PT95620B - Processo para a preparacao de pro-drogas glicosil-etoposido e de composicoes farmaceuticas que as contem em combinacao com conjugados de enzima especificos para tumor funcionalizados - Google Patents

Processo para a preparacao de pro-drogas glicosil-etoposido e de composicoes farmaceuticas que as contem em combinacao com conjugados de enzima especificos para tumor funcionalizados Download PDF

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Description

A presente invenção refere-se a pró-drogas glicosil-etoposido, a processos para a sua preparação e à sua aplicação, em combinação com conjugados de enzima específicos de tumor funcionalizado, para o tratamento de doenças cancerosas, referindo-se em especial a 4’-0-glioosil-etoposida= como pró-drogas qu.e, sob a acção de conjugados de enzima específicos de tumor, podem ser decompostos em agentes citotóxicos, estando estes agentes apropriados, devido à sua acção citostática, para o tratamento de doenças cancerosas.
A combinação de pró-drogas com conjugados anticorpo-enzima específicos de tumor, para aplicação como agentes terapêuticos, encontra-se descrita na literatura especializada. Nesses casos, injectaram-se anticorpos dirigidos
contra determinados tecidos, aos quais se encontra ligado covalentemente um enzima que liberta a pró-droga, a um animal que tem transplantado o referido tecido, e aâministra-se em seguida uffl. composto pró-droga activável pelo enzima. Sob a acção do conjugado anticorpo-enzima ligado ao tecido, a pr&d -droga transformasse num veneno para a célula, o que provoca um efeito citotóxico sobre o tecido transplantado.
Na TO 88/07378 encontra-se descrito um sistema terapêutico contendo dois componentes, constituído por um anticorpo-enzima e por uma pró-droga activável pelo enzima. Para a preparação dos conjugados anticorpos-enzima descreve-se neste caso a utilização de enzima de não mamíferos e exclui-se a utilização de enzimas endógenos devido à libertação de compos tos não específica. Uma vez que os enzimas exógenos são reconhecidos pelo organismo como antigenes estranhos, a sua utilização tem a desvantagem de provocar uma resposta imunológica a essas espécies não próprias do corpo, devido à qual 0 enzima imobilizado no anticorpo se desactiva e eventualmente se elimina todo 0 conjugado. Além disso, utilizam-se neste caso ácido p-bis-N-(2-cloroetil)aminobenzilglutâmico e os seus derivados, como pró-droga, cujo tempo de vida média é apenas de 5?3 a 16,3 horas. A instabilidade química de uma pró-droga é uma desvantagem devido aos efeitos secundários esperados.
Na EPA 0302473 A2 descreve-se também um sistema terapêutico contendo dois componentes, no qual o conju gado anticorpo-enzima localizado no tecido do tumor transforma um composto pró-droga num agente citotóxico. A utilização combinada, ai descrita, de 4í-fosfato de etoposido e seus derivados como pró-droga e de fosfatase alcalina imobilizada no anticorpc para a libertação de etoposido, é uma desvantagem devido à forte presença no soro de fosfatases alcalinas endógenas. Como descrito na DE 33 26562 Al, utilizam-se já os 4'-fosfatos de etoposido isoladamente como agentes terapêuticos anti-tumor, •
_ _ £ 4-
servindo as fosfatases presentes no soro para libertar o etoposido a partir da pró-droga.
Lescobriu-se surpreendentemente, que o composto ^‘-O-alfa-D-glucopiranosiletoposido, preparado sinta tioamente, e até ao momento não disponível, se pode transformar (cindir) em etoposido e D-glucose, com o enzima alfa-glucosidase bem como asm um conjugado anticorpo-glucosidase específico do tumor, in vitro.
A partir desta descoberta e atendendo às desvantagens acima descritas para as combinações de pró-drogas e de conjugados anticorpo-enzima, o objectivo da presente invenção foi o de preparar 4*-0-glicosiletoposidos sintéticos , cindiveis por enzimas, bem como enzimas funcionaliza dos específicos de tumor, e o de testar a utilidade farmacoló gica das combinações dos dois componentes em modelos de mamíferos adequados. Oonsegiu-se atingir este objectivo com a ;· obtenção dos compostos de fórmula I bem como de enzimas funcic nalidados específicos de tumor, que em aplicação combinada em testes de efeito citostatico apresentaram uma alta eficácia.
objectivo da presente invenção sao 4‘-0-glicosiletoposidos, de fórmula geral I
na qual
E£
Erepresenta um grupo metilo, benzilo ou 2-tienilo, representa um ãtomo de hidrogénio, um grupo proteotor acilo ou trialquil-O^-C^-sililo, representa um grupo hidroxilo, um grupo protector acilo ou trialquil-C^-C^-sililo, um grupo amino, acetilafllino, benziloxiearbonilamino ou dimetilamino, , ,
E representa um atomo de hidrogénio ou um grupo metilo, representa um átomo de hidrogénio, um grupo hidroxilo, um grupo protector acilo ou trialquil-C^-C^-sililo ligado por um átomo de oxigénio, um grupo amino, Jbenziloxicarbonilamino, azido ou acetilamino,
- 4 SVmnnwMMMI.urr
representa um grupo hidroxilo, um grupo protector acilo ou trialquil-O^-C^-sililo ligado por um átomo de oxigénic um grupo amino, benziloxicarbonilamino ou azido,
R?
representa um átomo de hidrogénio, um grupo protector acilo ou trialquil-O^-O^-sililo , e representa um grupo metilo, bidroximetilo ou um grupo pro tector acilo ligado por um grupo metilenoxi, ou um grupo benziloxicarbonilo, devendo entender-se por grupo protector acilo, um grupo aceti lo ou um grupo mono-, di- ou tri-haloacetilo, sendo o halogénio fluor ou cloro *
No âmbito da invenção, deve entender-se por enzima funcionalizado específico de tumor, um enzima de formula II
A-Sp-E II na qual
A significa um anticorpo ou um dos seus fragmentos, que apre. sente especificidade para um antigene associado ao tumor, ou uma biomolécula que se concentra no tumor, como EGF (facutor de crescimento epidermal), TGF-alfa (factor de crescimento transformante áLfa), PDGF (factor de crescimento derivado Platelet), IGF I+II (factor de crescimento análogo à insulina I+II) ou a^b FGF (factor de crescimento fibroblástico ácido + básico),
E significa uma glicosidaae não imunogénica ou pouco imunogénica, de preferência uma glicosidase de mamífero, como alfa-ou béta-glucosidase, alfa-galaclosida&e, alfa- ou beta -manosidade, alfa-fucosidade, N-acetil-alfa-galactosaminidase, N-acetil-beta-/N-acetil-alfa-glucosaminidase ou beta-glucoronidase,
Sp (Spacer) significa um grupo bifuncional sulfureto ou di-sulfureto, de fórmula III ou IV
X(S)nY III X(S)n IV ou um Spacer polipeptídico, em que
X ou Y significa -GO-R^-(H-succinimido)- ou
-g(=r10)-gh2-gh2-, q
com Ir significando -GH2~GH2-, 1,4-ciclo-hexilideno,
1,3- ou 1,4-fenileno ou metoxiearbonil ou cloro-1,4-fenileno e ΡΔθ significando 0 ou NH, e ainda,
Y significa ^(=R10)-CH2-CH2-, tenio R10 o significado anterior, e n é igual a 1 ou 2.
gene de fusão de Vg, Ggl Hing e gene de enzima, clona-se num plasmídeo de expressão, apropriado para a expressão em células encariéticas e que contém um marcador de selecção. Transfecciona-se o plasmídeo de expressão com o gene de fusão, juntamente com um plasmídeo de expressão que contém o gene pertencente à cadeia leve do anticorpo, em células de expressão eucarióticas. Após seleccão com um antibiótico apropriado, identificam-se os clonos transfeccionados que contêm as plasmídeos de expressão. Por meio de métodos de identificação apropriados (BioDot, ELISA) , identificam-se os clonos transfeccionados que segregam a proteína de fusão de fórmula II constituída pelo anticorpo e pelo enzima.
