RO114402B1

RO114402B1 - Metoda de anticalcifiere in vivo, a tesuturilor biologice tanate cu aldehida

Info

Publication number: RO114402B1
Application number: RO94-01488A
Authority: RO
Inventors: Eli Seifter; Robert William Mayo Frater
Original assignee: Seifter Eli New Hyde Park; Frater Robert William Mayo Bro
Priority date: 1992-03-13
Filing date: 1993-03-08
Publication date: 1999-04-30
Also published as: JPH07508706A; CA2117557C; EP0630416B1; BR9306072A; CA2117557A1; TW267939B; ES2142344T3; US5476516A; WO1993019209A1; EP0630416A4; JP3510246B2; EP0630416A1; DE69327231T2; DE69327231D1; ZA931559B

Description

Prezenta invenție se referă la o metodă de anticalcifiere in vivo a țesuturilor biologice tanate cu aldehida, destinate în special bioprotezelor valvulare, și în mod particular la metoda de tratare care minimizează in vivo calcifierea și reduce citotoxicitatea fără să deterioreze rezistența mecanică a țesutului tanat.

Când un țesut biologic conținând grupări amino (NH ₂), caracteristice proteinelor, este tratat cu aldehidă glutarică (CH(CH ₂)CH0), aldehida glutarică leagă între ele grupările amino conținute de proteine prin reacții de reticulare. Un produs ce rezultă din această reacție de reticulare este lipsit de orice fel de grupare aldehidică liberă, deoarece ambele grupări ale aldehidei glutarice reacționează cu diferite grupări amino, iar celălalt produs ce rezultă din reacția de reticulare reține o grupare aldehidă liberă deoarece ambele grupări amino reacționează cu aceeași grupare aldehidică a aldehidei glutarice. Deoarece ambele tipuri de produse de reticulare sunt prezente în echilibru, unul față de altul, țesutul biologic tanat cu aldehidă glutarică va conține întotdeauna grupări aldehidice libere.

Grupările aldehidice libere dintr-un implant sunt asociate cu inducerea unei reacții inflamatorii locale și ca urmare cu calcifierea grefei. Spălarea energică a țesutului tratat cu aldehidă este eficientă pentru îndepărtarea aldehidei glutarice nereacționate, dar este insuficientă pentru îndepărtarea grupărilor aldehidice libere ale aldehidei glutarice care a reacționat cu țesutul proteic. Metodele de tratare cunoscute (adică aminoacizi într-o soluție tampon acidă), în cazul țesutului biologic tant cu aldehidă, pentru îndepărtarea grupărilor aldehidice libere din aldehida glutarică, care a reacționat cu țesutul proteic, duc la o diminuare a rezistenței mecanice a țesutului tanat diminuînd astfel rezultatul procesului de tanare.

Bioprotezele valvulare pentru inimă folosite la ora actuală sunt realizate fie din valve aortice de porcine, fie din pericard bovin tanat cu aldehidă glutarică. Substitutele arteriale biologice sunt realizate din vase xenogrefe sau homogrefe tratate cu aldehidă glutarică ca și pericardul de bovină. Valvele de inimă artificiale, făcute din țesut tratat cu aldehidă glutarică sunt substituenți excelenți pentru valvele naturale bolnave, cu un risc deosebit de scăzut la tromboembolie. Utilizarea lor este totuși compromisă de tendința, deja menționată, spre calcifiere care se manifestă în aproape 100% din cazuri la copii într-un interval mai scăzut de 5 ani după implant și la adulții cu hiperparatiroidism sau insuficiență renală se manifestă aceeași tendință. Calcifierea produce eșecul implantului și necesitatea reînlocuirii este o barieră în multe situații cu excepția cazurilor de vârstă înaintată.

Alternativa înlocuirii valvei bioprostetice care folosește țesut netanat este inacceptabilă atâta timp cât țesutul netanat suferă din cauza digestiei parțiale și a resorbției, își pierde rezistența mecanică în timp și eventual se produce ruperea. Tanarea țesutului cu aldehidă minimizează sau previne pierderea rezistenței mecanice în timp.

Alternativa înlocuirii valvei mecanice aduce cu sine dezavantaje semnificative datorate necesității absolute de folosire a anticoagulanților (pentru a preveni tromboza de valvă) și a incidenței permanente a emboliei chiar și în cazul anticoagulației adecvate. Aceste probleme sunt mari în țările în care, un număr mare de copii suferă de boli de inimă valvulare și unde dificultățile în controlul anticoagulării sunt însoțite de o rată excesiv de mare a trombozelor și hemoragiilor.

O valvă bioprostetică care nu se calcifică reprezintă o valvă care ar trebui aleasă, deoarece înlocuiește nu numai valvele bioprostetice în uz curent, dar este preferabilă acelor cazuri numeroase în care se folosesc valvele mecanice. O astfel de valvă face posibilă creșterea numărului de operații chirurgicale de înlocuire de valvă cu rezultate bune. Țesutul biologic tanat pentru alte utilizări este produs la un nivel scăzut, dar com

RO 114402 Bl portamentul și posibilitățile de reușită sunt similare.

