpo de aproximadamente 24 mg/L.

También se obtuvieron clones de las células transfectadas con el vector V-mutFRalfa que comprende el receptor de folato alfa mutado como marcador seleccionable (seleccionado con ácido fólico 5 nM) en medio completo (sin mantener la presión de selección después de la selección) o en medio de selección (para mantener de esta manera la presión de selección después de la selección durante la obtención de clones). Los dos mejores clones se aislaron de medio completo así como de medio selectivo. El clon con la producción más elevada tuvo un título de 42 mg/L en el sobrenadante. En conjunto, se pudieron transferir cien clones a las placas de 24 pocillos, en virtud de esto 52 en medio completo y 48 en medio selectivo. Aquí, se consiguieron resultados similares en medio selectivo y completo. La Tabla 6 resume las tasas de productividad de los clones con la mejor producción.

Tabla 6: Resumen de los clones con la producción más elevada (mAb [mg/L]) después de la dilución de punto final

La Tabla 6 muestra que la selección con los dos marcadores seleccionables receptor de folato alfa no modificado (V-wtFRalfa) y receptor de folato alfa mutado (V-mutFRalfa) proporcionó después de la obtención de clones a partir de células individuales clones que consiguieron en el experimento de obtención de clones realizado uno resultados al menos igual de buenos que el marcador seleccionable de referencia DHFR. Experimentos adicionales (véase más adelante) muestran que también se pueden obtener tasas de productividad globales más elevadas cuando se utiliza el receptor de folato mutado de acuerdo con la presente divulgación como marcador seleccionable.

Ejemplo 4: Experimentos de cotransfección

Con el fin de analizar la rigurosidad y eficacia de selección de una presión de selección doble en forma de privación de ácido fólico en medio selectivo y adición de MTX, las células se cotransfectaron con V-DHFRref y V-mutFRalfa. Todos los vectores transfectados comprendieron los mismos genes de anticuerpos como proteína de interés. Se utilizaron dos vectores de expresión separados para la cotransfección, donde cada vector comprendió los casetes de expresión para expresar la cadena ligera y pesada del anticuerpo. Antes de la transfección, se lavaron las células CHO (excepto en el caso de las células que se utilizaron previamente para el control de referencia de DHFR) tres veces con PBS para reducir la transferencia de ácido fólico desde el medio de cultivo y se pasaron a medio selectivo para la transfección. El pase de las células CHO utilizadas para la transfección del control de referencia V-DHFRref se realizó en medio completo.

Los vectores se transfectaron en las células utilizando nucleofección. A diferencia de las transfecciones con un único vector, para la cotransfección se transfectaron el doble de células (1x107 LZ/mL) y se utilizó el doble de ADN (3 |jg por vector). Sin embargo, en función del número de células, la cantidad de ADN utilizada en la transfección fue la misma. Las células CHO que se transfectaron con V-DHFRref/V-mutFRalfa y controles se transfirieron a medio selectivo; las transfecciones de referencia se transfirieron al medio completo. La selección comenzó 48 horas después de la transfección. Se combinaron tres transfecciones por configuración de prueba después de 48 h, se centrifugaron y se resuspendieron en 9 mL de medio de selección o medio completo y se dividieron como triplicados para los tres medios de selección. Tres lotes de combinados de células cotransfectadas y controles se expusieron a tres concentraciones diferentes de ácido fólico/MTX para la selección. En paralelo a esto, se realizó el control de referencia con el vector V-DHFRref utilizando una selección con G418/MTX. Aquí, las células se cultivaron en medio completo que comprende ácido fólico en abundancia. Para comenzar el ciclo de selección, se añadieron entonces los agentes selectivos para inducir la presión de selección. Como control negativo, se realizó una transfección sin la adición de ADN. La transfección realizada y los medios de cultivo utilizados se resumen en la siguiente Tabla 7.

Tabla 7: Resumen de las cotransfecciones realizadas

Después de completar la selección, se prepararon cultivos discontinuos a partir de las células seleccionadas para determinar la tasa de expresión de los genes de anticuerpo integrados. Durante el cultivo discontinuo, las poblaciones celulares se cultivaron en medio completo. En todas las poblaciones celulares se determinaron las concentraciones de anticuerpo después de 13 días de cultivo discontinuo para la cotransfección y transfección de referencia utilizando cromatografía por afinidad con proteína A para determinar la expresión del anticuerpo. Los resultados se muestran en la Tabla 8, donde los cultivos discontinuos se nombraron según su origen en el medio de selección, es decir, se nombran según la selección realizada (50/50, 50/100, 12,5/50 [FA nM/MTX nM] o V-DHFRref-G418-MTX - realizada por triplicado). No se muestran los combinados celulares que no sobrevivieron. De nuevo, debido al método de medida utilizado, solo se consideran significativos los valores por encima de 9 mg/mL.