Ho âmbito da presente invenção, preferem -se os compostos de fórmula geral I, em que l1 .2 representa um grupo metilo, benzilo ou 2-tienilo, representa um átomo de hidrogénio, um grupo protector acetilo, cloroacetílà ou trialquil-G-^-G^-sililo,
R representa um grupo hidroxilo, um grupo protector acetilo, cloroacetilo ou trialquil-C^-O^-sililo ligado através de um átomo de oxigénio , um grupo amino, acetilamino, benziloxicarbon.il amino ou dime til amino 5
ZL , ,
R representa um atomo de hidrogénio ou um grupo metilo, / z ~S. representa um atomo de hidrogénio, um grupo hidroxilo ou um grupo protector acetilo, cloroacetilo ou trialquil-C^-G^-sililo ligado através de um átomo de oxigénio, um grupo amino, benziloxicarbonilamino, azido ou acetilamino,
R representa um grupo hidroxilo, um grupo protector acetilo cloroacetilo ou trialquil-G^-O^-sililo ligado através de um átomo de oxigénio, um grupo amino, benziloxicarbonilamino ou azido,
Ή? represente um átomo de hidrogénio, um grupo protector aci lo, cloroacetilo ou trialquil -sililo, e
O
R representa um grupo metilo, hidroximetilo, acetiloxi- ou cloracetiloxi-metilo ou um grupo benziloxicarbonilo, bem como um enzima funcional!zado específico de tumor, de férmula II, em que
A representa um anticorpo ou um sem fragmento, que apresente especificidade para um antigene associado com o tumor, ou uma biomolécula que se concentra no tumor, como EGE (factor de crescimento epidermal), TGE-alfa (factor de crescimento transformante alfa), PDGE (factor de crescimento Platelet derivado), IGEI + II (factor de crescimento análogo à insulina I+II), a + b EGE (factor de crescimento fibroblastico ácido + básico),
E representa uma glicosidase não imunogênica ou pouco imunogénico, de preferencia uma glicosidade de mamífero, por exemplo uma alfa- ou beta-glucosidase, alfa-galactosidase, alfa- ou beta-manosidase, alfa-fucosidase, H-acetil-alfa- 7 -
-galactosaminidase, N-acetil-beta-/N-acetil-aifa-glucoxami nidase ou beta-glucoronidase,
Sp representa um grupo bifuncional contendo di-sulfureto, de fórmula III ou IV, ou um espaçador polipeptídico, em que
X ou Ϊ significam - GO-R^-(N-succinimido)-ou
-0(=R'1'^)-GH9-GHo- com signidicando -GHq-GHo,10 significando 0 ou NH, ,10 ou 1,4-fenileno e E ,10· significa -O^R1 ^OH^-OHg-, tendo R1U o significado anterior, e é igual a 1 ou 2.
processo de acordo com a invenção, para a preparação de um composto degradável por glicosidase, de fórmula I, em que
R^* é um grupo metilo , benzilo ou 2-tienilo, p
R^ é um átomo de hidrogénio,
U e um grupo hidroxilo, amino ou dimetilamino,
R^ é um átomo de hidrogénio ou um grupo metilo,
R-? é um átomo de hidrogénio, um grupo hidroxilo, um grupo amino ou acetilamino, z
R e um grupo hidroxilo ou um grupo amino,
R? é um átomo de hidrogénio,
O
E é um grupo metilo ou hidroximetilo, ou um grupo carboxilo ou um grupo protector acilo ligado através de um grupo metilenoxi, ou um grupo benziloxicarbonilo, entendendo-se por grupo protector acilo um grupo acetilo, mono-, di- ou tri-halo-acetilo, sendo o halogénio fluor ou cloro, caracteriza-sse por se fazer reagir um composto etoposido, de fórmula V
em que κR representa um grupo metilo, benzilo ou 2-tienilo, representa um átomo de hidrogénio, um grupo protector acilo ou trialquil-C^-C^-sililo, representa um grupo hidroxilo, um grupo protector acilo ou trialquil-O^-C^-sililo ligado através de um átomo de oxigénio, um grupo acetilamino, henziloxicarbonilamino ou dimetilamino, e κ representa um átomo de hidrogénio ou um grupo metilo, com um kàdrato de carbono de fórmula VI
em que
R^ representa um átomo de hidrogénio , um grupo hidroxilo, um grupo protector acilo ligado através de um átomo de oxigénio, ou um grupo benziloxicarbonilamino, azido, ou acetilamino,
Εθ representa um grupo protector acilo ligado através de um átomo de oxigénio, um grupo benziloxicarbonilamino ou azido, representa um grupo protector acilo,
R representa um grupo metilo, um grupo protector metilenoxi -acilo ou um grupo benziloxicarbonilamino, e
Z representa um átomo de halogénio, de preferência fluor, cloro ou bromo, um grupo hidroxilo, um grupo trialquil-Ci-C^-sililoxi ou um grupo protector acilo ligado através de um átomo de oxigénio, sendo o grupo protector acilo um grupo acetilo, mono-, di- ou tri-halo-acetilo , sendo de preferência o halogénio fluor ou cloro, na presença de um promotor e, eventuaimente, de um captor de ácido ou de um agente excicante, num solvente, a uma/, temperatura de -50°G a 60°G, obtendo-se um derivado 4’-0-glicosil-etoposido, de fórmula I, em que todos os grupos R a R mantêm os significados acima definidos, e se removerem nestes compostos os grupos protectores presentes , por via hidrogenolítica ou hidrolítica, e, conforme o ca- 10
so, se transformar um dos compostos obtidos contendo grupos amino, através de uma alquilação redutiva, num outro composto de fórmula I contendo um grupo dimetilamino.