în literatura de brevete sunt cunoscute diferite metode de realizare a unor materiale apte a fi folosite ca implanturi.

Astfel US 5002566 descrie o metodă de obținere a unui material biologic rezistent la calcifiere, din care se realizează implanturi bioprostetice precum valve aortice de porcină, pericard de bovine etc., care constă în tratarea respectivului material tanat anterior, cu o soluție conținând ioni ferici, stanici sau o combinație a acestora, în scopul diminuării calcifierii. în cadrul acestei metode, glicolii nu sunt menționați ca agenți activi, ci numai ca un exemplu de varietate de solvenți organici pentru sărurile ferice sau stanice ceea ce este esența celor prevăzute în brevet și anume că un implant rezistent la calcifiere include un material biologic tanat care este impregnat cu un inhibitor al calcifierii, de ioni ferici sau stanici sau un amestec al acestora.

Metoda a apărut în urma utilizării în mod accidental a glicerolului învechit, conținând o cantitate relativ mare de fier și staniu. Exemplele stabilesc că responsabili pentru această reducere a calcifierii, obținută prin utilizarea glicerolului îmbătrânit sunt ionii ferici și stanici. în exemplul 3 din descriere se demonstrează că glicerolul comercial (neîmbătrînit) nu produce reducerea calcifierii la fel cum o face glicerolul îmbătrânit” care conține ionii amintiți. Revendicarea 1 se referă direct la folosirea efectului de reducere a calcifierii ionilor ferici și ionilor stanici, sau a amestecului de ioni ferici și stanici și glicerolul nici măcar nu este amintit.

în cadrul acestei metode cunoscute, glicerolul este doar solvent sau vehicol pentru ionii stanici și ferici.

Semnificativă este deasemenea în cadrul brevetului cunoscut absența unor exemple care să arate o singură situație în care soluția de glicerol fără acești ioni stanici și ferici să fie folosită după expunere la aldehide glutarice. Singura situație în care o soluție de glicerol este folosită după expunerea la aldehida glutarică este în Exemplul 2, iar glicerolul folosit este glicerol îmbătrânit care conține ioni stanici și ferici. în esență, în această metodă se folosește glicerol comercial care conține în părți egale în 90% dintre situații etanol, aldehidă formică și glicerol, cu numai 33% glicerol pur.

în brevetul GB 2180755 este descrisă o altă metodă de realizare a implanturilor bioprostetice vasculare în care se prezintă însă numai înlocuirea sau perforarea suprafeței endoteliale a ureterelor animalelor printr-un tratament mecanic, enzimatic sau chelatic, urmat de expunerea la glicerol, elasticizarea cu soluție electrolitică, și, în final tanarea cu 0,2% aldehida glutarică și apoi sterilizarea cu aldehida formică 4%. Cu alte cuvinte, în cadrul metodei întâi se tratează cu glicerol și numai după aceea se fixează cu aldehidă glutarică. în mod categoric aceasta nu reprezintă o metodă de tratare a țesutului biologic cu glicerol, tanat cu aldehidă, sau ceva similar.

Tratarea țesutului cu glicerol urmată de expunerea la aldehide a fost prezentată într-o lucrare referitoare la inducerea calcifierii mai degrabă decât reducerea ei (Gong G, Ling Z. Seifter E. Faxtor SM. Frater RWM în Eur J. Cardiothorac Surg. 5:288-293, 1991) în care folosirea glicerolului singur, fără aldehidă nu este o metodă adecvată pentru tratarea țesutului xenogrefat.

De asemenea, brevetul US 4911713 descrie o metodă de realizare a protezelor vasculare care comportă etapele de tratare a unei grefe din material textil poros cu o soluție de agent de reticulare, perfuzarea cu o a doua soluție de agent de reticulare și proteină și uscarea grefei perfuzate, ceea ce permite coagularea proteinei, care are ca rezultat umplerea completă a interstițiilor materialului textil poros. Pentru perfuzare se utilizează un amestec conținând albumină și aldehidă glutarică. Brevetul descrie și metode de conservare a acestor grefe prin tratare cu

RO 114402 Bl glicerol sau alți alcooli alchilici.

în cadrul etapei de perfuzare a grefei sintetice permeabile cu albumina sau altă proteină, interstițiile grefei sunt pline cu proteină, adăugâd aldehide, acestea se combină cu proteinele. Etapa este urmată de tratare cu etanol și de expunere într-o soluție de glicerol cu 50% etanol timp de 2 ore urmată de uscare în aer. Expunerea glicerolului este un mijloc pentru conservarea proteinei reticulate dar nu este dat mecanismul acesteia și se afirmă deasemenea că etilen glicolul, propilen glicolul și trimetilen glicolul pot înlocui glicerolul. Brevetul nu descrie deci o metodă de tratare împotriva calcifierii, ci dimpotrivă, propune expunerea prelungită la glicoli și dioli neglicolici lichizi specifici fără conținut de solvent.