Como se puede observar en la Tabla 8, los combinados del método de referencia con DHFR produjeron después de los tres pasos de selección (0,8 mg/mL de G418 - MTX 500 nM - MTX 1 |^jM) hasta 58 mg/L de título de anticuerpos. A partir de la cotransfección utilizando V-mutFRalfa/V-DHFRref casi todos los combinados celulares sobrevivieron cuando las células se transfirieron después de la selección a medio completo. Los combinados con V-mutFRalfa/ V-DHFRref originados a partir del medio de selección 50/50 produjeron hasta 25 mg/L, los combinados 50/100 y las poblaciones 12,5/50 produjeron títulos de hasta 36 mg/L.

Se utilizaron tres ciclos de selección consecutivos en el método de referencia con DHFR, debido a que una selección con G418 estuvo seguida de dos ciclos de selección con MTX (MTX 500 nM y 1 j M). Por lo tanto, se estudió adicionalmente si se pueden aumentar las tasas de expresión cuando se realizan dos ciclos de selección utilizando una concentración limitante de ácido fólico y MTX en el medio de cultivo celular. Por lo tanto, después de realizar el primer ciclo de selección utilizando una concentración limitante de ácido fólico y MTX (respecto a las concentraciones utilizadas véase anteriormente), las células se transfirieron a un medio completo para permitir la recuperación. Posteriormente, las células se expusieron de nuevo en un segundo ciclo de selección al mismo medio selectivo y, por lo tanto, a la misma presión de selección. Los resultados se muestran en la Tabla 9.

Tabla 9: Concentración del anticuerpo (mAb) en el sobrenadante de cultivo del cultivo discontinuo en [mg/L]

La Tabla 9 muestra que cuando las células transfectadas con V-mutFRalfa/V-DHFRref se expusieron de nuevo a la presión de selección de 35-38 días, las células mostraron un aumento significativo muy elevado en la producción de 21 a 670 mg/L. Esto es un aumento de treinta veces en el título de anticuerpos. Asimismo, la otra población en el medio de selección 50/50 produjo con una presión de selección repetida 20 veces más que el cultivo cultivado en medio completo. Además, los resultados obtenidos fueron significativamente mejores que con el método de referencia con DHFR (véase la Tabla 8), donde se realizaron tres ciclos de selección. Por lo tanto, este principio de selección, donde se realizan dos ciclos de selección utilizando un medio selectivo que comprende una concentración limitante de folato y un antifolato con un paso de cultivo intermedio en medio no selectivo dio como resultado título de expresión elevada extraordinarios.

Ejemplo 5: Obtención de clones a partir de células únicas

Con el fin de generar líneas celulares con una expresión del vector estable, se obtuvieron clones de las poblaciones celulares obtenidas de acuerdo con el ejemplo 4 después de completar la selección. Después de la selección, se obtuvieron clones de un combinado de transfección policlonal 50/50 utilizando dilución limitante en medio completo (de este modo no se mantiene la presión de selección durante la obtención de clones) y medio de selección (de este modo se mantiene la presión de selección durante la obtención de clones) en 6 x placas de 96 pocillos. Después del cultivo con éxito de los clones, los clones se transfirieron en una confluencia de más de un 70 % a placas de 24 pocillos y se estudiaron después de 10 días de cultivo discontinuo para determinar su productividad de anticuerpos. Los resultados conseguidos cuando se obtuvieron clones de la población cotransfectada con V-mutFRalfa/V-DHFRref y seleccionada se muestran en la Fig. 5. Como se muestra en la Fig. 5, la obtención de clones de las células V-mutFRalfa/V-DHFRref en medio completo y medio de selección dio como resultado 65 clones (55 en medio completo, 10 en medio selectivo que comprendía FA 50 nM/MTX 50 nM) a partir de 6 x placas de 96 pocillos. Los clones se alinearon (dependiendo del medio) del nivel de expresión más alto al más bajo. El clon con la producción más elevada se aisló a partir de la obtención de clones en medio completo y produjo en el lote de 24 pocillos 450 mg/L. En el matraz agitado de 250 mL (50 mL en total) el combinado original consiguió un título de 670 mg/L.

Como referencia, se obtuvieron clones con dilución limitante del vector DHFR V-DHFRref después de la selección anterior con G418-MTX. Los respectivos resultados se obtuvieron a partir de un experimento anterior y se realizaron en condiciones similares. La obtención de clones se realizó en medio de selección, para mantener de esta manera la presión de selección durante la obtención de clones. Los resultados se muestran en la Tabla 10.

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Aquí, se realizó una selección gradual con G-418 MTX 500 nM MTX 1 |^jM. La Tabla 10 muestra los resultados de una dilución de punto final de la población en medio de selección (MTX 1 ^jM). Los clones se alinearon del nivel de expresión más alto al más bajo. El clon con la producción más elevada de esta referencia consiguió 51 mg/L en el lote de 20 pocillos. Se consiguió un amplio espectro de productividades celulares, cuya mayoría, sin embargo, estuvieron por debajo del umbral de 9 mg/L.