Em pormenor procede-se do seguinte modo:
Para a glicosidação de derivado de etoposido de fórmula V, utilizam-se hidratos de carbono funcionalizados, de fórmula VI, tipicamente protegidos por grupos protectores acilo em 0(2), 0(3), 0(4) e eventualmente 0(6). Os grupos protectores acilo preferidos são acetilo, cloroacetilo e trifluoroacetilo. No caso dos amino-açúcares protege-se temporariamente o grupo amino com um grupo benziloxicarbonilo ou permanentemente com um grupo acetilo. É também possível o emprego de azido-açúcares, uma vez que estes se podem converter sem problemas em amino-açúcares por meio de hidrogenóli|se Os componentes hidrato de carbono devem funcionalizar-se adequadamente no centro anomérico. Para tal utilizam-se halogenetos de glicosilo como fluoretos, cloretos ou brometos, que se podem preparar por exemplo a partir de 1-0-acil-derivados com SE, H01, KBr ou TiBru. Á síntese dos componentes de glicosidação que possuem no centro anomérico um grupo Q-acilo ou hidroxilo, efectuar-se de acordo com processos usuais da química dos hidratos de carbono.
Á glicosidação de etoposidos de fórmula V com hidratos de carbono de fórmula VI efectua-se na presença de um promotor. Empregando fluoretos de glicosilo ou os seus análogos 1-hidroxilados ou 1- aciloxilados, utiliza-se como promotor BE^/éter ou um éster trialquil-O-^-O^-silílico do ácido trifluorometano-sulfónico, Np caso de cloretos ou brometos de glicosilo utilizam-se como promotores sais de prata ou de mercúrio.
Á glicosidação efectua-se num solvente orgânico aprótico como acetona, acetato de etilo, éter, tolue- 11
no, diclorometano ou dicloroetano ou em misturas destes. Para captar a água ou os ácidos formados na reacção, utilizam-se, oonforme o caso, agentes excicantes ou captores de ácido, como peneiros moleculares ou sulfato de magnésio. A temperatura da reacção situa-se, quando se empregam fluoretos de glicosi lo e seus análogos 1-h.idroxilados, na gama de -50°0 a 0°G, e quando se empregam cloretos ou brometos de glicodilo, na gama de 0°G a 60°C. Os etoposidos de glicosilo formados na reacção desbloqueiam-se de acordo com o seguinte processo: os grupos protectores acilo removem-se por meio de metanólise catalisado por sais de zinco (II) ou por permuta iónica alcalina em metanol, etanol ou em misturas destes com clorofórmio, diclorometano ou éter. Os grupos benzilo, benziloxicarbonilo ou azido removem-se por bidrogenólise com carvão de paládio ou paládio/sulfato de bário ou, no caso dos grupos azido, trar formam-se em grupos amino. Os compostos de fórmula I contendo amino-açúcares podem ainda transformar-se em dimetilaminoderivados por meio de alquilaçao redutiva com formaldeído/cianoboro-bidreto de sódio.
Para a preparação de A-Sp-E pode ligar-se o Spacer (Sp) através de um grupo amino a um enzima e ao anticorpo ou à biomolécula através de um grupo HS introduzido ou resultante da cisão da ponte de di-sulfureto, ou ligam-se covalentemente sequências de ácidos nucleicos que codificam para as partes A, Sp e E, por meio de métodos da biologia molecular, de modo a obter-se um gene de fusão, preparando-se o A-Sp-E por técnicas de engenharia genética.
Isto pode efectuar-se de várias maneiras;
A) Introduz-se uma posição de corte de restrição À no extremo 5’ do exão Sgl no gene da cadeia pesada da imunoglobulina, através de mutagénese específica. Gera-se a mesma posição de corte de restrição A no extremo <3·° oligonucleótido que codifica para o oligopeptido, que funciona como Spacer. Colocam-se ambas as posições de oorte de restri-12 -
ção A de modo que o gene de imunoglobulina se possa ligar ao oligonucleotido, através da posição de corte de restrição A, sem alterar o código de leitura.
No extremo 5’ do oligonucleótido gera-se uma posição de corte de restrição B. Introduz-se esta posição de corte de restrição B no gene que codifica para o enzi ma, na posição em que começa a sequência de ácido nucleicos codificante para a proteína madura. Liga-se então o gene do enzima, através da posição de corte de restrição B, ao gene de imunoglobulina-construção de lincagem. Colocam-se as posi·?· ções de corte de restrição B de modo que o código de leitura não seja alterado pela ligação. 0 gene de fusão do enzima de lincagem e 0^1 para a cadeia pesada da imunoglobulina, clona-se num plasmídeo de expressão, apropriado para a expressão em células eucarióticas e que contenha um maruador de seleção.
plasmídeo de expressão com o gene de fusão juntamente com um plasmídeo de expressão que contenha o gene da cadeia leve do anticorpo, tra-nsfeccionam-se em células eucarióticas (p.ex. células de mieloma). Por meio de selecção com antibióticos adequados, isolam-se clonos celulares que con têm os plasmideos com o gene de fusão e com o gene de cadeia leve (transfectonas). Através de métodos de identificação apropriados (BioDot; ELISA) identificam-se esses transfectomas que segregam a proteína de fusão, de fórmula A-Sp-E, constitui da por uma parte MAK-Eab, polipêptido de lincagem e enzima.
B) Introduz-se uma posição de corte de restrição A no extremo 3’ do exão Hinge do gene da cadeia pesada da imunoglnbulina. Introduz-se a posição de corte de restrição A na posição do gene do enzima em que começa a sequência de nucleótidos codificante para a proteína madura. 0 fragmen to do gene da cadeia pesada da imunoglobulina com os exoes Vg-j G^-l- e Hinge liga-se ao gene do enzima, através da posição de corte de restrição A.
Colocam-se as posições de corte de restrição A de modo que o código de leitura não seja alterado pe la ligação. A parte Hirge do anticorpo tem, nesta construção, a função do Spacer polipeptídico.
gene de fusão de V^-Hinge, C^l-Hinge e gene de enzima, clona-se num plasmídeo de expressão, adequa do para a expressão em células eucarióticas e que contenha um marcador de seleçção. 0 plasmídeo de expressão com o gene de fusão, juntamente com um plasmídeo de expressão que contém o gene da cadeia leve doanticorpo, transfeccionam-se em células de expressão eucarióticas. Após seleccção com um antibiótico apropriado identificaram-se os clonos transfectonas que contem os plasmídeos de expressão. Através de métodos de aválise adequados (BioDot, ELISA) identificaram-se os clonos transfectomas que segregem a proteína de. fusão, de fórmula II, cons tituída pelo anticorpo e pelo enzima.
acoplamento entre o enzima e o anticor po, um seu fragmento ou uma biomolécula, efectua-se de acordo com processos descritos na literatura (Α.Ξ. Blair e J.I. Ghose, I. Immunolog. Methods 56 (1983) 129-143? T.I. Ghose et al., Methodo in Enzymology. Vol. 93(19θ3) 280-333)·
Para tal, funcionalisa-se primeiro o enzima no seu grupo amino, por meio de 1-carboxilato de succinimidil-N-maleimidoalquilideno, -cicloalquilideno ou -arileno, desaparecendo a ligação dupla da função maleimido numa reacção com o grupo HS do anticorpo funcionalizado, de um seu fragmento ou da biomolécula, formando-se uma função tioéter.