Mai mult, o expunere timp de 2 ore sau chiar 10 ore într-o soluție diluată de glicerol, așa cum se prezintă în descriere nu constituie un tratament pentru diminuarea calcifierii.

Deși în brevetul cunoscut se afirmă că sunt folosite “orice proteze având interstițiile umplute cu proteină reticulată”, se lucrează în special cu proteze vasculare fabricate din textile, care sunt de multe feluri. Exemplul inițial se referă la grefe din poliester țesute sau tricotate. Sunt multe alte formulări, și “orice proteză” în acest context, se referă în mod clar la diferitele tipuri de proteze vasculare textile. Referirea făcută mai sus la orice proteză”, în mod absolut nu se face la ultrastructura pericardului sau a vârfurilor de valve aortice. Descrierea este complet nepotrivită pentru fibrele de colagen ale acestor structuri.

Deci brevetul cunoscut nu numai că nu se referă la problema tratării materialelor care nu au colagen, dar este dificient în specificarea poliolilor folosiți, a concentrației, și a timpului în care materialul tanat trebuie să fie expus cu scopul anticalcifierii.

Valvele artificiale pentru inimă făcute din țesut tanat cu aldehidă mai au și dezavantajul citotoxicității care inhibă endotelizarea implanturilor realizate din astfel de material. în timp ce citotoxicitatea reprezintă mai puțin o problemă importantă pentru folosirea implanturilor tanate cu aldehidă, decât capacitatea acestora de calcificare, aceasta rămâne o problemă care împiedică acceptarea pe scară largă a implanturilor tanate cu aldehidă, în special atunci când endotelizarea implantului este considerată critică.

Problema pe care o rezolvă prezenta invenție constă în realizarea unei metode simple, economice și sigure de tratare a unui țesut biologic tanat cu aldehidă pentru a minimiza in vivo calcifierea și citotoxicitatea țesutului respectiv fără reducerea rezistenței sale mecanice.

Metoda de anticalcifiere care face obiectul invenției rezolvă problema propusă prin tratarea țesutului biologic tanat cu aldehidă prin introducerea sa într-o soluție de cel puțin 60% de poliol lichid ales din grupul constând dintr-un glicol și un diol neglicolic și combinații ale acestora, care formează un aduct ciclic cu 5-6 membri al aldehidei, în care glicolul are formula:

^R1

II c- c- c-r₃

II

OHOH în care R, R,, R₂ și R₃ sunt în mod independent H, 0,-(65 alchil, CH₂0H, CH₂0-

acil în care	grupa acil	este C₂-C_g sau
CH₂0-alchil;	iar diolul	neglicolic are
formula:
	^R1 Rb I I	^R4 I
c-	I I C- C- C-	I OH I
	I I OH R₃	I r₅

în care R, R,, R₂ , R₃, R₄ și R₅ sunt în mod independent H, C,,-C₅ alchil, CH₂0acil în care grupa acil este C₂-C_g, sau

CH₂0 - alchil.

Avantajele metodei pot fi prezentate ca o concluzie a prezentei invenții.

Astfel cauza principală care produce

RO 114402 Bl calcifierea implantului de țesut tanat cu aldehidă este prezența inevitabilă a grupărilor aldehidice libere din țesutul tanat cu aldehidă. Cauza principală care face ca materialele biologice, implantate să nu se acopere cu endoteliu de la primitor este prezența grupărilor aldehidice libere. Prezenta invenție prezintă metoda de eliminare a grupărilor aldehidice reziduale printr-un tratament post-tanare, în special, cu glicoli lichizi concentrați sau dioli specifici non-glicolici. Fără să se altereze rezistența și flexibilitatea materialului tanat această tratare post-tanare diminuează în mod eficient tendința de calcifiere a materialului biologic tanat cu aldehidă, care a fost implantat în sistemul circulator. în plus, tratarea posttanare produce în mod spontan o creștere de endoteliu pe suprafața materialului implantat. Prezenta invenție realizează aceasta prin eliminarea grupărilor reziduale de aldehidă și producerea unui compus stabil.

în conformitate cu prezenta invenție, țesuturile biologice tanate cu aldehidă glutarică sunt tratate pentru minimizarea in vivo a calcifierii, și mai mult pentru reducerea citotoxicității țesuturilor tanate fără diminuarea forței mecanice a acestora. în funcție de intenția de utilizare a țesutului tanat, țesutul biologic netratat poate fi tanat folosind oricare dintre agenții aldehidici tanați convenționali, aldehida glutarică fiind preferată deoarece ea conține o pereche de grupări aldehidice în loc de una singură și astfel se mărește probabilitatea de reticulare a proteinelor țesutului biologic deoarece există două mecanisme de reacție posibile.