Los resultados mostrados en la Fig. 5 y la Tabla 10 muestran que una cotransfección con V-mutFRalfa/V-DHFRref dio como resultado productividades significativamente más elevadas y además, el número de clones celulares con producción elevada aislados aumentó significativamente. Más de un 50 % de los clones aislados de la población policlonal seleccionada consiguieron un título que fue superior a 300 mg/L. La cotransfección en la rigurosidad de selección más elevada consiguió un aumento de nueve veces en la concentración de anticuerpos dentro de los clones superiores de células productoras de V-mutFRalfa, V-DHFRref (diferentes métodos de selección) y V-mutFRalfa/V-DHFRref. Los resultados se muestran en la Tabla 11.

T l 11: R m n l l n n l r i n m l v

La Tabla 11 muestra la concentración de anticuerpos (mAb [mg/L]) de los mejores productores de las selecciones realizadas después de la obtención de clones. Como se puede observar, la cotransfección de V-mutFRalfa/V-DHFRref y la selección en un medio de selección que comprende una concentración limitada de ácido fólico y además que comprende un antifolato proporcionaron los mejores resultados.

Los resultados anteriores muestran que la selección que se basa en el uso de un receptor de folato mutado como marcador seleccionable permitió la supervivencia de células transfectadas con éxito cuando se utiliza un medio de selección que comprende una cantidad limitante de folato, aquí ácido fólico. La selección utilizando el receptor de folato mutado alfa como marcador de selección fue más rápida que cuando se utiliza el receptor de folato alfa no modificado como marcador de selección. Debido a que el receptor de folato alfa no modificado se une con una afinidad elevada al ácido fólico (KD = 0,1 nM), la presión de selección es elevada por debajo de la concentración umbral de ácido fólico tolerada por debajo de la cual también las células transfectadas sin ADN podrían sobrevivir. Esto también queda reflejado en la concentración de anticuerpos determinada. Las células que fueron transfectadas con el receptor de folato mutado pudieron sobrevivir en todos los medios selectivos estudiados. Además, se observó un crecimiento relativamente homogéneo. En los tres medios de cultivo más concentrados, se pudieron realizar pases de las células después de 12 días; en los tres medios con la concentración de ácido fólico más baja se había conseguido la recuperación al llegar al día 16. En estos casos, la presión de selección sobre las células se comparó con el receptor de folato no modificado aumentó aún más. Debido a que la sobreexpresión del receptor de folato mutado se correlaciona con la expresión de la proteína de interés, el título de anticuerpos determinado es inversamente proporcional a la concentración de ácido fólico en el medio de selección.

Ejemplo 6: Transfección de vectores con dhfr, FolR no modificado y FolR A49L como marcadores seleccionables

En este ejemplo, se estudiaron y compararon diferentes condiciones de selección. Las células CHO se transfectaron con los vectores V-DHFRref, V-wtFRalfa y V-mutFRalfa (mutante A49L). Se utilizó una concentración limitante de ácido fólico en el medio de selección para crear una presión de selección sobre las células hospedadoras, también denominada en la presente privación de ácido fólico.

El cultivo celular, la transfección y el cribado se llevaron a cabo en matraces agitados utilizando células CHO que crecen en suspensión en un medio de cultivo definido químicamente. Las células se transfectaron mediante electroporación (nucleofección). Para la selección con privación de ácido fólico, se pasaron las células a medio sin ácido fólico 3 días antes de la transfección y se transfectaron en un medio sin ácido fólico para reducir las reservas internas de ácido fólico. Dependiendo de la viabilidad celular, se inició la selección 24-48 h después de la transfección añadiendo el medio selectivo a las células. Las células transfectadas con V-wtFRalfa y V-mutFRalfa se seleccionaron utilizando 6 concentraciones diferentes de ácido fólico (11700, 150, 50, 5, 0,5 y 0 nM) mientras que en el caso de células transfectadas con V-DHFRref se estudiaron 6 concentraciones diferentes de MTX como referencia (2000, 1000, 500, 250, 125 y 0 nM).

Después de que las células se recuperaran hasta una viabilidad superior a un 80 % después de la selección, se analizó la productividad de la población de células supervivientes. Se analizó la productividad de las poblaciones celulares seleccionadas después de la selección mediante cultivos discontinuos en matraces agitados con sobrecrecimiento en un medio completo que contenía ácido fólico 11,7 |^jM. Se sembraron cultivos discontinuos en matraces agitados (125) con un volumen de trabajo de 50 mL y se cultivaron en un armario agitador (no humidificado) a 150 rpm y un 10 % de CO². La viabilidad de las células tuvo que ser > 90 % al inicio del ensayo. La densidad de células para la siembra fue de 2x105 c/mL. La determinación del valor cuantitativo tuvo lugar el día 13. Se determinaron los títulos de anticuerpos en el sobrenadante del cultivo celular mediante HPLC con proteína A 13 días después del inicio del cultivo.