Para a preparação dos conjugados anticorpo- enzima podem utilizar-se anticorpos monoclonais, como os descritos na EP-A-0 141 079, de preferência os anticorpos
431/26, 25O/183, 704/152 3 494/32. A especificidade dos anticorpos em relação aos antigenes associados a tumores fora
já testada em animais e seres humanos, pon meio de imuno-cintigrafia e imuno-histoquímica.
A sequência de nucleósidos dos genes V destes anticorpos monoclonais encontra-se descrito no registo de patente alemão DE-A-39 09 799 «4.
Para a preparação dos conjugados de enzima específicos de tumor podem purificar-se os enzima a seguir indicados, ohtidos das fontes indicadas, de acordo com os processos da literatura referidos:
- alfa-galactosidase de fígado humano; Dean, K.g. e Sweeley c.c. (1979), J. Biol, Ohem. 254, 994-1000
- heta-glueoronidase de fígado humano; Ho, K.J. (1985), Biochem. Biophys. Acta 827, 197-206
- alfa-L-fucosidase de fígado humano; Dawson, G·., Tsay,
G. (I977), Areh. Biochem. Biophys. 184, 12-23
- alfa-manosidase de fígado humano; G-rahowski; G.A.,
Ikonne, J.U., Sesnick, E.j. (1980), Enzyme 25, 13-25
- heta-manosidase de placenta humana; Noeska, 0.,
Mersmann, G. (1983), Hoppe Seylers Z. Physiol. Ohem..
564, 1645-1651
- alfa-glucoxidaáe de estômago humano mucosa de intestino humana; Asp, N.-H., Gudmand-Hoeyer, E., Ohristiansen, P.H., Dahlquist, A. (197^), Scand. J. Olim. Lah. Invest. 33, 239-245
- heta-glucosidase de fígado humano; Daniels, L.B., Ooyle, P.J., Ohiao, Ϊ.-Β., Glew, R.H. (1981), J. Biol, Ohem. 256, 1 3004-13013
- heta-glucocerehrosidase de placenta humana; Eurbish, E.S. Balir, Ξ.Ε., Shiloach, J., Pentchen, P.G., Brady, E.O. (1977), Proc. Natl. Acad. Sei. USA 74, 3560-5563
- alfa-N-acetilglucosaminidase de placenta humana; Eoehrhorn, W., von Pigura, K. (197θ), Hoppe Seylers Z. Physiol. Ohem. 359, 1353-1562
- beta-N-acetilglucosaminidase de membrana amniótica humana; Orlacehio, A., Emiliani, 0., di Benzo, G-.C.,
Gosmi; E.V. (1986), Glim. Ohim. Acta 159, 279-289
- alfa-N-acetilgalactosaminidase; Salvayre, B., Negre.
A., IViaret,A., Douste-Blazy, L. (1984), Pathol. Biol. (Paris), 32, 269-284.
 actividade glicolítica dos enzimas específicos de tumor funcionalizados determinou-se em ensaios com parativos com p-nitrofenil-glicósidos, em cada caso ao pH óptimo.
È ainda um objectivo da invenção um empacotamento contendo um glicosiletoposido de acordo com a invenção e um conjugado de enzima específico de tumor, funcionalizado, em combinação com conjugados de enzima específicos de fumos funcionalizados.
Para testar a eficácia de uma composição temporária combinada, administrou-se o enzima funoionalizado a ratos transplantados, esperou-se até ao dia em que o especulo plasmático do enzima praticamente desceu a zero, administrou-se o glicosiletoposido e observou-se se ocorria uma paragem de crescimento ou uma regressão.
Exemplo 1
Preparação dos componentes de glicosilação
Éster benzi lico do ácido D-glucorónico (Gomposto 1)
A uma solução de D-glucoronato de sódio (59» 23.15 mmol) em DMF (300 ml) adicionou-se brometo de benzilo (4.89 g? 28.5 9 mmol). Agitou-se a mistura reaccional durante 2 h a 40°G, depois durante 16 h a 80°0 e evaporou-se em vácuo. Purificou-se o resíduo por cromatografia em coluna
cLe sílica gel (I30 g) com clorofórmio: metanol água 80:20:1. Rendimento: 4.87 § (74·%)· Oaracterizou-se o composto do título por meio de ^0-fflR.
Éster benzílico do ácido 1,2,3,4-tetra-0-cloroacetil-alfae beta-D-glucorónlco (Qomposto 2 a e 2b)
Suspendeu-se éster benzílico do ácido D-glucorónico (3.80 g, 13·3θ mmol) em diclorometano (200 ml). Após a adição de cloreto de cloroacetico (7.90 g, 69.94 mmol) arrefeceu-se a mistura a -30°G e adicionou-se-lhe piridina (4.339» 54.74- mmol) dissolvida em diclorometano (50 ml). Agitou-se a mistura reacional durante 16 h a -30°0 e em seguida adicionou-se-lhe cloreto de cloroacetilo (7.90 g) e piridina (4.33 g) . Após 16 h de agitação adicionou-se à mistura diclor metano frio (150 ml) e lavou-se com tampão de citrato de sódic a 5% (pH 5» 60 ml x 2) e água gelada (50 ml x 2). 0 produto resultante (7*92 g)5 gue para além do composto do titulo continha cerca de 30% de éster benzílico do ácido 2,3»4-tri-0-cloroacetil-alfa- e beta-D-glucónico, utilizou-se para 0 passo seguinte sem mais purificação.
Éster benzílico do áoido_ 2,5.,4-tri-O-cloroaoetil-alfa, beta-D-glucorónico (compostos 3a, 3b)
Dissolveu-se 0 produto bruto (7.92 g) dos compostos 2a/2b em metanol/clorofórmio 3:1 e adicionou-se-lhe sílica gel amimada (11.09 g) · Agitou-se a mistura reaccional durante 6 h à temperatura ambiente e filtrou-se. Após evaporação do filtrado cromatografou-se o resíduo em sílica gel (220 g) com éter de petróleo/acetato de etilo 2:1 para purificação.
Rendimento: 4.94 g (72% em relação aos compostos 2a/2b).
Éster benzílico do ácido 1-desoxi-l-flupro-alfa-D-glucorónico (composto 4)
Suspendeu-se o sal de sódio do ácido 1-desoxi-l-fluoro-alfa-D-glucorónico (6.22 g, 28.51 mmol) em Dff (550 ml) θ adicionou-se brometo de benzilo (4.89 S?
28.59 mmol). Agitou-se a mistura reaccional durante 24 h a 60 °0 e evaporou-se em seguida. Dissolveu-se o resíduo em clorofórmio/metanol 3;1 e adicionou-se-lhe sulfato de magnésio (12 g). Após 2 h de agitação filtrou-se a suspensão e eva porou-se 0 filtrado. Purificou-se 0 resíduo por cromatografia em coluna de sílica gel (160 g) com diclorometano/acetona 4:1, Rendimento: 5*95 g (73 %) ·
Éster benzílico do ácido l-desoxi-l-fluoro-2,3^-tri-O-benzil-alfa-D-glucorónico (composto 5)
Suspendeu-se 0 composto 4 (5.0 g, 1/.46 mmol) em diclorometano (120 ml) e adicionou-se a 0°C brometo de benzilo (9.85 g» 57*61 mmol) e óxido de prata (11.2 g). Agitcu -se a mistura-reaccional durante 5 h a 0°0, e depois durante 28 h à temperatura ambiente. Piltrou-se a mistura reaccional e evaporou-se 0 filtrado em vácuo. Purificou-se o resíduo poi cromatografia em sílica gel (240 g) com éter de petróleo/ace-tato de etilo 3:1»
Rendimento: 6.60 g (68%).