Pentru ca invenția să fie mai bine înțeseasă trebuie să se expliciteze că un diol·’ este compus care are două grupări hidroxil, fiecare pe un alt carbon, așa cum un triol are trei grupări hidroxil pe trei carboni diferiți. Un glicol este un compus care are două sau mai multe grupări hidroxil pe doi carboni alăturați. Hidroxilii trebuie să fie pe carboni alăturați. Glicolii sunt în mod special folosiți în prezenta invenție deoarece ei sunt capabili să formeze structuri inelare cu aldehidele.

Formarea inelelor implică câteva etape. Prima etapă este adiția de către primul hidroxil a glicolului la aldehidă. în astfel de reacție, apa concurează cu glicolul și de aceea soluțiile concentrate de glicol sunt preferate în locul celor diluate. A doua etapă este închiderea inelului, și această etapă este de asemenea inhibată de prezența apei atât din punct de vedere cinetic cât și termodinamic. Din punct de vedere cinetic, din cauză că apa are tendința să concureze cu cel de al doilea hidroxil care este prezent după ce se formează produsul de adiție din aldehidă și glicol, și din punct de vedere termodinamic, deoarece inelul este favorizat pentru că formarea sa are loc cu degajare de energie. Aldehidele prezente în colagenul conținând aldehidă glutarică de tanare reacționează cu glicolul pentru a produce un 1,3-dioxan (un inel cu 5 ramificații) și cu diolul non-glicolic (în care un singur atom de carbon separă diolii) pentru a forma 1,4-dioxan (un inel cu 6 membrii). Formația inelară este critică pentru stabilitatea țesutului implantat.

Geometria diolului, așa cum a fost descrisă este critică. Prin comparație, 1,4-butandiolul și 1,5-pentandiolul nu sunt capabile pentru a forma un inel și reacționează foarte slab deoarece aductul o dată format, trebuie să fie stabil pentru o perioadă de timp foarte mare, chiar ani, chiar în absența agenților de blocare (reversibilitatea reacției trebuie să fie foarte lentă).

Poliolii utilizați în prezenta invenție sunt de preferință lichizi la temperatura camerei, fără solvenți (aceasta în condițiile în care sunt folosiți în forme concentrate). Poliolii lichizi la temperatura camerei sunt preferați atât pentru reactivitatea lor chimică cât și pentru ușurința de a fi sterilizați. Mai mult, diolii care sunt solizi la temperatura camerei au tendința să se evapore din țesut și de a-l face mai puțin suplu. Sunt preferați poliolii care nu conțin solvenți (cel puțin 99% puritate) deoarece prezența solRO 114402 Bl venților introduce grupări funcționale adiționale care pot intra în reacție cu grupările amino ale țesutului proteic și astfel să împiedice dezvoltarea reticulării în țesutul tanat cu aldehidă deoarece mecanismele tanării cu aldehidă sunt reversibile. Soluțiile de polioli care au cel puțin 60% poliol sunt deasemeni folosite.

Poliolii aleși pentru a fi utilizați în prezenta invenție sunt diolii propilen glicol [H(CH0H)₂CH₂] (deasemeni cunoscut ca 1,2-propandiol),1,3-propandiol [(CH₂0H₂CH₂],2,3-butilen glicoKCHgiCHDHȚCHJ și triol glicerol [(CH₂0H)₂CH0H].AIți dioli cum ar fi butandiolii și pentandiolii, au dovedit deasemeni că pot fi utilizați în procesul prezentei invenții. Astfel, folosirea unei grupe mai largi de alchili (C₄, Cg, etc.) pentru substituienții R și R' mărește solubilitatea lipidelor fără diminuarea proprietăților chimice ale aldehidelor libere și mărește plasticitatea țesutului tratat fără să slăbească reticularea. în mod aparent lungimea catenelor dintre grupările hidroxil este mult mai importantă decât lungimea totală a catenei sau lungimea catenei oricărui substituent.

Diolii disubstituiți, cum ar fi diferiți propandioli și 2,3-butilen glicolul, demonstrează o stabilitate mărită și o foarte bună eficiență în prezenta invenție, comparativ cu triolii substituiți cum ar fi glicerolul. Stările de tranziție conținând grupări hidroxil libere sunt susceptibile la hidroliză și producerea aldehidei libere nedorite, în timp de stările de tranziție bazate pe legarea grupărilor hidroxil libere nu sunt formate din aducți de dioli. Astfel diolii sunt agenți mult mai eficienți de blocare a aldehidelor comparativ cu poliolii și au demonstrat o diminuare a calcifierii induse de aldehide. Diolul preferat este propilen glicolul. Deși în metoda conform prezentei invenții se pot folosi diferiți dioli, sa constatat că acei dioli care produc aducți ciclici cu 5 sau 6 membri ai aldehidelor sunt inhibitori mai buni ai calcifierii, decât triolii sau alți polioli deoarece aducții inelari sunt mai slabi. Mai mult, diolul preferat de prezenta invenție produce inele 1,3-dioxalan și 1,3-dioxan. Glicerolul poate deasemenea să formeze inele de dioxalan și dioxan cu țesutul tratat cu aldehidă glutarică, cele două forme de inele existând în stare de echilibru una față de cealaltă. Totuși, cei doi aducți ciclici formați din glicerol includ grupe hidroxil libere atașate la inel (fie direct, fie indirect), în timp ce aducții diolici nu conțin grupe fără hidroxil și sunt de aceea mai stabili.