Los resultados de este experimento se describen a continuación. Para evaluar la rigurosidad de selección de ambas variantes del receptor de folato en concentraciones limitantes de ácido fólico, se estudiaron diversas concentraciones de ácido fólico comprendidas entre 11700 nM (medio de referencia, medio completo) y 0 nM para seleccionar las células que sobreexpresaban anticuerpos. En paralelo, se estudiaron diferentes concentraciones de MTX con el vector DHFR de referencia para comparar el rendimiento. Fue posible recuperar todas las poblaciones de células transfectadas. Las que estaban con ácido fólico 0 nM presumiblemente contuvieron algunas trazas de ácido fólico transferido desde el medio de precultivo. Estas cantidades residuales de ácido fólico fueron aparentemente suficientes para promover la supervivencia de una subporción de células. Sin embargo, fue necesaria la adición posterior de medio que contenía ácido fólico para recuperar estas poblaciones. Se evaluó la productividad como se ha descrito anteriormente. La Tabla 12 resume los resultados de la productividad.

T l 12: Pr ivi l i n l l r l l i n

La Tabla 12 muestra los resultados de células transfectadas seleccionadas con diferentes concentraciones de ácido fólico o MTX que se analizaron en cultivos discontinuos en matraces agitados. En el día 13 del cultivo, se tomaron muestras del medio de cultivo y se analizaron para determinar el contenido de anticuerpo por HPLC con proteína A. Se observó que todas las poblaciones celulares producen anticuerpos. Con V-wtFRalfa, se consiguió la productividad máxima con una selección de ácido fólico 5 nM. Esta concentración de ácido fólico es inferior a la concentración observada en los experimentos anteriores y probablemente es atribuible al hecho de que se transfirió algo de ácido fólico desde el medio de cultivo inicial en este ejemplo. Esto también explicaría la recuperación y tasas de producción conseguidas con un ácido fólico 0 nM. Una reducción adicional de ácido fólico no dio lugar a una productividad más elevada cuando se utilizó el receptor de folato no modificado. Por el contrario, con V-mutFRalfa, se consigue una productividad más elevada con la concentración más baja de ácido fólico durante la selección. Esta productividad conseguida con el mutante es significativamente más elevada que la productividad conseguida con el receptor de folato no modificado y también es significativamente superior a la de DHFR/MTX.

Además, cuando se analizó la recuperación de las células durante la selección se observó que las células transfectadas con V-mutFRalfa se recuperaron significativamente más rápido en concentraciones muy bajas de ácido fólico, en particular < 25 nM. Por lo tanto, las tasas de recuperación más rápidas descritas anteriormente también se confirmaron en este experimento.

Los ejemplos de 1 a 6 descritos anteriormente demuestran las ventajas que se consiguen con el contenido de la presente divulgación, donde se utiliza un receptor de folato mutado para la selección. Por ejemplo, en los ejemplos descritos anteriormente se determinó una secreción de anticuerpo de la población de referencia (DHFR) de 28 mg/L, con la rigurosidad de selección de supervivencia más elevada de células transfectadas con V-wtFRalfa se obtuvieron 24 mg/L y con las células transfectadas con V-mutFRalfa se obtuvieron 26,6 mg/L. Por lo tanto, las tasas de productividad determinadas en el experimento respectivo estuvieron en un nivel similar, lo que muestra que el receptor de folato alfa no modificado no modificado así como también el receptor de folato alfa mutado consiguen como marcadores seleccionables resultados comparables al sistema de selección consolidado DHFR/MTX que se puede considerar como el «método de referencia». Además, cuando se comparan los periodos de tiempo necesarios para la selección se observó que es posible una selección significativamente más rápida con un sistema de selección que utiliza el receptor de folato mutado como proporciona la presente divulgación. Incluso las células transfectadas con el vector V-wtFRalfa en ácido fólico 15 nM y ácido fólico 25 nM que necesitaron una fase de recuperación más larga que las células transfectadas con V-mutFRalfa con la misma concentración (16 días) mostraron con 20 días una ventaja más clara respecto al control de referencia (DHFR), que está en este momento todavía en crisis. La utilización del receptor de folato mutante de acuerdo con la presente divulgación permite, por lo tanto, en comparación con el sistema DHF^r/MTX ahorrar tiempo durante la fase de selección en el desarrollo de la línea celular y también es más rápido que el sistema de selección que utiliza el componente no modificado. Estos resultados también indican que la utilización del receptor de folato mutado proporciona a las células una ventaja en comparación con la utilización del receptor de folato no modificado en el medio selectivo estudiado, ya que las células sobreviven en una ventana de concentraciones de ácido fólico mayores y, en particular, pueden sobrevivir en concentraciones de ácido fólico más bajas, y de esta manera permiten condiciones de selección más rigurosas. Además, la crisis de selección se recuperó significativamente antes con el receptor de folato mutado que en el caso de las células que se transfectaron con el receptor de folato no modificado. Los resultados muestran que la utilización de un receptor de folato mutado como el descrito en la presente tiene ventajas importantes.