Éster benzílico do ácido l-desoxi-l-fluoro-2,5,4-tri-0-cloroacetil-alfa-D-glucorónlco (composto 6)
Suspendeu-se o composto 4 (5.0 g, 14.46 mmol) em diclorometano (260 ml) e adicionou-se a -30°C cloreto de cloroacetilo (9.68 g, 87.30 mmol). Após adiçao de dicloro metano/piridina 10:1 (100 ml) agitou-se a mistura reaccional durante 18 t a -30°0. Adicionou-se à mistura diclorometano frio (80 ml) e lavou-se som tempão de citrato de sódio (pH 5*8, 80 ml x 3) © depois com água. Secou-se a fase orgânica ' sobre sulfato de sódio e evaporou-se. Purificou-se o resíduo por cromatografia em coluna de sílica gel (260 g) com éter . de petiúieo/acetato de etilo 5:1.
Rendimento: 7.58 g (92?/o) .
Eluoreto de 2,5,4,6-tetra-O-cloroacetil-alfa-D-galactopiranosilo (Composto 7)
Dissolveu-se fluoreto de alfa-D-galactopiranosilo (2.50 g, 12,62 mmol) em diclorometano seco (100 ml) e adicionou-se a -25°0 cloreto de cloroacetilo (9.0 g, 79.68 mmol) e diclorometano/trietilamina 1:1 (55 ml). Agitou-se a mistura reaccional durante 16 h. e em. seguida adicionou-se-lhe cloreto de cloroacetilo (9.0 g) e diclorometano/ /trietilamina 1:1 (55 ml). Após mais 24- h. de agitação lavou-se a mistura reaccional com tampão de citrato de sódio (pH 5.0, 50 ml st 5) θ depois com água. Secou-se a fase orgânica sobre sulfato de sódio e evaporou-se em vácuoPurificou-se 0 resíduo por cromatografia em coluna cLe sílica gel (500 g) com diclorometano/éter de petróleo/acetato de etilo 40:8:1. Rendimento : 5 .19 S (&2/o) .
alfa p = = 64-.2° (0=1, diclorometano).
Fluoreto de 2,5,4-,6-tetra-O-benzll-alfa-D-galactopiranosil (composto 8)
Dissolveu-se fluoreto de alfa-D-galactopiranosilo (2.50 g, 12.62 mmol) em DMF seca (40 ml) e adicionou-se a -20°0 brometo de benzilo (12.95 Sj 75«72 mmol) e óxido de prata (10 g). Agitou-se a mistura reaccional durante 5 k a -20°0 e depois durante 24 b â temperatura ambiente. Em seguida filtraram-se os sais e evaporou-se 0 filtrado em vácuo. purificou-se 0 resíduo por cromatografia em coluna de sílica gel (350 g) com éter de petróleo/acetato de etilo
15:1.
Rendimento: 5.20 g (76%).
Exemplo 2
Síntese de glicósidos
4l-0-desmetil-4-0-(2,5'-di-0-çlopoacetil-4,6-0-etilideno-beta-D-glucopiranosil)-4-epi-poáofilotoxina (composto 9)
Hidrogenou-se 4’-0-benziloxicarbonil-4-0-demetil-4-0-(2,3-di-0-cloroacetil-4,6-0-etilideno-beta-D-glucopiranosil)-4-epi-podofilotoxina (10 g, 11.42 mmol) em acetato de etilo/metanol 2:1 (200 ml), na presença de Pd/C a 10% (5.0 g), durante 2 h. Filtrou-se a mistura reaccional e evaporou-se o filtrado em vácuo. Filtrou-se o resíduo através de uma camada de sílica gel (50 g). 0 produto recristalizou-se de metanol/acetato de etilo.
Rendimento: 7-50 g (88.6 %) ; Ponto de fusão: 201-203°0; alfa j) = ~ 75 ·4-° (0 = 1, clorofórmio).
Ester.. benzi lico do ácldo4.,-Q-desmetil-4-0-fdi-0-cloroacetil-4,6-0-etilideno-beta-D-glu.oopiranosil) -4-epi-4/-0-(2,3 ,4-tri-O-benzil-beta-D-glucopiranosil)-urónico-podofilotoxina (composto 9)
Dissolveram-se éster benzílico do ácido 1-fluoroglicorónico (composto 5, 4.23 g» 7·60 mmol) e 2,3-di-O-cloroacetil-etoposido (composto 9, 5*63 g» 7.60 mmol) em diclorometano (220 ml) e adicionaram-se peneiros moleculares de 4 â. (10 g) . Adicionou-se à mistura reaccional a -40°C BF3/éter (2.5 ml) e em seguida agitou-se durante 20 te a -30°0. Após adição de trietilamina (7.0 ml) filtrou-se a mistura reac cional. Lavou-se o filtrado com tampão de citrato (pH 5, 80 ml x 3) e com água (120 ml x 3), secou-se sobre sulfato de sódio e evaporou-se em vácuo. Purificou-se o resíduo por cromatografia em coluna de silica gel (360 g) com diclorometano/ /éter de petróleo/acetona 5:5*1·
Rendimento: 6.49 g (67%)
4t-0-desmetil-4-Q-(di-Q-oloroaoetil-4>6-Q-etilideno-beta-D-glucopiranosil)-4-epi-4l-0-(2,5,4,6-tetra-Q-benzil-alfa- e beta-D-galaotopiranosil)-podofilotoxina (compostos 10a e 10b)
Dissolvem-se fluoreto de tetra-O-benzil·· galactopiranosilo (composto 8, 3.60 g, 6.65 mmol) e o derivado de etoposido (composto 9, 4.93 g, 6.65 mmol) em diclorometano (250 ml). Após a adição de peneiros moleculares 4 2 (7.2 g) arrefeceu-se a mistura reaccional a -40°0 e adicionou-se gota a gota BE^-óter a 30% (2.2 ml). Agitou-se a mistura durante 20 h a -30°0, adicionou-se-lbe em seguida trietilamina (5.5 ml) e filtrou-se. Lavou-se 0 filtrado com tampão de citrato (75 ml x 3, pH 5) e água (70 ml x 2), secou-se sobre sulfato de sódio e evaporou-se. Prá-purificou-se o resíduo por cromatografia em coluna de sílica gel (370 g) com áter de petróleo/diclorometano/acetona 5s5íl. A purificação subsequente por cromatografia em coluna deu origem aos compostos do título 10a (alfa-glicósido: 4.36 g (52%)) e 10b (beta-glicósido! 1.42 g (17%)).