Conform testelor in vitro testul tanat cu aldehidă glutarică, tratat potrivit prezentei invenții, atunci când a fost inoculat cu celule endoteliale vasculare, a dezvoltat un strat endotelial, în timp ce țesutul tanat cu aldehida glutarică nu a prezentat același efect. Astfel prezenta invenție furnizează un mijloc de creștere a probabilității ca un implant format să se fixeze în noul loc în mod lent și astfel să funcționeze în mod adecvat.

Potrivit cu testele in vivo, implanturile de țesut tanat cu aldehida glutarică tratat potrivit invenției își păstrează integritatea fizică (ex: rezistență la întindere) și este mult mai simplu și mult mai puțin rigid comparativ cu țesutul netratat cu aldehidă glutarică. Păstrarea integrității fizice, mărite a supleții și rigidității mai reduse mărește utilitatea țesutului ca implant valvă prostetică.

Tratarea, potrivit cu prezenta invenție, a țesutului biologic proaspăt (țesut biologic care nu a fost tanat cu aldehide) conduce la scăderea rezistenței mecanice a țesutului, în timp ce tratarea conform invenției, după tanarea cu aldehidă mărește rezistența valvei prin prevenirea calcifierii.

Mai mult, în concordanță cu metoda prezentei invenții țesutul tanat cu aldehidă este spălat salinic pentru îndepărtarea excesului de aldehidă care nu a reacționat. Țesutul spălat este apoi tratat cu un poliol, în conformitate cu prezenta invenție și depozitat pentru utilizare. Dacă se dorește, tratarea cu poliol poate fi combinată, de exemplu realizată simultan cu spălarea salină.

Materialele tratate conform prezentei invenții pot fi folosite ca valve

RO 114402 Bl pentru inimă, vase sanguine, esofag, trahee, tendoane, ligamente, membre și părți ale acestora.

Se dau în continuare trei exemple concrete de realizare a invenției.

Exemplul 1

Acest exemplu compară calciul conținut după 70 de zile de la implantarea în (a) țesut proaspăt [țesut care nu a fost nici tanat nici tratat conform prezentei invenții), (b) țesut tanat cu aldehidă glutarică netratat conform prezentei invenții, și (C) țesut tanat cu aldehidă glutarică tratat conform prezentei invenții (fie cu glicerol fie cu propilen glicol).

Pericard proaspăt bovin a fost tanat cu 0,6% aldehidă glutarică (Glu), spălat salin, și transferat în vase conținând fie un diol (de exemplu propilen glicol) fie un triol (de exemplu 60% sau

99% în greutate glicerol). Materialul a fost implantat la șobolani așa după cum a fost și probele de țesut proaspăt și țesut tanat netratat.

După 70 de zile, implantul a fost io recuperat și s-a făcut determinarea conținutului de calciu în micrograme de calciu pe miligramul de țesut biologic, raportat la substanța uscată. Rezultatele sunt prezentate în Tabelul 1, alături de 15 deviațiile standard (S.D.) și de numărul de șobolani testați în fiecare caz.

Tabelul 1

Conținutul de calciu (pg/mg greutate substanță uscată)

	Proaspăt	Glu	Glu+99% glicerol	Glu+60% glicerol	Glu+ propilen glicerol
conținutul de calciu	0,38	232,29	8,50	188,36	1,0
S.D.+-	0,11	13,01	0,44	11,04	0,77
Numărul de șobolani	10	10	8	10	10

în timp ce tanarea cu aldehidă 30 glutarică (Glu) a mărit calcifierea țesutului comparativ cu țesutul proaspăt tratarea cu glicerol pur (99%) a țesutului tanat, potrivit prezentei invenții, a moderat calcifierea, iar tratarea cu propilen 35 glicol (PG) a țesutului tanat, potrivit prezentei invenții, a fost și mai eficientă în inhibarea calcifierii.

Exemplul 2 în Tabelul 2 sunt prezentate da- 4o tele obținute în urma unui experiment făcut în paralel cu cel prezentat în Tabelul 1. Scopul experimentului a fost să se determine efectele tratărilor descrise în această experiență, asupra proprietăților mecanice ale implantului recuperat. Rezistența maximă la întindere (Smax.) și conținutul de hidroxiprolina (OHP) au fost determinate pentru pericard de bovină (a) fixat cu aldehidă glutarică (Glu), (b) fixat cu aldehidă glutarică și tratat cu propilen glicol (Glu+PG) și (c) nefixat tratat cu glicerol.