Además, los experimentos donde se realizó una selección doble contra el receptor de folato y DHFR como marcadores seleccionables utilizando un medio de selección que comprende folato en una concentración limitante y además que comprende un antifolato, también mostraron ventajas claras para el receptor de folato mutado. La mutación en el receptor de folato aparentemente tiene un efecto positivo en el crecimiento celular en dicha presión de selección doble. Sin desear ceñirse a ninguna teoría, podría ser que la afinidad por antifolatos tales como MTX se reduce en el mutante, de modo que se incorpora menos MTX a las células. Además, se observó que es conveniente repetir la selección y transferir las células a medio completo entre dos ciclos de selección para permitir a las células que se recuperen después del primer ciclo de selección. Después de retransferir las células al medio de selección, fue posible el enriquecimiento en células que habían integrado ambos vectores en su genoma y, por lo tanto, fueron capaces de sobrevivir la presión de selección doble. Se observó que la productividad aumentó en comparación con el medio completo hasta de veinte a treinta veces. Esto es una ventaja significativa. En comparación con el control de referencia después de una selección en múltiples pasos con G418/MTX estándar, aún se observó un aumento de seis a trece veces en la productividad. Por lo tanto, el sistema de selección de acuerdo con la presente divulgación donde se utiliza un receptor de folato mutado combinado con DHFR tiene ventajas claras respecto al sistema de selección de la técnica anterior. Además, utilizando esta estrategia de selección doble se pudieron seleccionar más de un 50 % de clones con producción elevada que tenía un título superior a 300 mg/L. Por lo tanto, la búsqueda de clones con una producción muy elevada fue menos complicada, lo que es una mejora significativa respecto a las tecnologías de cribado existentes en particular a efectos de la producción industrial de proteínas.

El receptor de folato mutado que está de acuerdo con la presente divulgación utilizado como marcador seleccionable es sumamente ventajoso, ya que las poblaciones transfectadas sobreviven las crisis de crecimiento más rápidamente que los sistemas de selección de referencia. Además, las poblaciones celulares que se transfectaron con el receptor de folato mutado mostraron después de la selección en diferentes medios selectivos una expresión del receptor y anticuerpo que fue inversamente proporcional a la concentración de ácido fólico. Esta correlación se pudo mostrar utilizando análisis biológico molecular del ADN genómico (número de copias) así como a nivel de ARN. Además, se observó que utilizar un receptor de folato mutado como el descrito en la presente es sumamente ventajoso cuando se lleva a cabo una coselección con DHFR/MTX. Los controles utilizados (transfecciones únicas de FRwt, FRmut y DHFR) no pudieron

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sobrevivir el efecto letal de una combinación rigurosa de privación de ácido fólico y MTX. La rigurosidad elevada de este sistema de selección también tuvo el efecto no obstante de que algunas de las poblaciones cotransfectadas se seleccionaron. Sin embargo, al añadir ácido fólico como paso intermedio y realizar un segundo ciclo de selección, se consiguieron resultados muy buenos con el principio de cotransfección cuando se utilizó un principio de selección doble con FRmut/DHFR. Se mostró que este método permite un cribado más rápido y menos complicado para identificar los clones (superiores) mejores productores. La obtención de clones a partir de células individuales de la población de células con la producción más elevada (670 mg/L en un volumen de cultivo de 50 mL) dio como resultado una recuperación de aproximadamente un 50 % de clones de células con producción elevada que produjeron más de 300 mg/mL. En comparación con la transfección única y la referencia, la obtención de clones de la población cotransfectada consiguió una productividad promedio de 240 mg/L, lo que es un aumento de 40 veces de la productividad. El clon celular con la mayor producción consiguió 450 mg/L en un lote de 24 pocillos. Estos resultados confirman que la presente divulgación, que se basa en el uso de un receptor de folato mutado como marcador de selección, realiza una contribución significativa a los sistemas de selección existentes.

Ejemplo 7: Transfección de un vector de expresión que comprende dos marcadores seleccionables

En este ejemplo, se transfectaron (nucleofección) células CHO con un vector de expresión que comprendía un casete de expresión que comprende un polinucleótido que codifica un receptor de folato alfa humano mutado (mutante A49L -mutFRalfa, véase anteriormente) y un casete de expresión que comprende un polinucleótido que codifica DHFR (V-mutFRalfa/DHFRref). Por lo tanto, ambos marcadores seleccionables mutFRalfa y DHFR estaban en el mismo vector de expresión. Además, el vector de expresión comprendía un casete de expresión que comprende un polinucleótido que codifica la cadena ligera de un anticuerpo y un casete de expresión que comprende un polinucleótido que codifica la cadena pesada de un anticuerpo. En este experimento, se expresó un anticuerpo diferente al de los ejemplos anteriores. Se estudiaron cinco condiciones de selección diferentes utilizando ácido fólico (FA) 50 nM y diferentes concentraciones de MTX. Los medios de selección se resumen en la siguiente Tabla 13. Después de la selección, los combinados celulares seleccionados se transfirieron a medio completo y se cultivaron en cultivos discontinuos en matraces agitados. En el día 13 del cultivo, se tomaron muestras del medio de cultivo y se analizaron para determinar el contenido de anticuerpo por HPLC con proteína A. Los resultados también se muestran en la Tabla 13.