Exemplo 3
Reacção de desbloqueamento de etoposidos de glicosilo éster benzílico do ácido 4l-0-desmetil-4-epi-4-Q-(4,6-Q-etilidenft-beta-D-gluoopiranosil)-4*-0-(2,3 ,4-tri-O-benzil-beta-D-gluoopiranosil)-urónico-podofilotoxina (composto 11)
Dissolvem-se 0 derivado de glucoronido (composto 9» 4.56 g, 3.57 mmol) em metanol/clorofÓrmio 4:1 (120 ml) e mistur©u-se com DOWEX 1x8 (6.2 g). Agitou-se a mistura reaccional durante 3 b. à temperatura ambiente e filtrou-se em seguida. Ao filtrado adicionou-se clorofórmio (I50 ml) e agitou-se com sulfato de magnásio (lOg)· Após filtração dos sais evaporou-se o filtrado em vácuo. Purificou-se 0 resíduo por cromatografia em coluna com 200 g de sílica gel com diclorometano/áter de petróleo/acetona 5í2:l. Rendimento: 3*29 g (82%).
Ácido 4l-Q-desmetil-4-epi-Q-(4,6-0-etilideno-beta-D-glucopira· nosil) -4* -0-(beta-D-glucoplranosil)-urónico-podofilotQxlna (composto 12)
Dissolveu-se o derivado de glucoronido desocilado (composto 11, 3*62 g, 3*22 mmol) em metanol/acetato de etilo 4:1 (180 ml) e bidrogenou-se na presença de Pd/C a 10% (2.76 g) durante 20 b. Após filtração do catalisador evaporou-se o filtrado em vácuo. Purificou-se 0 resíduo por cromatografia em coluna de sílica gel EP-18 com um gradiante de metanol/hexano.
Rendimento: 1.82 g (74%).
4,-0-desmetil-4-epi-4-0-(4,6-0-etilideno-beta-D-glucopiranosi3)
-4 * -0--( 2,3 »4 ,6-tetra-O-benzil-alfa-D-galaotopiranoxil) -podof ilotoxina (composto 13)
Dissolveu-se galactopiranosido de podofilotoxina (composto 10a, 3·0 g, 2.37 mmol) em metanol/clorofórmio 3?1 ® misturou-se com DQWEX 1x8. Agitou-se a mistura reaccional durante 3 b à temperatura ambiente e filtrou-se. Evaporou-se 0 filtrado em vácuo. Lavou-se 0 resíduo, dissolvido em clorofórmio, com tampão de fosfato (pH 7, 30 mlx3) » e depois com água. Secou-se a fase orgânica sobre sulfato de sódio e evaporou-se. Purificou-se o resíduo por cromatografia em coluna de sílica gel (85 g) com diclorometano/eter de petróleo/acetona 5*3*1·
Rendimento: 2.27 g (86%).
4*-0-desmetil-4-epi-4l-0-(alfa-D-galactopiranosil)-4-0-(4,6-Q-etilideno-beta-D-glucopiranosil)-podofilotoxina (composto 14)
Dissolveu-se galactopiranosido do podofilotoxina desacilado (composto 13, 2.0 g, 1.80 mmol) em metanol/acetato de etilo 3*1 e hidrogenou-se na presença de Pd/O
a 10% (2.5 s) durante 24 b. Agitou-se a mistura reaccional com sulfato de magnésio e filtrou-se. Evaporou-se 0 filtrado em vácuo. Purificou-se 0 resíduo por cromatografia em coiu na de sílica gel RP-18 com um gradiente de metanol/acetato de etilo·
Rendiemtoi 1.37 S (72%).
Resultados
Nas condições do ensaio não se verificou qualquer actividade enzimática para a alfa-galaotosidase nem para a beta-glucoronidase·
Exemplo 5
Determinação da actividade enzimática de conjugados de beta-glucoronidase
Á beta-glucoronidase, purificada de acor do com 0 processo acima mencionado, acoplou-se ao anticorpo/ /biomolécula e determinou-se a actividade do enzima e do conjugado, do modo seguinte 5
A 500 ydl de uma solução 2,5 mM de beta-D-glucoronido de p-nitrofenilo em HEPES 100 mM (ácido Ν-2-hidroxietil-piperazino-N'-2-etano-sulfónico), pH5, adicionaram-s ' . . . ... testar incu
uma solução 0,4 M de glicina, pH 10,8. Em seguida, efectuou-se a determinação do p-nitrofenol libertado, pela medição da extinção a 405 nm.
Resultado:
conjugado apenas acidentalmente mostrou uma actividade enzimática diminuída.
- 23 Exemplo 9
Efeito anti-tumor in vivo do sistema pró-droga glicosil-eto posi ao “ ~ ' ““
A 30 ratos WRI nu/nu fez-se uma inoculação subcutânea de 4 pedaços de tumor humano OoOa de cerca de 5 mm7» hQ dia zero, a cada animal. Após desenvolvimento dos tecidos de tumor humano nos ratos (dias 7-14), administrou-se a cada grupo de 5 animais as seguintes substâncias ;
a,b,c 3x300 ^ig de conjugado de glucoronidase-MAE BW 494/32, d 5x500 ydg de MAE BW 494/32, e 5x500 ^ug de glucoronidase f 5x500 fl de PBS, durante 5 dias consecutivos, por meio de injecção intravenosa.
Ao 52, 6^ e 72 dias, após terminada a injecção de glucoronidase-MAE BW 494/32, MAE BW 494/3 2, glucoromidase ou PBS, administrou-se aos ratos dos grupos a, d e e, por animal, um terço da dose tolerável máxima (MTD) diária, dc etoposido de glicosilo, por injecção intravenosa. Aos ratos do grupo b aãministrou-se 1/10 da MTD e aos do grupo c 1/20 da MTD, nos mesmos dias.
Eesultado:
Eos grupos d e e verificou-se um crescimento de tumor que não se distinguia significativamente do grupo f. Os grupos a. b e c apresentavam uma notável inibição do crescimento do tumor, sendo e efeito mais acentuado o observado no grupo a.
Obtiveram-se resultados comparáveis com o sistema xenográfico OoOa 4 MAE BW 431/26 e BW 250/180, bem como o sistema xenográfico M21 com MAE BW 7O2*-.
Exemplo 10
a) Cisão do etoposido de 4l-0-alfa-D-galactopiranosilo com alfa-galactosidase (de grão de café verdes)
Dissolveu-se etoposido de 4’-0-alía-D-galactopiranosilo, numa concentração de 1 mg/ml em tampão de fosfato de sódio 20 mM, pH 5» misturou-se com 0.3U/ml de alfa-galactosidase (grão de café verdes; Sigma Co.; 1U » cisãc de 1 nmol de p-nitrofenil-al£a-D-galactósido por minuto a pH / fS o
6.5 e 25 C), e incubou-se a 37 C. Seguiu-se a degradação do etoposido de 4*-0-alfa-D-galactopiranosilo e o aparecimento de etoposido livre, por meio de HPLC. 0 tempo de vida média foi de 15 minutos.
b) Cisãodo etoposido de 4,-Q-alfa-D-galaotopiranosilo com alfa-galactosidase A (de placenta humana)
Dissolveu-se etoposido de 4*-0-alfa-D-galactopiranosilo, numa concentração de 107 ou 10,7^Alem tampão de fosfato de sódio 20 mM, pH%, misturou-se com 0.36U/ml de alfa-galactosidase A (isolada a partir de placenta humana; 1U * cisão de 1 yumol de 4-metumbeliferil-alfa-D-galactãsido por minutos a pH 5 θ 37°C), e incubou-se a 37°C. Segiu-se a degradação do etoposido de 4*-0-alfa-D-galactopiranosilo e o aparecimento de etoposido livre, por meio de HPLC ·
O tempo de vida média foi de 4 ou 7 horas.