Tabelul 2

Neimplantat	Glu.	Glu.+PG	99% Glicerol
Nr.de șobolani	7	7	7

RO 114402 Bl

Tabelul 2 (continuare)

Smax(Kg/mm²)	0,82+0,28	0,86+0,24	0,83±0,30
0HP(pg/mg)	15,2+2,6	14,8±2,1	13,4±2,90
70 de zile după implantare
Nr. de șobolani	7	7	7
Smax(Kg/mm²)	1,02+0,35	0,96±0,39	0,14±0,16*
0HP(pg/mg)	9,11±1,1	9,65±2,4	7,84±2,40
Glu. față de Glu.+PG p >0,5; *Glicerol față de Glu. sau Glu. + PG, p <0,001
Valorile p
Neimplantat (0 timp]	Implantat (70 zile)
Glu	Glu + PG	Glicerol
Smax	>0,05	>0,1	«0,001
OHP	<0,01	<0,05	<0,05

Rezistenta la întindere a țesuturilor implantate

Glu față de Glu + PG

Glu față de Glu

Glu față de Glu PG p>O,O5 p<O,OO1 p<O,OO1

Nota: Fără aldehidă glutarică, implantul pierde apoape 5/6 din rezistență la întindere. Astfel, Glu+PG realizează creșterea rezistenței fără schimbarea calcifierii datorată Glu.

Exemplul 3 3o

Următorul exemplu este o descriere a unui experiment specific și rezultatele obținute în acest experiment, între paranteze sunt comentarii asupra rezultatelor variabilelor din cadrul altor 35 experimente nedetaliate aici.

Țesut *

1. Pericard de bovină:

Pericard proaspăt de bovină a fost livrat în gheață de firma Max Insei 4o Cohen Inc. imediat după sacrificarea vițeilor. Pericarul a fost spălat cu apă rece curentă timp 30 minute până când grosimea și vasele de sânge au fost îndepărtate, și apoi pericardul a fost 4 5 tăiat în bucăți de 1 cm². Pericardul a fost clătit în saramură obișnuită timp de 10 min. înainte de următoarele tratamente.

2. Valvă aortică de porcină: 50

Valve aortice proaspete de por cine au fost livrate în gheață de firma Max Insei Cohen Inc. imediat după sacrificarea porcilor. Vârfurile au fost tăiate și scoase din țesutul ce le înconjoară și spălate sub jet de apă rece timp de 10 min și apoi clătite în soluție salină normală timp de 10 min înainte de tratamentele următoare.

Prepararea materialului

Aldehidă glutarică (25%) a fost obținută de la Fisher Scientific Company și a fost diluată la 0,625% soluție de aldehidă glutarică cu saramură normală netamponată pH=6,2.(în alte experimente au fost utilizate ca tampon soluții isotonice de fostat cu pH=6,8-7,4; tonicitatea (rezistența față de soluția de fixare], în timpul procesului de fixare, este importantă pentru conservarea structurii). Așa cum a fost descris în capitolul de mai jos Tratamente” toate țesuturile au fost spălate de aldehida

RO 114402 Bl glutarică liberă și substanțe tampon înainte de tratarea de post-fixare, conservare la păstrare sau implantare prin mai multe clătiri cu soluție salină sau apă. Acest lucru este necesar deoarece atât prezența aldehidei cât și a fosfatului tampon favorizează calcifierea.

în studiul prezentat, fixarea se produce prin plasarea țesutului în fixativ timp de 48 de ore, timpul minim cerut pentru obținerea maximului de reticulare. Gradul de reticulare este determinat în principal de pH, concentrația soluției de aldehidă și volumul soluției utilizate. în prezentul studiu, au fost tăiate 18 pătrate de țesut (1cm² fiecare] și au fost plasate în flacoane conținând 100 ml de fixativ.

Propilen glicolul (100%) a fost obținut de la Fisher Scietific Company și a fost filtrat prin filtru membrană din nylon de 0,22 pm înainte de utilizare. (în alte experimentări propilen glicol a fost utilizat ca soluție 60% preparat cu apă distilată, ca diluant. în timp ce tonicitatea fixativului (aldehida) și tratarea de postfixare (glicolul) sunt mai importante, tonicitatea soluției de conservare este puțin importantă. Soluțiile preferate de glicol conțin între 60 și 100% substanță activă). în prezent studiu, problele au fost păstrate în propilen glicol 100%.

Tratamente

Grupa de probe martor: Pericardul a fost conservat în aldehidă glutarică 0,625% la 20°C timp de 10-14 zile.

