Изобретение относится к медицинской биотехнологии, в частности к получению вакцин гриппа. The invention relates to medical biotechnology, in particular to the production of influenza vaccines.
Целью изобретения является повышение качества вакцины за счет уменьшения содержания в ней овальбумина. The aim of the invention is to improve the quality of the vaccine by reducing the content of ovalbumin in it.
С этой целью вируссодержащий материал, частично очищенный и сконцентрированный с помощью сорбции - элюции на куриных эритроцитах, дополнительно очищают и концентрируют методом ультрафильтрации в сочетании с диафильтрацией на полых волокнах ВПУ-100, а ультрацентрифугирование проводят в режиме рециркуляции при скорости протока 7-8 л/ч. To this end, a virus-containing material, partially purified and concentrated by sorption - elution on chicken red blood cells, is further purified and concentrated by ultrafiltration in combination with diafiltration on VPU-100 hollow fibers, and ultracentrifugation is carried out in recirculation mode at a flow rate of 7-8 l / hours
П р и м е р. Вируссодержащую аллантоисную жидкость с титром 1:640 в количестве 450 л добавляют в куриные эритроциты и оставляют на сутки при 4оС для полной сорбции вируса. Затем надосадочную жидкость сливают, а осадок эритроцитов заливают физиологическим раствором и оставляют на 24 ч при 4оС. Надосадочную жидкость снова сливают, а осадок 3 раза промывают, добавляя охлажденный физиологический раствор в соотношении 1:1 и центрифугируя при скорости 2500 об/мин.PRI me R. Virus-containing allantoic fluid with a titer of 1: 640 in an amount of 450 l was added to the chicken erythrocytes and allowed to stand overnight at 4 ° C for complete adsorption of the virus. The supernatant was then discarded and the erythrocyte pellet was poured physiological saline solution and left for 24 hours at 4 ° C. The supernatant was decanted again and the precipitate was washed 3 times by adding chilled saline in the ratio 1: 1 and centrifuging at a speed of 2500 rev / min.
Затем к осадку отмытых эритроцитов с адсорбированным на них вирусом добавляют физиологический раствор в соотношении 1:10 к объему исходной аллантоисной жидкости и помещают их в водяную баню при 38оС на 3 ч, после чего взвесь эритроцитов центрифугируют при 2500 об/мин. Надосадочную жидкость, содержащую основную часть вируса, отделяют. Аналогично проводят повторное элюирование. Таким образом получают 50 л элюата с титром 1:5120 и содержанием овальбумина 40 мкг/мл.Then to the pellet washed erythrocytes adsorbed virus was added to them with saline 1:10 to original volume of allantoic fluid and placed in waterbath at 38 ° C for 3 hours, after which the erythrocyte suspension was centrifuged at 2500 rev / min. The supernatant containing the bulk of the virus is separated. Repeated elution is carried out similarly. Thus, 50 l of an eluate with a titer of 1: 5120 and an ovalbumin content of 40 μg / ml are obtained.
Ультрафильтрацию ведут на полых волокнах ВПУ-100. Вход и выход колонки с полыми волокнами подключают к бутыли с элюатом. Таким образом, процесс ведется в режиме рециркуляции. 50 л элюата концентрируют до 5 л и далее ведут диафильтрацию, добавляя физиологический раствор так, чтобы объем элюата оставался постоянно 5 л, объем физиологического раствора на диафильтрацию составляет 50 л. Затем вирус смывают с волокон сначала физиологическим раствором, а затем 0,3 М раствором NaCl. Получают 10 л концентрированного элюата с титром 1:25000 и содержанием овальбумина 4 мкг/мл. Ultrafiltration is carried out on VPU-100 hollow fibers. The inlet and outlet of the hollow fiber column are connected to the eluate bottle. Thus, the process is conducted in recirculation mode. 50 l of the eluate is concentrated to 5 l and then diafiltered, adding saline so that the volume of the eluate remains constant 5 l, the volume of saline for diafiltration is 50 l. Then the virus is washed off the fibers first with physiological saline and then with 0.3 M NaCl. 10 l of concentrated eluate are obtained with a titer of 1: 25000 and an ovalbumin content of 4 μg / ml.
Полученный концентрированный элюат центрифугируют в градиенте плотности сахарозы в проточном роторе ультрацентрифуги SCР60Y "Хитачи" в режиме рециркуляции. The obtained concentrated eluate is centrifuged in a sucrose density gradient in a flow rotor of an Hitachi SCP60Y ultracentrifuge in a recirculation mode.
Рециркуляция осуществляется следующим образом. Концентрированный элюат из бутыли поступает на вход проточного ротора SRP 35 СТ ультрацентрифуги SCP60Y "Хитачи", пройдя через ротор, жидкость, содержащая некоторое остаточное количество вируса, снова поступает в ту же бутыль. Процесс продолжается до тех пор пока жидкость, содержащаяся в бутыли, не станет прозрачной. Получают 300 мл концентрата с титром 1:800000 и содержанием овальбумина 0,1 мкг/мл. Recycling is as follows. Concentrated eluate from the bottle enters the inlet of the SRP 35 CT flowmeter of the Hitachi SCP60Y ultracentrifuge, passing through the rotor, the liquid containing some residual virus enters the same bottle. The process continues until the liquid contained in the bottle becomes clear. 300 ml of concentrate are obtained with a titer of 1: 800000 and an ovalbumin content of 0.1 μg / ml.