Exemplo 11
A. Glicosilação de etoposidos
Processo geral:
A uma solução de etoposido de 2, 3”-di-O-cloroacetilo (0.67 mmol) e halogeneto de glicosilo (brometo ou cloreto, 1.2 mmol) em dielorometano (50 ml), adicionaram-se peneiros moleculares (1.4 g), carbonato de prata (0.857
g) e perclorato de prata, a -2Q°C, e agitou-se a mistura reac- 25 -
cional durante 60 h. ao abrigo da luz. Adicionou-se dielorome tano (50 ml) à mistura e filtrou-se. Lavou-se o filtrado com água e secou-se sobre sulfato de magnésio. Cromatografou-se o resíduo, obtendo-se os compostos Q-glicosidicos ligados na configuração alfa ou beta.
Etoposido de 2” ,3 --di-O-cloroacetil-41-0-(2,3 ,4,6-tetra-0-benzil-alfa-D-galactopirano silo)
Preparou-se o composto do título a parti de cloreto de 2,3,4,6-tetra-O-benzil-alfa-D-galactopiranosilo (ou do brometo) e de etoposido de 2”,3“-di-0-cloroacetilo, de acordo com o processo acima descrito.
Alfa-glicósido /~alfa__7p =» + 11.8°C(C = 1, clorofórmio)
Etoposido de 2ll,3,,-di-0-clorQacetil-4t-0-(2,5 ,4,6-tetra»0-benzil-beta-D-galaotopiranosilo)
Preparou-se o composto do título a partir de brometo de 2,3,4,6-tetra-O-benzil-alfa-D-galactopiranosilo e de etoposido de 2”,3-di-0-cloroacetilo, de acordo com o Processo acima descrito.
Beta-glicôsido ^alfajj, , _59>8o (θ . olorofi5rmio)
Etoposido de 2 ,3>,-di-0-cloroacetil-4l-0-(2,3 ,4,6-tetra-O-benzil-alfa-D-gluoopiranosilo)
Preparou-se o composto do título a partir de cloreto (ou brometo) de 2,3,4,6-tetra-O-benzil-alfa-D-glucopiranosilo e de etoposido de 2”,3”-di-0-cloroacetilo, de acordo com o processo acima descrito.
Alfa-glicósido /alfa/^ = + 16.2° (C = 1, clorofórmio)
Etogosido de 2”,3H-di-0-oloroacetil-4l-0-(2,5,4,6-tetra-0-benzil-beta-D-glucopiranosilo)
Preparou-se o composto do título a partir de brometo de 2,3,4,6-tetra-O-benzil-alfa-D-glucopiranosilo e de etoposido de 2”,3”-di-0-cloroacefcilo, de acordo com o processo acima descrito.
Beta-glicósido /”alfa__7^ = - 44.5° (0 = 1, clorofórmio)
Etoposido de 2M,3*,-di-0-cloroaeetil-4l-0-(2,3,4,6-tetra-0-benzil-beta-D-gluooronilo)
Preparou-se o composto do título a parti cie 2,3,4-tri-0-benzil-l-cloro(ou bromo)-l-desoxi-alfa-D-glucopiranuronato de benzilo e de etoposido de 2”,3-di-0-cloroacetilo, de acordo com o processo acima descrito.
Deta-glicósido /~alfa__7p = - 52.4° (0 = 1, clorofórmio)
B. Desbloqueamento de grupos protectores cloroacetilo em etoposidos de glicosilo
Processo geral;
Agitou-se uma mistura de um etoposido de glicosilo 2”,3r,-di-0-cloroacetilado (0.75 mmol) e de permutador iónico DOWEX 1x8 (3*0 g) em metanol/diclorometano 3:2 (200 ml), durante lhà temperatura ambiente. Após filtração da resina, lavou-se o filtrado com tampão de fosfato (pH 6), secou-se sobre sulfato de sódio e evaporou-se em vácuo. Purificou-se o resíduo por cromatografia em coluna.
Prepararam-se os seguintes compostos:
Etoposido de 4*-0-(2,3,4,6-tetra-O-benzil-alfa-D-galactopiranosilo)
Alfa-glicósido {_ alfaj^ β + θ.θο β
Etoposido de 4’-0-(2,3,4,6-tetra-O-benzil-beta-D-galactopira• nosilo)
- 27 Etoposido âe 4’-0-(2,3,4,6-tetra-O-benzil-alfa-D-gluoopiranosilo)
Alfa-glicósido /“alfa^p = + 14.9° (0=1, clorofórmio)
Etoposido âe 4*-Q-(2,3,4,6-tetra-O-benzil-beta-D-gluoopiranosido)
Beta-glucósido /“alfa__7D = -53° (0 = 1, clorofórmio)
Etoposido âe 4’-Q-(2,3,4,6-tetra-O-benzil-beta-D-glucuronilo).
Cisão hidrogenolítica âe grupos protectores benzilo em etoposiâos âe glioosilo
Prooesso gerais
Hidrogenou-se uma mistura âe um etoposi âo âe glioosilo (0.64 mmol) em ácido acético (10 ml), na presença âe Pâ/O a 10% (1.0 g), durante 24 h. Após filtração do catalisador evaporou-se o filtrado em vácuo a ceroa de 0°0· Purificou-se o resíduo por cromatografia em coluna de sílica gel, tendo-se preparado os seguintes etoposiâos de glioosiloj
Etoposido de 4‘-0-alfa-D-galactopiranosilo
Álfa-glicósido /alfa^Tp = * 6.2° (0 = 1, clorofórmio) Etoposido de 4‘-0-beta-D-galactopiranosilo Beta-glicósido ^“alfa^/j) ? ~ 73·!° (0 = 1, clorofórmio) Etoposido de 4t-0-alfa-D-glucopiranosilo Alfa-glicósido /“alfa^Tp e + 19·2° (0 = 1, olorofórmio) Etoposido de 4*-0-beta-D-glucopiranosilo
Beta-glicósido /alfa_7 HDY = - 76.6° (0 = 0.9, clorofórmio) Etoposido de 4-0-beta-D-glucoronilo.