Grupa de probe cu propilen glicol: Pericardul a fost fixat în aldehidă glutarică 0,625% la 20°C timp de 2 zile, după care a fost spălat în soluție salină normală (10 min X 3 ori), și în final pus în soluție de propilen glicol 100% la 20°C timp de 7-10 zile.

înaite de implantare, ambele grupe de probe de pericard au fost spălate de câte 3 ori cu soluție salină normală timp de 10 minute.

Fâșiile de valve aortice de porcină curățate și fâșiile de pericard de bovină curățate au fost tratate identic. (Este de notat că pericardul martor și fâșiile de valve aortice de porcină au fost fixate timp de 10-14 zile, în timp ce probele experimentului au fost fixate timp de 2-8 zile și conservate timp de 7-20 zile. Acest lucru a fost făcut astfel ca să se utilizeze numai fâșiile de probe dintr-o singură șarjă de pericard sau valvă aortică într-un experiment. S-a considerat justificat deoarece experimentele anterioare cu fixare cu aldehidă glutarică nu au demonstrat nici o modificare în rezistența la rupere a țesutului fixat în perioade de timp de 2 zile sau mai mult, de exemplu 18 zile, iar schimbarea timpului de fixare nu a influențat rezistența la rupere, conțintul de colagen sau conținutul de calciu al țesuturilor implantate.

Experimentul 1

S-au folosit grupe de câte nouă șobolani masculi de 70-1 OOg din rasa Sprague Dawley. Pentru a studia efectul fixării și al conservării asupra rezistenței țesutului implantat au fost studiate două grupe de câte nouă șobolani. O grupă a fost destinată să fie sacrificată la 45 de zile, iar cealaltă la 90 de zile. Sub anestezie cu pentobarbital, șobolanii au suferit o incizie de 3 cm paravertebrală, de grosimea totală a pielii și au fost modelate două pliuri subcutanate. într-un pliu a fost implantată o probă de 3 cm de țesut pericardic spălat, fixat cu aldehidă glutarică. în celălalt pliu s-a introdus o probă similară, care în prealabil a fost fixată cu aldehidă glutarică și ținută în propilen glicol timp de 8 zile. O grupă de animale a fost sacrificată după 45 de zile, iar cealaltă după 90 de zile.

Implanturile extrase au fost studiate cu un tensiometru pentru determinarea rezistenței la întindere (forța necesară pentru ruperea țesutului împărțit la suprafață, Kg/mm²), o metodă de măsurare a rezistenței țesutului. Implanturile recuperate au fost deasemenea studiate din punct de vedere al deformării {adică modificarea lungimii dL la puntul de rupere, împărțit la lungimea inițială !_□), o metodă de măsurare a elasticității țesutului.

Rezultate

Rezultatele sunt date în Tabelul 3

RO 114402 Bl și indică faptul că tratarea cu propilen glicol nu modifică semnificativ rezistența sau elasticitatea probelor de pericard fixat cu aldehidă glutarică. Rezultatele arată deasemenea că în perioada de timp scurtă a studiului, probele nu și-au pierdut rezistența mecanică în timp.

Tabelul 3

După 45 de zile de la implantare
Pericard de bovină	Glu+PG	Glu
Rezistență la întindere	1,D2±0,36	1,01+0,38
Deformare	O,74±O,25	0,63+0,13
După 90 de zile de la implantare
Pericard de bovină	Glu±PG	Glu
Rezistență la întindere	1,0±0,24	□ ,87±0,36
Deformare	□,58±0,25	0,58±0,17

Experimentul 2 3 o

S-au utilizat patru grupe de câte nouă șobolani pentru a studia efectele tratării cu propilen glicol asupra țesuturilor de pericard de bovină și valvă aortică de porcină fixate cu aldehidă 35 glutarică, din punct de vedere al conținutului de colagen și calciu, în cazul acestor tipuri de implanturi.

Așa după cum a fost descris mai înainte, sub anestezie cu pentobarbital, 40 toți șobolanii au suferit câte o incizie cutanată de 2 cm și au fost practicate câte două pliuri subcutanate pentru fiecare șobolan, în care a fost implantat, în primul, 1cm² de țesut fixat cu aldehidă 45 glutarică, și în al doilea, 1cm² de țesut fixat cu aldehidă glutarică și conservat în propilen glicol. Două dintre grupe au primit transplant de pericard de bovină, unul fixat cu aldehidă glutarică și celălalt 50 fixat cu aldehidă glutarică și tratat cu propilen glicol. Animalele unui grup au fost sacrificate după 45 de zile, implanturile lor fiind recuperate și analizate din punct de vedere al conținutului de calciu și hidroxiprolină; celălalt grup a fost studiat după 90 de zile. în paralel alte două grupe au primit (în locul pericardului de bovină) implanturi de valvă aortică de porcină, fixat cu aldehidă glutarică, și țesut fixat cu aldehidă glutarică și tratat cu propilen glicol. Studiul în cazul experimetului cu valvă aortică de porcină a fost același cu cel din cazul pericardului de bovină.