Tabla 13: Productividad del combinado que se obtiene con el vector de expresión V-mutFRalfa/DHFRref utilizando diferentes condiciones de selección

Como se puede observar, una concentración de MTX de tan solo 5 nM proporciona una ventaja de selección significativa cuando se utilizó el vector de expresión V-mutFRalfa/DHFRref que comprende un receptor de folato mutado y DHFR como marcador seleccionable. Esto confirma las ventajas de utilizar el receptor de folato mutado combinado con DHFR para la selección que también se muestran en los otros ejemplos. Las productividades de anticuerpos aumentan significativamente y además se pueden utilizar concentraciones más bajas de MTX durante la selección, lo que es una ventaja significativa considerando que MTX es un agente tóxico.

Ejemplo 8: Transfección con un pretratamiento simplificado de células CHO originales

Con el fin de estudiar si es posible evitar los pasos de centrifugación/lavado de células en el procedimiento, se tomaron las células CHO originales en cultivo utilizando medios de cultivo que contenían una concentración limitante de ácido fólico de 50 nM, ya fuera de células crioconservadas en medio completo o medio con ácido fólico 50 nM. Después de varios pases en este medio, las células se transfectaron utilizando el método de nucleofección y el vector de expresión V-mutFRalfa/DHFRref que codifica un anticuerpo monoclonal. Esta transfección y cultivo posterior se realizó utilizando el mismo medio con ácido fólico 50 nM. A continuación, 48 h después de la transfección, se aumentó la presión de selección añadiendo MTX 10 nM al cultivo. Se evaluó la productividad de los cultivos recuperados de la selección en los cultivos discontinuos en matraces agitados utilizando medio completo. Los resultados se muestran en la Tabla 14. Como se muestra en la Tabla 14, tales protocolos simplificados para los procedimientos de transfección y selección dio como resultado productividades comparables a los procedimientos de los ejemplos anteriores (por ejemplo, Tabla 13).

Tabla 14: Productividad del combinado que se obtiene con el vector de expresión V-mutFRalfa/DHFRref utilizando diferentes condiciones de selección.

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Claims

REIVINDICACIONES

1. Un vector de expresión o combinación de al menos dos vectores de expresión que comprende:

b) al menos un polinucleótido que codifica un polipéptido de interés,

2. El vector de expresión o combinación de al menos dos vectores de expresión de acuerdo con la reivindicación 1, donde la alanina presente en la secuencia no modificada en la posición 49 es sustituida por un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en leucina, glicina, valina, isoleucina, histidina y ácido aspártico.

3. El vector de expresión o combinación de al menos dos vectores de expresión de acuerdo con una o más de las reivindicaciones 1 o 2, que tiene una o más de las siguientes características:

a) el receptor de folato mutado codificado comprende una secuencia de aminoácidos que se obtiene a partir de la secuencia de aminoácidos del receptor de folato alfa humano no modificado maduro mostrada como SEQ ID NO 1, donde la secuencia de aminoácidos del receptor de folato mutado comprende más de una mutación que disminuye la afinidad de unión al folato en comparación con el receptor de folato alfa humano no modificado maduro mostrado como SEQ ID NO 1; y/o

b) el receptor de folato mutado codificado comprende al menos una sustitución en una posición aminoacídica que corresponde desde un punto de vista estructural o según homología con la secuencia de aminoácidos a una posición aminoacídica seleccionada entre la posición 104 y 166 de una secuencia del receptor de folato humano no modificado maduro.

4. El vector de expresión o combinación de al menos dos vectores de expresión de acuerdo con una o más de las reivindicaciones de 1 a 3, donde el receptor de folato mutado tiene una menor afinidad de unión al diastereoisómero 6S de 5-metiltetrahidrofolato en comparación con el receptor de folato no modificado y/o donde el receptor de folato mutado tiene una menor afinidad de unión al ácido fólico en comparación con el receptor de folato no modificado.

5. El vector de expresión o combinación de al menos dos vectores de expresión de acuerdo con una o más de las reivindicaciones de 1 a 4, donde el receptor de folato mutado codificado tiene las siguientes características:

a) el receptor de folato mutado maduro comprende la siguiente secuencia IAWARTELLNVCMNAKHHKEKPGPEDKLHEQCRPWRKNACCSTNTSQEXaaHKDVSYLYRFNWNHCGEMAPACKRHFI QDTCLYECSPNLGPWIQQVDQSWRKERVLNVPLCKEDCEQWWEDCRTSYTCKSNWHKGWNWTSGFNKCAVGAACQ PFHFYFPTPTVLCNEIWTHSYKVSNYSRGSGRCIQMWFDPAQGNPNEEVARFYA mostrada como SEQ ID NO 9 donde Xaa es un aminoácido seleccionado entre leucina, glicina, valina, isoleucina, histidina y ácido aspártico o es leucina; o

b) el receptor de folato mutado maduro comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad secuencial de al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 96 %, al menos un 97 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % respecto a la secuencia mostrada como SEQ ID NO 9, y donde Xaa no es alanina en dicho receptor de folato mutado y donde la afinidad de unión al folato de dicho receptor de folato mutado es menor en comparación con la secuencia del receptor de folato alfa humano no modificado maduro donde Xaa es alanina mostrada como SEQ ID NO 1, y donde Xaa es un aminoácido seleccionado entre leucina, glicina, valina, isoleucina, histidina y ácido aspártico o es leucina.