Claims (1)

  1. REIVINDICAÇÕES
    - ia Processo para a preparação de um composto de fórmula I, na qual 1
    R é um grupo metilo, benzilo ou 2-tienilo, p
    R é um átomo de hidrogénio, § um grupo hidroxilo, amino ou dimetilamino,
    R^ é um átomo de hidrogénio ou um grupo metilo,
    R^ é um átomo de hidrogénio, um grupo hidroxilo, amino, ou acetilamino,
    R é um grupo hidroxilo ou amino,
    R? é um átomo de hidrogénio,
    R é um grupo metilo ou hidroximetilo, ou um grupo carboxilo ou um grupo acilo-protector ligado através de um grupo metilenoxi, ou um grupo benziloxicarbonilo, sendo o grupo aoilo-protector um grupo acetilo, mono-, di- ou tri-haloacetilo com halogénio igual a fluor ou cloro, caracterizado por se fazer reagir um composto etoposido, de férmula V na qual
    R1 é um grupo metilo, benzilo ou 2-tienilo,
    R2 é um átomo de hidrogénio, um grupo acilo-protector ou um grupo protector tri-Gj-G^-alquilsililo,
    R^ é um grupo hidroxilo, um grupo acilo- protector ou um grupo protector tri-G^-G^-alquilsililo ligado pelo oxigénio, um grupo benziloxicarbonilamino ou dimetilamino, e
    R + é um átomo de hidrogénio ou um grupo metilo, oom um componente hidrato de carbono, de fórmula VI, na qual
    R^ é um átomo de hidrogénio, um grupo hidroxilo, um grupo acilo- protector ligado por um átomo de oxigénio, um grupo benziloxicarbonilamino, azido ou acetilo, it é um grupo acilo-protector ligado por um átomo de oxigénio, um grupo benziloxicarbonilamino ou azido
    TS? é um grupo cilo-proteetor,
    8 /
    R e um grupo metilo, um grupo metilenoxiacilo-protector ou um grupo benziloxicarbonilo, e
    Z é um átomo de halogénio, de preferência fluor, cloro ou bromo, um grupo hidroxilo ou tri-O^-O^-alquilsililoxi ou um grupo acilo-protector ligado por um átomo de oxigénio, sendo o grupo acilo-protector um grupo acetilo, mono-, di- ou tri-haloacetilo, de preferência com halogénio igual a fluor ou cloro, na presença de um promotor e, conforme o caso, de um captor de ácido ou de um desidratante, num solvente a -50°G até 60°0, obtendo-se um derivado 4-O-glicosil-etoposido, de fórmula I, mantendo todos os grupos R a R a definição acima indicada, e se removerem neste composto os grupos protectores presentes, por via hidrogenolítioa ou hidrolítica e, conforme o caso, se transformar esse composto, caso contenha grupos amino, num outro composto de fórmãla I, contendo um grupo dimetilamino, por meio de uma alquilação redutiva.
    - 2â
    Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se preparar um composto de fórmula I, utilizando como grupo acilo-protector um grupo acetilo, cloro acetilo ou trifluoroacetilo.
    Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se preparar um composto de fórmula I, na qual
    R
    R‘
    R'
    R
    Rc é um grupo metilo, benzilo ou 2-tienilo, é um átomo de hidrogénio, um grupo protector acilo ou tri-G^-O^-alquilsililo, é um grupo hidroxilo, um grupo protector acilo ou tri-Og-G^-alquilsililo, um grupo amino, acetilamino, benziloxicarbonilamino ou dimetilamino, é um átomo de hidrogénio ou um grupo metilo, é um átomo de hidrogénio, um grupo hidroxilo, um grupo protector acilo ou tri-0^-0^-alquilsililo, ligado por um átomo de oxigénio, um grupo amino, benziloxicarbonilamino, azido ou acetilo, ê um grupo hidroxilo, um frupo protector acilo ou tri-0^-0^-alquilsililo, ligado por um átomo de oxigénio, um grupo amino, benziloxicarbonilamino ou azido, é um átomo de hidrogénio, um grupo protector acilo ou tri-O^-O^-alquilsililo, e ê um grupo metilo, hidroximetilo, um grupo acilo-protector ligado por um grupo metilenoxi, ou um grupo benziloxicarbonilo, sendo o grupo acilo-protector um grupo acetilo, mçj_ no-, di- ou tri-haloacetilo, com halogénio igual a fluor ou cloro.
    1, na
    R1
    E2
    EE'
    R
    E7
    R8
    Processo de acordo com a reivindicação caracterizado por se preparar um composto de fórmula I, qual é um grupo metilo, benzilo ou 2-tienilo, é um átomo de hidrogénio, um grupo protector acetilo, cloro acetilo ou tri-O-^-O^-alquilsililo,
    -é um grupo hidroxilo, um grupo protector acetilo, cloroacetilo ou tri-C^-O^-alquilsilil, ligado por um átomo de oxigénio, um grupo amino, acetilamino, benziloxicarbonilamino ou dimetilamino, é um átomo de hidrogénio ou um grupo metilo, é um átomo de hidrogénio, um grupo hidroxilo, um grupo protector acetilo, cloroacetilo ou tri-O^-C^-alquilsililo, ligado por um átomo de oxigénio, um grupo amino, benziloxicarbonilamino, azido ou acetilamino, é um grupo hidroxilo, um grupo protector acetilo, cloroacetilo ou tri-C^-O^-alquilsililo, ligado por um átomo de oxigénio, um grupo amino, benziloxicarbonilamino ou azido é um átomo de hidrogénio, um grupo protector acetilo, cloroacetilo ou tri-C^-C^-alquilsililo, e é um grupo metilo, hidroximetilo, acetiloxi ou cloroacetiloximetilo ou um grupo benziloxicarbonilo.
    - 5a Processo para a preparação de uma composição farmacêutica, caracterizado por se incorporarem como ingredientes activos um composto de fórmula I, quando preparado de acordo com qualquer das reivindicações anteriores, e um enzima específico para tumores, funcionalizado, de fórmula II
    A-Sp-E III na qual
    A é um anticorpo ou um seu fragmento, que apresenta especificidade para um antigene associado com o tumor, ou uma molécula que se forma no tumor,
    G- é uma glicosidase não imunogéniea ou pouco imunogénica, e
    Sp (Spacer) ê um grupo bifuncional contendo sulfureto ou dissulfureto, de fórmulas III ou IV em que
    X ou Y
    III x(s)
    IV significam -OO-R^-(N-succinimido)- ou -0 (»Η^θ)-0Β>ΟΒ com Ry
    -GH9-0H9-, 1,4-ciclohexilideno, 1,3- ou 1,4-fenileno d, £ γη ou metoxicarbonilo ou clorofenileno-1,4 e R é NH ou 0, e significa ainda -G (=R10)-GH2-GH2, tendo R10 o significado indicado, e significa 1 ou 2.
    Y n
    conjuntamente com veículos e/ou aditivos farmacêuticos adequados de modo a obter-se uma forma de administração conveniente .
    - 34 - 6â Processo de acordo com a reivindicação 5, caracterizado por se preparar uma composição farmacêutica utilizando um enzima A-Sp-Ξ preparado por engenharia genética, no qual A e E têm os significados indicados na reivindicação 5 e Sp significa um oligopéptido ou um polipéptido.
    - 7â Processo de acordo com a reivindicação 5, caracterizado por se preparar uma composição farmacêutica utilizando um enzima específico para tumores, funcionalizado, ou um produto de engenharia genética, de fórmula II, que contenha uma glicosidade.
    A requerente reivindica a prioridade
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