Rezultate

Rezultatele sunt prezentate în tabelul 4 și arată că tratarea cu propilen glicol diminuează rata calcifierii datorată fixării cu aldehidă glutarică. Situația este similară pentru cazuri, respectiv implant cu țesut de pericard și valvă aortică. Calogenul este conservat de către propilen glicol, și poate să crească în cazul țesutului de valvă aortică. Deci, propilen glicolul inhibă calcifierea implanturilor fără să fie dăunător pentru rezistența țesutului.

RO 114402 Bl

Tabelul 4

După 45 de zile de la implantare
Pericard de bovină	Glut+PG	Glut
Calciu	3,0±2,88	79,9±41,54*
Hidroxiprolina	8,37±1,13	8,01 ±0,47
După 90 de zile de la implantare
Pericard de bovină	Glut+Pg	Glut
Calciu	1D,45±5,75	214,43±34,34
Hidroxiprolina	9,41±1,00	8,1D±0,76#
După 45 de zile de la implantare
Valvă aortică de porcină	Glut + PG	Glut
Calciu	3,68±5,85	141,48±58,17*
Hidroxiprolina	5,42±1,84	3,58±1,48#
După 90 de zile de la implantare
Valva aortică de porcină	Glut+PG	Glut
Calciu	2,78±4,5	199,33±53,44*
Hidroxiprolina	6,20±0,56	4,25±0,65#

*pereche t test (9 în fiecare set) <0,001 #pereche t test (p în fiecare set) <0,005

Din cele prezentate se poate con- 35 stata că Exemplul 1 prezintă rezultatele slabe obținute cu soluție 60% și preferință pentru soluție cu conținut de ingredient activ între 60-100%” și pentru utilizarea propilen glicolului 100%. 40 Aceasta este o caracteristică importantă a prezentei invenții deoarece reacția aldehidei glutarice cu poliolul (de exemplu propilen glicolul) produce apă și este rezolvată prin relativa lipsă de apă. 45 Dimpotrivă este dificil să se obțină apă ca produs de reacție între două molecule în prezența unei concentrații mari de apă. Astfel, din punct de vedere termodinamic, dacă o reacție dintre un poliol și 50 aldehidă este dorită, atunci este necesară o concentrație relativ mare a poliolului. Se preferă un poliol de concentrație 99%, deși pot fi folosite valori mai mici, adică de peste 6D%în greutate.

în concluzie, prezenta invenție propune o metodă de tratare a țesuturilor biologice tanate cu aldehide pentru minimizarea in vivo a calcifierii fără diminuarea rezistenței mecanice obținute prin tanare cu aldehide și în același timp reducerea toxicității implanturilor tanate cu aldehidă care astfel ar inhiba endotelizarea implanturilor. Metoda de tratare este simplă, economică și sigură.

Claims

1. Metodă de anticalcifiere in vivo a țesuturilor biologice tanate cu aldehidă destinate, în special, bioprotezelor valvulare, caraterizată prin aceea că, se trateză țesutul biologic tanat cu aldehidă, prin introducerea sa într-o soluție de cel

RO 114402 Bl puțin 60% de poliol lichid ales din grupul constând dintr-un glicol și un diol neglicolic și combinații ale acestora, care formează un aduct ciclic cu 5-6 membri al aldehidei, în care glicolul are formula: 5

Ri Ra

I I c- c- c-r₃ ' ¹ 10

OH OH în care R, R^ R₂ și R₃ sunt în mod independent H, C-i-Cș alchil, CH₂OH, CH₂O-acil în care grupa acil este C₂-C_g, sau CH₂O-alchil; iar diolul neglicolic are 15 formula:

R, R₂ r₄

I I I

C- C- C- C-OH ¹¹¹ 20 OH R₃ R_s în care R, R_v R₂, R₃, R₄ și R₅ sunt în mod independent H, C₁₍ -C₅ alchi, CH₂0acil în care grupa acil este C₂-C_g, sau

CH₂0-alchil.

2. Metodă conform revendicării

1, caracterizata prin aceea că, poliolul este ales din grupul format din 1,2-propandiol (propilen glicol), 1,3-propandiol (propandiol), 2,3-butandiol (2,3-butilen glicol) și glicerina.

3. Metodă conform revendicării

1 .caracterizată prin aceea că, diolul este 1,2-propandiol (propilen glicol).

4. Metodă conform revendicării

1, caracterizată prin aceea că, poliolul este lichid la temperatura camerei.

5. Metodă conform revendicării

1, caracterizată prin aceea că, poliolul este substanțial lipsit de solvent.

6. Metodă conform revendicării 1, caracterizată prin aceea că, țesutul biologic este pericard de bovină.

7. Metodă conform revendicării 1, caracterizată prin aceea că, țesutul biologic este valvă aortică de porcină.