6. El vector de expresión o combinación de al menos dos vectores de expresión de acuerdo con una o más de las reivindicaciones de 1 a 5, donde el receptor de folato mutado codificado tiene las siguientes características:

a) comprende la secuencia IAWARTELLNVCMNAKHHKEKPGPEDKLHEQCRPWRKNACCSTNTSQEXaaHKDVSYLYRFNWNHCGEMAPACKRHFI QDTCLYECSPNLGPWIQQVDQSWRKERVLNVPLCKEDCEQWWEDCRTSYTCKSNWHKGWNWTSGFNKCAVGAACQ PFHFYFPTPTVLCNEIWTHSYKVSNYSRGSGRCIQMWFDPAQGNPNEEVARFYAAAMSGAGPWAAWPFLLSLALMLLW LLS mostrada como SEQ ID NO 13

donde Xaa es un aminoácido seleccionado entre leucina, glicina, valina, isoleucina, histidina y ácido aspártico;

o

b) comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad secuencial de al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 96 %, al menos un 97 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % respecto a la secuencia mostrada como SEQ ID NO 13, y donde Xaa es un aminoácido seleccionado entre leucina, glicina, valina, isoleucina, histidina y ácido aspártico y donde la afinidad de unión de dicho receptor de folato mutado al diastereoisómero 6S de 5-metiltetrahidrofolato es menor en comparación con la secuencia del receptor de folato alfa humano no modificado maduro donde Xaa es alanina mostrada como la SEQ ID NO 1.

7. El vector de expresión o combinación de al menos dos vectores de expresión de acuerdo con una o más de las reivindicaciones de 1 a 6, donde el receptor de folato mutado codificado se obtiene a partir de un receptor de folato alfa.

8. El vector de expresión o combinación de al menos dos vectores de expresión de acuerdo con una o más de las reivindicaciones de 1 a 7, que comprende además un polinucleótido que codifica un marcador seleccionable que participa en el metabolismo del folato, donde opcionalmente el polinucleótido que codifica un marcador seleccionable codifica una dihidrofolato-reductasa.

9. El vector de expresión o combinación de al menos dos vectores de expresión de acuerdo con una o más de las reivindicaciones de 1 a 8, que comprende:

a) un casete de expresión que comprende un polinucleótido que codifica un receptor de folato mutado, donde el receptor de folato mutado codificado comprende una sustitución de aminoácidos en la posición correspondiente desde un punto de vista estructural o según homología con la secuencia de aminoácidos al aminoácido 49 de la secuencia del receptor de folato alfa humano no modificado maduro mostrada como SEQ ID NO 1, donde la alanina presente en la secuencia no modificada en dicha posición es sustituida por leucina;

b) al menos un casete de expresión que comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido de interés; y c) adicionalmente un casete de expresión que comprende un polinucleótido que codifica un marcador seleccionable adicional, opcionalmente donde el marcador seleccionable es dihidrofolato-reductasa.

10. Una célula hospedadora cuya viabilidad depende de la captación de folato que comprende

a) un polinucleótido introducido que codifica un receptor de folato mutado que es un receptor de folato unido a la membrana funcional que tiene una afinidad de unión al folato menor en comparación con el receptor de folato no modificado como marcador seleccionable y donde el receptor de folato mutado codificado comprende una sustitución de aminoácidos en la posición correspondiente desde un punto de vista estructural o según homología con la secuencia de aminoácidos al aminoácido 49 de la secuencia del receptor de folato alfa humano no modificado maduro como se muestra en la SEQ ID NO 1 donde la alanina presente en la secuencia no modificada es sustituida por un aminoácido que da como resultado una afinidad de unión al folato menor,

y

b) al menos un polinucleótido introducido que codifica un polipéptido de interés,

11. La célula hospedadora de acuerdo con la reivindicación 10, donde el receptor de folato mutado tiene una o más características como las definidas en una cualquiera de las reivindicaciones de 2 a 7 y donde la célula hospedadora comprende opcionalmente un vector de expresión o combinación de al menos dos vectores de expresión como los definidos en una o más de las reivindicaciones de 1 a 9.

12. La célula hospedadora de acuerdo con la reivindicación 10 u 11, donde la célula hospedadora tiene una o más de las siguientes características:

a) es una célula de mamífero;

b) es una célula de roedor;

c) es una célula CHO;

d) expresa un receptor de folato endógeno;

e) comprende un polinucleótido introducido que codifica un marcador seleccionable que participa en el metabolismo del folato, que opcionalmente, es una dihidrofolato-reductasa; y/o

f) los polinucleótidos introducidos se integran de manera estable en el genoma.

13. Un método para producir una célula hospedadora de acuerdo con al menos una de las reivindicaciones de 10 a 12, que comprende introducir en la célula hospedadora cuya viabilidad depende de la captación de folato

a) un polinucleótido que codifica un receptor de folato mutado que es un receptor de folato unido a la membrana funcional que tiene una afinidad de unión al folato menor en comparación con el receptor de folato no modificado como marcador seleccionable y donde el receptor de folato mutado codificado comprende una sustitución de aminoácidos en la posición correspondiente desde un punto de vista estructural o según homología con la secuencia de aminoácidos al aminoácido 49 de la secuencia del receptor de folato alfa humano no modificado maduro como se muestra en la SEQ ID NO 1 donde la alanina presente en la secuencia no modificada es sustituida por un aminoácido que da como resultado una afinidad de unión al folato menor,

donde opcionalmente el receptor de folato mutado tiene una o más de las características como se han definido en una cualquiera de las reivindicaciones de 2 a 7,

y

b) al menos un polinucleótido que codifica un polipéptido de interés, donde el polipéptido de interés se secreta a partir de dicha célula hospedadora,

donde opcionalmente, un vector de expresión o combinación de al menos dos vectores de expresión de acuerdo con una o más de las reivindicaciones de 1 a 9 se introduce en la célula hospedadora.

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14. Un método para seleccionar al menos una célula hospedadora capaz de expresar un polipéptido de interés con un rendimiento deseado, que comprende

a) proporcionar una pluralidad de células hospedadoras de acuerdo con las reivindicaciones de 10 a 12;

y

15. El método de acuerdo con la reivindicación 14, que tiene una o más de las siguientes características:

i) se llevan a cabo uno o más ciclos de selección que comprenden los pasos b) y c)

ii) después del paso c) las células se cultivan en un medio de cultivo que comprende una concentración no limitante de folato y entonces se cultivan nuevamente de acuerdo con el paso b) y se obtienen de acuerdo con el paso c);

iii) se llevan a cabo uno o más pasos de selección adicionales antes y/o después de llevar a cabo el paso b) y/o c), donde dicho uno o más pasos de selección adicionales se seleccionan de una selección según citometría de flujo y una selección de uno o más marcadores seleccionables adicionales introducidos en la célula hospedadora;

iv) las células hospedadoras se transforman de manera estable; y/o

v) las células hospedadoras seleccionadas expresan de manera recombinante y secretan una molécula de inmunoglobulina.

16. Un proceso para producir un polipéptido de interés, que comprende

a) cultivar una célula hospedadora de acuerdo con al menos una de las reivindicaciones de 10 a 12 y/o una célula hospedadora seleccionada de acuerdo con la reivindicación 14 o 15 en condiciones que permitan la expresión y secreción del polipéptido de interés;

b) aislar el polipéptido de interés a partir del medio de cultivo celular y

c) opcionalmente procesar el polipéptido de interés aislado.

17. Uso de un polinucleótido que codifica

a) un receptor de folato mutado que comprende la siguiente secuencia IAWARTELLNVCMNAKHHKEKPGPEDKLHEQCRPWRKNACCSTNTSQEXaaHKDVSYLYRFNWNHCGEMAPACKRHFI QDTCLYECSPNLGPWIQQVDQSWRKERVLNVPLCKEDCEQWWEDCRTSYTCKSNWHKGWNWTSGFNKCAVGAACQ PFHFYFPTPTVLCNEIWTHSYKVSNYSRGSGRCIQMWFDPAQGNPNEEVARFYA mostrada como SEQ ID NO 9 donde Xaa no es alanina y donde la afinidad de unión al folato del receptor de folato mutado es menor en comparación con el correspondiente receptor de folato no modificado donde Xaa es alanina mostrado como SEQ ID NO 1;

o

b) un receptor de folato mutado que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad secuencial de al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 96 %, al menos un 97 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % respecto a la secuencia mostrada como SEQ ID NO 9, y donde Xaa no es alanina en dicho receptor de folato mutado y donde la afinidad de unión al folato de dicho receptor de folato mutado es menor en comparación con la secuencia del receptor de folato alfa humano no modificado maduro donde Xaa es alanina mostrada como SEQ ID NO 1

como marcador seleccionable para seleccionar células cuya viabilidad depende de la captación de folato, donde opcionalmente Xaa es un aminoácido seleccionado entre leucina, glicina, valina, isoleucina, histidina y ácido aspártico.

18. Uso de un polinucleótido que codifica

a) un receptor de folato mutado que comprende la siguiente secuencia IAWARTELLNVCMNAKHHKEKPGPEDKLHEQCRPWRKNACCSTNTSQEXaaHKDVSYLYRFNWNHCGEMAPACKRHFI QDTCLYECSPNLGPWIQQVDQSWRKERVLNVPLCKEDCEQWWEDCRTSYTCKSNWHKGWNWTSGFNKCAVGAACQ PFHFYFPTPTVLCNEIWTHSYKVSNYSRGSGRCIQMWFDPAQGNPNEEVARFYA mostrada como SEQ ID NO 9 donde Xaa es leucina;

o

como marcador seleccionable para seleccionar células de mamífero cuya viabilidad depende de la captación de folato.